Artykuł metodologiczny

Wizualizacja proprioceptorów w larwach i poczwarkach Drosophila

13.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/3846

⸱

13 czerwca 2012

 ,  , 
1Department of Genetics and the Rappaport Institute for Research in the Medical Sciences, Rappaport Faculty of Medicine, Technion-Israel Institute of Technology

W tym artykule

Podsumowanie

Opisano metodę immunobarwienia i wizualizacji organów chordotonalnych w larwach i poczwarkach Drosophila melanogaster.

Streszczenie

Propriocepcja to zdolność wyczuwania ruchu lub położenia części ciała poprzez reagowanie na bodźce powstające wewnątrz organizmu. U muszek owocowych i innych owadów propriocepcję zapewniają wyspecjalizowane organy sensoryczne nazywane organami chordotonalnymi (ChOs) 2. Podobnie jak wiele innych organów u Drosophila, ChOs rozwijają się dwukrotnie w cyklu życiowym muchy. Najpierw larwalne ChOs rozwijają się podczas embriogenezy. Następnie dorosłe ChOs zaczynają rozwijać się w larwalnych tarczach imaginalnych i nadal różnicują się podczas metamorfozy.

Rozwój larwalnych ChO podczas embriogenezy był przedmiotem licznych badań 10,11,13,15,16. Centralnym elementem każdego ChO jest jednostka sensoryczna składająca się z neuronu i komórki skolopalnej. Jednostka sensoryczna jest rozciągnięta pomiędzy dwoma typami komórek akcesoryjnych, które przylegają do kutykuli za pomocą wyspecjalizowanych komórek przyczepu epidermalnego 1,9,14. Podczas ruchu larwy muchy względne przemieszczenie komórek przyczepu epidermalnego prowadzi do rozciągnięcia jednostki sensorycznej i w konsekwencji do otwarcia specyficznych kanałów potencjału przejściowego waniloidowego (TRPV) w segmencie zewnętrznym dendrytu 8,12. Wywołany sygnał jest następnie przekazywany do obwodu centralnego generatora wzorców lokomocyjnych w ośrodkowym układzie nerwowym.

U dorosłej muchy opisano wiele ChO 7. Znajdują się one w pobliżu stawów wyrostków dorosłej muchy (nóg, skrzydeł i halterów) oraz w klatce piersiowej i odwłoku. Ponadto kilkaset ChO wspólnie tworzy organ Johnston'a w czułku dorosłego osobnika, który przekształca energię akustyczną w mechaniczną 3,5,17,4.

W przeciwieństwie do rozległej wiedzy na temat rozwoju ChO w stadiach embrionalnych, bardzo niewiele wiadomo o morfologii tych organów w stadiach larwalnych. Co więcej, z wyjątkiem ChO udowych 18 oraz organu Johnstona, nasza wiedza na temat rozwoju i struktury ChO u dorosłej muchy jest bardzo fragmentaryczna.

W niniejszym opracowaniu opisujemy metodę barwienia i wizualizacji ChO u larw trzeciego stadium oraz u poczwarek. Metodę tę można stosować w połączeniu z narzędziami genetycznymi, aby lepiej scharakteryzować morfologię i zrozumieć rozwój różnych ChO u muchy.

Protokół

Przed rozpoczęciem

  1. Hoduj pożądane kultury much. Dbaj o to, aby w fiolkach nie było zbyt dużego zagęszczenia (około 30 much na fiolkę 50 ml). Pozostaw muchy do składania jaj w każdej fiolce tylko przez jeden dzień. Zapewni to larwom wystarczającą ilość pokarmu i pozwoli im osiągnąć maksymalny rozmiar przed opuszczeniem podłoża. Przechowuj fiolki w odpowiedniej temperaturze do momentu, gdy larwy trzeciego stadium zaczną wędrować po ściankach fiolki.
  2. Przygotuj świeży zapas soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS) oraz PBT (0,1% Tween w PBS). Przechowuj 10 ml PBS w lodzie.
  3. Przygotuj 1-5 ml świeżego utrwalacza (4% formaldehydu w PBT) i przechowuj go w lodzie. Jako roztwór zapasowy stosujemy butelkowany formaldehyd 37-38%.

1. Disekcja i utrwalenie larw trzeciego stadium rozwojowego

  1. Wybrać wędrującą larvę trzeciego stadium z ścianki fiolki i umieścić ją w 50 μl kropli lodowatego PBS na płytce do sekcji Sylgard (wykonanej z zestawu elastomeru silikonowego Sylgard 184, DOW Corning Corporation, w naczyniu do hodowli tkanek).
  2. Przytrzymać larvę stroną grzbietową do góry w pobliżu haczyków gębowych za pomocą precyzyjnej pęsety (pęseta Dumont #5) i przebić mózg larwy szpilką entomologiczną (minutien, 0,1 mm, stal nierdzewna).
  3. Chwycić tylny koniec larwy pęsetą, delikatnie pociągnąć i rozciągnąć larvę wzdłuż jej osi. Wbić drugą szpilkę entomologiczną pomiędzy dwa tylne przetchlinki.
  4. Za pomocą nożyczek sprężynowych wykonać dwa poziome nacięcia w ścianie ciała (prostopadle do osi przednio-tylnej), blisko przedniej i tylnej szpilki.
  5. Za pomocą nożyczek sprężynowych przeciąć ścianę ciała larwy wzdłuż linii środkowej grzbietu od nacięcia przedniego do tylnego.
  6. Usunąć narządy wewnętrzne (jelita, gruczoły ślinowe, cewki Malpighiego itp.) oraz tchawki za pomocą precyzyjnej pęsety. Przemyć delikatnie raz lub dwa razy PBS.
  7. Chwycić dwie płaty ściany ciała pęsetą, rozciągnąć je i przytwierdzić do płytki za pomocą dwóch szpilek entomologicznych na każdą stronę.
  8. Usunąć PBS i dodać 50 μl roztworu utrwalającego (4% formaldehyd w PBT). Inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
  9. Usunąć utrwalacz. Przemyć dwukrotnie PBS. Wyjąć szpilki entomologiczne. Za pomocą nożyczek sprężynowych odciąć głowę i ogon larwy, pozostawiając prostokątny płat tkanki. Przenieść utrwaloną tkankę do schłodzonej probówki Eppendorf z PBS.
  10. Po utrwaleniu odpowiedniej liczby larw można przejść bezpośrednio do barwienia przeciwciałami. Jeśli natychmiastowe barwienie nie jest planowane, utrwalone larwy należy przemyć 3 razy, po 5 minut każdorazowo, w 95% etanolu i przechowywać w 95% etanolu w temperaturze -20 °C.

2. Disekcja i utrwalanie poczek

Część I

  1. Obsługuj fiolki w taki sam sposób jak podczas utrwalania larw, aż larwy trzeciego stadium zaczną się przepoczwarzać. Przeglądaj fiolki co godzinę i zaznaczaj poczwarki, które przeszły proces przepoczwarczania. Pozostaw zaznaczone poczwarki do rozwoju przez 30-40 godzin w temperaturze 24 °C lub przez 24-27 godzin w temperaturze 29 °C.
  2. Używając precyzyjnej pęsety, wybierz 20-30 poczwarek w odpowiednim wieku i umieść je w ciemnej porcelanowej wielokomorowej szalce sekcyjnej. Należy uważać, aby nie uszkodzić badanych tkanek.
  3. Wyjmij poczwarki z pochewek. Zacznij od odłupania operculum i kontynuuj, aż poczwarka zostanie uwolniona. Umieść poczwarkę w komorze wypełnionej PBT. Kontynuuj wyjmowanie pozostałych poczwarek. Kroki 2.4-2.6 należy wykonywać w małych partiach po pięć poczwarek jednocześnie.
  4. Umieść pięć poczwarek na płaskiej powierzchni między komorami szalki sekcyjnej. Używając mikronoża sekcyjnego, odetnij wierzchołek głowy oraz tylny koniec odwłoka (alternatywnie można użyć dwóch pęset, aby wyrwać otwory na obu końcach poczwarek).
  5. Przytrzymaj poczwarkę w miejscu za pomocą precyzyjnej pęsety i użyj strzykawki 1 ml, aby wypłukać organy wewnętrzne poczwarki, wstrzykując PBT przez otwór przedni.
  6. Krótko opłucz zdysekowaną poczwarkę, zanurzając ją w komorze wypełnionej PBS, a następnie przenieś ją do zimnego utrwalacza w probówce Eppendorf trzymanej na lodzie.
  7. Inkubuj przez noc (ON) w temperaturze 4 °C.

Część II

  1. Wylać utrwalacz i przemyć poczwarki trzykrotnie, po 5 minut każdorazowo, za pomocą PBT. Przemyte poczwarki przechowywać w lodzie.
  2. Napełnić dwa dołki naczynia do sekcji roztworem PBT. Za pomocą polietylenowej pipety Pasteura przenieść kilka poczwarek do jednego z dołków.
  3. Przenosić po jednej poczwarcze do drugiego dołka. Używając dwóch par ostrych pęset z idealnie dopasowanymi końcówkami, usunąć przezroczystą kutykulę poczwarki z poziomu skrzydła: unieruchomić poczwarkę na dnie dołka jedną pęsetą i delikatnie rozdarć kutykulę drugą pęsetą. Po rozdarciu kutykuli, oddzielić ją od skrzydła. Należy uważać, aby nie oddzielić skrzydła od poczwarki. Po usunięciu kutykuli z płytki skrzydła, kontynuować usuwanie kutykuli z przegubu skrzydła (gdzie znajdują się ChOs skrzydła).
  4. Po usunięciu kutykuli skrzydła można spróbować w podobny sposób usunąć kutykulę z odnóży. W procesie tym prawdopodobnie utraci się wiele odnóży, jednak mimo niskiej wydajności, krok ten jest wysoce zalecany, ponieważ znacznie poprawia barwienie ChOs odnóży. ChOs halthere i odwłoka można wizualizować bez dalszego usuwania kutykuli.
  5. Umieścić „oczyszczoną” poczwarkę w probówce Eppendorf wypełnionej metanolem i przechowywać w temperaturze pokojowej. Kontynuować usuwanie kutykuli ze wszystkich poczwarek i dodawać je do tej samej probówki. Na każde barwienie należy zebrać co najmniej 10 starannie oczyszczonych poczwarek.
  6. Usunąć metanol i przemyć trzykrotnie, po 5 minut każdorazowo, 95% Etanolem. Utrwalone poczwarki można przechowywać przez dłuższy czas w 95% Etanolu w temperaturze -20 °C.

3. Immunobarwienie larw i poczek

  1. Utrwaloną tkankę przemyć trzy razy PBT, po 30 minut każdego płukania, w temperaturze pokojowej. Larwy można płukać przy delikatnym wstrząsaniu na rotatorze. Poczwarki płukać bez wstrząsania.
  2. Zastąpić PBT buforem blokującym (PBT + 5% normalnego surowicy koziej) i inkubować przez noc (ON) w temperaturze 4 °C.
  3. Usunąć bufor blokujący i inkubować z przeciwciałami pierwszorzędowymi (rozcieńczonymi w buforze blokującym) przez noc (ON) w temperaturze 4 °C.
  4. Przemyć cztery razy PBT zgodnie z opisem w kroku 3.1.
  5. Usunąć PBT i inkubować z przeciwciałami drugorzędowymi (rozcieńczonymi w buforze blokującym) przez noc (ON) w temperaturze 4 °C.
  6. Przemyć dwukrotnie PBT i raz PBS zgodnie z opisem w kroku 3.1.
  7. Zastąpić PBS medium montażowym (Dako Fluorescent Mounting Medium (Dako Cytomation, Glostrup, Denmark)) i inkubować przez noc (ON) w temperaturze 4 °C.

4. Montowanie larw

  1. Larwy montuje się na szkiełku przedmiotowym w kropli medium montażowego, tak aby kutykula była skierowana w dół, a mięśnie ściany ciała w górę. Należy nanieść małą kroplę medium montażowego na czysty szkiełko nakrywkowe i przykryć nią preparat. Nie należy wywierać żadnego nacisku na zamontowane larwy.

5. Montowanie poczek

  1. Przygotować dwa szkiełka przedmiotowe z kroplą medium montażowego: jedno do sekcji, a drugie do przygotowania trwałego.
  2. Umieścić kilka poczek na jednym ze szkiełek.
  3. Za pomocą nożyczek sprężynowych usunąć głowę oraz tylną część odwłoka.
  4. Oddzielić grzbietową połowę klatki piersiowej od połowy brzusznej, przecinając tkanki między skrzydłami a nogami.
  5. Umieścić rozczłonkowane części ciała poczki na drugim szkiełku przedmiotowym w kropli roztworu montażowego. Należy upewnić się, że skrzydła i nogi są rozpostarte, i maksymalnie ograniczyć nakładanie się tkanek.
  6. Nanieść kroplę medium montażowego na szkiełko nakrywkę i położyć ją na próbce. Nie należy wywierać nacisku na zamontowaną próbkę.

6. Reprezentatywne wyniki

Przykład ChOs w trzecim stadium larwalnym po barwieniu immunologicznym przedstawiono na Rysunku 1. Przykład ten ukazuje odpowiednio rozciągnięty segment brzuszny, w którym wyraźnie widocznych jest siedem z ośmiu ChOs. Neurony zostały znakowane przeciwciałem MAb22C10 (1:20, otrzymanym z Developmental Studies Hybridoma Bank na University of Iowa); komórki czapki, więzadła, przyczepu czapki i przyczepu więzadła zostały znakowane przeciwciałem anti-αTub85E (1:10, Klein et al., 2010). Jako przeciwciała wtórne do barwienia fluorescencyjnego zastosowano przeciwciała anty-mysie/królicze sprzężone z Cy3 lub Cy5 (1:200, Jackson Immunoresearch Laboratories). Próbki analizowano przy użyciu mikroskopii konfokalnej (LSM 510, Zeiss).

Grupę komórek ChO skrzydła w brzusznej żyłce promienistej poczwarki w 35. godzinie rozwoju pokazano na Rysunku 2.

Schemat sieci neuronalnej, mapowanie białek; mikroskopia fluorescencyjna, analiza połączeń neuronalnych.
Rysunek 1. (A) Schematyczny rysunek sześciu typów komórek tworzących pojedynczy organ Ch: przyczep czepka (CA), czepek (C), skolopale (S), neuron (N), więzadło (L) i przyczep więzadła (LA). Organ LCh5, w którym zgrupowane jest pięć ChOs, rozciąga się przez grupę bocznych mięśni poprzecznych (LT1-4). Przedstawiono również boczny mięsień podłużny (LL1), brzuszne mięśnie podłużne (VL1-4) oraz boczny mięsień ukośny (LO1). Komórki ścięgniste zaznaczono jako brązowe sfery (zapożyczono z Klein et al., 2010). (B) Jeden segment odwłoka larwy trzeciego stadium widoczny przy powiększeniu 10X. Widocznych jest siedem z ośmiu ChOs obecnych w każdym segmencie odwłoka: pięć organów bocznych, które razem tworzą organ pentaskolopidialny (LCh5), pojedynczy organ boczny (LCh1) oraz jeden z dwóch brzusznych ChOs (VChB). Neurony (N) organów ChOs są znakowane neuronalnym markerem MAb 22C10 (czerwony). Więzadło (L), czepek (C) i komórki przyczepu (LA, CA) są znakowane przeciwciałem anti-αTub-85E (niebieski). Komórki czepka i więzadła są dodatkowo znakowane specyficznym dla ChO reporterem GFP zawierającym element regulacyjny z locus dei (Nachman et al., dane nieopublikowane).

Mikroskopia fluorescencyjna struktury neuronów; białka 22C10, αTub85E, GFP w układzie spektroskopowym.
Rysunek 2. Organy chordotonalne skrzydła przy brzusznej żyłce promienistej widziane przy powiększeniu 40X. Neurony (N) są znakowane markerem neuronalnym 22C10 (czerwony, B). Komórki więzadła (L) i czepki (C) są współznakowane przeciwciałami anty-αTub85E (niebieski, C) oraz specyficznym dla ChO transgenem reporterowym GFP (Nachman et al., niepublikowane dane).

Dyskusja

Protokół opisany w tym filmie umożliwia wizualizację proprioceptywnych ChO w stadiach larwalnym i poczwarki. Badania nad strukturą i rozwojem proprioceptywnych ChO były dotychczas ograniczone głównie do stadiów embrionalnych oraz larwalnych tarcz wyobraźnia. W związku z tym wiele aspektów późniejszych etapów rozwoju, zarówno larwalnych, jak i adultowych ChO, pozostaje w dużej mierze nieznanych. Opisany protokół, w połączeniu z powszechnymi narzędziami genetycznymi u Drosophila, może zostać wykorzystany do identyfikacji i badania nowych genów oraz szlaków, które odgrywają rolę w późniejszych etapach rozwoju ChO. Protokół ten został zoptymalizowany pod kątem wizualizacji ChO, ale można go dostosować do barwienia innych tkanek, takich jak skrzydła poczwarki 6.

Oświadczenia

Nie zgłoszono konfliktów interesów.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować Developmental Studies Hybridoma Bank na Uniwersytecie w Iowa za przesłanie przeciwciał. Praca ta była wspierana przez grant (nr 29/08) z Israel Science Foundation. A.S. otrzymuje również wsparcie z grantu badawczego od DFG (Deutsche Forschungsgemeinschaft).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Pinceta Dumont #5 (lub #55), końcówka biologicznaF.S.T.11252-20 lub 11252-10 (lub podobna pinceta)
Stalowe szpilki entomologiczne Austerlitz, minutiens 0.1mm Roboz Surgical Instruments Co.RS-6083-10
Zestaw elastomeru silikonowego Sylgard 184 Dow Corning240.4019862
Mikronóżki Vannasa (proste, 7.5 cm, ostrze 3mm)AS Mdeizintechnik GmbH11-590-00Nożyczki sprężynowe Vannasa o identycznych specyfikacjach można nabyć w Roboz Surgical Instrument Co.
Mieszadło orbitalne - Rotamax-120HeidolphN/A
Medium montażowe do fluorescencji Dako Fluorescent Mounting Medium Dako
Roztwór PBS X10 Jakość PBS jest krytyczna dla powodzenia tego protokołu2 gr/lit KCl, 2 gr/lit KH2PO4, 80 gr/lit NaCl,
21.7 gr/lit Na2HPO4.7H2O
PBTX1 PBS + 0.1% Tween 20

Bibliografia

  1. Brewster, R., Bodmer, R. Origin and specification of type II sensory neurons in Drosophila. Development. 121, 2923-2936 (1995).
  2. Caldwell, J. C., Miller, M. M., Wing, S., Soll, D. R., Eberl, D. F. Dynamic analysis of larval locomotion in Drosophila chordotonal organ mutants. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 16053-16053 (2003).
  3. Eberl, D. F. Feeling the vibes: chordotonal mechanisms in insect hearing. Curr. Opin. Neurobiol. 9, 389-393 (1999).
  4. Eberl, D. F., Boekhoff-Falk, G. Development of Johnston's organ in Drosophila. Int. J. Dev. Biol. 51, 679-687 (2007).
  5. Eberl, D. F., Hardy, R. W., Kernan, M. J. Genetically similar transduction mechanisms for touch and hearing in Drosophila. J. Neurosci. 20, 5981-5988 (2000).
  6. Egoz-Matia, N., Nachman, A., Halachmi, N., Toder, M., Klein, Y., Salzberg, A. Spatial regulation of cell adhesion in the Drosophila wing is mediated by Delilah, a potent activator of βPS integrin expression. Dev Biol. 351, 99-109 (2011).
  7. Field, L. H., Matheson, T. Chordotonal organs of insects. Advances in Insect Physiology. 27, 1-228 (1998).
  8. Gong, Z., Son, W., Chung, Y. D., Kim, J., Shin, D. W., McClung, C. A., Lee, Y., Lee, H. W., Chang, D. J., Kaang, B. K. Two interdependent TRPV channel subunits, inactive and Nanchung, mediate hearing in Drosophila. J. Neurosci. 24, 9059-9066 (2004).
  9. Inbal, A., Volk, T., Salzberg, A. Recruitment of ectodermal attachment cells via an EGFR-dependent mechanism during the organogenesis of Drosophila proprioceptors. Dev. Cell. 7, 241-250 (2004).
  10. Jarman, A. P., Grau, Y., Jan, L. Y., Jan, Y. N. atonal is a proneural gene that directs chordotonal organ formation in the Drosophila peripheral nervous system. Cell. 73, 1307-1321 (1993).
  11. Jarman, A. P., Sun, Y., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Role of the proneural gene, atonal, in formation of Drosophila chordotonal organs and photoreceptors. Development. 121, 2019-2030 (1995).
  12. Kim, J., Chung, Y. D., Park, D. Y., Choi, S., Shin, D. W., Soh, H., Lee, H. W., Son, W., Yim, J., Park, C. S. A TRPV family ion channel required for hearing in Drosophila. Nature. 424, 81-84 (2003).
  13. Klein, Y., Halachmi, N., Egoz-Matia, N., Toder, M., Salzberg, A. The proprioceptive and contractile systems in Drosophila are both patterned by the EGR family transcription factor Stripe. Dev. Biol. 337, 458-470 (2010).
  14. Matthews, K. A., Miller, D. F., Kaufman, T. C. Functional implications of the unusual spatial distribution of a minor alpha-tubulin isotype in Drosophila: a common thread among chordotonal ligaments, developing muscle, and testis cyst cells. Dev. Biol. 137, 171-183 (1990).
  15. Okabe, M., Okano, H. Two-step induction of chordotonal organ precursors in Drosophila embryogenesis. Development. 124, 1045-1053 (1997).
  16. Rusten, T. E., Cantera, R., Urban, J., Technau, G., Kafatos, F. C., Barrio, R. Spalt modifies EGFR-mediated induction of chordotonal precursors in the embryonic PNS of Drosophila promoting the development of oenocytes. Development. 128, 711-722 (2001).
  17. Todi, S. V., Sharma, Y., Eberl, D. F. Anatomical and molecular design of the Drosophila antenna as a flagellar auditory organ. Microsc. Res. Tech. 63, 388-399 (2004).
  18. zur Lage, P., Jarman, A. P. Antagonism of EGFR and notch signalling in the reiterative recruitment of Drosophila adult chordotonal sense organ precursors. Development. 126, 3149-3159 (1999).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Organy chordotonalnepoczwarki Drosophilamikroskopia konfokalnaimmunobarwieniesekcjonowanie tkanekprotokół fiksacjimedia montażowereporter GFP
Wizualizacja proprioceptorów w larwach i poczwarkach Drosophila
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.