Mycobacterium tuberculosis tworzy lekooporne biofilmy podczas hodowli w określonych warunkach. W niniejszej pracy opisujemy metody hodowli biofilmów M. tuberculosis oraz określania częstotliwości występowania lekoopornych form przetrwalnikowych (persisterów). Protokoły te będą przydatne w dalszych badaniach nad mechanizmami tolerancji leków u M. tuberculosis.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Wzrost biofilmu Mycobacterium tuberculosis
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Mycobacterium tuberculosis, czynnik etiologiczny gruźlicy u ludzi, posiada niezwykłą zdolność przetrwania w warunkach stresu środowiskowego, w tym w obecności antybiotyków. Chociaż odporność M. tuberculosis na stres jest prawdopodobnie jednym z czynników przyczyniających się do konieczności stosowania 6-miesięcznej chemioterapii gruźlicy 1, molekularne mechanizmy leżące u podstaw tego charakterystycznego fenotypu patogenu pozostają niejasne. Wiele gatunków mikroorganizmów wyewoluowało tak, aby przetrwać w stresujących środowiskach poprzez samoorganizację w wysoko uporządkowane, przytwierdzone do powierzchni i otoczone macierzą struktury nazywane biofilmem 2-4. Wzrost w formie społeczności wydaje się być preferowaną strategią przetrwania mikroorganizmów, co jest osiągane dzięki komponentom genetycznym regulującym przytwierdzanie do powierzchni, komunikację międzykomórkową oraz syntezę zewnątrzkomórkowych substancji polimerowych (EPS) 5,6. Tolerancja na stres środowiskowy jest prawdopodobnie ułatwiona przez EPS, a być może także przez adaptację fizjologiczną poszczególnych prątków do heterogenicznych mikrośrodowisk w obrębie złożonej architektury biofilmu 7.
W serii niedawnych prac wykazaliśmy, że M. tuberculosis oraz Mycobacterium smegmatis wykazują silną tendencję do wzrostu w zorganizowanych strukturach wielokomórkowych, zwanych biofilmem, które mogą tolerować stężenia ponad 50-krotnie wyższe od minimalnych stężeń hamujących dla leków przeciwprątkowych izoniazydy i rifampicyny 8-10. Co ciekawe, M. tuberculosis wymaga jednak specyficznych warunków do tworzenia dojrzałych biofilmów, w szczególności stosunku przestrzeni nad cieczą do pożywki wynoszącego 9:1, a także ograniczonej wymiany powietrza z atmosferą 9. Potrzeba wyspecjalizowanych warunków środowiskowych może być powiązana z faktem, że M. tuberculosis jest obligatoryjnym patogenem człowieka i w związku z tym przystosował się do środowiska tkankowego. W niniejszej publikacji prezentujemy metody hodowli biofilmów M. tuberculosis w butelkach oraz w formacie płytki 12-dołkowej, co jest wygodne zarówno w badaniach bakteriologicznych, jak i genetycznych. Opisaliśmy protokół dla osłabionego szczepu M. tuberculosis, mc27000, z delecją w dwóch loci, panCD i RD1, które są krytyczne dla wzrostu patogenu in vivo 9. Szczep ten może być bezpiecznie stosowany w warunkach BSL-2 w celu zrozumienia podstawowej biologii patogenu gruźlicy, co pozwala uniknąć konieczności korzystania z kosztownych zapleczy BSL-3. Metoda ta może zostać rozszerzona, poprzez odpowiednią modyfikację pożywek, na hodowlę biofilmów innych hodowlanych gatunków prątków.
Ogólnie rzecz biorąc, jednolity protokół hodowli biofilmu prątków pomoże badaczom zainteresowanym analizą podstawowych cech odporności prątków. Ponadto przejrzysta i zwięzła metoda hodowli biofilmu prątków pomoże również badaczom klinicznym i farmaceutycznym w testowaniu skuteczności potencjalnych leków.
Protokół
1. Hodowla biofilmu M. tuberculosis w butelce 250 mL z zakrętką
- Przygotowanie pożywki: Rozpuścić 0,5g KH2PO4, 0,5g MgSO4, 4g L-asparaginy, 2g kwasu cytrynowego, 0,05g cytrynianu amonu żelaza (III) oraz 60mL glicerolu w 900mL wody. Dostosować pH do wartości 7,0 za pomocą NaOH. Przeprowadzić autoklawowanie, schłodzić, a bezpośrednio przed rozpoczęciem eksperymentu dodać sterylny ZnSO4 do stężenia końcowego 0,1% w/v. Ponieważ mc27000 jest aukstrofem pantotenianowym, szczep ten wymaga również dodatku kwasu pantotenowego w stężeniu końcowym 10μg/mL.
Uwaga: Jest to standardowy skład pożywki Sautona stosowanej dla M. tuberculosis. Jeśli jednak jest to wymagane, do innych gatunków prątków można zastosować inne specjalistyczne pożywki.
- Przygotowanie inokulum: Hodować M. tuberculosis w podłożu 7H9OADC z dodatkiem 0,05% Tween-80 przez tydzień, aż do uzyskania OD600 na poziomie 0,7–1,0. Kulturę można bezpośrednio wykorzystać jako inokulum w rozcieńczeniu 1:100.
- Odmierzyć 25 mL pożywki Sautona do 250 mL polistyrenowej butelki z zakrętką (Corning). Dodać 250 μl inokulum do pożywki, szczelnie zakręcić butelkę i umieścić ją w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37°C na 3 tygodnie, nietruchając. Butelkę należy obserwować codziennie, aby upewnić się, że nie doszło do kontaminacji.
- Pod koniec trzeciego tygodnia poluzować zakrętkę butelki, aby umożliwić dalszy wzrost M. tuberculosis na granicy faz. Jeśli zakrętka nie zostanie poluzowana na tym etapie, niewystarczająca koncentracja tlenu w naczyniu zahamuje dalszy wzrost bakterii.
2. Wzrost biofilmu M. tuberculosis w płytkach 12-dołkowych
- Przygotować pożywkę oraz inokulum mc27000 zgodnie z opisem w sekcjach A1 i A2.
- Wymieszać 60mL pożywki z 600μl inokulum. Rozdzielić po 4,5mL mieszaniny do każdego dołka płytki. Przykryć płytkę pokrywką. Owinąć płytkę kilkukrotnie parafilmem. Inkubować płytkę bez zakłócania w inkubatorze z nawilżaniem w temperaturze 37°C przez 5 tygodni.
3. Określanie częstości występowania lekoopornych komórek persystujących w biofilmach M. tuberculosis
- Hodować biofilmy M. tuberculosis w formacie 12-dołkowym zgodnie z opisem w sekcji B. Cały proces potrwa około 5 tygodni.
- Po dojrzeniu biofilmów (po 5 tygodniach inkubacji) wstrzyknąć wybrany antybiotyk w pożądanym stężeniu do medium pod biofilmami, używając mikrokońcówki do pipety.
Uwaga: Objętość pożywki pod błonami biofilmu zmniejsza się do około 3,0 mL. W związku z tym badacze powinni odpowiednio obliczyć ilość leku.
- Delikatnie zakręć płytką, aby antybiotyk został dokładnie rozproszony w podłożu. W celu uzyskania statystycznie istotnych wyników, wstrzyknij antybiotyk do czterech dołków. Równolegle wstrzyknij taką samą objętość rozpuszczalnika, w którym rozpuszczono antybiotyk, do kolejnych czterech dołków, a ostatnie cztery dołki na płytce pozostaw nietknięte. Przykryj płytkę pokrywką i owiń brzegi płytki nowymi warstwami parafilmu. Umieść ją z powrotem w inkubatorze na pożądany czas.
- Po zakończeniu inkubacji otwórz płytkę i dodaj Tween-80 do stężenia końcowego 0,1% (objętościowo) w każdym z dołków. Delikatnie zakręć całą płytką, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie detergentu. Inkubuj płytkę w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Wymieszaj zawartość każdego dołka pipetą kilka razy, aby całą zawartość można było równomiernie przenieść do 15mL probówki stożkowej.
- Odwiruj zawartość probówki przy 4000rpm przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Resuspenduj osad w 5mL świeżego buforu do mycia (PBS z 10% glicerolem i 0,05% Tween-80). Powtórz proces mycia trzy razy. Resuspenduj osad w 5mL buforu do mycia. Przechowuj na rockerze przez noc w temperaturze 4°C.
Uwaga: Chociaż niska temperatura została pierwotnie opracowana dla M. smegmatis (aby zminimalizować jego wzrost podczas dyspersji) i stosowana również dla M. tuberculosis, gatunki wolnorosnące można najprawdopodobniej inkubować w wytrząsarkach w temperaturze pokojowej bez wpływu na wynik. Wytrząsanie w temperaturze pokojowej może być konieczne w przypadku pracy w laboratorium poziomu BSL-3.
- Przygotować sterylną strzykawkę z założoną mikrokońcówką (2-200μl), odcinając jej szeroki koniec do odpowiedniego rozmiaru, mocując ją do strzykawki i owijając parafilmem. Przenieść całą zawartość probówki za pomocą strzykawki z końcówką i zebrać do nowej probówki 15mL. Powtórzyć ten krok 5-6 razy, aż do uzyskania dość jednorodnej zawiesiny.
- Przygotować rozcieńczenia seryjne zawiesiny i wysiać je na płytki 7H11OADC, aby określić liczbę żywych kolonii w każdej próbce. Inkubować płytki przez trzy tygodnie w inkubatorze w temperaturze 37°C. Określić częstotliwość występowania persisterów w populacji biofilmu, obliczając stosunek liczby kolonii uzyskanych na płytkach traktowanych antybiotykiem do liczby kolonii na płytkach traktowanych rozpuszczalnikiem.
4. Reprezentatywne wyniki
W przypadku hodowli w butelce, wzrost M. tuberculosis można zaobserwować na dnie naczynia pod koniec pierwszego tygodnia. Pod koniec drugiego tygodnia widoczny jest punktowy wzrost bakterii na granicy fazy powietrze-medium, choć wzrost na tej granicy jest stale widoczny pod koniec trzeciego tygodnia (Rys. 1A). W tym czasie obserwuje się również przywieranie bakterii do ścianki pojemnika. Od tego momentu wzrost kultury odbywa się przede wszystkim na granicy fazy powietrze-medium. Ciecz pod powierzchnią wzrostu pozostaje klarowna. Zazwyczaj struktura ta dojrzewa pod koniec piątego tygodnia (Rys. 1B). Jeśli inkubacja zostanie przedłużona, struktury zaczną opadać na dno pojemnika. Co interesujące, szczelne zakręcenie korka do końca trzeciego tygodnia jest istotnym etapem procesu i z nieznanych przyczyn butelka z niedokręconym korkiem znacznie opóźnia inicjację wzrostu na granicy faz 9.
W formacie 12-dołkowym, pod koniec pięciu tygodni, w każdym z dołków widoczny jest trwały biofilm na granicy fazy powietrze-pożywka (Rys. 2A). Jeśli płytki nie zostaną całkowicie owinięte, obserwuje się zróżnicowany wzrost biofilmu. W najgorszym przypadku znaczne odparowanie pożywki może zahamować wzrost bakterii (Rys. 2B). Zatem owinięcie płytki jest niezbędne zarówno w celu zapobieżenia odparowaniu, jak i zapewnienia środowiska sprzyjającego tworzeniu się biofilmu (patrz poprzedni akapit).
Liczba żywotnych prątków w biofilmach wyznaczona tą techniką jest dość powtarzalna. Odpowiedź biofilmów M. tuberculosis różni się w zależności od rodzaju antybiotyków. W przypadku antybiotyku bakteriobójczego, takiego jak ryfampicyna, utrata żywotności wykazuje trend dwufazowy 9. Następuje szybki spadek żywotności w ciągu pierwszych trzech do czterech dni, po którym następuje faza persistencji, w której niewielki odsetek populacji pozostaje całkowicie oporny na antybiotyki, niezależnie od stężenia leku lub czasu ekspozycji. Rycina 3 przedstawia liczbę żywotnych prątków w dojrzałych biofilmach po 7-dniowej ekspozycji na 50μg/mL (50 razy więcej niż MIC) ryfampicyny.
Rysunek 1A. Wczesne pojawienie się prątków M. tuberculosis na granicy fazy powietrze-podłoże bakterii po 3 tygodniach inkubacji.
Rysunek 1B. Dojrzałe biofilmy M. tuberculosis na granicy fazy powietrze-pożywka po pięciu tygodniach inkubacji.
Rycina 2A. 5-tygodniowe biofilmy M. tuberculosis hodowane w formacie 12-dołkowym.
Rysunek 2B. Nieudana próba hodowli biofilmu M. tuberculosis w płytce 12-dołkowej bez zastosowania parafilmu.
Rycina 3. Reprezentatywny wykres przedstawiający częstość występowania tolerancyjnych na leki form przetrwalnikowych (persisters) w biofilmach M. tuberculosis hodowanych w formacie 12-dołkowym i eksponowanych na 50μg/mL ryfampicyny przez siedem dni.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Gruźlica (TB), wywołana zakażeniem Mycobacterium tuberculosis, pozostaje poważnym zagrożeniem dla zdrowia publicznego na świecie. Szacuje się, że niemal jedna trzecia populacji świata jest bezobjawowo zakażona tym patogenem; co roku w klinikach pojawia się około 9 milionów nowych przypadków z objawami aktywnej gruźlicy, a około 1,7 miliona osób umiera z powodu tej infekcji 11. Ogromne obciążenie wynikające z tej choroby jest spowodowane przede wszystkim brakiem szczepionki oraz niezwykle skomplikowaną...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie mamy nic do ujawnienia.
Podziękowania
Praca została zrealizowana przy wsparciu finansowym National Institute of Health oraz American Lung Association.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Inkubator | VWR international | Model # 1923/25 | |
| Polistyrenowe butelki hodowlane | Fisher Scientific | 03-374-300 | |
| 12-dołkowa płytka do hodowli tkankowych | VWR international | 62406-165 | |
| Probówki stożkowe 50 mL | VWR international | 89039-660 | |
| Wstrząsarka (rocker) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 57019-662 | |
| Lodówka chromatograficzna | VWR international | 55702-520 | |
| szalka Petriego | VWR international | 25384-342 | |
| KH2PO4 (jednopodstawkowy) | EMD Millipore | PX1565-1 | |
| MgSO4 | Fisher Scientific | M65-500 | |
| L-asparagina | Sigma-Aldrich | A4284-100G | |
| kwas cytrynowy | Sigma-Aldrich | C1857-100G | |
| cytrynian amonu(III) | Sigma-Aldrich | F5879-100G | |
| glicerol | EMD Millipore | GX0185-5 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S8045-500G | |
| ZnSO4 | Sigma-Aldrich | Z4750-500G | |
| kwas D-pantotenowy | Sigma-Aldrich | P2250-25G | |
| Pożywka Difco Middlebrook 7H9 | BD Biosciences | 271310 | |
| Suplement Middlebrook OADC | BBL | 212351 | |
| Tween-80 | Fisher Scientific | T164-500 | |
| butelka do przechowywania 250 mL | Corning | 430281 | |
| płytki 12-dołkowe | Falcon BD | 353043 | |
| ryfampicyna | Sigma-Aldrich | R3501-1G | |
| metanol | JT Baker | 9070-05 | |
| strzykawka 10 mL | BD Biosciences | 301604 | |
| końcówki do pipet 1-200μL | VWR international | 89079-458 | |
| Parafilm M | VWR international | PM-996 | |
| probówka wirówki 15 mL | Greiner Bio-One | 188-285 | |
| Agar Difco Mycobacteria 7H11 | BD Biosciences | 283810 | |
| NaCl | Fisher Scientific | BP358-1 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333-500G | |
| Na2HPO4 (dwupodstawkowy) | Sigma-Aldrich | S0876-500G |
Bibliografia
- Saltini, C. Chemotherapy and diagnosis of tuberculosis. Respir. Med. 100, 2085-2097 (2006).
- Hall-Stoodley, L., Stoodley, P. Biofilm formation and dispersal and the transmission of human pathogens. Trends Microbiol. 13, 7-10 (2005).
- Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections. Science. 284, 1318-1322 (1999).
- Blankenship, J. R., Mitchell, A. P. How to build a biofilm: a fungal perspective. Curr Opin Microbiol. 9, 588-594 (2006).
- Henke, J. M., Bassler, B. L. Bacterial social engagements. Trends Cell Biol. 14, 648-656 (2004).
- Kolter, R., Losick, R. One for all and all for one. Science. 280, 226-227 (1998).
- Branda, S. S., Vik, S., Friedman, L., Kolter, R. Biofilms: the matrix revisited. Trends Microbiol. 13, 20-26 (2005).
- Ojha, A. GroEL1: a dedicated chaperone involved in mycolic acid biosynthesis during biofilm formation in mycobacteria. Cell. 123, 861-873 (2005).
- Ojha, A. K. Growth of Mycobacterium tuberculosis biofilms containing free mycolic acids and harbouring drug-tolerant bacteria. Mol. Microbiol. 69, 164-174 (2008).
- Ojha, A. K., Trivelli, X., Guerardel, Y., Kremer, L., Hatfull, G. F. Enzymatic hydrolysis of trehalose dimycolate releases free mycolic acids during mycobacterial growth in biofilms. J. Biol. Chem. 285, 17380-17389 (2010).
- Dye, C., Lonnroth, K., Jaramillo, E., Williams, B. G., Raviglione, M. Trends in tuberculosis incidence and their determinants in 134 countries. Bull World Health Organ. 87, 683-691 (2009).
- Jindani, A., Dore, C. J., Mitchison, D. A. Bactericidal and sterilizing activities of antituberculosis drugs during the first 14 days. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 167, 1348-1354 (2003).
- Carter, G., Wu, M., Drummond, D. C., Bermudez, L. E. Characterization of biofilm formation by clinical isolates of Mycobacterium avium. J. Med. Microbiol. 52, 747-752 (2003).
- Hall-Stoodley, L., Lappin-Scott, H. Biofilm formation by the rapidly growing mycobacterial species Mycobacterium fortuitum. FEMS Microbiol. Lett. 168, 77-84 (1998).
- Alibaud, L. Temperature-dependent regulation of mycolic acid cyclopropanation in saprophytic mycobacteria: role of the Mycobacterium smegmatis 1351 gene (MSMEG_1351) in CIS-cyclopropanation of alpha-mycolates. J. Biol. Chem. 285, 21698-21707 (2010).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
