Badania przesiewowe za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i sekwencjonowanie nowej generacji: przydatne narzędzia do identyfikacji genów zaangażowanych w integralność organelli

Podsumowanie

Podstawowym zadaniem w biologii komórki jest zdefiniowanie mechanizmów, które leżą u podstaw tożsamości organelli tworzących komórki eukariotyczne. W tym miejscu proponujemy metodę identyfikacji genów odpowiedzialnych za morfologiczną i funkcjonalną integralność organelli roślinnych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i narzędzi sekwencjonowania nowej generacji.

Streszczenie

Ten protokół opisuje badanie przesiewowe siewek rzodkiewnika za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego i opisuje, jak mapować mutacje recesywne, które zmieniają subkomórkowy rozkład specyficznego oznaczonego markera fluorescencyjnego w szlaku wydzielniczym. Arabidopsis jest potężnym modelem biologicznym do badań genetycznych ze względu na rozmiar genomu, czas generacji i zachowanie mechanizmów molekularnych wśród królestw. Genotypowanie matrycowe jako podejście do mapowania mutacji w sposób alternatywny do tradycyjnej metody opartej na markerach molekularnych jest korzystne, ponieważ jest stosunkowo szybsze i może pozwolić na mapowanie kilku mutantów w naprawdę krótkim czasie. Metoda ta pozwala na identyfikację białek, które mogą wpływać na integralność wszelkich organelli w roślinach. Tutaj, jako przykład, proponujemy badanie przesiewowe do mapowania genów ważnych dla integralności retikulum endoplazmatycznego (ER). Nasze podejście można jednak łatwo rozszerzyć na inne organelle komórek roślinnych (na przykład patrz^1,2), a zatem stanowi ważny krok w kierunku zrozumienia molekularnych podstaw rządzących innymi strukturami subkomórkowymi.

Protokół

1. Leczenie EMS

Nasiona Arabidopsis thaliana są mutagenizowane przy użyciu sulfonianu metanu etylu (EMS)^3,4, który wprowadza do genomu zmiany C-do-T, powodując mutacje C/G do T/A^5-7.

1. Zważ 0,8 g nasion Arabidopsis (~ 40 000 nasion) zawierających marker fluorescencyjny organelli (w szczególności w tym badaniu ssGFPHDEL (tetrapeptyd sekwencji sygnałowej GFP-HDEL) został użyty jako marker ER).
2. Przenieś nasiona do 50-mililitrowej probówki sokoła, a następnie dodaj 25 ml wody destylowanej.
3. Dodać 0,2% (v/v) sulfonian etylometanu.
4. Inkubować przez 16 godzin na mieszadle nutującym z niską prędkością.
5. Zassać ciecz i wrzucić ją do kolby zawierającej 1,0 M NaOH w celu dezaktywacji EMS.
6. Dodać 25 ml wody do probówki Falcon zawierającej nasiona, zamknąć i odwrócić 5 razy, aby umyć nasiona; poczekać, aż wszystkie nasiona opadną, następnie zassać wodę i wylać do kolby 1,0 M NaOH.
7. Powtórz krok prania do 10 razy.
8. Po ostatnim umyciu ponownie zawieś nasiona w minimalnej ilości wody.
9. Przystąp do sterylizacji nasion, dodając 25 ml 10% wybielacza, energicznie wstrząsaj przez 30 s. Pozwól nasionom osiąść na dnie, a następnie odlej wybielacz i spłucz 25 ml sterylnej wody. Odlej sterylną wodę i dodaj 25 ml 70 % etanolu. Potrząsaj probówkami przez 30 sekund. Niech nasiona osiądą na dnie. Odlej etanol i spłucz 25 ml sterylnej wody. Powtórz dwukrotnie mycie sterylną wodą, a następnie wylej nasiona na plastikową szalkę Petriego zawierającą bibułę filtracyjną o grubości 3 mm i pozostaw do wyschnięcia pod maską. Przechowywać w temperaturze 4 °C przez 2 dni.
10. Umieść nasiona na 1/2 MS fitamelu (połowa stężenia pożywki Murashige i Skoog), 150-milimetrowej szalce Petriego (~250-300 nasion na talerz
).
11. Uprawiaj nasiona M1 na talerzu przez 2 tygodnie, a następnie przeszczep do gleby.
12. Zbierz nasiona M2 z poszczególnych roślin M1, aby wygenerować linie M2 (1000 niezależnych linii).

2. Konfokalne badania przesiewowe populacji M2 i M3

W tej sekcji opisujemy obserwację sadzonek za pomocą mikroskopu konfokalnego lub fluorescencyjnego, jak opisano wcześniej⁸.

1. Sześćdziesiąt nasion z każdej linii M2 jest hodowanych przez 7 do 10 dni na plastikowych szalkach Petriego, 1/2 MS fitagelu; na tej samej płytce hoduje się również 5 sadzonek nietraktowanych EMS (kontrola).
2. Pięć do dziesięciu liścieni jest montowanych stroną aosiową w kierunku soczewki (40X) na szkiełku mikroskopowym i zamykanych szkiełkiem nakrywkowym.
3. Każdy liścień jest obserwowany, od kory mózgowej do przyśrodkowej, pod wpływem fluorescencji pod kątem zmienionego subkomórkowego rozmieszczenia markera organelli.
4. Rośliny z dodatnim wynikiem przesadza się do gleby, a ich nasiona są zbierane i ponownie przesiewane, aby potwierdzić zmutowany fenotyp w pokoleniu M3.
5. Usunąć zanieczyszczające mutacje tła poprzez co najmniej trzykrotne krzyżowanie wsteczne z genomem typu dzikiego, który może zawierać pożądany marker fluorescencyjny organelli.
   1. Z rośliny matecznej za pomocą cienkich nożyczek lub kleszczy usuń dojrzałe krzemionki i otwórz kwiaty.
   2. Usuń zbyt małe pąki z merystemu.
   3. Włóż końcówkę jednej pary kleszczy między płatki i działki, aby otworzyć jeden pączek kwiatowy i usunąć wszystkie pylniki.
   4. Za pomocą jednej pary kleszczy weź otwarty dojrzały kwiat z rośliny rodzicielskiej i pocieraj pylniki o piętno wykastrowanej rośliny.

3. Mapowanie

Ta sekcja zasadniczo opisuje, jak zmapować mutację recesywną za pomocą zmodyfikowanego protokołu z Borevitz⁹, który jest szybszy w porównaniu z tradycyjnymi metodami mapowania^10,11 . W tym podejściu wykorzystuje się macierze oligonukleotydowe o dużej gęstości z możliwością wykrywania wielu polimorfizmów jednocechowych (SFP) w jednym teście¹². Za pomocą macierzy Affymetrix Arabidopsis ATH1 GeneChip można przeanalizować około 24 000 genów. Pula osobników F₂ wykazujących mutację jest porównywana z pulą dzikich roślin typu_{F 2} zebranych w tej samej segregującej populacji. Następnie mutacja zostanie zmapowana w regionie, w którym pula mutantów jest wzbogacona o allele zmutowanego genotypu, a w konsekwencji w tym samym regionie pula typu dzikiego zostanie wzbogacona o allele rodzicielskie typu dzikiego¹³.

1. Genomowe DNA (3 μg) jest ekstrahowane z homozygotycznego mutanta Columbia (M3) za pomocą zestawu Qiagen DNeasy Plant Mini Kit i jest przesyłane do sekwencjonowania Illumina Genome Analyzer II (GA II⁾¹⁴.
2. Homozygotyczny mutant Columbia (M3) jest krzyżowany z Landsberg erecta w celu wygenerowania populacji mapowej.
3. Mapowanie przeprowadza się na 70 do 100 osobnikach F2 wykazujących nieprawidłowy fenotyp i taką samą liczbę roślin F2 o fenotypie typu dzikiego.
4. Zbierz z każdej rośliny krążek liściowy (0,60 mm) za pomocą dziurkacza. Krążek liściowy powinien być pobrany z liści w tym samym wieku, aby mieć pewność, że mają podobną ilość DNA. Próbki mogą być przetwarzane do ekstrakcji genomowej pojedynczo lub w grupach. W takim przypadku możliwe jest pobranie 5-10 próbek dla każdej probówki Eppendorfa, dzięki czemu w efekcie końcowym będzie mniej probówek Eppendorfa, z których trzeba będzie wyekstrahować genomowe DNA.
5. Zestaw do oczyszczania DNA z liści roślin MasterPure (Epicentre) służy do ekstrakcji genomowego DNA. Genomowe DNA uzyskane z każdej próbki określa się ilościowo za pomocą nanokropli.
6. Ta sama ilość genomowego DNA z każdej próbki jest następnie łączona do łącznej ilości 300 ng (~30 μL) DNA roślinnego; dodać 60 μL 2,5X roztworu starterów losowych [125 mM Tris-HCl (pH 6,8), 12,5 mM MgCl2, 25 mM 2-merkaptoetanolu, 750 μg/ml starterów oligodeoksyrybonukleotydowych (losowe oktamery)] (zestaw Bioprime) i 42 μl wody (końcowa objętość 132 μL).
7. Denaturacja DNA w temperaturze >95 °C przez 5 do 10 minut.
8. Schłodzić na lodzie.
9. Do każdego zdenaturowanego DNA dodaj 15 μL 10X dNTPs wymieszaj z Biotyną dCTP [1 mM biotyny-14-dCTP, 1 mM dCTP, 2 mM dATP, 2 mM dGTP, 2 mM dTTP w 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 1 mM Na2EDTA] (zestaw Bioprime) i uzupełnij 3 μl polimerazy Klenowa (zestaw Bioprime).
10. Inkubować przez noc w temperaturze 25 °C.
11. Następnego dnia dodać 15 μl 3 M NaOAc i 400 μl zimnego 100% EtOH; wymieszać.
12. Inkubować w temperaturze -80 °C przez 1 godzinę, następnie wirować w temperaturze 20 500 g przez 15 minut, usunąć supernatant i przemyć 500 μl zimnego 75% EtOH.
13. Wiruj z prędkością 20 500x g przez 10 minut.
14. Suszyć granulki DNA w temperaturze 37 °C przez 10 minut i ponownie zawiesić w 100 μl wody.
15. Użyj 5 μl, aby sprawdzić wydajność i jakość żelu (rysunek 2).
16. Wyślij 95 μl reakcji znakowania dla typu dzikiego i mutanta dla hybrydyzacji GeneChip Arabidopsis ATH1 Genome Array.
17. Tablice są skanowane, a plik . Uzyskane pliki CEL są analizowane za pomocą oprogramowania R (http://www.r-project.org/).
18. Zainstaluj oprogramowanie R, a następnie otwórz program i wklej następujący ciąg:
    source("http://bioconductor.org/biocLite.R")
    biocLite()
    Następnie naciśnij Return - spowoduje to zainstalowanie standardowych pakietów Bioconductor (http://www.bioconductor.org).
19. W nowym folderze na pulpicie pobierz z następującej strony internetowej (http://www.naturalvariation.org/methods) pliki:
    readcel. R
    SFP. R
    Map.R
    ath1V5.RData
    ColLerCEL.zip
    Plik ColLerCEL.zip powinien zostać rozpakowany, a wynikowe pliki wklejone do nowego folderu.
20. Zmień nazwę danych uzyskanych z eksperymentu GeneChip na wildtype. CEL i mutant. CEL.
21. Skopiuj teraz swoje dane GeneChip (wildtype. CEL i mutant. CEL) do swojego folderu.
22. Otwórz R, a) dla Maca: kliknij "Różne", a następnie kliknij "Zmień katalog roboczy". b) dla PC: kliknij "Plik", a następnie "Zmień katalog"
23. a) dla komputerów Mac: Wybierz folder zawierający pliki. Kliknij "Obszar roboczy", "Załaduj plik obszaru roboczego" i wybierz ath1V5.RData, b) dla PC: Wybierz folder zawierający powyższe pliki, kliknij "Plik", a następnie "Załaduj obszar roboczy" i wybierz ath1V5.RData.
24. Otwórz readCEL.R za pomocą Notatnika i skopiuj cały tekst do R.
25. Otwórz SFP. R za pomocą Notatnika i skopiuj cały tekst do R.
26. Otwórz Map.R za pomocą Notatnika i skopiuj cały tekst do R.
27. W oknie Konsola zostanie wyświetlony następujący komunikat:
    Chromosom x graniczny Mb y z
    Szukaj genów w TAIR wklej w tym linku
    3http://arabidopsis.org/servlets/sv?action=download&chr=x&start=y&end=z
28. Skopiuj i wklej link do swojej przeglądarki internetowej. Pojawi się okno z prośbą o otwarcie lub zapisanie pliku; Należy wybrać opcję Zapisz. Wybierz nazwę pliku i dołącz rozszerzenie ".xls", a następnie kliknij przycisk Zapisz.
29. Otwórz plik ".xls", w którym możesz znaleźć współrzędne swojego mutanta (wynik jest graficznie przedstawiony na rysunku 3).
30. W zmapowanym obszarze w zmontowanych odczytach zmutowanego genomu Illumina identyfikuj specyficzne przejścia EMS ⁴ wśród polimorfizmów pojedynczego nukleotydu. Uzupełnij zmutowany fenotyp poprzez transformację genem (genami) typu dzikiego przy użyciu standardowych procedur¹⁵.

4. Reprezentatywne wyniki

Rysunek 1 pokazuje podejście użyte do identyfikacji mutanta szlaku wydzielniczego za pomocą badań przesiewowych pod mikroskopią konfokalną. Rysunek 2 przedstawia typowe przygotowanie znakowanego genomowego DNA do hybrydyzacji macierzowej. Na rycinie 3 przedstawiono typowy wynik oczekiwany po analizie danych uzyskanych z GeneChip Arabidopsis ATH1 Genome Array .

Rysunek 1. Rośliny transgeniczne Arabidopsis wykazujące ekspresję ssGFPHDEL (marker ER) (1) były uprawiane w celu wytworzenia wystarczającej ilości nasion do leczenia EMS (2). Nasiona zaprawione EMS zostały następnie wysiane w celu wytworzenia roślin M1 (3). Każda roślina M1 reprezentuje inną linię, a nasiona zostały zebrane osobno z każdej z nich. Nasiona M2 posiano na podłożu 1/2 MS (4), a następnie przesiewano pod kątem wad morfologii ER za pomocą mikroskopii konfokalnej (5). Podczas badań przesiewowych znaleźliśmy rośliny, które zachowywały morfologię ER typu dzikiego (6) oraz rośliny, które wykazują wadliwe fenotypy ER (7). Rośliny te uprawiano w celu uzyskania generacji M3 i potwierdzenia fenotypu (8). Genomowe DNA z rośliny M3 wykorzystano do sekwencjonowania Solexa Illumina (a). Ta sama roślina została również wykorzystana do krzyżówek z Ler-wt w celu uzyskania populacji mapującej F2 (b).

Rysunek 2. Losowe reakcje znakowania Bioprime (5 μL ze 100 μL) załadowano na żel agarozowy 1%. Pas a pochodzi z puli dzikich roślin F2, a pas b pochodzi z puli zmutowanych roślin F2. (Marker to 1 Kb drabinka DNA-N3232, z NEB).

Rysunek 3. Rysunek przedstawia przykład mapowania mutacji Col-0 przy użyciu hybrydyzacji GeneChip Arabidopsis ATH1 Genome Array. Mutacja w tym przykładzie znajduje się na chromosomie 1, ograniczonym pionowymi paskami. Poziome słupki reprezentują progi wykrywania.

Dyskusja

Tutaj opisaliśmy badania przesiewowe oparte na mikroskopii konfokalnej w celu identyfikacji mutantów endomembranowych. Podejście to można łatwo rozszerzyć na inne organelle komórki, dla których dostępne są specyficzne fluorescencyjne markery białkowe. Badanie przesiewowe opiera się na identyfikacji mutantów, które wykazują nieprawidłowy rozkład markera fluorescencyjnego w organellach docelowych lub w organellach, które nie powinny zawierać markera. Odpowiednio, mutanty te reprezentują populacje, w których albo zdolność o...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Sulfonian etylometanu	Sigma-Aldrich	M0880
NaOH	JT Baker	3722-05
Murashige skoog podłoże bazowe w witaminach gamborg	Fito technolog laboratorie	M404
Phytagel	Sigma-Aldrich	P8169-1Kg
RNeasy mini zestaw	Qiagen	74104
Master czyste DNA liści roślin zestaw do oczyszczania	Epicentre Biotechnologies	MPP92100
System znakowania DNA Bioprime	Invitrogen	18094-011
Alkohol 200 proof	Decon Laboratories	2716
NaOAc	JT Baker
Gene chip Arabidopsis Macierz genomowa ATH1	Affymetrix	900385
Falcon probówki 50 ml	Corning	430290
Probówki Eppendorfa 1,5 ml
Bibuła filtracyjna 90 mm	Whatman, GE Healthcare	1001090
Waga analityczna	Mettler Toledo	n.a
Wytrząsarka nutacyjna (falowa)	Heidolph	n.a
Wirówka	Eppendorf	n.a