Fundamentalnym celem biologii komórki jest zdefiniowanie mechanizmów leżących u podstaw tożsamości organelli tworzących komórki eukariotyczne. W niniejszej pracy proponujemy metodę identyfikacji genów odpowiedzialnych za integralność morfologiczną i funkcjonalną organelli roślinnych, wykorzystując mikroskopię fluorescencyjną oraz narzędzia sekwencjonowania następnej generacji.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Przesiew mikroskopii fluorescencyjnej i sekwencjonowanie następnej generacji: użyteczne narzędzia do identyfikacji genów zaangażowanych w integralność organelli
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Niniejszy protokół opisuje przesiewanie siewek Arabidopsis przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego oraz sposób mapowania mutacji recesywnych, które zmieniają subkomórkową dystrybucję specyficznego fluorescencyjnego markera z tagiem w szlaku wydzielniczym. Arabidopsis jest potężnym modelem biologicznym w badaniach genetycznych ze względu na rozmiar genomu, czas generacji oraz konserwację mechanizmów molekularnych pomiędzy królestwami. Genotypowanie macierzowe jako podejście do mapowania mutacji, stanowiące alternatywę dla tradycyjnej metody opartej na markerach molekularnych, jest korzystne, ponieważ jest stosunkowo szybsze i pozwala na mapowanie kilku mutantów w bardzo krótkim czasie. Metoda ta umożliwia identyfikację białek, które mogą wpływać na integralność dowolnego organellum w roślinach. W tym przypadku, jako przykład, proponujemy przesiew w celu zmapowania genów istotnych dla integralności retikulum endoplazmatycznego (ER). Nasze podejście można jednak łatwo rozszerzyć na inne organella komórek roślinnych (patrz np.1,2), co stanowi zatem istotny krok w stronę zrozumienia podstaw molekularnych sterujących innymi strukturami subkomórkowymi.
Protokół
1. Obróbka EMS
Arabidopsis thaliana nasiona poddaje się mutagenezie z użyciem etanosulfonianu etylu (EMS) jako czynnika mutagennego3,4, który indukuje w genomie zamiany C na T, prowadząc do mutacji C/G na T/A5-7.
- Odważ 0,8 g nasion Arabidopsis (~40 000 nasion) zawierających fluorescencyjny marker organelli (konkretnie w niniejszym badaniu jako marker ER zastosowano ssGFPHDEL (sekwencja sygnałowa-GFP-tetrapeptyd HDEL)).
- Przenieś nasiona do probówki typu Falcon o pojemności 50 ml, a następnie dodaj 25 ml wody destylowanej.
- Dodaj 0,2% (v/v) metanosulfonianu etylu.
- Inkubuj przez 16 godzin na mieszalniku nutacyjnym przy niskich obrotach.
- Odsącz ciecz i wlej ją do kolby zawierającej 1,0 M NaOH w celu dezaktywacji EMS.
- Do probówki Falcon z nasionami dodaj 25 ml wody, zamknij i odwróć 5 razy, aby wypłukać nasiona; poczekaj, aż wszystkie nasiona opadną na dno, a następnie odsącz wodę i wlej ją do kolby z 1,0 M NaOH.
- Powtórz etap płukania do 10 razy.
- Po ostatnim płukaniu ponownie zawieś nasiona w minimalnej ilości wody.
- Przejdź do sterylizacji nasion, dodając 25 mL 10% wybielacza i energicznie wstrząsając przez 30 s. Pozostaw nasiona do opadnięcia na dno, a następnie zlej wybielacz i przepłucz 25 mL sterylnej wody. Zlej sterylną wodę i dodaj 25 mL 70% etanolu. Wstrząsaj probówkami przez 30 s. Pozostaw nasiona do opadnięcia na dno. Zlej etanol i przepłucz 25 mL sterylnej wody. Powtórz dwukrotnie płukanie sterylną wodą, a następnie wysyp nasiona na plastikową szalkę Petri zawierającą papier filtracyjny 3 MM i pozostaw do wyschnięcia pod dygestorium. Przechowuj w temperaturze 4 °C przez 2 dni.
- Wysiej nasiona na podłoże ½ MS phytagel (połowa stężenia pożywki Murashige and Skoog) w szalce Petri o średnicy 150 mm (~250-300 nasion na szalkę).
- Hoduj nasiona M1 na szalce przez 2 tygodnie, a następnie przesadź do gleby.
- Zbierz nasiona M2 z poszczególnych roślin M1 w celu wygenerowania linii M2 (1000 niezależnych linii).
2. Przesiew konfokalny populacji M2 i M3
W tej sekcji opisujemy obserwację siewek za pomocą mikroskopu konfokalnego lub fluorescencyjnego, zgodnie z wcześniejszym opisem8.
- Sześćdziesiąt nasion z każdej linii M2 hoduje się przez 7 do 10 dni na plastikowych szalkach Petri z pożywką ½ MS phytagel; na tej samej płytce hoduje się również 5 siewek niepoddanych działaniu EMS (kontrola).
- Od pięciu do dziesięciu liści zakotwiczych montuje się stroną abaksjalną do obiektywu (40X) na szkiełku przedmiotowym i przykrywa szkiełkiem nakrywkowym.
- Każdy liść zakotwiczy obserwuje się w fluorescencji, od regionu kory do regionu środkowego, pod kątem jakichkolwiek zmian w subkomórkowej dystrybucji markera organelli.
- Rośliny pozytywne przesadza się do gleby, a ich nasiona zbiera i ponownie poddaje przesiewowi w celu potwierdzenia fenotypu mutantów w generacji M3.
- Usuwa się mutacje tła poprzez krzyżowanie wsteczne co najmniej trzy razy z genomem typu dzikiego, który może zawierać pożądany fluorescencyjny marker organelli.
- Z rośliny matecznej, używając precyzyjnych nożyczek lub pęsety, usuwa się dojrzałe strąki oraz otwarte kwiaty.
- Z merystemu usuwa się zbyt małe pąki.
- Koniec pęsety wsuwa się między płatki a działki, aby otworzyć pąk kwiatowy i usunąć wszystkie pręciki.
- Za pomocą pęsety pobiera się otwarty, dojrzały kwiat z rośliny ojcowskiej i pociera się pręcikami o znamię rośliny poddanej emasculacji.
3. Mapowanie
W tej sekcji opisano zasadniczy sposób mapowania mutacji recesywnej z wykorzystaniem zmodyfikowanego protokołu Borevitza9, który jest szybszy w porównaniu do tradycyjnych metod mapowania10,11. Podejście to wykorzystuje macierze oligonukleotydowe o wysokiej gęstości, które umożliwiają wykrycie licznych polimorfizmów pojedynczych cech (SFPs) w jednym badaniu12. Dzięki zastosowaniu macierzy Affymetrix Arabidopsis ATH1 GeneChip możliwe jest przeanalizowanie około 24 000 genów. Pulę osobników F2 wykazujących mutację porównuje się z pulą roślin F2 typu dzikiego, pobranych z tej samej populacji segregującej. Następnie mutacja zostanie zmapowana w regionie, w którym pula mutantów jest wzbogacona o allele genotypu mutanta, a w konsekwencji w tym samym regionie pula typu dzikiego okaże się wzbogacona o allele rodzica typu dzikiego13.
- DNA genomowy (3 μg) ekstrahuje się z homozygotycznej mutanty Columbia (M3) przy użyciu zestawu Qiagen DNeasy Plant Mini Kit, a następnie przekazuje do sekwencjonowania na Illumina Genome Analyzer II (GA II)14.
- Homozygotyczną mutantę Columbia (M3) krzyżuje się z Landsberg erecta w celu wygenerowania populacji mapującej.
- Mapowanie przeprowadza się na 70 do 100 osobnikach F2 wykazujących aberracyjny fenotyp oraz na takiej samej liczbie roślin F2 o fenotypie typu dzikiego.
- Z każdej rośliny pobiera się wycinek liścia (0,60 mm) za pomocą wycinaka do papieru. Wycinki należy pobierać z liści w tym samym wieku, aby zapewnić podobną ilość DNA. Próbki można przetwarzać w celu ekstrakcji genomowej oddzielnie lub w grupach. W tym drugim przypadku można zebrać od 5 do 10 próbek do jednej probówki Eppendorf, tak aby ostatecznie otrzymać mniej probówek, z których należy wyekstrahować DNA genomowy.
- Do ekstrakcji DNA genomowego stosuje się zestaw MasterPure Plant Leaf DNA Purification Kit (Epicentre). Ilość DNA genomowego uzyskanego z każdej próbki określa się za pomocą nanodropu.
- Następnie łączy się taką samą ilość DNA genomowego z każdej próbki, aż do uzyskania całkowitej ilości 300 ng (~30 μL) DNA roślinnego; dodaje się 60 μL roztworu random primers 2,5X [125 mM Tris-HCl (pH 6,8), 12,5 mM MgCl2, 25 mM 2-merkaptoetanol, 750 μg/ml oligodeoksynukleotydowych starterów losowych (random octamers)] (zestaw Bioprime) oraz 42 μL wody (objętość końcowa 132 μL).
- Denaturuje się DNA w temperaturze >95 °C przez 5 do 10 min.
- Schładza się na lodzie.
- Do każdego zdenaturowanego DNA dodaje się 15 μL mieszaniny dNTPs 10X z Biotin dCTP [1 mM biotin-14-dCTP, 1 mM dCTP, 2 mM dATP, 2 mM dGTP, 2 mM dTTP w 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 1 mM Na2EDTA] (zestaw Bioprime) i uzupełnia 3 μL polimerazy Klenow (zestaw Bioprime).
- Inkubuje się przez noc w temperaturze 25 °C.
- Następnego dnia dodaje się 15 μL 3 M NaOAc i 400 μL zimnego 100% EtOH; miesza się.
- Inkubuje się w temperaturze -80 °C przez 1 godzinę, następnie wiruje przy 20 500x g przez 15 min, usuwa nadosad i przemywa 500 μL zimnym 75% EtOH.
- Wiruje przy 20 500x g przez 10 min.
- Osady DNA suszy się w temperaturze 37 °C przez 10 min i resuspendsuje w 100 μL wody.
- Używa się 5 μL do sprawdzenia wydajności i jakości na żelu (Rycina 2).
- 95 μL reakcji znakowania dla typu dzikiego i mutanty przekazuje się do hybrydyzacji na matrycy genomowej GeneChip Arabidopsis ATH1 Genome Array.
- Matryce są skanowane, a otrzymane pliki .CEL analizuje się przy użyciu oprogramowania R (http://www.r-project.org/).
- Instaluje się oprogramowanie R, następnie otwiera program i wkleja następujący ciąg znaków:
source("http://bioconductor.org/biocLite.R")
biocLite()
Następnie naciska się klawisz Enter – zainstaluje to standardowe pakiety Bioconductor (http://www.bioconductor.org). - W nowym folderze na pulpicie pobiera się z następującej strony internetowej (http://www.naturalvariation.org/methods) pliki:
readcel.R
SFP.R
Map.R
ath1V5.RData
ColLerCEL.zip
Plik ColLerCEL.zip należy rozpakować, a otrzymane pliki wkleić do nowego folderu. - Dane otrzymane z eksperymentu GeneChip zmienia się na wildtype.CEL oraz mutant.CEL.
- Kopiuje się teraz dane GeneChip (wildtype.CEL i mutant.CEL) do folderu.
- Otwiera się program R: a) dla systemu Mac: klika się „Misc”, a następnie „Change working directory”; b) dla systemu PC: klika się „File”, a następnie „Change directory”.
- a) dla systemu Mac: wybiera się folder zawierający pliki. Klika się „Workspace”, „Load workspace file” i wybiera ath1V5.RData; b) dla systemu PC: wybiera się folder zawierający powyższe pliki, klika się „File”, następnie „Load workspace” i wybiera ath1V5.RData.
- Otwiera się plik readCEL.R w Notatniku i kopiuje cały tekst do programu R.
- Otwiera się plik SFP.R w Notatniku i kopiuje cały tekst do programu R.
- Otwiera się plik Map.R w Notatniku i kopiuje cały tekst do programu R.
- W oknie konsoli pojawi się następujący komunikat:
Chromosome x limits Mb y z
Search genes at TAIR paste in this link
3http://arabidopsis.org/servlets/sv?action=download&chr=x&start=y&end=z - Kopiuje się i wkleja link do przeglądarki internetowej. Pojawi się okno z prośbą o otwarcie lub zapisanie pliku; należy wybrać zapisz. Wybiera się nazwę pliku i dodaje rozszerzenie „.xls”, a następnie klika Zapisz.
- Otwiera się plik „.xls”, w którym można znaleźć współrzędne dla mutanty (wynik przedstawiono graficznie na Rycini 3).
- W zmapowanym obszarze zmontowanych odczytów Illumina genomu mutanty identyfikuje się specyficzne przejścia EMS 4 wśród polimorfizmów pojedynczego nukleotydu. Fenotyp mutanty uzupełnia się poprzez transformację genami typu dzikiego przy użyciu standardowych procedur15.
4. Reprezentatywne wyniki
Rysunek 1 przedstawia podejście wykorzystane do identyfikacji mutanta szlaku wydzielniczego za pomocą przesiewania mikroskopią konfokalną. Rysunek 2 przedstawia typowe przygotowanie znakowanego DNA genomowego do hybrydyzacji macierzowej. Na rysunku 3 zaprezentowano typowy wynik oczekiwany po analizie danych uzyskanych z macierzy genomowej GeneChip Arabidopsis ATH1.
Rysunek 1. Transgeniczne rośliny Arabidopsis wykazujące ekspresję ssGFPHDEL (marker ER) (1) były hodowane w celu uzyskania wystarczającej liczby nasion do traktowania EMS (2). Nasiona potraktowane EMS wysiano, aby wygenerować rośliny M1 (3). Każda roślina M1 reprezentuje inną linię, a nasiona zbierano oddzielnie z każdej z nich. Nasiona M2 wysiano na podłoże ½ MS (4), a następnie przesiewano pod kątem wad morfologii ER za pomocą mikroskopii konfokalnej (5). Podczas przesiewania zidentyfikowano rośliny zachowujące morfologię ER typu dzikiego (6) oraz rośliny wykazujące defektywne fenotypy ER (7). Rośliny te doprowadzono do pokolenia M3 w celu potwierdzenia fenotypu (8). DNA genomiczne z rośliny M3 wykorzystano do sekwencjonowania Solexa Illumina (a). Tę samą roślinę wykorzystano również do krzyżówek z Ler-wt w celu uzyskania populacji mapowania F2 (b).
Rycina 2. Reakcje znakowania losowego Bioprime (5 μL z 100 μL) naniesiono na żel agarozowy 1%. Ścieżka a pochodzi z puli roślin F2 typu dzikiego, a ścieżka b z puli roślin F2 mutantów. (Marker to drabinka DNA 1 Kb-N3232, z NEB).
Rycina 3. Rycina przedstawia przykład mapowania mutacji Col-0 z wykorzystaniem hybrydyzacji macierzy genomowej GeneChip Arabidopsis ATH1. Mutacja w tym przykładzie znajduje się w chromosomie 1, ograniczona pionowymi liniami. Poziome linie reprezentują progi detekcji.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W niniejszej pracy opisaliśmy metodę przesiewową opartą na mikroskopii konfokalnej w celu identyfikacji mutantów endomembranowych. Podejście to można łatwo rozszerzyć na inne organella komórkowe, dla których dostępne są specyficzne markery białkowe fluorescencyjne. Przesiew opiera się na identyfikacji mutantów wykazujących aberracyjny rozkład markera fluorescencyjnego, albo w organellum docelowym, albo w organellach, które nie powinny zawierać tego markera. Odpowiednio, mutanty te reprezentują populacje, w których zaburz...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie mamy nic do ujawnienia.
Podziękowania
Potwierdzamy wsparcie ze strony Chemical Sciences, Geosciences and Biosciences Division, Office of Basic Energy Sciences, Office of Science, Departamentu Energii USA (numer grantu DE-FG02- 91ER20021) oraz National Science Foundation (MCB 0948584) (F.B.). Dziękujemy pani Karen Bird za redakcję tekstu.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Etylomethanosulfonian | Sigma-Aldrich | M0880 | |
| NaOH | JT Baker | 3722-05 | |
| podstawkowa pożywka Murashige i Skooga z witaminami Gamborga | Laboratoria fitotechnologiczne | M404 | |
| Phytagel | Sigma-Aldrich | P8169-1Kg | |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74104 | |
| Zestaw do zaawansowanego oczyszczania czystego DNA z liści roślin | Epicentre Biotechnologies | MPP92100 | |
| System znakowania DNA Bioprime | Invitrogen | 18094-011 | |
| Alkohol 100% | Decon Laboratories | 2716 | |
| NaOAc | JT Baker | ||
| Macierz genomowa Arabidopsis ATH1 (gene chip) | Affymetrix | 900385 | |
| Probówki Falcon 50 ml | Corning | 430290 | |
| probiówki Eppendorf 1,5 ml | |||
| Papier filtracyjny 90 mm | Whatman, GE Healthcare | 1001090 | |
| Waga analityczna | Mettler Toledo | n.d. | |
| Mieszadło oscylacyjne (falowe) | Heidolph | n.d. | |
| Wirówka | Eppendorf | n.d. |
Bibliografia
- Marti, L. A missense mutation in the vacuolar protein GOLD36 causes organizational defects in the ER and aberrant protein trafficking in the plant secretory pathway. The Plant journal : for cell and molecular biology. 63, 901-913 (2010).
- Stefano, G., Renna, L., Moss, T., McNew, J., Brandizzi, F. Arabidopsis the spatial and dynamic organization of the endoplasmic reticulum and Golgi apparatus is influenced by the integrity of the c-terminal domain of RHD3, a non-essential GTPase. The Plant Journal. , Forthcoming (2011).
- Kim, Y., Schumaker, K. S., Zhu, J. K. EMS mutagenesis of Arabidopsis. Methods in molecular biology. 323, 101-103 (2006).
- Maple, J., Moller, S. G. Mutagenesis in Arabidopsis. Methods in molecular biology. 362, 197-206 (2007).
- Greene, E. A. Spectrum of chemically induced mutations from a large-scale reverse-genetic screen in Arabidopsis. Genetics. 164, 731-740 (2003).
- Krieg, D. R. Ethyl methanesulfonate-induced reversion of bacteriophage T4rII mutants. Genetics. 48, 561-580 (1963).
- Kovalchuk, I., Kovalchuk, O., Hohn, B. Genome-wide variation of the somatic mutation frequency in transgenic plants. The EMBO journal. 19, 4431-4438 (2000).
- Boulaflous, A., Faso, C., Brandizzi, F. Deciphering the Golgi apparatus: from imaging to genes. Traffic. 9, 1613-1617 (2008).
- Borevitz, J. Genotyping and mapping with high-density oligonucleotide arrays. Methods in molecular biology. 323, 137-145 (2006).
- Konieczny, A., Ausubel, F. M. A procedure for mapping Arabidopsis mutations using co-dominant ecotype-specific PCR-based markers. The Plant journal : for cell and molecular biology. 4, 403-410 (1993).
- Bell, C. J., Ecker, J. R. Assignment of 30 microsatellite loci to the linkage map of Arabidopsis. Genomics. 19, 137-144 (1994).
- Hazen, S. P., Kay, S. A. Gene arrays are not just for measuring gene expression. Trends in Plant Science. 8, 413-416 (2003).
- Hazen, S. P. Rapid array mapping of circadian clock and developmental mutations in Arabidopsis. Plant Physiology. 138, 990-997 (2005).
- Bentley, D. R. Accurate whole human genome sequencing using reversible terminator chemistry. Nature. 456, 53-59 (2008).
- Weigel, D., Glazebrook, J. Arabidopsis. A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. (2002).
- Voelkerding, K. V., Dames, S., Durtschi, J. D. Next generation sequencing for clinical diagnostics-principles and application to targeted resequencing for hypertrophic cardiomyopathy: a paper from the 2009 William Beaumont Hospital Symposium on Molecular Pathology. J. Mol. Diagn. 12, 539-551 (2010).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
