Oznaczanie liczby komórek ssaczych, wielkości komórek i stanu zdrowia komórek przy użyciu automatycznego licznika komórek Moxi Z Mini

Podsumowanie

Miniaturowy automatyczny licznik komórek Moxi Z to nowoczesny instrument, który łączy zasadę Coultera z opatentowaną technologią cienkowarstwowych czujników oraz autorskim algorytmem oprogramowania, aby umożliwić pomiar rozmiaru i zliczanie cząstek z szerokiego zakresu wielkości, a także ocenę ogólnego stanu hodowli monodyspersyjnych komórek ssaków. Niniejszy protokół opisuje zastosowanie tego urządzenia do zliczania i oceny kondycji hodowli komórkowych.

Streszczenie

Zliczanie cząstek i komórek jest wykorzystywane w wielu zastosowaniach, w tym w rutynowych hodowlach komórkowych, analizach hematologicznych i kontrolach przemysłowych^1-5. Kluczowym przełomem w technologiach zliczania komórek i cząstek było opracowanie ponad 50 lat temu metody Coultera przez Wallace'a Coultera. Technika ta polega na przyłożeniu pola elektrycznego w poprzek apertury o rozmiarze mikronowym i hydrodynamicznym ogniskowaniu pojedynczych cząstek przechodzących przez tę aperturę. Wynikająca z tego okluzja apertury przez cząstki powoduje mierzalną zmianę impedancji elektrycznej, którą można bezpośrednio i precyzyjnie skorelować z rozmiarem lub objętością komórki. Uznanie tego podejścia za punkt odniesienia w zliczaniu komórek i cząstek wynika z nadzwyczajnej precyzji i dokładności pomiarów wielkości oraz liczby cząstek, szczególnie w porównaniu z technologiami manualnymi i opartymi na obrazowaniu (dokładność rzędu 98% dla liczników Coultera w przeciwieństwie do 75-80% dla systemów manualnych i wizyjnych). Można to przypisać faktowi, że w przeciwieństwie do metod zliczania komórek opartych na obrazowaniu, metoda Coultera wykonuje rzeczywisty trójwymiarowy (3-D) pomiar komórek/cząstek, co drastycznie zmniejsza zakłócenia zliczania przez zanieczyszczenia i aglomeraty dzięki obliczaniu precyzyjnych informacji o objętości komórek/cząstek. Ogólnie rzecz biorąc, zapewnia to sposób enumeracji i pomiaru wielkości komórek w sposób bardziej dokładny, mniej żmudny, mniej czasochłonny i mniej subiektywny niż w przypadku innych technik zliczania⁶.

Mimo znaczenia techniki Coultera w liczeniu komórek, jej powszechne zastosowanie w rutynowych badaniach biologicznych było ograniczone ze względu na koszt i rozmiary tradycyjnych instrumentów. Chociaż opracowano tańsze urządzenie oparte na zasadzie Coultera, posiada ono ograniczenia w porównaniu z droższymi odpowiednikami w zakresie korekcji tzw. „zdarzeń koincydencji”, podczas których dwie lub więcej komórek przechodzi przez otwór i jest mierzonych jednocześnie. Kolejnym ograniczeniem istniejących technologii Coultera jest brak wskaźników dotyczących ogólnego stanu zdrowia próbek komórkowych. W konsekwencji, w celu oceny żywotności komórek często konieczne jest stosowanie dodatkowych technik wraz z liczeniem metodą Coultera. Wydłuża to czas przygotowania eksperymentu i zwiększa jego koszty, ponieważ tradycyjne metody oceny żywotności wymagają barwienia komórek i/lub użycia drogiego i nieporęcznego sprzętu, takiego jak cytometr przepływowy.

Opisany tutaj mini automatyczny licznik komórek Moxi Z to ultra-kompaktowy instrument laboratoryjny, który łączy dokładność zasady Coultera z technologią czujników cienkowarstwowych, umożliwiając precyzyjne określanie wielkości i liczby cząstek w zakresie od 3-25 mikronów, w zależności od zastosowanej kasety do liczenia komórek. Kaseta typu M może być wykorzystywana do liczenia cząstek o średnich średnicach od 4 - 25 mikronów (zakres dynamiczny 2 - 34 mikrony), natomiast kaseta typu S może być stosowana do liczenia cząstek o średniej średnicy od 3 - 20 mikronów (zakres dynamiczny 2 - 26 mikrony). Ponieważ system wykorzystuje metodę pomiaru objętościowego, zakres 4-25 mikronów odpowiada zakresowi objętości komórek od 34 - 8 180 fL, a zakres 3 - 20 mikronów odpowiada zakresowi objętości komórek od 14 - 4200 fL, co ma znaczenie przy pomiarze cząstek niesferycznych. Aby przeprowadzić zliczanie komórek ssaczych za pomocą Moxi Z, komórki przeznaczone do zliczenia należy najpierw rozcieńczyć za pomocą ORFLO lub podobnego rozcieńczalnika. Kaseta do liczenia komórek jest wkładana do instrumentu, a próbka jest wprowadzana do portu kasety. Tysiące komórek przechodzi pojedynczo przez „strefę wykrywania komórek” (CSZ) w membranie cienkowarstwowej w czasie od 8-15 sekund. Po zakończeniu pomiaru instrument wykorzystuje autorski dopasowanie krzywej w połączeniu z autorskim algorytmem oprogramowania w celu korekcji zdarzeń koincydencyjnych oraz oceny ogólnego stanu kondycji hodowli poprzez wyznaczenie stosunku liczby komórek w populacji docelowej do całkowitej liczby cząstek. Całkowita liczba cząstek obejmuje skurczone i rozpadnięte martwe komórki, a także inne szczątki i zanieczyszczenia. Wyniki są prezentowane w formie histogramu z automatycznym dopasowaniem krzywej oraz bramkami, które w razie potrzeby można dostosować ręcznie.

W ostatecznym rozrachunku Moxi Z umożliwia liczenie z precyzją i dokładnością porównywalną do Coulter Z2, który obecnie stanowi złoty standard, zapewniając jednocześnie dodatkowe informacje o kondycji hodowli. Co więcej, urządzenie to osiąga te wyniki w krótszym czasie, zajmuje mniej miejsca, charakteryzuje się znacznie łatwiejszą obsługą i konserwacją oraz generuje ułamek kosztów technologii porównywalnych.

Protokół

1. Przygotowanie próbek

1. Rozcieńcz zawiesinę komórkową rozcieńczalnikiem ORFLO lub innym odpowiednim rozcieńczalnikiem tak, aby stężenie komórek mieściło się w zakresie roboczym urządzenia (od 3 000 do 500 000 komórek/mL dla kasety typu M lub od 3 000 do 2 500 000 komórek/mL dla kasety typu S).
2. Dla większości linii komórek ssaczych zaleca się rozcieńczenie od 1:5 do 1:20 (kaseta typu M) lub brak rozcieńczenia do rozcieńczenia 1:5 (kaseta typu S), jednak odpowiedni stopień rozcieńczenia zależy od rodzaju komórek i gęstości zasiewu. Objętość wymagana do dokładnego przeliczenia wynosi około 75 μL.

2. Analiza próbek

1. Włącz urządzenie Moxi Z, naciskając przycisk zasilania, aż pojawi się ekran Home.
2. Naciśnij tackę i włóż kasetę do urządzenia Moxi Z. Wyświetlony zostanie ekran Pipette 75μL Sample... .
3. Pipetuj 75 μL próbki do otworu wlewu kasety (niebieski owal z oznaczeniem 1 lub 2, w zależności od tego, która strona kasety została włożona do urządzenia). Są to kasety jednorazowe, które można wykorzystać do 2 testów. Uwaga: Umieść końcówkę pipety bezpośrednio w otworze załadowania pod kątem ok. 45°, tak aby końcówka znalazła się pod przednią krawędzią otworu. Podczas dozowania ważne jest, aby podciśnienie nie "wyprzedziło" przepływu cieczy, co mogłoby spowodować dostanie się pęcherzyków powietrza do kasety. Zaleca się, aby podczas dozowania nad otworem utworzył się niewielki wypukły kropel cieczy (wielkości otworu wlotowego).
4. Aby zliczyć większość komórek ssaków, dotknij ekranu w dowolnym miejscu, aby rozpocząć. Do liczenia bardzo małych cząsteczek (średnica średnia od 4 do 8 μm dla typu M oraz 3-8 μm dla typu S), Moxi Z może pracować w trybie Small Particle Mode. Uwaga: typ kasety jest wskazany na czarnym pasku u góry ekranu. W tym trybie Moxi Z ustawia domyślną skalę średnic od 2 do 10 μm i wykonuje pomiar przy użyciu zoptymalizowanych parametrów wykrywania małych komórek. Naciśnij przycisk TOUCH HERE Small Particle Mode (czarny kwadrat), aby zainicjować test i uruchomić pracę w tym trybie.
5. Moxi Z rozpocznie test, a wyniki liczenia komórek zostaną uzyskane w ciągu około 8 sekund (kaseta typu M) lub 15 sekund (kaseta typu S).
6. Obliczenia dopasowania krzywej (Curve Fitting) oraz MVI rozpoczynają się automatycznie i wymagają jedynie kilku dodatkowych sekund. Po znalezieniu odpowiedniego dopasowania wyniki zostaną automatycznie wyświetlone na ekranie.
7. Aby ustawić Gating jako domyślny tryb akwizycji, naciśnij przycisk Curve Fit Count, aby przełączyć urządzenie w tryb Gating.
8. W tym momencie kasetę można wyjąć z urządzenia.

3. Zarządzanie danymi

1. Jeśli skalowanie w trybie AutoMode jest wyłączone, wyniki są początkowo wyświetlane dla liczby dopasowań krzywej w skali średnicy 2-34 μm (kaseta typu M) lub 2-26 μm (kaseta typu S). Jeśli skalowanie w trybie Automode jest włączone, urządzenie Moxi Z automatycznie dostosuje skalę osi poziomej (osi x) do zakresu najbliższego szerokości populacji dopasowanej do krzywej, zapewniając jednocześnie wyświetlenie wszystkich danych dopasowania.
2. Jeśli skalowanie w trybie AutoMode jest wyłączone, aby ręcznie wyświetlić wyniki w wyższej rozdzielczości, dotknij ikony 2-26 μm (typ M) lub ikony 2-18 μm (typ S). Uwaga: Typ kasety jest wskazany w niebieskim polu w lewym górnym rogu ekranu. Jest to zalecane podczas liczenia mniejszych komórek lub cząstek, aby poprawić zarówno możliwości dopasowania krzywej, jak i zdolność użytkownika do wizualnego rozróżniania niuansów w danych.
3. Po zwiększeniu rozdzielczości poziomej przycisk skalowania dynamicznie dostosuje się, umożliwiając przełączanie między dostępnymi zakresami skali osi x: 2-34, 2-26, 2-18 i 2-10 μm dla kasety typu M lub 2-26, 2-18 i 2-10 μm dla kasety typu S. Funkcja ta jest dostępna wyłącznie bezpośrednio po wykonaniu pomiaru liczby komórek.
4. Informacje o liczbie komórek (cells/ml) dla regionu dopasowania krzywej lub obszaru bramkowania są wyświetlane w czarnym polu pod lewą stroną histogramu. Informacje o średniej wielkości komórek są wyświetlane w czarnym polu pod prawą stroną histogramu.
5. Wartość MVI jest wyświetlana w niebieskim polu w prawym górnym rogu histogramu. Jeśli test został przeprowadzony w trybie małych cząstek, MVI nie ma zastosowania i zostanie wyświetlony komunikat „MVI=SPM”. Dodatkowo, jeśli stężenie komórek wykracza poza zakres pracy MVI, wyświetlony zostanie komunikat „MVI=Out of Range”.
6. Aby zapisać aktualny histogram, dotknij ikony Done. Dane zostaną zapisane pod nazwą „Test XXX”, gdzie XXX to odpowiadający im numer testu.
7. Aby ręcznie bramkować histogram, dotknij przycisku wyników liczby dopasowań krzywej (Curve Fit), aby go przełączyć. Sprawi to, że Gating (bramkowanie) stanie się domyślnym trybem akwizycji. Następnie przesuń każdy niebieski marker bramkujący, aby ustawić bramki, lub dotknij strzałek lewej i prawej (pojawiają się po dotknięciu niebieskiego markera bramkującego), aby precyzyjnie dostosować bramki. Liczone są tylko komórki znajdujące się pomiędzy markerami. Pionowa skala histogramu jest automatycznie skalowana na podstawie amplitudy populacji dopasowanej do krzywej. Aby dostosować tę skalę pionową, przesuń ekran w górę lub w dół w obszarze histogramu.
8. Dotknij przycisku wyników liczby bramkowanej (Gated Count), aby przywrócić tryb dopasowania krzywej i uczynić go domyślnym trybem akwizycji.
9. Następnie naciśnij ikonę Done, aby zapisać wyniki i powrócić do ekranu głównego (Home). Aby usunąć wyniki, naciśnij w dowolnym momencie ikonę Delete, aby trwale usunąć wyniki testu.

4. Analiza wcześniej pozyskanych danych

1. Aby otworzyć zapisany test, naciśnij ikonę Histogram na ekranie Home.
2. Na ekranie wyświetlą się ikony do dziewięciu zapisanych histogramów. Naciśnij odpowiednią ikonę dla interesującego testu lub naciśnij ikony Page Up lub Page Down, aby wyświetlić więcej wyników testów.
3. Każdy histogram zostanie otwarty w trybie Curve Fit Count lub Gated Count, w zależności od sposobu jego zapisania. W trybie Gated Count markery bramkowania można ustawić w pożądany sposób, przesuwając każdy niebieski marker bramkowania niezależnie. Funkcję Auto Gate aktywuje się poprzez dotknięcie pożądanego piku. Dotknij ekranu, aby prze przełączyć się między trybami Gated Count a Curve Fit Count.
4. Naciśnij ikony Zoom oraz Unzoom, aby dostosować skalę pionową histogramu. Skalę pionową można również zmienić, przesuwając palcem po wyświetlaczu w górę (aby zwiększyć) lub w dół (aby zmniejszyć).
5. Naciśnij ikonę Delete, aby trwale usunąć wyniki testu.
6. Naciśnij ikonę Done, aby zamknąć wyniki testu i powrócić do ekranu Home. (Uwaga: powiększony widok nie zostanie zapisany).

5. Przesyłanie danych do komputera PC

1. Dane można przesłać do komputera PC za pomocą aplikacji Orflo Moxichart lub poprzez transfer USB, podłączając kabel USB urządzenia Moxi Z do komputera PC lub Mac. W przypadku transferu przez Bluetooth (MoxiChart), najpierw należy ustalić identyfikator Bluetooth urządzenia, naciskając ikonę Bluetooth na ekranie Home urządzenia Moxi Z.
2. Na komputerze należy otworzyć aplikację MoxiChart i kliknąć ikonę Bluetooth w prawym górnym rogu. Następnie należy wybrać urządzenie odpowiadające identyfikatorowi Bluetooth Moxi Z oraz wskazać folder docelowy dla przesyłanych plików.
3. Moxichart automatycznie prześle wszystkie pliki do wskazanego katalogu za pomocą połączenia Bluetooth.
4. Pliki przesłane przez Bluetooth (MoxiChart) lub USB można otwierać i analizować bezpośrednio w aplikacji MoxiChart lub, ponieważ są to pliki w formacie .csv, można je otwierać bezpośrednio w programie Microsoft Excel lub innych programach do analizy danych w celu przeprowadzenia dodatkowej lub niestandardowej analizy.

6. Reprezentatywne wyniki

Aby ocenić precyzję i dokładność urządzenia Moxi Z, zliczono komórki HEK-293, HeLa, CHO-K1, drożdże, komórki Jurkat E6-1, komórki PC12 oraz precyzyjnie skalibrowane zawiesiny kulek w stężeniach od 0-500 000 cells/mL (kaseta typu M) oraz 0-2-2,5e⁶ cells/ml (kaseta typu S), a następnie porównano wyniki uzyskane za pomocą Coulter Z2 oraz Moxi Z. Wszystkie komórki ssacze pozyskano z American Type Culture Collection (ATCC) i hodowano zgodnie z wcześniejszymi opisami^7-11. W skrócie, komórki hodowano w zawiesinie w kolbach do hodowli tkankowej o powierzchni 75 mm² w podstawowych pożywkach RPMI 1640 (Jurkat E6-1, PC12), MEM (HEK-293, HeLa) lub F12K (CHO-K1). Wszystkie pożywki uzupełniono o 10% płodowej surowicy bydlęcej oraz 100 U penicyliny/100 μg streptomycyny. Kolby utrzymywano w inkubatorze w temperaturze 37 °C przy 5% CO₂. Pasażowanie komórek przeprowadzano co 3 dni. Komórki drożdży (X5, C. albicans, Vin 13) zostały przekazane i użyte natychmiast po otrzymaniu. Początkowe stężenia próbek wynoszące ~500 000 cells/ml dla danych z kasety typu M oraz ~2-2,5e⁶ cells/ml dla kasety typu S ustalono za pomocą Coulter Z2. Następne teoretyczne poziomy stężeń przygotowano poprzez rozcieńczenia seryjne w buforach fizjologicznych (Isoton II lub zrównoważony roztwór soli Hanksa). Dla każdego stężenia identyczne próbki mierzono oboma systemami, a wyniki naniesiono na wykres korelacji. Jak widać na Rysunku 2, wystąpiła silna korelacja liniowa (typ M r²>0,9886, typ S r²>0,9781) między liczbami komórek dla wszystkich próbek. Stężenia porównano również z oczekiwanymi/teoretycznymi stężeniami komórek zarówno dla Moxi Z, jak i Z2 (Rysunek 3), co ponownie wykazało silne korelacje liniowe (typ M r²>0,9758, typ S r²>0,9774).

Aby ocenić precyzję, przeprowadzono zliczenia komórek HEK-293 i HeLa przy użyciu analizatorów Coulter Z2, Moxi Z oraz komory licznikowej (hemocytometru). Obliczono średni współczynnik zmienności (CV, n=19) dla zliczeń komórek przy użyciu Moxi Z (kaseta typu M), Coulter Z2 oraz hemocytometru, przyjmując wartości CV zmierzone w 5 oddzielnych zliczeniach w zakresie 200 000-300 000 komórek/ml. Mały średni CV (Rycina 4) w przypadku Moxi Z jest porównywalny z wynikiem dla Z2 i reprezentuje wysoki poziom precyzji, który jest osiągalny wyłącznie dzięki technologiom zliczania opartym na zasadzie Coultera.

Następnie oceniono precyzję pomiaru wielkości cząstek urządzenia Moxi Z poprzez pomiar zakupionych, precyzyjnie skalibrowanych kulek polistyrenowych. Średnie pomiary wielkości cząstek (n=5) wykonane za pomocą Moxi Z przedstawiono na wykresie w zestawieniu z rozmiarami podanymi przez producenta. Jak widać na Rysunku 5, pomiary Moxi Z były spójne z wartościami producenta i wykazały wysoką korelację liniową (r²=0.9989).

Poza informacjami o rozmiarze i liczbie, Moxi Z zapewnia bezodczynnikową, ogólną ocenę stanu zdrowia hodowli komórek ssaków za pomocą raportowanej wartości indeksu żywotności Moxi (MVI). Indeks ten jest generowany na podstawie stosunku liczby komórek w badanej populacji do całkowitej liczby cząstek. Aby zademonstrować możliwości pomiaru MVI, odczyty MVI (kaseta typu M) porównano ze standardowymi ręcznymi oraz przepływowymi technikami pomiaru żywotności komórek (live/dead). Populacje martwych (<10% żywotnych) komórek HEK-293 i HeLa uzyskano poprzez inkubację żywych komórek przez noc w rozcieńczalniku pozbawionym składników odżywczych, zawierającym fluorek sodu (Isoton II, Beckman Coulter) w temperaturze 37 °C. Kontrolowane teoretyczne poziomy żywotności przygotowano poprzez ratiometryczne mieszanie znanych stężeń komórek żywych i martwych. Uzyskane roztwory analizowano pod kątem poziomów żywotności w dubletach, wykorzystując zarówno zliczenia w hemocytometrze, jak i pomiary w cytometrze przepływowym. Pomiary hemocytometrem przeprowadzono przy użyciu tradycyjnej mieszaniny 50/50 0,1% roztworu błękitu trypanu oraz komórek. Pomiary cytometrii przepływowej wykonano za pomocą cytometru Guava PCA (Merck) z zastosowaniem odczynnika Viacount oraz protokołu określonego przez producenta (Merck). Jak pokazano na Rysunku 6, wartości współczynnika korelacji Pearsona (r²) „dopasowania liniowego danych MVI do analogicznych procentów żywotności z hemocytometru dla” komórek HEK i komórek HeLa wyniosły odpowiednio r²=0,9937 i r²=0,9728. Wyniki te dowodzą, że podejście to dostarcza informacji o stanie zdrowia hodowli w szerokim zakresie żywotności komórek, co wypada korzystnie w porównaniu do pomiarów żywotności uzyskanych za pomocą cytometru przepływowego lub hemocytometru.

Tabele i rysunki (na podstawie Dittami et al., 2011)¹⁵:

Rycina 1. Liczenie metodą Coultera w cienkiej warstwie: Prąd elektryczny przepływa przez strefę detekcji komórek (CSZ) kasety z cienkiej warstwy. Gdy komórki przepływają pojedynczo przez CSZ, urządzenie Moxi Z mierzy chwilowe wzrosty napięcia.

Rycina 2. Wyniki zliczania w urządzeniu Moxi Z są porównywalne z wynikami z urządzenia Coulter Z2. Identyczne zawiesiny komórek i kulek zliczono przy użyciu zarówno Coulter Z2, jak i Moxi Z. Średnie wartości zliczeń (n=3-4) z Moxi Z naniesiono na wykres w odniesieniu do odpowiadających im zliczeń z Coulter Z2 i wyznaczono wartości r² dla dopasowania liniowego. A) Kaseta typu M – zakres stężeń 0 - 500 000 komórek/ml. B) Kaseta typu S – zakres stężeń 0 - 2-2,5e⁶/ml. Słupki błędów oznaczają ± 1 odchylenie standardowe.

Rysunek 3. Pomiary stężenia Moxi Z w stosunku do teoretycznych stężeń komórek. A) Kaseta typu M - Wartości stężenia teoretycznego przygotowano z rozcieńczeń seryjnych początkowej próbki o stężeniu 500,000 cells/ml. B) Kaseta typu S - Wartości stężenia teoretycznego przygotowano z rozcieńczeń seryjnych początkowej próbki o stężeniu 2 - 2.5e⁶ cells/ml. Słupki błędów oznaczają ± 1 odchylenie standardowe.

Rycina 4. Współczynnik zmienności dla Coulter Z2, Moxi Z (kaseta typu M) oraz komory countingowej.Średni współczynnik zmienności (CV, n=19) dla liczby komórek HEK-293 i HeLa dla każdej metody został obliczony na podstawie wartości CV zmierzonych z 5 oddzielnych pomiarów komórek HEK-293 i HeLa w zakresie 200 000–300 000 komórek/ml. Słupki błędów wskazują ± 1 odchylenie standardowe.

Rycina 5. Precyzja pomiarów rozmiaru cząstek za pomocą Moxi Z- Rozmiar kulek zmierzony przez Moxi Z (kaseta typu M) w stosunku do rozmiaru kulek podanego przez producenta. Słupki błędów wskazują ± 1 odchylenie standardowe.

Rycina 6. Ocena stanu zdrowia kultury za pomocą MVI - Porównanie pomiarów MVI (kaseta typu M) oraz żywotności metodą Guava PCA Viacount w stosunku do wizualnych pomiarów żywotności przy użyciu barwienia błękitem trypanowym i komory countingowej.

Dyskusja

Sposób implementacji metody Coultera może w znacznym stopniu determinować ogólną dokładność pomiarów. Krytycznym obszarem jest korekta surowych wyników zliczania komórek o tzw. „zdarzenia koincydencji” (coincidence events), w których dwie lub więcej komórek przechodzi jednocześnie przez otwór i zostaje zmierzone jako pojedynczy impuls elektryczny. „Zdarzenia koincydencji” przyczyniają się do błędu, który zmienia się w zależności od wielu czynników, w tym od wielkości komórek i stopnia ich agregacji (Davis et al 1967)⁶. W rezultacie wymagana korekta koincydencji dla danej próbki nie może zostać przewidziana, gdyż znacząco różni się ona w zależności od rodzaju komórek/cząstek, a nawet między różnymi kulturami tych samych typów komórek. Ugruntowana teoria, oparta na pierwszych publikacjach Coultera, zakłada zastosowanie logarytmicznej korekty surowych zliczeń na podstawie liczby zaobserwowanych zdarzeń oraz empirycznie wyznaczonego, specyficznego dla danej cząstki współczynnika korekcji z. Choć za pomocą tego algorytmu korekcyjnego można uzyskać dokładne zliczenia, jego praktyczna zastosowalność jest ograniczona ze względu na duże różnice w wartościach z między typami komórek i wynikającą z tego trudność w precyzyjnym przewidzeniu tej wartości. W tym przypadku, wykorzystując „prawdziwą” liczbę komórek zidentyfikowaną przez dopasowanie krzywej Moxi Z w połączeniu z algorytmem korekcji koincydencji, urządzenie Moxi Z dynamicznie koryguje koincydencję w celu uzyskania rzeczywistych stężeń. W porównaniu z wynikami uzyskanymi za pomocą zaawansowanego systemu Coulter Z2, Moxi Z dostarczył porównywalnych zliczeń w zakresie stężeń od 0 do 500 000 cells/ml (kaseta typu M) oraz od 3 000 do 2-2.5e⁶ cells/ml (kaseta typu S). Co więcej, Moxi Z osiąga tę dokładność zliczania przy podobnie niskim współczynniku zmienności oraz precyzji pomiaru wielkości cząstek, która jest charakterystyczna dla złotego standardu w zliczaniu komórek, jakim jest technika Coultera.

Co więcej, przedstawione tutaj dane wskazują, że Moxi Z może dostarczyć cennych informacji na temat ogólnego stanu hodowli komórkowych. Moxi Z wykorzystuje metodę dopasowania krzywej z autorskim algorytmem oprogramowania do przeprowadzenia tej oceny stanu hodowli. Zmiany morfologiczne związane z śmiercią komórek, takie jak pęcherzykowanie (blebbing), fragmentacja i zniekształcenia objętościowe (Kataoka and Tsuruo 1996, Liegler et al 1995, Sheridan et al 1981)^12-14, umożliwiają urządzeniu Moxi-Z rozróżnienie różnic impedencyjnych między populacjami żywych komórek a populacjami martwych komórek i debris. MVI jest generowany poprzez analizę rozkładu wielkości kultur/cząstek w celu zidentyfikowania względnego udziału debris, skurczonych komórek nekrotycznych oraz dopasowanej do krzywej populacji komórek będącej przedmiotem zainteresowania. Wartość MVI odzwierciedla zatem indeks populacyjny lub miarę ratiometryczną liczebności populacji monodyspersyjnej w stosunku do ogólnego profilu populacji cząstek. Wartość ta jest następnie korygowana algorytmicznie na podstawie statystyk populacyjnych i obserwacji empirycznych. Ponieważ MVI analizuje parametry inne niż tradycyjne metody barwienia, nie oczekuje się, że będzie on odzwierciedlał wyniki tych technik, lecz stanowi wartościową alternatywną perspektywę oceny stanu hodowli komórkowej, szczególnie w odniesieniu do debris i zanieczyszczeń mikrobiologicznych.

Podsumowując, licznik komórek Moxi-Z to ultra małe urządzenie laboratoryjne, które umożliwia precyzyjne i powtarzalne pomiary liczby, wielkości oraz kondycji komórek, wykorzystując zasadę Coultera i algorytmy dopasowywania krzywych w połączeniu z opatentowaną technologią cienkowarstwowych czujników. Dzięki zastosowaniu kasety typu M urządzenie pozwala na zliczanie cząstek o średnicy od 4 do 25 mikronów (zakres dynamiczny od 2 do 34 mikronów) w czasie 8 sekund. Z kasetą typu S umożliwia zliczanie cząstek o średnicy od 3 do 20 mikronów (zakres dynamiczny od 2 do 26 mikronów) w czasie 15 sekund. Ponadto Moxi-Z wykonuje oceny stanu zdrowia komórek bez użycia odczynników. Metoda ta jest znacznie mniej pracochłonna i mniej subiektywna niż zliczanie ręczne. W porównaniu do standardowego zliczania metodą Coultera, Moxi jest szybsze, znacznie mniejsze, dostarcza więcej informacji, wymaga znacznie mniejszej konserwacji, jest łatwiejsze w obsłudze i stanowi jedynie ułamek kosztów.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Rozcieńczalnik ORFLO	ORFLO	MXA006
Dozownik kasety	ORFLO		Przechowuje do 25 kaset w celu wygodnego dozowania
Kabel USB	ORFLO		Łączy instrument z komputerem PC/Mac lub adapterem zasilania
Adapter zasilania (tylko modele US i EU)	ORFLO		Łączy kabel USB z gniazdem zasilania AC
Dysk USB	ORFLO		Przechowuje oprogramowanie Moxi Z i instrukcję obsługi
Kulek do kontroli kalibracji	ORFLO
Elektroniczna kaseta kalibracyjna	ORFLO		Elektroniczna kaseta do weryfikacji prawidłowego działania i kalibracji systemu