Przygotowanie komórek fibroblastów zarodkowych myszy odpowiednich do hodowli ludzkich embrionalnych i indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

Podsumowanie

Jakość embrionalnych fibroblastów mysich (MEFs) zależy od wyboru odpowiedniego szczepu myszy, takiego jak CF-1. MEFs wspierające pluripotencję oraz pożywka warunkowana (CM) uzyskana z tych komórek powinny zawierać optymalne stężenia Activin A, Gremlin oraz Tgfβ1, które są niezbędne do współdziałania szlaków Activin/Nodal i FGF w celu utrzymania samoodnawiania i pluripotencji.

Streszczenie

Ogólnie rzecz biorąc, ludzkie embrionalne komórki macierzyste (hESCs) oraz ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (hiPSCs)¹ mogą być hodowane w zmiennych warunkach. Niemniej jednak stworzenie skutecznego systemu hodowli tych komórek nie jest łatwe. Ponieważ warunki hodowli mogą wpływać na ekspresję genów nadających pluripotencjalność hESCs i hiPSCs, optymalizacja i standaryzacja metody hodowli są kluczowe.

Ustanowienie linii hESC zostało po raz pierwszy opisane z wykorzystaniem MEF jako komórek zasilających oraz pożywki hodowlanej zawierającej płodową surowicę bydlęcą (FBS)². Następnie FBS zastąpiono zamiennikiem surowicy knockout (KSR) oraz FGF2, co zwiększyło proliferację hESC³. W końcu systemy hodowli bezkomórkowych (feeder-free) umożliwiły hodowlę komórek na płytkach pokrytych Matrigelem w warunkowanej pożywce zawierającej KSR (pożywka warunkowana przez MEF)⁴. W kolejnym etapie warunki hodowli hESC ewoluowały w stronę hodowli bezkomórkowej w warunkach chemicznie zdefiniowanych^5-7. Ponadto, aby uniknąć potencjalnego zanieczyszczenia patogenami i białkami zwierzęcymi, opracowano metody hodowli z wykorzystaniem komponentów wolnych od produktów pochodzenia zwierzęcego (xeno-free)⁸.

Aby uzyskać lepsze warunki, komórki karmące myszy zastąpiono ludzkimi liniami komórkowymi (np. płodowymi komórkami mięśniowymi i skórnymi⁹, dorosłymi komórkami skóry¹⁰, fibroblastami napletka^11-12, mezenchymalnymi komórkami błony płodowej¹³). Jednakże wydajność utrzymywania niezróżnicowanych hESC z wykorzystaniem warstw karmących pochodzących z ludzkich fibroblastów napletka nie jest tak wysoka, jak w przypadku mysich komórek karmących, co wynika z niższego poziomu wydzielania aktywiny A¹⁴. Oczywiście istnieje wyraźna różnica w produkcji czynników wzrostu przez mysie i ludzkie komórki karmące.

Analizy transkryptomów komórek karmicieli mysich i ludzkich ujawniły istotne różnice między komórkami wspierającymi a niewspierającymi. Egzogenny FGF2 jest kluczowy dla utrzymania zdolności do samoodnowy hESC i hiPSC i został zidentyfikowany jako kluczowy czynnik regulujący ekspresję Tgfβ1, aktywiny A oraz gremliny (antagonisty BMP) w komórkach karmicielach. Wykazano, że aktywina A indukuje ekspresję OCT4, SOX2 i NANOG w hESC^15-16.

W przypadku hodowli długoterminowej, hESC i hiPSC można hodować na mitotycznie inaktywowanych MEF lub w warunkach bezfeederowych w MEF-CM (medium warunkowanym przez MEF) na płytkach pokrytych Matrigelem, aby utrzymać ich niezróżnicowany stan. Sukces obu warunków hodowli w pełni zależy od jakości komórek feederowych, ponieważ bezpośrednio wpływają one na wzrost hESC.

W niniejszej pracy przedstawiamy zoptymalizowaną metodę izolacji i hodowli embrionalnych fibroblastów mysich (MEFs), przygotowania pożywki warunkowanej (CM) oraz testu immunoenzymatycznego (ELISA) w celu oceny poziomu aktywiny A w pożywkach.

Protokół

1. Izolacja embrionalnych fibroblastów mysich (MEFs)

Następujące dwa kroki są wykonywane w warunkach nieaseptycznych.

1. Poddać eutanazji ciężarną mysz (CF1, Harlan, USA) w 13. lub 14. dniu po zapłodnieniu (d.p.c.) poprzez zwichnięcie kręgów szyjnych.
2. Wypreparować rogi macicy, krótko opłukać w 70% (v/v) etanolu i umieścić w probówce typu falcon zawierającej PBS bez Ca²⁺Mg²⁺ (Gibco, Invitrogen).

Kolejne kroki są wykonywane w komorze z laminarnym przepływem powietrza do hodowli tkanek, w warunkach aseptycznych i przy użyciu sterylnych narzędzi.

3. Umieścić rogi macicy w płytce Petriego i oddzielić każdy embrion od łożyska i pęcherzyka zarodkowego.
4. Wypreparować głowę i narządy czerwone, przemyć w PBS i umieścić wszystkie embriony w czystej płytce Petriego. Tkankę drobno posiekać za pomocą sterylnej żyletki, aż stanie się możliwa do pobrania pipetą.
5. Dodać 1 ml 0,05% trypsyny/EDTA (Gibco, Invitrogen), zawierającej 100 jednostek Kunitza DNazy I (USB), na każdego embriona.
6. Przenieść tkankę do probówki typu Falcon 50 ml i inkubować przez 15 min w 37 °C. Po każdych 5 min inkubacji dysocjować komórki poprzez dokładne pipetowanie w górę i w dół.
7. Zneutralizować trypsynę, dodając około 1 objętości świeżo przygotowanej pożywki MEF.
   Pożywka hodowlana MEF (składniki do przygotowania 500 ml pożywki, wymieszać wszystkie składniki i przefiltrować):
   450 ml DMEM, 50 ml FBS (10% (v/v)), 5 ml 200 mM L-glutaminy (1/100 (v/v)), 5 ml penicyliny-streptomycyny (1/100 (v/v)).
8. Odwirować komórki z niską prędkością (300 x g) przez 5 min, ostrożnie usunąć nadosad i resuspendować pellet komórkowy w ciepłej pożywce MEF.
9. Przesiać liczbę komórek odpowiadającą około 3-4 embrionom do każdej kolby T150 (TPP) pokrytej 0,2% żelatyną (Gelatine from bovine skin, Type B, Sigma) na 2 h. Fibroblasty (P0, pasaż 0) są jedynymi komórkami, które mają zdolność do przylegania do kolb pokrytych żelatyną.
10. W idealnych warunkach komórki osiągają 80-90% konfluencji po 24 h i na tym etapie większość komórek P0 jest mrożona do późniejszego użycia.
11. Namnażać pozostałe kolby T150 z komórkami P0 do pasażu P3 lub P4, a następnie inaktywować i wykorzystać jako komórki feeder do ponownego wysiewania hESC lub do produkcji pożywki warunkowanej (CM).

2. Inaktywacja i wysiew MEF (Przygotowanie komórek karmicieli)

Wszystkie etapy są wykonywane w komorze z laminarnym przepływem powietrza w warunkach aseptycznych.

1. Pokryć kolby T150 0,2% żelatyną i inkubować w RT przez co najmniej 2 h.
2. Rozcieńczyć mitomycynę C w PBS (1 mg/ml) i przefiltrować.
3. Odssać pożywkę z MEF i przemyć PBS bez Ca²⁺Mg²⁺.
4. Nanieść 20 ml pożywki zawierającej 10 μg/ml mitomycyny C na MEF.
5. Inkubować przez 2 h w 37 °C w pożywce z mitomycyną C, następnie przemyć dwukrotnie PBS, poddać trypsynizacji, odwirować (przez 5 min przy 300 x g) i resuspenderować komórki w ciepłej pożywce.
6. Policzyć komórki i wysiać w kolbach T150 z gęstością 56.000 komórek/cm², a następnie wykorzystać do produkcji CM przez kolejne 6 dni.

3. Przygotowanie pożywki warunkowanej (CM)

Wszystkie etapy są wykonywane w komorze z laminarnym przepływem powietrza w warunkach aseptycznych.

1. Dzień po wysianiu inaktywowanych MEF z gęstością 56.000 komórek/cm² należy zastąpić podłoże MEF podłożem hESC (UM, podłoże nieuwarunkowane) (0.5 ml/cm²) świeżo uzupełnionym o 4 ng/ml FGF2.
2. Po 24 h inkubacji należy zebrać CM z kolb z warstwą karmidła i dodać do karmidła świeże podłoże hESC zawierające 4 ng/ml FGF2.
3. Procedurę tę należy powtarzać przez kolejne 6 dni. Każdego dnia zebrane CM należy przechowywać w temperaturze -20 °C.
4. Po 6 dniach należy wymieszać wszystkie alikwoty podłoża i przefiltrować (Corning, 0.22 μm, PAS). Należy przygotować alikwoty po 50 ml i przechowywać je w temperaturze -80 °C.
5. Przed dodaniem do hESC hodowanych na Matrigelu, CM należy uzupełnić o dodatkowe 4 ng/ml FGF2.

4. Pomiar zawartości aktywiny A w pożywce warunkującej (ELISA)¹⁵

1. Doprowadzić wszystkie próbki i odczynniki do temperatury pokojowej.
2. Rozcieńczyć przeciwciało przechwytujące (Human\Mouse\Rat Activin A MAb, R&D Systems) w PBS z 1% BSA, dodać do mikropłytki (100 μl/dołek) i inkubować przez noc w temperaturze pokojowej.
3. Po 24 h przemyć dołki trzykrotnie PBST (PBS z 0,05% Tween 20) (300 μl/dołek), a następnie zablokować (1% BSA/PBS, 300 μl/dołek) przez 1 h w temperaturze pokojowej.
4. W tym czasie przygotować krzywą standardową dla Activin A (R&D Systems), obejmującą 7 rozcieńczeń (stężenie poniżej 30 ng/ml) oraz próbkę ślepą. Liniowy zakres roboczy dla Activin A wynosi od 0,25 do 32 ng/ml.
5. Dodać dublety standardów i próbek do dołków (100 μl/dołek) i inkubować przez 2 h w temperaturze pokojowej.
6. Przemyć dołki trzykrotnie (300 μl PBST).
7. Dodać przeciwciało wtórne (biotynilowane) (Human/Mouse/Rat Biotinylated Activin A MAb, R&D Systems) (0,25 μg/ml w 1% BSA/PBS) i inkubować przez 2 h w temperaturze pokojowej.
8. Przemyć dołki trzykrotnie (300 μl PBST), dodać Streptawidynę-HRP (rozcieńczoną w 1% BSA/PBS, R&D Systems) i inkubować przez 20 min w temperaturze pokojowej.
9. Przemyć dołki trzykrotnie (300 μl PBST), dodać 100 μl roztworu substratu (Quantikine, R&D Systems) i inkubować przez 30 min w temperaturze pokojowej w ciemności.
10. Dodać 100 μl roztworu stopującego (Quantikine, R&D Systems) do każdego dołka i delikatnie wymieszać.
11. Ustawić czytnik mikropłytek (Molecular Devices Spectra Max 250, Global Medical Instrumentation, Inc., Minnesota) na 450 nm, z korekcją długości fali przy 540 lub 570 nm, aby wyznaczyć gęstość optyczną każdego dołka.

5. Reprezentatywne wyniki

Ogólny schemat procedury izolacji przedstawiono na Rysunku 1. Typowa morfologia hESC i hiPSC hodowanych w różnych warunkach przedstawiona jest na Rysunku 2. Morfologia MEF oraz nieaktywnych komórek karmiacych użytych do przygotowania CM przedstawiona jest na Rysunku 3. Generalnie komórki powinny osiągnąć konfluencję 24 godziny po izolacji i być gotowe do zamrożenia lub namnożenia. Czasami jednak uzyskanie konfluencyjnych kultur może zająć od 2 do 3 dni. CM należy przygotować z komórek na 4. pasażu lub wcześniej. Jest to kluczowe, ponieważ komórki pierwotne można namnażać jedynie przez 4-5 pasaży przed wystąpieniem starzenia się komórek.

Cytokina aktywina A jest uważana za najważniejszy czynnik wydzielany przez komórki zasilające w celu wsparcia niezróżnicowanego wzrostu komórek pluripotencjalnych¹⁴. Pomiar poziomu aktywiny A w CM (Rycina 4) jest bardzo wygodnym testem ilościowym służącym do monitorowania jakości MEF.

Rysunek 1. Schematyczna reprezentacja procedury izolacji MEF.

Rysunek 2. Typowa morfologia niezróżnicowanych hESC hodowanych w obecności (A) komórek karmicieli, (B) medium warunkowanego oraz (C) medium zdefiniowanego. Typowa morfologia hiPSC hodowanych w obecności (D, E) komórek karmicieli.

Rysunek 3. Typowa morfologia zarodkowych fibroblastów mysich (MEFs). (A) Pasaż 0 (P0) dwa dni po wysianiu/izolacji, (B) inaktywowana warstwa feederów przy gęstości 56.000 komórek/cm.²

Rysunek 4. Pomiary stężenia Aktywiny A w pożywce warunkującej (CM) przygotowanej z zarodkowych fibroblastów mysich pochodzących z linii myszy CF1, wykonane za pomocą testu ELISA. CM była zbierana przez 6 dni, a następnie połączona. CM"1" i CM"2" odnoszą się do różnych partii pożywek, a UM do pożywki niewarunkowanej. Ponieważ funkcją procesu warunkowania jest sekrecja Aktywiny A do pożywki przez MEF, Aktywina A jest niemal niewykrywalna w UM.

Dyskusja

Przedstawiona tutaj procedura izolacji MEF umożliwia ustanowienie zestandaryzowanych warunków hodowli dla hESC i hiPSC. Ponadto system oparty na metodzie ELISA, wykorzystywany do oceny produkcji cytokin przez komórki dokarmiające, jest użytecznym wskaźnikiem jakości pożywki kondycjonowanej pochodzącej z MEF. Rutynowe utrzymywanie szczepu myszy (CF1) dostarczającego fibroblastów wspierających jest niezbędne, aby uniknąć różnic między partiami pożywek hodowlanych. Ponadto zaleca się jednoczesną izolację embrionów z kilku myszy w celu uzyskania spójnej jakości komórek. Świeżo izolowane MEF mogą być oczywiście przechowywane w zamrożeniu na etapach P0 i P1. Również inaktywowane MEF mogą być przechowywane w zamrożonych alikwotach o odpowiednich ilościach, w zależności od wymagań hodowli komórkowej. Zazwyczaj do hodowli hESC i komórek iPS w pojedynczej studience płytki 6-dołkowej należy wysiać około 250.000 komórek. Ustanowiona i zoptymalizowana metoda może być rutynowo stosowana w celu zminimalizowania zmienności pomiędzy różnymi eksperymentami.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
DMEM (wysoka zawartość glukozy)	Gibco, Invitrogen	41966-052
FBS	Biochrom	S0115
L-glutamina	Gibco, Invitrogen	25030-024
Penicylina-streptomycyna	Gibco, Invitrogen	15140-122
Próżniowy system filtracji	Corning	431097	500 ml, 0.22 μm, PAS
DMSO	Sigma	D2650
Knockout DMEM	Gibco, Invitrogen	10829-018
Zamiennik surowicy Knockout	Gibco, Invitrogen	10828-028
Nieessentialne aminokwasy	Gibco, Invitrogen	11140-035
beta-merkapto–etanol	Sigma	M7522
PBS	Gibco, Invitrogen	14190-169
DNaza I	Sigma	D4527
Mitomycyna C	Roche	10107409001
Podstawowy czynnik wzrostu fibroblastów	PeproTech	100-18B
Biotynilowane przeciwciało anty-aktywina A (człowiek/mysz/szczur)	R&D Systems	BAM3381
Żelatyna	Sigma	G9391
MAb przeciwko aktywinie A (człowiek/mysz/szczur)	R&D Systems	MAB3381
0.05% Trypsyna-EDTA	Gibco, Invitrogen	25300-054
Nożyczki tęczówkowe ekstra cienkie	FST	14088-10
Pęseta Graefe ekstra precyzyjna	FST	11150-10
Pęseta Pierse do fiksacji	FST	18155-13