$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Krok 1: Hodowla komórek embrionalnej łodygi myszy (mES) (czas: 3 dni)
1. Posiewanie pierwotnych embrionalnych fibroblastów myszy (PMEF)
- Pokryj cztery 100-milimetrowe szalki do hodowli tkankowych żelatyną w celu uzyskania adhezji PMEF. Do każdego naczynia dodać 8 ml 0,1% roztworu żelatyny (StemCell Technologies) i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
- Usuń nadmiar żelatyny z naczyń. Nie spłukuj naczyń.
- Rozcieńczyć jedną fiolkę inaktywowanego przez Mitomycynę C PMEF (Milipore), która zawiera ok. 5 x 106 komórek, w 40 ml pożywki PMEF (patrz przepis w Tabeli 1) i umieścić na czterech 100-milimetrowych szalkach do hodowli tkankowych. PMEF zapewnia warstwę zasilającą dla komórek mES.
- PMEF należy posiać co najmniej jeden dzień przed dodaniem kultur komórkowych mES. PMEF można stosować do 1 tygodnia po poszyciu.
2. Posiewanie komórek mES
Aby monitorować efektywność różnicowania komórek mES w neurony ruchowe, użyliśmy HBG3, linii komórkowej ES pochodzącej od transgenicznej myszy wyrażającej eGFP pod kontrolą specyficznego dla neuronu ruchowego promotora Hb9.
- Rozmrozić 1 fiolkę z komórkami mES HBG3 (ok. 1 x 107, współautor dr Douglas Kerr, Uniwersytet Johnsa Hopkinsa) w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Dodać 5 ml pożywki ES (patrz przepis w tabeli 1) do probówki o pojemności 15 ml i odwirowywać komórki z prędkością 800 obr./min przez 5 minut.
- Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki mES w 20 ml pożywki ES ze świeżo dodanym czynnikiem hamującym białaczkę (LIF) w końcowym stężeniu 10 ng/ml. UWAGA: LIF należy dodać w dniu użycia i jest to wymagane do utrzymania komórek mES w stanie niezróżnicowanym.
- Usunąć 10 ml pożywki PMEF z PMEF w każdym naczyniu i dodać 10 ml zawiesiny komórek HBG3 ES do każdego naczynia.
- 24 godziny po posianiu komórki mES tworzą małe kolonie, podobne wielkością do kolonii wskazanej przez grot strzałki na rysunku 1B. 72 godziny po posianiu kolonie zwiększają swoją wielkość, wiele z nich ma średnicę około 100 μm (ryc. 1B, oznaczone strzałkami). Komórki te są gotowe do różnicowania. Pożywki powinny być wymieniane codziennie, aby utrzymać proliferację komórek.
2. Krok 2: Indukcja neuronalna (czas: 2 dni)
Aby wywołać różnicowanie komórek mES w neurony ruchowe, komórki mES muszą być oddzielone od PMEF i hodowane w środowisku zawiesinowym. Kolby powlekane żelatyną służą do oddzielania PMEF od komórek mES.
- Gdy kolonie mES są gotowe do indukcji neuronalnej (zdefiniowanej jako dzień różnicowania 0), pokryj 2 kolby T150 0,1% żelatyny (18 ml / kolbę) przez 30 minut w temperaturze pokojowej, a następnie usuń nadmiar żelatyny i przemyj 1x PBS trzy razy. UWAGA: Każda kultura talerza o średnicy 100 mm będzie wymagała jednej kolby pokrytej żelatyną T150 do oddzielenia PMEF.
- Ostrożnie usuń pożywkę przez aspirację, uważając, aby nie usunąć luźno przyczepionych kolonii. Dodać na krótko 10 ml PBS, a następnie usunąć przez aspirację do pełnego etapu mycia.
- Aby oddzielić komórki mES od PMEF, dodaj 0,25% trypsyny/EDTA (3 ml/naczynie, StemCell Technologies) i inkubuj przez 3-5 minut w temperaturze 37 °C, aż komórki macierzyste i PMEF oderwą się od płytki. Dodaj 15 ml świeżej pożywki ES bez LIF i pipetuj komórki w górę iw dół, aby rozbić kolonie (około 15-20 razy). Następnie dodać do 0,1% kolby T150 pokrytej żelatyną i inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C. Po inkubacji PMEF powinien przyczepić się do zżelowanej powierzchni, podczas gdy komórki ES powinny unosić się na wodzie. Zebrać pływające komórki mES do probówki o pojemności 50 ml.
- Odwirować z prędkością 800 obr./min i ponownie zawiesić komórki w 10 ml pożywki różnicującej neuronów (patrz przepis w tabeli 1).
- Policz komórki za pomocą hemocytometru, a następnie umieść około 2 x 10 6 komórek mES na 100-milimetrowym naczyniu do hodowli bakterii lub zawiesiny. Płytki te umożliwiają wzrost kultur zawiesinowych i sprzyjają tworzeniu ciał zarodkowych (EB).
- W pierwszym dniu różnicowania komórki mES tworzą małe pływające agregaty (EB), które są widoczne pod mikroskopem świetlnym. Wszelkie przeniesione PMEF dołącz do naczynia. Przenieść komórki zawiesiny i pożywkę do probówki o pojemności 15 ml i wirować z niską prędkością (500 obr./min) przez 3 minuty. Ostrożnie odessać pożywkę, dodać 10 ml świeżej pożywki do różnicowania neuronalnego do granulowanych EBs, a następnie umieścić komórki w nowym naczyniu bakteryjnym. Oprócz uzupełniania nośnika, ten krok usuwa wszelkie PMEF, które są przenoszone z poprzedniego kroku.
- W drugim dniu różnicowania EB są gotowe do indukcji do neuronów ruchowych.
3. Krok 3: Specyfikacja neuronu ruchowego (czas: 5 dni)
- W 2. dniu różnicowania zamieszać szalkę hodowlaną i przenieść pożywkę oraz EB do probówki o pojemności 15 ml. Pozwól EB osiąść grawitacyjnie (~ 10 min) lub przez wirowanie przy niskiej prędkości (500 obr./min) przez 3 min.
- Ostrożnie odessać pożywkę i ponownie zawiesić EB w 10 ml pożywki do różnicowania neuronów ruchowych (MND) (patrz przepis w Tabeli 1). Umieść EB w nowym naczyniu bakteryjnym i zmieniaj podłoże codziennie przez 5 dni.
- W 7 dniu różnicowania EB powinny mieć średnicę około 150 - 200 μm i powinny wyrażać silne sygnały GFP (ryc. 1C). Te EB są gotowe do dysocjacji i posiewu na naczyniach pokrytych poli-DL-ornityną/lamininą lub szkiełkach nakrywkowych.
4. Krok 4: Przygotowanie szkiełek nakrywkowych pokrytych poli-DL-ornityną/lamininą (czas: 2 dni)
Dwa dni przed dysocjacją EB (tj. w 5 dniu różnicowania), przygotuj szkiełka nakrywkowe pokryte poli-DL-ornityną/lamininą.
- Umieść okrągłe szkiełka nakrywkowe o średnicy 12 mm (Warner Instruments) na dnie płytki 24-dołkowej. Rozpuścić 25 mg poli-DL-ornityny (Sigma-Aldrich) w 25 ml sterylnej, podwójnie destylowanej wody (d2H2O) w celu uzyskania 10-krotnego roztworu podstawowego (1 mg/ml). Gdy poli-DL-ornityna jest gotowa do użycia, rozcieńczyć ją w stosunku 1:10 za pomocą d2H2O, aby uzyskać stężenie 100 μg/ml. Dodać 0,5 ml do każdego dołka na płytce 24-dołkowej i inkubować w temperaturze 4 °C przez noc.
- Następnego dnia (6. dzień różnicowania) należy odessać poli-DL-ornitynę i pozostawić płytki i szkiełka nakrywkowe do wyschnięcia na powietrzu w kapturze do hodowli tkankowych. Przepłukać studzienki płytki trzykrotnied2H2O. Pozostaw powietrze do wyschnięcia na kolejną godzinę.
- Rozpuścić 1 mg mysiej lamininy (milipore) w 5 ml lodowato zimnego 1X PBS, aby uzyskać 100x roztwór podstawowy (200 μg/ml). Gdy produkt jest gotowy do użycia, rozcieńczyć w stosunku 1:100 w lodowato zimnym 1X PBS (2 μg lamininy/ml). Dodać 0,5 ml/basenik do płytki 24-dołkowej i inkubować w temperaturze 4 °C przez noc. Przed wysiewem komórek należy usunąć nadmiar lamininy i dwukrotnie przepłukać studzienki 1X PBS. Szkiełka nakrywkowe można przechowywać w podłożu MND (0,5 ml/dołek).
5. Krok 5: Wydłużenie aksonu (czas: 2 dni)
- W 7. dniu różnicowania zebrać EB do probówki o pojemności 15 ml i pozostawić EB do osiadania (około 3 min). Odessać pożywkę i ponownie zawiesić EB w PBS. Pozwól EB osiąść, a następnie odessaj PBS. Powtórz ten krok 3 razy. Dodać 1 ml Accumax (Millipore) do EBs, delikatnie wymieszać i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Następnie odessać nadmiar Accumax pokrywający EBs.
- Aby oddzielić EBs, dodać 3 ml pożywki MND. Pipetować w górę i w dół 20 razy za pomocą mikropipety Eppendorf o pojemności 1 ml (niebieska końcówka), aby rozbić EBs. Inkubować przez 2 minuty w temperaturze pokojowej. Przenieść zawiesinę komórek do probówki o wymiarach 12x75 mm z nasadką z sitkiem (BD Falcon) w celu uzyskania zawiesiny pojedynczej komórki. Powtórzyć ten etap dysocjacji z pozostałymi grudkami i komórkami zatrzymanymi przez filtr, aby wzbogacić wydajność pojedynczych komórek. Ostateczna zawiesina jednokomórkowa będzie miała pojemność 6 ml.
- Delikatnie wymieszaj tę zawiesinę pojedynczych komórek i policz komórki za pomocą hemocytometru. Rozcieńczyć komórki w pożywce MND (uzupełnionej 10 ng / ml każdego BDNF, GDNF, CNTF i NT-3) do gęstości 2x105 komórek na ml. Dodać zawiesinę komórek (0,5 ml/basenik) do 24-dołkowych płytek zawierających szkiełka nakrywkowe pokryte poli-DL-ornityną/lamininą (uprzednio przygotowane w sposób opisany powyżej). Zróżnicowane komórki wydłużają długie neuryty po 2 dniach w hodowli (ryc. 1D).
6. Reprezentatywne wyniki
Rysunek 1A przedstawia zarys protokołu. W etapie 1 komórki mES są hodowane na PMEF i uzupełniane LIF, aby zapobiec spontanicznemu różnicowaniu. Ogólnie rzecz biorąc, niezróżnicowane kolonie mES są okrągłe i zwarte oraz mają wyraźnie zaznaczone krawędzie. Kolonie nie stykają się ze sobą. Zazwyczaj komórki mES należy dzielić w stosunku 1:4 co 2 ~ 3 dni. Jednak każda pojedyncza linia komórkowa będzie rosła w innym tempie, a współczynnik podziału musi być określony empirycznie. Strzałki na rysunku 1B wskazują typowy wygląd komórek mES po hodowli na warstwie zasilającej PMEF przez 3 dni. Kolonie te są duże (50-100 μm średnicy), ale nadal zachowują zaokrąglone i wyraźne krawędzie. Na tym etapie kolonie są gotowe do różnicowania lub subkultury. Grot strzały na rysunku 1B pokazuje małą kolonię mES, którą zwykle znajduje się 24 godziny po posiewie. Cztery dni po posiewie komórki mES przerastają. Wykazują one spłaszczony wygląd i utratę zdefiniowanych granic, co wskazuje, że zaczynają się różnicować. Takie komórki nie są optymalne do różnicowania się w komórki neuronalne.
Aby zróżnicować komórki mES w neurony ruchowe, komórki mES muszą być hodowane w warunkach zawieszenia, aby umożliwić tworzenie EB. W kroku 2 komórki ES są przenoszone na powierzchnię hodowli bez warstwy zasilającej, aby ułatwić tworzenie EB. Na tym etapie są inkubowane w pożywce do różnicowania neuronalnego uzupełnionej Noggin, bFGF i FGF-8 przez 2 dni, aby skierować komórki do linii neuronalnej. Małe EB można zaobserwować pod mikroskopem w 1. dniu różnicowania. Powinny unosić się w podłożu. Przenoszony PMEF można również znaleźć w 1. dniu różnicowania i należy go usunąć. Komórki te przylegają do naczyń bakteryjnych, więc są eliminowane, gdy EB są przenoszone do nowego naczynia bakteryjnego. Tak więc do 2 dnia różnicowania w naczyniu hodowlanym powinno być niewiele PMEF lub nie powinno być go wcale. W kroku 3 dalsze przenoszenie EB do nowych naczyń powinno zapewnić usunięcie wszelkich pozostałych PMEF. EB są hodowane w pożywkach różnicowania neuronów ruchowych (MND) uzupełnionych RA i SAG przez 5 dni w celu różnicowania komórek w neurony ruchowe. Podczas hodowli EB nadal rosną i można je zobaczyć gołym okiem w dniu różnicowania 3 ~ 4. Rycina 1C przedstawia mikroskopijny wygląd EB w 7 dniu różnicowania. W przeciwieństwie do komórek niezróżnicowanych, EB wykazują silną fluorescencję spowodowaną ekspresją GFP. Te EB są optymalnie zróżnicowane i są gotowe do dysocjacji. Cytometria przepływowa wykazała, że 51% ± 0,8% komórek z dysocjowanych EB zróżnicowało się w komórki wykazujące ekspresję GFP5. W kroku 5 hodowla tych neuronów ruchowych w obecności GDNF, CNTF, BDNF i NT3 powoduje wydłużenie długich projekcji aksonalnych. Rycina 1D przedstawia pojawienie się zróżnicowanych komórek 2 dni po posiewie zdysocjowanych EB. Zwróć uwagę na długie neuryty wystające z ciał komórkowych posianych komórek. Barwienie immunofluorescencyjne pokazuje, że komórki GFP + wyrażają marker panneuronalny (łańcuch neurofilament-medium) i dwa markery specyficzne dla neuronów ruchowych (Islet-1 i acetylotransferaza choliny, ryc. 2).
Rysunek 1. Różnicowanie komórek mES w neurony ruchowe (zdjęcie zmodyfikowane z Wu i wsp.5). A) Schemat protokołu różnicowania od komórek mES do neuronów ruchowych. B) Niezróżnicowane komórki mES tworzą okrągłe kolonie na wierzchu warstwy zasilającej fibroblasty. Mają słabą ekspresję GFP. C) Komórki mES oddzielono od warstw zasilających i hodowano na szalkach o niskim przyczepie w celu utworzenia EB. W ciągu pierwszych dwóch dni procesu różnicowania komórki były wystawione na działanie 50 ng/ml Noggin, 20 ng/ml bFGF i 20 ng/ml FGF-8. Następnie indukowano je do różnicowania za pomocą 1 μM kwasu retinowego i 1 μM agonisty sonika jeża SAG przez 5 dni. Zróżnicowane komórki mES wykazywały silną fluorescencję GFP. D) Po 7-dniowym różnicowaniu EB zdysocjowano i posiano na płytkach pokrytych poli-DL-ornityną/lamininą. Zróżnicowane komórki wydłużyły długie procesy neuronalne po 2 dniach w hodowli. Podziałka = 200 μm. MN = neuron ruchowy. B, C i D są obrazami jasnego pola, a B', C' i D' są odpowiadającymi im obrazami fluorescencyjnymi.
Rysunek 2. Charakterystyka neuronów ruchowych pochodzących z komórek mES. Barwienie immunofluorescencyjne dla średniego łańcucha neurofilamentu (NF-M, czerwony), ChAT (czerwony) i Islet-1 (czerwony) był zbieżny z ekspresją GFP (zielony). Do identyfikacji jąder użyto DAPI (niebieski). Podziałka = 50 μm.