Opracowaliśmy nowy protokół w celu zwiększenia wydajności różnicowania embrionalnych komórek macierzystych myszy w neurony ruchowe in vitro. Zróżnicowane komórki ES nabyły cechy neuronów ruchowych, co potwierdzono poprzez wykazanie ekspresji markerów neuronalnych i neuronów ruchowych z wykorzystaniem technik immunohistochemicznych.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Efektywna różnicowanie embrionalnych komórek macierzystych myszy w neurony ruchowe
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Bezpośrednia różnicowanie komórek macierzystych zarodkowych (ES) w funkcjonalne neurony ruchowe stanowi obiecujące narzędzie do badania mechanizmów chorobowych, przesiewania nowych związków leczniczych oraz opracowywania nowych terapii chorób neuronów ruchowych, takich jak rdzeniowy zanik mięśni (SMA) i stwardnienie zanikowe boczne (ALS). Wiele aktualnych protokołów wykorzystuje kombinację kwasu retinowego (RA) i białka sonic hedgehog (Shh) do różnicowania mysich komórek macierzystych zarodkowych (mES) w neurony ruchowe1-4. Jednakże wydajność różnicowania komórek mES w neurony ruchowe osiągała dotychczas jedynie umiarkowany sukces. Opracowaliśmy dwuetapowy protokół różnicowania5, który znacząco poprawia wydajność różnicowania w porównaniu z obecnie ustanowionymi protokołami. Pierwszy etap polega na wzmocnieniu procesu neuralizacji poprzez dodanie Noggin oraz czynników wzrostu fibroblastów (FGFs). Noggin jest antagonistą białka morfogenetycznego kości (BMP), który uczestniczy w indukcji neuralnej zgodnie z modelem domyślnym neurogenezy, co prowadzi do powstania przedniej struktury układu nerwowego6. Sygnalizacja FGF działa synergistycznie z Noggin w indukowaniu tworzenia tkanki nerwowej poprzez promowanie tylnej tożsamości neuralnej7-9. Na tym etapie komórki mES poddano działaniu Noggin, bFGF i FGF-8 przez dwa dni, aby promować różnicowanie w kierunku linii neuralnych. Drugim etapem jest indukcja specyfikacji neuronów ruchowych. Komórki mES eksponowane na Noggin/FGFs inkubowano z RA oraz agonistą Shh, agonistą białka Smoothened (SAG), przez kolejne 5 dni, aby ułatwić generowanie neuronów ruchowych. W celu monitorowania różnicowania mES w neurony ruchowe wykorzystano linię komórek ES pochodzącą od myszy transgenicznej wykazującej ekspresję eGFP pod kontrolą specyficznego dla neuronów ruchowych promotora Hb91. Stosując ten skuteczny protokół, osiągnęliśmy wydajność różnicowania na poziomie 51±0.8% (n = 3; p < 0.01, test t Studenta)5. Wyniki barwienia immunofluorescencyjnego wykazały, że komórki GFP+ wykazują ekspresję markerów specyficznych dla neuronów ruchowych: Islet-1 oraz cholinoacetylotransferazy (ChAT). Nasz dwuetapowy protokół różnicowania stanowi wydajny sposób różnicowania komórek mES w rdzeniowe neurony ruchowe.
Protokół
1. Krok 1: Hodowla embrionalnych komórek macierzystych myszy (mES) (Czas trwania: 3 dni)
1. Wysiewanie pierwotnych embrionalnych fibroblastów mysich (PMEF)
- Pokryj cztery 100-milimetrowe naczynia do hodowli tkankowej żelatyną w celu zapewnienia adhezji PMEF. Dodaj 8 ml 0,1% roztworu żelatyny (StemCell Technologies) do każdego naczynia i inkubuj przez 30 min w temperaturze pokojowej.
- Usuń nadmiar żelatyny z naczyń. Nie płucz naczyń.
- Rozcieńcz jedną fiolkę PMEF inaktywowanych mitomycyną C (Millipore), zawierającą ok. 5 x 106 komórek, w 40 ml pożywki dla PMEF (patrz przepis w Tabeli 1) i wysiej na cztery 100-milimetrowe naczynia do hodowli tkankowej. Komórki PMEF stanowią warstwę pokarmową dla komórek mES.
- PMEF powinny zostać wysiane co najmniej jeden dzień przed dodaniem kultur komórek mES. PMEF można wykorzystać do 1 tygodnia po wysianiu.
2. Wysiewanie komórek mES
Aby monitorować wydajność różnicowania komórek mES w neurony ruchowe, wykorzystano linię komórek ES HBG3, pochodzącą od myszy transgenicznej wykazującej ekspresję eGFP pod kontrolą specyficznego dla neuronów ruchowych promotora Hb9.
- Rozmrozić 1 ampułkę komórek mES HBG3 (ok. 1 x 107, udostępnionych przez dr. Douglasa Kerra z Johns Hopkins University) w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C. Do probówki o pojemności 15 ml dodać 5 ml pożywki ES (patrz przepis w Tabeli 1) i odwirować komórki przy 800 rpm przez 5 min.
- Odssać supernatant i resuspendować komórki mES w 20 ml pożywki ES z dodanym na świeżo czynnikiem hamującym białaczkę (LIF) w stężeniu końcowym 10 ng/ml. UWAGA: LIF należy dodać w dniu użycia; jest on niezbędny do utrzymania komórek mES w stanie niedróżnicowanym.
- Usunąć 10 ml pożywki PMEF z każdego naczynia z PMEF i dodać do każdego naczynia 10 ml zawiesiny komórek ES HBG3.
- 24 h po wysianiu komórki mES tworzą małe kolonie, o rozmiarze zbliżonym do kolonii wskazanej grotem strzałki na Rysunku 1B. 72 h po wysianiu kolonie zwiększają swoją wielkość, przy czym wiele z nich ma średnicę około 100 μm (Rysunek 1B, wskazane strzałkami). Komórki te są gotowe do różnicowania. Pożywkę należy wymieniać codziennie, aby utrzymać proliferację komórek.
2. Krok 2: Indukcja neuronalna (Czas trwania: 2 dni)
Aby indukować różnicowanie komórek mES w neurony ruchowe, komórki mES muszą zostać oddzielone od PMEF i hodowane w środowisku zawiesiny. Do oddzielenia PMEF od komórek mES stosuje się kolby powlekane żelatyną.
- Gdy kolonie mES są gotowe do indukcji neuronalnej (definiowanej jako dzień 0 różnicowania), pokryj 2 kolby T150 0,1% żelatyną (18 ml/kolba) przez 30 min w temperaturze pokojowej, a następnie usuń nadmiar żelatyny i przemyj trzykrotnie 1x PBS. UWAGA: Każda hodowla w szalce 100-mm będzie wymagać jednej kolby T150 pokrytej żelatyną w celu oddzielenia PMEF.
- Ostrożnie usuń medium poprzez aspirację, uważając, aby nie oderwać słabo przytwierdzonych kolonii. Dodaj na krótko 10 ml PBS, a następnie usuń je przez aspirację, aby zakończyć etap płukania.
- Aby oddzielić komórki mES od PMEF, dodaj 0,25% trypsyny/EDTA (3 ml/szalka, StemCell Technologies) i inkubuj przez 3-5 min w 37 °C, aż komórki macierzyste i PMEF oddzielą się od płytki. Dodaj 15 ml świeżego medium ES bez LIF i pipetuj komórki w górę i w dół, aby rozbić kolonie (około 15-20 razy). Następnie przenieś je do kolby T150 pokrytej 0,1% żelatyną i inkubuj przez 30 min w 37 °C. Po inkubacji PMEF powinny przytwierdzić się do żelatynowanej powierzchni, podczas gdy komórki ES powinny pozostać w zawiesinie. Zbierz pływające komórki mES do probówki 50 ml.
- Wirować przy 800 rpm i resuspendować komórki w 10 ml Medium do Różnicowania Neuronalnego (patrz receptura w Table 1).
- Policz komórki za pomocą hemocytometru, a następnie wysiej około 2 x 106 komórek mES na 100-mm szalkę do hodowli bakterii lub kultur w zawiesinie. Płytki te umożliwiają wzrost kultur w zawiesinie i wspomagają tworzenie ciałek zarodkowych (EBs).
- W 1 dniu różnicowania komórki mES tworzą małe pływające agregaty (EBs), które są widoczne pod mikroskopem świetlnym. Wszelkie pozostałe PMEF przytwierdzają się do szalki. Przenieś komórki w zawiesinie wraz z medium do probówki 15 ml i wiruj przy niskiej prędkości (500 rpm) przez 3 min. Ostrożnie aspiruj medium, dodaj 10 ml świeżego Medium do Różnicowania Neuronalnego do osadu EBs, a następnie wysiej komórki na nową szalkę do hodowli bakterii. Ten krok, oprócz uzupełnienia medium, usuwa wszelkie PMEF, które przeniosły się z poprzedniego etapu.
- W 2 dniu różnicowania EBs są gotowe do indukcji w neurony ruchowe.
3. Krok 3: Specyfikacja neuronów ruchowych (Czas trwania: 5 dni)
- W 2. dniu różnicowania delikatnie zamieszaj naczynie hodowlane, a następnie przenieś medium wraz z EB do probówki o pojemności 15 ml. Pozostaw EB do osadzenia pod wpływem grawitacji (~ 10 min) lub poprzez wirowanie z niską prędkością (500 rpm) przez 3 min.
- Ostrożnie odessij medium i resuspenduj EB w 10 ml medium do różnicowania neuronów ruchowych (MND) (patrz przepis w Tabeli 1). Przenieś EB do nowej szalki bakteriologicznej i wymieniaj medium codziennie przez 5 dni.
- W 7. dniu różnicowania EB powinny mieć średnicę około 150 - 200 μm i wykazywać silny sygnał GFP (Rycina 1C). Takie EB są gotowe do dysocjacji i wysiania na naczynia lub szkiełka nakrywkowe powlekane poli-DL-ornityną/lamininą.
4. Krok 4: Przygotowanie szkiełek podstawowych pokrytych poly-DL-ornityną/lamininą (Czas trwania: 2 dni)
Na dwa dni przed dysocjacją ciał embrioidalnych (EB) (tj. w 5. dniu różnicowania) należy przygotować szkiełka podstawowe pokryte poly-DL-ornityną/lamininą.
- Umieść okrągłe szkiełka nakrywki o średnicy 12 mm (Warner Instruments) na dnie płytki 24-dołkowej. Rozpuść 25 mg poli-DL-ornityny (Sigma-Aldrich) w 25 ml sterylnej, dwukrotnie destylowanej wody (d2H2O), aby otrzymać 10X roztwór zapasowy (1 mg/ml). Przed użyciem przygotuj 1/10 rozcieńczenie poli-DL-ornityny w d2H2O, aby uzyskać stężenie 100 μg/ml. Dodaj 0,5 ml do każdego dołka płytki 24-dołkowej i inkubuj przez noc w temperaturze 4 °C.
- Następnego dnia (6. dzień różnicowania) odessij poli-DL-ornitynę i pozostaw płytki oraz szkiełka nakrywkowe do wyschnięcia w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Przepłucz dołki płytki trzykrotnie wodą d2H2O. Pozostaw do wyschnięcia przez kolejną godzinę.
- Rozpuść 1 mg lamininy mysiej (Millipore) w 5 ml schłodzonego 1X PBS, aby przygotować 100x roztwór zapasowy (200 μg/ml). Przed użyciem wykonaj 1/100 rozcieńczenie w schłodzonym 1X PBS (2 μg lamininy/ml). Dodaj 0,5 ml na dołek w płytce 24-dołkowej i inkubuj przez noc w temperaturze 4 °C. Przed wysianiem komórek należy usunąć nadmiar lamininy i dwukrotnie przepłukać dołki roztworem 1X PBS. Szkiełka nakrywkowe można przechowywać w medium MND (0,5 ml/dołek).
5. Krok 5: Wydłużanie aksonów (Czas trwania: 2 dni)
- W 7. dniu różnicowania zebrać ciała embroidalne (EBs) do probówki 15 ml i pozwolić im osiaść (około 3 min). Odessać medium i resuspendować EBs w PBS. Pozostawić EBs do osiadania, a następnie odessać PBS. Powtórzyć ten krok 3 razy. Dodać 1 ml Accumax (Millipore) do EBs, delikatnie wymieszać i inkubować przez 5 min w temperaturze pokojowej. Następnie odessać nadmiar Accumax pokrywający EBs.
- Aby zdysocjować EBs, dodać 3 ml medium MND. Pipetować 20 razy w górę i w dół za pomocą mikropipety Eppendorf 1 ml (niebieska końcówka), aby rozbić EBs. Inkubować przez 2 min w temperaturze pokojowej. Przenieść zawiesinę komórkową do probówki 12x75 mm z nakrętką z filtrem do komórek (BD Falcon), aby uzyskać zawiesinę pojedynczych komórek. Powtórzyć ten krok dysocjacji z pozostałymi skupkami i komórkami zatrzymanymi przez filtr w celu zwiększenia wydajności uzyskania pojedynczych komórek. Końcowa objętość zawiesiny pojedynczych komórek wyniesie 6 ml.
- Delikatnie wymieszać tę zawiesinę pojedynczych komórek i policzyć komórki za pomocą hemocytometru. Rozcieńczyć komórki w medium MND (uzupełnionym o 10 ng/ml każdego z czynników BDNF, GDNF, CNTF i NT-3) do gęstości 2x105 komórek na ml. Przenieść zawiesinę komórkową (0,5 ml/dołek) do płytek 24-dołkowych zawierających szkiełka podstawowe pokryte poly-DL-ornityną/lamininą (przygotowane wcześniej zgodnie z powyższym opisem). Zróżnicowane komórki wykształcają długie neuryty po 2 dniach hodowli (Rycyna 1D).
6. Reprezentatywne wyniki
Rysunek 1A przedstawia schemat protokołu. W kroku 1 komórki mES są hodowane na PMEF z dodatkiem LIF w celu zapobiegania spontanicznej różnicowaniu. Zazwyczaj niezróżnicowane kolonie mES są okrągłe, zwarte i mają wyraźnie zdefiniowane krawędzie. Kolonie nie stykają się ze sobą. Typowo komórki mES powinny być pasażowane w stosunku 1:4 co 2~3 dni. Jednak każda poszczególna linia komórkowa rośnie w innym tempie, a stosunek pasażowania musi zostać określony empirycznie. Strzałki na Rysunku 1B wskazują typowy wygląd komórek mES po 3 dniach hodowli na warstwie zasilającej PMEF. Kolonie te są duże (50-100 μm średnicy), lecz nadal zachowują okrągłe i wyraźne krawędzie. Na tym etapie kolonie są gotowe do różnicowania lub subkultury. Grot strzałki na Rysunku 1B pokazuje małą kolonię mES, którą typowo spotyka się 24 h po wysianiu. Cztery dni po wysianiu komórki mES stają się przerośnięte. Wykazują spłaszczony wygląd i utratę wyraźnych granic, co wskazuje na rozpoczęcie procesu różnicowania. Takie komórki nie są optymalne do różnicowania w komórki neuronalne.
Aby zróżnicować komórki mES w neurony ruchowe, komórki mES muszą być hodowane w warunkach zawiesiny, aby umożliwić tworzenie ciałek zarodkowych (EB). W kroku 2 komórki ES są przenoszone na powierzchnię hodowlaną bez warstwy karmionej, aby promować tworzenie EB. Na tym etapie są one inkubowane w medium do różnicowania neuralnego uzupełnionym o Noggin, bFGF i FGF-8 przez 2 dni, aby skierować komórki na linię neuralną. Małe EB można zaobserwować pod mikroskopem w 1. dniu różnicowania. Powinny one unosić się w medium. W 1. dniu różnicowania mogą być obecne również pozostałości PMEF, które muszą zostać usunięte. Komórki te przylegają do naczyń bakteryjnych, więc są eliminowane podczas pasażowania EB do nowego naczynia bakteryjnego. Zatem do 2. dnia różnicowania w naczyniu hodowlanym powinno być widocznych niewiele lub żadnych PMEF. W kroku 3 dalsze przenoszenie EB do nowych naczyń powinno zapewnić usunięcie wszelkich pozostałych PMEF. EB są hodowane w medium do różnicowania neuronów ruchowych (MND) uzupełnionym o RA i SAG przez 5 dni, aby zróżnicować komórki w neurony ruchowe. Podczas hodowli EB nadal zwiększają swoją wielkość i mogą być widoczne gołym okiem w 3–4. dniu różnicowania. Rycina 1C przedstawia wygląd mikroskopowy EB w 7. dniu różnicowania. W przeciwieństwie do komórek niezróżnicowanych, EB wykazują silną fluorescencję dzięki ekspresji GFP. Te EB są optymalnie zróżnicowane i gotowe do dysocjacji. Cytometria przepływowa wykazała, że 51% ± 0,8% komórek z dysocjowanych EB zróżnicowało się w komórki wykazujące ekspresję GFP5. W kroku 5 hodowla tych neuronów ruchowych w obecności GDNF, CNTF, BDNF i NT3 prowadzi do wydłużenia długich projekcji aksonalnych. Rycina 1D przedstawia wygląd zróżnicowanych komórek 2 dni po wysianiu dysocjowanych EB. Zwróć uwagę na długie neuryty wychodzące z ciał komórkowych wysianych komórek. Barwienie immunofluorescencyjne pokazuje, że komórki GFP+ wykazują ekspresję markera pan-neuronalnego (neurofilament średniołańcuchowy) oraz dwóch markerów specyficznych dla neuronów ruchowych (Islet-1 oraz cholinoacetylotransferazy, Rycina 2).
Rysunek 1. Różnicowanie komórek mES w neurony ruchowe (rysunek zmodyfikowany z Wu et al.5). A) Schemat protokołu różnicowania komórek mES w neurony ruchowe. B) Niedoróżnicowane komórki mES tworzą okrągłe kolonie na powierzchni warstwy karmionej z fibroblastów. Wykazują słabą ekspresję GFP. C) Komórki mES oddzielono od warstw karmionych i hodowano na naczyniach o niskim stopniu przylegania w celu utworzenia ciał embroidalnych (EB). Podczas pierwszych dwóch dni procesu różnicowania komórki poddano działaniu 50 ng/ml Noggin, 20 ng/ml bFGF oraz 20 ng/ml FGF-8. Następnie indukowano ich różnicowanie za pomocą 1 μM kwasu retinowego i 1 μM agonisty sonic hedgehog SAG przez 5 dni. Zróżnicowane komórki mES wykazały silną fluorescencję GFP. D) Po 7-dniowym różnicowaniu EB rozdzielono i wysiano na płytki pokryte poli-DL-ornityną/lamininą. Zróżnicowane komórki wytworzyły długie wypustki neuronalne po 2 dniach hodowli. Pasek skali = 200 μm. MN = neuron ruchowy. B, C i D to obrazy w polu jasnym, a B', C' i D' to odpowiadające im obrazy fluorescencyjne.
Rysunek 2. Charakterystyka neuronów ruchowych pochodnych z komórek mES. Barwienie immunofluorescencyjne dla średniołańcuchowego neurofilamentu (NF-M, czerwony), ChAT (czerwony) i Islet-1 (czerwony) pokrywało się z ekspresją GFP (zielony). DAPI (niebieski) zastosowano do identyfikacji jąder komórkowych. Pasek skali = 50 μm.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Jakość komórek mES jest krytycznym parametrem dla wydajnej generacji neuronów ruchowych. Komórki mES muszą być hodowane na PMEF, aby zapobiec spontanicznej różnicowaniu. Dodatek LIF pomaga utrzymać komórki mES w stanie nieróżnicowanym. Ponieważ komórki mES dzielą się co 12-15 h, pożywka hodowlana szybko ulega wyczerpaniu i musi być wymieniana codziennie.
Efektywna aktywacja szlaku Shh jest krytycznym parametrem niezbędnym do indukcji specyfikacji neuronów ruchowych. W celu promowania tworzenia...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Niniejszy manuskrypt jest dedykowany pamięci dr Wenlan Wang, która zmarła 26 maja 2011 roku. Dziękujemy dr. Douglasowi A. Kerrowi za hojność w udostępnieniu linii komórek mES HBG3 wykorzystanych w tej pracy. Praca ta była finansowana przez Nemours, grant (2 RR016472-10) w ramach programu INBRE Narodowego Centrum Zasobów Badawczych (NCRR), a także grant COBRE przyznany przez NCRR (5 P20 RR020173-05) na wsparcie Centrum Badań Pediatrycznych w Alfred I. duPont Hospital for Children w Wilmington, Delaware, USA.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| PMEF | EMD Millipore | PMEF-H | N.D. |
| DMEM | Invitrogen | 11965-118 | N.D. |
| FBS | Invitrogen | 16140-071 | 10% |
| L-glutamina | Invitrogen | 25030-081 | 1% |
| Penicylina/streptomycyna | Invitrogen | 15240-063 | 1% |
| DMEM | Stem Cell Technologies | 36250 | N.D. |
| FBS kwalifikowany dla komórek ES | Invitrogen | 16141-079 | 15% |
| GlutaMax-I | Invitrogen | 35050-061 | 1% |
| Niezbędne aminokwasy | Invitrogen | 11140-050 | 1% |
| Nukleozydy | EMD Millipore | ES-008-D | 1% |
| β-merkapto–etanol | EMD Millipore | ES-007-E | 0.1 mM |
| Penicylina/streptomycyna | EMD Millipore | TMS-AB2-C | 1% |
| LIF | EMD Millipore | LIF2010 | 10 ng/ml |
| DMEM | Stem Cell Technologies | 36250 | N.D. |
| FBS ES Cult | Stem Cell Technologies | 06905 | 15% |
| Niezbędne aminokwasy | Invitrogen | 11140-050 | 1% |
| Monotioglicerol | Sigma-Aldrich | M-6145 | 1mM |
| Noggin | Invitrogen | PHC1506 | 50 ng/ml |
| FGF-8 | Invitrogen | PHG0274 | 20 ng/ml |
| bFGF | Invitrogen | PHG0024 | 20 ng/ml |
| Podłoże podstawowe ES-Cult Medium-A | Stem Cell Technologies | 5801 | N.D. |
| Zamiennik surowicy Knockout | Invitrogen | 10828-028 | 10% |
| Suplement N-2 | Invitrogen | 17502-048 | 1% |
| Suplement ITS-B | Stem Cell Technologies | 07155 | 1% |
| Kwas askorbinowy | Stem Cell Technologies | 07157 | 1% |
| Penicylina/streptomycyna | EMD Millipore | TMS-AB2-C | 1% |
| GlutaMax-I | Invitrogen | 35050-061 | 1% |
| D-glukoza | Sigma-Aldrich | G-8270 | 0.15% w d2H2O |
| Fibrynektyna | Stem Cell Technologies | 07159 | 5 μg/ml |
| Heparyna | Sigma-Aldrich | H3149 | 20 μg/ml w d2H2O |
| β-merkapto–etanol | EMD Millipore | ES-007-E | 0.1 mM |
| Kwas retinowy | Sigma-Aldrich | R-2625 | 1 μM |
| SAG | EMD Millipore | 566660 | 1 μM |
| Podłoże podstawowe ES-Cult Medium-A | Stem Cell Technologies | 5801 | N.D. |
| Zamiennik surowicy Knockout | Invitrogen | 10828-028 | 10% |
| Suplement N-2 | Invitrogen | 17502-048 | 1% |
| Suplement ITS-B | Stem Cell Technologies | 07155 | 1% |
| Kwas askorbinowy | Stem Cell Technologies | 07157 | 1% |
| Penicylina/streptomycyna | EMD Millipore | TMS-AB2-C | 1% |
| GlutaMax-I | Invitrogen | 35050-061 | 1% |
| D-glukoza | Sigma-Aldrich | G-8270 | 0.15% w d2H2O |
| Fibrynektyna | Stem Cell Technologies | 07159 | 5 μg/ml |
| Heparyna | Sigma-Aldrich | H3149 | 20 μg/ml w d2H2O |
| β-merkapto–etanol | EMD Millipore | ES-007-E | 0.1 mM |
| BDNF | R&D Systems | 248-BD-005/CF | 10 ng/ml |
| CNTF | R&D Systems | 257-NY-010/CF | 10 ng/ml |
| GDNF | R&D Systems | 212-GD-010/CF | 10 ng/ml |
| NT-3 | R&D Systems | 267-N3-005/CF | 10 ng/ml |
| N.D. = nie dotyczy | |||
| Tabela 1. PMEF i podłoża do hodowli lub różnicowania komórek mES | |||
| 0,1% żelatyny | Stem Cell Technologies | 07903 | N.D. |
| Poly-DL-ornityna | Sigma-Aldrich | P0421 | 0.1 mg/ml w d2H2O |
| Laminina mysia | EMD Millipore | CC095 | 2 μg/ml w PBS |
| 0,25% trypsyny/EDTA | Stem Cell Technologies | 07901 | N.D. |
| Accumax | EMD Millipore | SCR006 | N.D. |
| N.D. = nie dotyczy | |||
| Tabela 2. Odczynniki do powlekania i dysocjacji |
Bibliografia
- Wichterle, H., Lieberam, I., Porter, J. A., Jessell, T. M. Directed differentiation of embryonic stem cells into motor neurons. Cell. 110, 385-397 (2002).
- Miles, G. B. Functional properties of motoneurons derived from mouse embryonic stem cells. J. Neurosci. 24, 7848-7858 (2004).
- Wichterle, H., Peljto, M. Differentiation of mouse embryonic stem cells to spinal motor neurons. Curr. Protoc. Stem Cell. Biol. Chapter 1, Unit 1H.1.1-Unit 1H.1.9 (2008).
- Kiris, E. Embryonic stem cell-derived motoneurons provide a highly sensitive cell culture model for botulinum neurotoxin studies, with implications for high-throughput drug discovery. Stem Cell Res. 6, 195-205 (2011).
- Wu, C. Y. Proteomic assessment of a cell model of spinal muscular atrophy. BMC Neurosci. 12, 25(2011).
- McMahon, J. A. Noggin-mediated antagonism of BMP signaling is required for growth and patterning of the neural tube and somite. Genes Dev. 12, 1438-1452 (1998).
- Storey, K. G. Early posterior neural tissue is induced by FGF in the chick embryo. Development. 125, 473-484 (1998).
- Launay, C., Fromentoux, V., Shi, D. L., Boucaut, J. C. A truncated FGF receptor blocks neural induction by endogenous Xenopus inducers. Development. 122, 869-880 (1996).
- Sinha, S., Chen, J. K. Purmorphamine activates the Hedgehog pathway by targeting Smoothened. Nat. Chem. Biol. 2, 29-30 (2006).
- Chen, J. K., Taipale, J., Young, K. E., Maiti, T., Beachy, P. A. Small molecule modulation of Smoothened activity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 14071-14076 (2002).
- Lee, S. M., Danielian, P. S., Fritzsch, B., McMahon, A. P. Evidence that FGF8 signaling from the midbrain-hindbrain junction regulates growth and polarity in the developing midbrain. Development. 124, 959-969 (1997).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
