Artykuł metodologiczny

Ekspresja i oczyszczanie białka regulatora przewodnictwa przezbłonowego w mukowiscydozie w Saccharomyces cerevisiae

22K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/3860

⸱

10 marca 2012

 ,  ,  , 
1Faculty of Life Sciences, University of Manchester

W tym artykule

Podsumowanie

Próby ekspresji regulatora przewodnictwa przezbłonowego w mukowiscydozie (CFTR) w Saccharomyces cerevisiae przynosiły dotychczas stosunkowo niskie ilości białka. Niniejszy protokół oraz powiązane z nim odczynniki dystrybuowane przez Cystic Fibrosis Foundation powinny umożliwić przygotowanie miligramowych ilości tego „trudnego” eukariotycznego białka błonowego.

Streszczenie

Regulator przewodnictwa przezbłonowego w mukowiscydozie (CFTR) jest kanałem chlorkowym, którego mutacje mogą prowadzić do rozwoju mukowiscydozy u ludzi. Istnieje zatem duże zainteresowanie tym białkiem, jednak próby zbadania jego struktury i aktywności były utrudnione ze względu na trudności w ekspresji i oczyszczaniu odpowiednich ilości białka1-3. Podobnie jak w przypadku wielu „trudnych” eukariotycznych białek błonowych, pożądana, lecz wymagająca, jest ekspresja w szybko rosnącym organizmie; w drożdżach S. cerevisiae dotychczas uzyskiwano niskie ilości białka i obserwowano jego szybką degradację 4-9. Opisano białka zaangażowane w procesing rekombinowanego CFTR w drożdżach6-9. W niniejszym raporcie opisujemy metodologię ekspresji CFTR w drożdżach oraz jego oczyszczania w znaczących ilościach. Protokół opisuje, w jaki sposób można przezwyciężyć wcześniejsze problemy z proteolizą oraz jak znacznie zwiększyć poziom ekspresji CFTR poprzez modyfikację warunków wzrostu komórek i kontrolę warunków indukcji, w szczególności czasu przed zbiorem komórek. Odczynniki związane z niniejszym protokołem (drożdże ekspresyjne mysiego CFTR lub plazmidy drożdżowe) będą dystrybuowane za pośrednictwem US Cystic Fibrosis Foundation, która sponsorowała te badania. Artykuł opisujący projekt i syntezę konstrukcji CFTR wykorzystanej w tym raporcie zostanie opublikowany oddzielnie (Urbatsch, I.; Thibodeau, P. et al., niepublikowane). W niniejszym artykule wyjaśnimy naszą metodę, zaczynając od transformacji komórek drożdży plazmidem drożdżowym zawierającym konstrukt CFTR (Rys. 1). Konstrukt posiada sekwencję zielonego białka fluorescencyjnego (GFP) połączoną z CFTR na jego C-końcu i opiera się na systemie opracowanym przez Drew et al. (2008)10. GFP pozwala na stosunkowo łatwe monitorowanie ekspresji i oczyszczania CFTR. Wizualizowany protokół JoVE kończy się na przygotowaniu mikrosomów z komórek drożdży, choć zamieszczamy kilka sugestii dotyczących oczyszczania białka z mikrosomów. Czytelnicy mogą wprowadzić własne modyfikacje do procedury oczyszczania mikrosomów, w zależności od końcowych eksperymentów planowanych z białkiem oraz dostępnego sprzętu laboratoryjnego. Białko CFTR wyekspresowane w drożdżach może zostać częściowo oczyszczone za pomocą chromatografii powinowactwa do jonów metali, wykorzystując wewnętrzny znacznik oczyszczania polihistydynowy. Następująca po niej chromatografia wykluczania cząsteczek pozwala uzyskać białko, które według analizy SDS-PAGE i barwienia żelu Coomassie wydaje się być czyste w >90%.

Protokół

1. Przygotowanie pożywek i buforów

  1. YNB: Aby przygotować jeden litr, zawiesić 6,9 g bazy azotowej dla drożdży bez aminokwasów oraz 0,77 g kompletnej mieszaniny suplementów bez uracylu w 1 l wody. Autoklawować. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
  2. YNBA: Aby przygotować 400 ml, zawiesić 2,76 g bazy azotowej dla drożdży bez aminokwasów, 0,38 g kompletnej mieszaniny suplementów bez uracylu oraz 8 g agaru bakteriologicznego w 350 ml wody. Autoklawować. Wymieszać 8 g glukozy z 50 ml wody i delikatnie podgrzewać do czasu rozpuszczenia. Sterylizować przez filtr 0,2 μm i dodać do YNBA, gdy agar jest jeszcze w stanie ciekłym. Przechowywać w temperaturze pokojowej.
  3. Pożywka z 20% glukozą: Aby przygotować 500 ml, zmieszać 100 g glukozy z 500 ml YNB i delikatnie podgrzewać do czasu rozpuszczenia. Przefiltrować przez filtr 0,2 μM do sterylnej butelki Duran. Przechowywać w temperaturze pokojowej.
  4. Pożywka z 20% galaktozą: Aby przygotować 2 litry, zmieszać 400 g galaktozy z 2 l YNB i delikatnie podgrzewać do czasu rozpuszczenia. Przefiltrować przez filtr 0,2 μm do sterylnej butelki Duran. Przechowywać w temperaturze pokojowej.
  5. Roztwory zapasowe inhibitorów proteaz: CFTR jest wysoce podatny na proteolizę4. Autorzy stwierdzili, że następujące inhibitory są skuteczne w ograniczaniu proteolizy, choć czytelnicy mogą chcieć dostosować tę listę do własnych potrzeb. Przechowywać w alikwotach po 100 μl w temperaturze -20 °C, aby uniknąć problemów związanych z wielokrotnym zamrażaniem i rozmrażaniem. Wszystkie inhibitory należy rozcieńczać z roztworów zapasowych do stężeń roboczych zgodnie z poniższymi instrukcjami:
InhibitorStężenie roztworu zapasuPrzygotowanie roztworu zapasuStężenie robocze
AEBSF200 mMRozpuścić 48mg w 1ml wody destylowanej0.2 mM
Benzamidine300 mMRozpuścić 36mg w 1ml wody destylowanej0.3 mM
Chymostatin4 mMRozpuścić 2.5mg w 1ml bezwodnego DMSO4 μM
E-647 mMRozpuścić 2.5mg w 1ml wody destylowanej7 μM
Leupeptin20 mMRozpuścić 10mg w 1ml wody destylowanej20 μM
Pepstatin A15 mMRozpuścić 10mg w 1ml bezwodnego DMSO15 μM
PMSF1 MRozpuścić 174mg w 1ml bezwodnego DMSO1 mM
  1. DTT (1 M): Rozpuścić 154 mg ditiotreitolu w 1 ml wody destylowanej. Przechowywać w temperaturze -20 °C. Stosować w rozcieńczeniu 1:1000 w odpowiednich buforach.
  2. EDTA (0,5 M): Wymieszać 29,22 g kwasu etylenodiaminotetraoctowego ze 100 ml wody. Dodawać kroplami 10 N NaOH, aż cały EDTA się rozpuści, a pH osiągnie wartość 8. Dopełnić wodą do 200 ml i przefiltrować przez filtr 0,2 μm do sterylnej butelki Duran. Przechowywać w temperaturze pokojowej.
  3. CRB (300 mM Tris-HCl, pH 7,4, 0,56 M sorbitolu, 1 mM EDTA): Rozpuścić 18,17 g Tris-base w 350 ml wody i dostosować pH do 7,4 poprzez dodanie HCl. Dodać 51,35 g sorbitolu i dopełnić wodą do objętości 500 ml. Autoklawować. Dodać 1 ml roztworu zapasowego EDTA i przechowywać w temperaturze 4 °C.
  4. Bufor CFTR (50 mM Tris, pH 8,0, 10% v/v glicerolu): Rozpuścić 6,06 g Tris-base w 500 ml wody. Dostosować pH do 8 za pomocą HCl, dodać 100 ml glicerolu i dopełnić wodą do 1 L. Autoklawować i przechowywać w temperaturze 4 °C.
  5. Barwnik do ładowania 2x: 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 5% glicerolu, 5 mM EDTA (pH 8,0), 0,02% błękitu bromofenolowego, 4% SDS, 0,05 M DTT. Przygotować 10 ml, podzielić na alykwoy i przechowywać w temperaturze -20 °C.

2. Przesiewanie transformantów

Niniejszy protokół zakłada, że gen fuzyjny CFTR-GFP-8His został wprowadzony do plazmidu drożdżowego za promotorem galaktozowym GAL1 (Rys.1), a plazmid ten został ztransformowany do komórek FGY217, będących mutantem z delecją Pep4 szczepu S.cerevisiae10. Komórki można hodować na płytkach YNBA i przechowywać przez kilka tygodni w temperaturze 4 °C. Do długoterminowego przechowywania należy przygotować zapasy w glicerolu i przechowywać je w temperaturze -80 °C. Metody klonowania i transformacji zostały szczegółowo opisane przez Drew et al. (2008)10.

  1. Wybierz 5-10 dobrze odseparowanych kolonii z płytki po transformacji. Przenieś każdą kolonię do oddzielnej sterylnej probówki Falcon 50 ml zawierającej 9 ml YNB i 1 ml pożywki z 20% glukozą. Na tym etapie ważne jest uzyskanie końcowego stężenia 2% glukozy (m/v) w hodowli, aby utrzymać wzrost komórek. Hoduj przez noc (16 godzin) przy 250 rpm i 30 °C w inkubatorze orbitalnym z wytrząsaniem.
  2. Przygotuj banki glicerolowe dla każdej z przesiewanych kolonii. Aseptycznie dodaj 0,8 ml nocnych kultur do 0,2 ml sterylnego glicerolu w opisanych fiolkach z nakrętką, krótko wymieszaj na vortexie i przechowuj w temperaturze -80 °C.
  3. Rozcieńcz pozostałe nocne kultury do końcowej objętości 50 ml w YNB, dodając 250 μl pożywki z 20% glukozą. Na tym etapie ważne jest rozcieńczenie stężenia glukozy do około 0,1% (m/m) w hodowli, ponieważ wysokie stężenie glukozy może represować promotor GAL110. Hoduj kultury w opisanych kolbach Erlenmeyera z przegrodami o pojemności 250 ml do uzyskania OD600 na poziomie 0,7-0,8 przy 250 rpm i 30 °C w inkubatorze orbitalnym z wytrząsaniem.
  4. Indukuj kultury poprzez dodanie 5 ml pożywki z 20% galaktozą do każdej kolby i inkubuj przez kolejne 16 godzin.
  5. Potwierdź ekspresję CFTR za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Pobierz 100 μl kultury i dodaj 100 μl glicerolu, aby ograniczyć ruchliwość komórek w roztworze. Analizuj komórki na mikroskopie Delta Vision RT (lub podobnym), używając niebieskiego lasera i filtra FITC (długość fali wzbudzenia 490 nm i długość fali emisji 528-538 nm). Pozytywna ekspresja białka fuzyjnego CFTR-GFP powinna być widoczna jako pierścień fluorescencji na błonie plazmatycznej komórek drożdży. Jako kontrolę można wykorzystać nietransformowane komórki drożdży.
  6. Przenieś kultury do probówek Falcon 50 ml. Zbierz komórki przez wirowanie przy 3500 x g i 4 °C przez 10 minut w wirówce laboratoryjnej. Podczas wirowania przygotuj probówki do mikrowirówki o pojemności 2 ml z nakrętkami, zawierające około 500 μl szklanych kulek mytych kwasem, i umieść je na lodzie. Odlej nadsącz i resuspenduj każdy osad w 500-800 μl lodowatego buforu CRB z inhibitorami proteaz. Przenieś zawiesiny do probówek z kulekami i przechowuj na lodzie.
  7. Zlizuj komórki poprzez energiczne wstrząsanie/vortexowanie każdej probówki w 10 cyklach po 30 sekund, z przerwami na lodzie między cyklami. Alternatywnie można zastosować homogenizator kuleczkowy, np. BioSpec mini beadbeater, pracujący przez 3 min.
  8. Umieść probówki w mikrowirówce laboratoryjnej i wiruj przy 3 500 x g i 4 °C przez 5 minut. Przenieś nadsącze zawierające surową frakcję błonową do czystych probówek i umieść na lodzie. Dodaj 500 μl świeżego, lodowatego buforu CRB z inhibitorami proteaz do każdej probówki i powtórz proces, aby zgromadzić błony.
  9. Zbierz surowe błony przez wirowanie z maksymalną prędkością przy 4 °C w mikrowirówce laboratoryjnej przez 2 godziny. Odlej nadsącz i resuspenduj każdy osad w 50 μl lodowatego buforu CFTR.
  10. W czystych probówkach do mikrowirówki zmieszaj 15 μl każdej zawiesiny z 15 μl 2x barwnika do ładowania, pipetując w górę i w dół. Inkubuj w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Nie gotuj próbek, ponieważ spowoduje to tworzenie się nierozpuszczalnych w SDS agregatów CFTR i innych białek błonowych oraz denaturację znacznika GFP.
  11. Nałóż próbki wraz z barwionymi standardami białek PageRuler Plus (Fermentas) na żel gradientowy 4-20% Tris/glicyna (NuSep) i prowadź elektroforezę przy 150 V przez 40 minut lub do momentu dotarcia frontu barwnika do dołu żelu.
  12. Zidentyfikuj komórki o najwyższej ekspresji za pomocą fluorescencji w żelu. Umieść żel w systemie obrazowania fluorescencyjnego, np. skanerze Typhoon. Skanuj żel za pomocą niebieskiego lasera przy długości fali wzbudzenia 488 nm i długości fali emisji 526 nm. Fuzja CFTR-GFP powinna być widoczna przy masie około 220 kDa. Widoczny będzie również słaby prążek fluorescencyjny przy około 70 kDa, który prawdopodobnie jest endogennym drożdżowym białkiem błonowym zawierającym FAD (np. podjednostka A dehydrogenazy bursztynianowej) 11,12.
  13. Zbarw żel Coomassie, odbarw i zeskanuj żel w celu porównania z obrazem fluorescencyjnym za pomocą odpowiedniego oprogramowania do przeglądania obrazów. Żel barwiony Coomassie pozwala na relatywną ocenę poziomu ekspresji CFTR-GFP w różnych liniach klonalnych po normalizacji względem ilości całkowitego białka nałożonego na każdą ścieżkę żelu.
  14. Wyestryjkuj linię komórkową o najwyższej ekspresji z jej banku glicerolowego (2.2) na świeżą płytkę YNBA i inkubuj w temperaturze 30 °C przez 2-3 dni. Płytkę tę można następnie przechowywać przez maksymalnie 2 tygodnie w temperaturze 4 °C.

3. Hodowla w fermentorze na dużą skalę

  1. Przygotować prekultury do fermentora. Za pomocą sterylnej pętli zebrać komórki z obszaru 1cm2 z płytki YNBA (2.13) i dodać do 45 ml YNB oraz 5 ml pożywki z 20% glukozą, tak aby OD600 wynosiła około 0,1. Hodować w kolbach Erlenmeyera z przegrodami o pojemności 250 ml przy 250 rpm i 30 °C w inkubatorze z wytrząsarką orbitalną, aż OD600 osiągnie wartość 1.
  2. Podzielić kulturę pomiędzy dwie kolby Erlenmeyera z przegrodami o pojemności 2 l, z których każda zawiera 450 ml YNB i 25 ml pożywki z 20% glukozą. Hodować je przy 250 rpm i 30 °C w inkubatorze z wytrząsarką orbitalną, aż OD600 osiągnie wartość 1,2.
  3. Podczas wzrostu prekultur przygotować fermentor. Przygotować 11,2 l YNB zgodnie z opisem w punkcie 1.1, rozpuszczając dodatkowo 8,28 g YNB i 0,95 g suplementu drop out, aby zrekompensować dodatek glicerolu podczas indukcji. Aseptycznie dodać 11,2 l YNB i 75 ml pożywki z 20% glukozą do sterylnego naczynia fermentora o pojemności 20 l i ustawić temperaturę roboczą na 30 °C.
  4. Aseptycznie przenieść prekultury do fermentora, ustawić prędkość mieszania na około 800 rpm i utrzymać temperaturę 30 °C. Przepływ sprężonego powietrza powinien wynosić około 15 dm3min-1. Gdy kultura w fermentorze osiągnie OD600 wynoszącą 1,2, przeprowadzić indukcję poprzez aseptyczne dodanie 1,5 l roztworu YNB z 20% galaktozą oraz 1,2 l glicerolu. Obniżyć temperaturę do 25 °C i hodować kulturę przez 16 godzin.
  5. Przenieść zawartość fermentora do schłodzonych naczyń wirówkowych o pojemności 1 l na lodzie za pomocą pompy perystaltycznej. Zebrać komórki poprzez wirowanie przy 3 500 x g i 4 °C przez 30 minut w rotorze o dużej pojemności (np. 6 litrów). Resuspender komórki w 150 ml lodowatego buforu CRB z inhibitorami proteaz. Od tego momentu wszystkie prace należy prowadzić w temperaturze 4 °C.
  6. Zlizeować komórki, przepuszczając je przez homogenizator komórkowy Constant Systems w 4 cyklach przy 25, 30, 32 i 35 kPa, zbierając lizat na lodzie w każdym przypadku. Alternatywnie użyć homogenizatora kuleczkowego (Biospec) z równą objętością wymytych kwasem szklanych kuleczek o średnicy 0,5 mm i mieszać przez 3 minuty przy pełnej mocy. Przenieść lizat do probówek Falcon 50 ml i odwirować szczątki komórkowe przy 3 500 x g i 4 °C przez 15 minut w wirówce laboratoryjnej.
  7. Przenieść nadsącz do schłodzonych probówek wirówkowych. Wirować przy 14 000 x g i 4 °C przez 30 minut w wirówce w celu usunięcia mitochondriów.
  8. Przenieść nadsącz do schłodzonych probówek do ultrawirowania. Wirować przy 200 000 x g i 4 °C przez 90 minut w ultrawirówce w celu zebrania mikrosomów.
  9. Ostrożnie odlać i usunąć nadsącz, a do każdej probówki dodać 2 ml lodowatego buforu CFTR z inhibitorami proteaz i 1 mM DTT. Delikatnie resuspender osady za pomocą pędzelka, dopełnić każdą probówkę buforem CFTR i wymieszać za pomocą miksera wortex.
  10. Wirować zawiesinę przy 200 000 x g i 4 °C przez 60 minut w ultrawirówce, usunąć nadsącz i resuspender osady w 2 ml lodowatego buforu CFTR z inhibitorami proteaz (bez DTT) za pomocą pędzelka.
  11. Połączyć zresuspenderowane mikrosomy, dostosować objętość końcową do 50 ml buforem CFTR i dobrze wymieszać. Odstawić aliquotę 1 ml do analizy żelem SDS-PAGE, zgodnie z opisem w punktach 2.9 - 2.11. Mikrosomy można teraz zamrozić gwałtownie w ciekłym azocie, a następnie przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu użycia.
  12. Białko CFTR można ekstrahować z mikrosomów, używając jednego z następujących detergentów: kwasu perfluorooctanowego litu (LiPFO), tetradekanolo-lizo-fosfatydylo glicerolu (LPG14), n-dodecyl-β-D-maltosidu (DDM). Wymieszać mikrosomy z buforem CFTR, inhibitorami proteaz i 5% detergentem (m/m). W przypadku użycia DDM dodać do buforu również 300 mM NaCl. Mieszać w temperaturze 4 °C przez 15 minut na rotatorze do probówek.
  13. Wirować próbki przy 100 000 x g i 4 °C przez 1 godzinę w ultrawirówce. Zachować nadsącz i pobrać niewielką aliquotę do analizy żelem SDS-PAGE. CFTR można teraz oczyścić z rozpuszczonego materiału za pomocą chromatografii powinowactwa do zimmobilizowanych jonów metali, a następnie chromatografii wykluczania cząsteczkowego.

4. Reprezentatywne wyniki

Transformacja drożdży plazmidem zawierającym CFTR nie jest w 100% wydajna. Reprezentatywny screening małoskalowy ekspresji CFTR w wybranych koloniach z eksperymentu transformacji wykaże, że białko jest eksprimowane w około 1 na 4 koloniach. Typowy wynik screeningu 5 kolonii pobranych z płytki przedstawiono na panelu A rys. 3. Jedna z kolonii wykazuje silny poziom ekspresji białka fuzyjnego CFTR-GFP, które zazwyczaj migruje między markerami 250 kDa a 130 kDa, jak pokazano. Poziomy fluorescencji CFTR-GFP będą znacznie różnić się między eksperymentami, przy czym kolonia 4 na rys. 3 wykazuje co najmniej 10-krotnie większą fluorescencję niż wewnętrzny prążek fluorescencyjny przy około 70kDa. Jeśli poziomy ekspresji CFTR-GFP wydają się dawać mniejszą fluorescencję niż prążek 70 kDa, prawdopodobnie warto przeprowadzić ponowną transformację i wybrać kolonię o wyższych poziomach ekspresji CFTR-GFP. Jak pokazano na rys. 3A, nawet przy wysokim poziomie ekspresji CFTR-GFP, jest mało prawdopodobne, aby prążek CFTR-GFP był widoczny w ekstrakcie komórkowym po barwieniu Coomassie.

Po wyhodowaniu wybranych kolonii w eksperymentach na większą skalę i wyizolowaniu mikrosomów, należy ocenić obecność CFTR-GFP wewnątrz mikrosomów, jak pokazano na Rys. 3B. Wyniki tego eksperymentu są istotne nie tylko dla oceny wydajności indukcji ekspresji, ale także dla sprawdzenia, czy mikrosomy zostały przygotowane starannie i czy zminimalizowano proteolizę. Wyniki przedstawione na Rys. 3B sugerują, że w tym eksperymencie ekspresja CFTR-GFP jest nieco niższa (oceniana w stosunku do wewnętrznego prążka 70kDa) niż w eksperymencie w małej skali pokazanym na panelu A. Wrażenie to jest jednak zaburzone przez prześwietlenie detektora fluorescencji w tym pomiarze. Działo się tak, ponieważ badacz sprawdzał obecność fragmentów proteolitycznych konstruktu CFTR. W tym eksperymencie istnieją dowody na obecność niektórych fluorescencyjnych fragmentów proteolitycznych między markerami 130 kDa a 100 kDa, ale są one bardzo słabe w porównaniu z pełnowymiarowym prążkiem CFTR-GFP. Przy zastosowaniu opisanych tutaj inhibitorów proteaz stwierdzamy niewielkie dowody na degradację proteolityczną CFTR po rozbiciu komórek. W przypadku zaobserwowania znacznej proteolizy zalecamy przygotowanie świeżych roztworów zapasowych inhibitorów proteaz. Stwierdziliśmy również, że komercyjne tabletki z koktajlem inhibitorów proteaz nie są tak skuteczne w tym systemie. Hodowla komórek powyżej 16 hr (po indukcji) doprowadzi do zmniejszenia ekspresji CFTR, co pokazano na Rysunku 4. Jest to prawdopodobnie spowodowane wymianą białka, być może w wyniku upregulacji mechanizmu kontroli jakości białek u drożdży6-9,13. Dlatego zaleca się monitorowanie poziomów ekspresji CFTR po indukcji galaktozą, jeśli jest to możliwe, ponieważ optymalny czas zbioru komórek może różnić się w zależności od laboratorium.

Schemat plazmidu, gen CFTR, znacznik eGFP, 8His, system ekspresyjny p424GAL1, badanie ekspresji genu.
Rycina 1. Drożżowy plazmid zawierający konstrukt CFTR. Fuzja CFTR-GFP-8His została wprowadzona do wektora ekspresyjnego 2μ p424GAL1, pod kontrolą promotora galaktozowego (GAL1). Wektor zawiera również marker selekcyjny uracylu (URA) oraz gen oporności na ampicylinę (Amp).

Schemat procesu transformacji bakteryjnej: przesiewanie i hodowla w fermentorze; obejmuje wyniki SDS-PAGE.
Rysunek 2. Schemat blokowy podsumowujący przedstawiony protokół.

Kolonie transformantów i wyniki elektroforezy białek w żelu; analiza mikrosomów i oczyszczonego CFTR.
Rycina 3. Reprezentatywne żele SDS-PAGE obrazujące ekspresję i oczyszczanie CFTR. Panel A przedstawia pięć losowo wybranych kolonii transformantów (ścieżki 1-5), które zostały przebadane pod kątem ekspresji CFTR. Panel B przedstawia mikrosomy wyizolowane z kultury w fermentorze o pojemności 15l. Panel C przedstawia oczyszczony mysi CFTR uzyskany po dwuetapowym oczyszczaniu z wykorzystaniem chromatografii powinowactwa, a następnie chromatografii wykluczania cząsteczkowego. Wszystkie żele pokazano w warunkach oświetlenia wzbudzającego fluorescencję domeny GFP (lewo) oraz po barwieniu Coomassie (prawo). Względne położenia markerów masy cząsteczkowej są wymienione po lewej stronie (kDa).

Pomiar fluorescencji; A: wykres czasu w funkcji fluorescencji; B: obraz z mikroskopii fluorescencyjnej.
Rysunek 4. Reprezentatywne dane dla ekspresji CFTR w drożdżach. Panel A przedstawia przebieg czasowy ekspresji CFTR po indukcji galaktozą. Ekstrakty komórkowe analizowano za pomocą SDS-PAGE, a następnie zintegrowano fluorescencję GFP dla prążka białka CFTR-GFP. Panel B przedstawia typowe wyniki mikroskopii fluorescencyjnej komórek wykazujących ekspresję GFP 16 h po indukcji. Zazwyczaj tylko część komórek wykazuje wysoką ekspresję CFTR.

Dyskusja

Niniejsza praca przedstawia metodę ekspresji mysiego białka CFTR w komórkach drożdży, co powinno ułatwić badania nad mukowiscydozą. Celem jest powiązanie tej pracy z udostępnieniem konstrukcji DNA mysiego CFTR, która będzie dostępna za pośrednictwem Cystic Fibrosis Foundation (http://www.cff.org/research/CFFT/). Inne ortologi powinny stać się dostępne w późniejszym terminie. Transformacja komórek drożdży wektorem zawierającym CFTR jest prosta, jednak ważne jest wyselekcjonowanie kolonii wykazujących wysoki poziom ekspresji CFTR. Zmienne poziomy ekspresji mogą wynikać z kilku czynników, ale liczba kopii plazmidu na komórkę prawdopodobnie odpowiada za znaczną część tych różnic. Opisane tutaj krytyczne etapy powinny umożliwić otrzymanie komórek drożdży eksponujących CFTR oraz błon mikrosomalnych zawierających CFTR. Po opanowaniu procesów transformacji, wzrostu, zbioru i lizy komórek drożdży, możliwa powinna być puryfikacja białka; na Rysunku 3 przedstawiliśmy przykład czystości, którą można osiągnąć w tym przypadku, jako przydatny punkt odniesienia. W niniejszym manuskrypcie nie zamierzamy przedstawiać szczegółowej metodologii puryfikacji białka. Istnieją jednak pewne krytyczne etapy puryfikacji końcowej specyficzne dla systemu ekspresyjnego S.cerevisae, takie jak liza komórek i puryfikacja mikrosomów, które zostały szczegółowo opisane w pracy. Należy jednak wspomnieć, że poza dwiema zastosowanymi przez nas metodami, można wykorzystać alternatywne metody rozbijania komórek drożdży, takie jak użycie prasy francuskiej (French pressure cell). Białko rekombinowane posiada C-terminalną domenę GFP z miejscem cięcia dla proteazy TEV, co pozwala na śledzenie białka po indukcji (Rys. 4). Drożdże posiadają endogenne białko 70kDa (prawdopodobnie dehydrogenazę bursztynianową12), które fluorescuje w tych samych warunkach11, co może stanowić przydatny wewnętrzny standard kalibracyjny dla względnych poziomów ekspresji CFTR w ekstraktach z całych komórek lub w mikrosomach (Rys. 3). Z danych przedstawionych na Rysunku 4 wynika jednoznacznie, że czas zbioru komórek po indukcji galaktozą jest kluczowy. Wydajność CFTR gwałtownie spada po około 16 hr indukcji, tak że po 24 hr indukcji w komórkach drożdży prawie nie wykrywa się CFTR.

Wydajność oczyszczonego białka wynosi około 1-2mg białka CFTR z 15 litrów kultury w fermentorze. Odzysk można oszacować na około 70% całkowitego białka CFTR-GFP do etapu mikrosomów oraz około 25% odzysku białka oczyszczonego. Charakterystyka CFTR ekspresowanego w S. cerevisiae jest w toku. Jak pokazano na Rys. 4, lokalizację białka w komórce można monitorować za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Chociaż znaczna część fluorescencji znajduje się wokół peryferii komórki, zgodnie z oczekiwaniami10, część białka wykazuje lokalizację punktową, w obrębie lub tuż wewnątrz błony plazmatycznej, co może wynikać z recyklingu CFTR poprzez późną drogę aparatu Golgiego/endosomalną14 lub być wynikiem obecności w przedziale za etapem pączkowania pęcherzyków transportowych z ER4. Traktowanie PNGazą F, enzymem deglikozylującym białka, wykazało minimalną zmianę w migracji prążka białka CFTR w SDS-PAGE, co sugeruje, że jest ono nieglikozylowane lub wykazuje minimalną glikozylację15. Trwają eksperymenty nad stanem fosforylacji białka. W niektórych z dotychczas przetestowanych detergentów oczyszczone białko wykazuje aktywność ATPase (hamowaną przez specyficzny inhibitor CFTR16) z szybkością podobną do wcześniej opublikowanych danych2,15. Pomiar aktywności kanału CFTR będzie wymagał rekonstytucji oczyszczonego białka, co wiązałoby się z końcowym etapem oczyszczania w detergencie o stosunkowo wysokim krytycznym stężeniu micelarnym (cmc)17. Mikrosomy drożdżowe zawierające CFTR można solubilizować za pomocą kilku powszechnie stosowanych detergentów18, w tym detergentów takich jak dodecyl maltosyd2, które są ogólnie uważane za „łagodne”. Jednakże większość detergentów o wysokim cmc okazała się do tej pory nieefektywna w solubilizacji, co sugeruje, że wymianę na te detergenty należy rozważyć na późnym etapie każdego schematu oczyszczania.

Oświadczenia

Nie zgłoszono konfliktów interesów.

Podziękowania

Dziękujemy fundacji Cystic Fibrosis Foundation (CFF) za sfinansowanie tych prac w ramach konsorcjum CFTR 3D Structure Consortium (numer grantu FORD08XX0). Wyrażamy uznanie dla ogromnego wkładu wszystkich naszych współpracowników z Konsorcjum w tę pracę, w szczególności w zakresie projektowania genów CFTR. Dziękujemy również za nieoceniony wkład dr Jamesa Birtleya (NCSR Demokritos, Grecja), dr Marka Younga (University of Cardiff, Wielka Brytania) oraz dr Davida Drew (Imperial College, Londyn, Wielka Brytania) na wczesnych etapach prac. Szczególne podziękowania kierujemy do dr Iny Urbatsch (Texas Tech University, Lubbock) za krytyczną lekturę manuskryptu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Szczep FGY217 S.cerevisiae, z delecją pep4 10
Podłoże azotowe dla drożdży bez aminokwasówFormediumCYN0410
Kompletna mieszanina suplementów bez uracyluFormediumDCS0169
Agar bakteriologicznySigma-AldrichA5306
D-galaktozaFisherBP656-500
D-glukozaFisherD16-500
Pepstatyna ASigma-AldrichP4265
LeupeptynaMerck108975
ChimostatynaSigma-AldrichC7268
Fenylometanosulfonylofluorek (PMSF)Sigma-AldrichP7626
Epoksysuccinylo-leucyloamido-butan (E-64)Sigma-AldrichE3132
Amin–tylobenzenosulfonylofluorek (AEBSF)Sigma-AldrichA8456
Chlorowodorek benzamidynySigma-Aldrich434760
Dimetylosulfotlenek (DMSO)Sigma-AldrichD8418
Ditiotreitol (DTT)Sigma-Aldrich43815
Kwas etylendiaminotetraoctowy (EDTA)FisherBP120500
Tris-baseFormediumTRIS01
Tris-HClFisherP631
D-sorbitolSigma-AldrichS1876
GlicerolFisher065017
NaClSigma-AldrichS6191
n-dodecyl-β-D-maltopiranozydAffymetrixD310S
Błękit bromofenolowySigma-Aldrich114391
Barwione standardy białkowe PageRuler PlusFermentasSM1811
Żele gradientowe NuSep tris-gly 4-20%NuSepNB10-420
Barwnik Coomassie Instant BlueNovexinISB1L
Kuleczki szklane, myte kwasemSigmaG8772
Sterylne probówki Falcon 50 mlSarstedt62.547.254
Sterylne fiolki z nakrętką 2 mlSarstedt72.694.005
Sterylne kolby Erlenmeyera z wypustkami 250 mlBD Biosciences355119
Sterylne kolby Erlenmeyera z wypustkami 2 lBD Biosciences355131
Probówki do mikrocentryfugi 2 mlSarstedt72.695
Filtr strzykawkowy 0,2μMSartoriusFC121
Probówki do ultracentryfugiBeckman Coulter355618
Probówki do wirówkiBeckman Coulter357000
Kubki do wirówki 1 lBeckman Coulter969329
Inkubator z wytrząsaniem orbitalnym i kontrolą temperaturyNew Brunswick Scientific
Mikroskop do rekonstrukcji RT DeltavisionApplied Vision
Wirówka nakładkowaHERMLEZ300
Mikrowirówka nakładkowaFisher13-100-511
Mieszadło VortexStar Labs
Skaner Typhoon TrioGE Healthcare63-0055-87
System obrazowania LAS3000Fuji
Zbiornik fermentora 20 l i jednostka sterującaApplikon
Homogenizator komórkowy Constant systemsConstant systems
Homogenizator komórkowy BeadbeaterBioSpec1107900
Mini-beadbeater-16BioSpec607
Rotor JA-17Beckman Coulter369691
Ultracentryfuga Optima L-100Beckman Coulter392050
Rotor 50.2TiBeckman Coulter337901

Bibliografia

  1. Ford, R. C., Birtley, J., Rosenberg, M. F., Zhang, L. CFTR three-dimensional structure. Methods Mol. Biol. 741, 329-346 (2011).
  2. Rosenberg, M. F., Kamis, A. B., Aleksandrov, L. A., Ford, R. C., Riordan, J. R. Purification and crystallization of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. CFTR). J. Biol. Chem. 279, 39051-39051 (2004).
  3. Zhang, L., Aleksandrov, L. A., Riordan, J. R., Ford, R. C. Domain location within the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator protein investigated by electron microscopy and gold labelling. Biochim. Biophys. Acta. 1808, 399-404 (2011).
  4. Kiser, G. L. Expression and degradation of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator in Saccharomyces cerevisiae. Arch. Biochem. Biophys. 390, 195-205 (2001).
  5. Huang, P., Stroffekova, K., Cuppoletti, J., Mahanty, S. K., Scarborough, G. A. Functional expression of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator in yeast. Biochim. Biophys. Acta. 1281, 80-90 (1996).
  6. Ahner, A., Nakatsukasa, K., Zhang, H., Frizzell, R. A., Brodsky, J. L. Small heat-shock proteins select deltaF508-CFTR for endoplasmic reticulum-associated degradation. Mol. Biol. Cell. 18, 806-814 (2007).
  7. Fu, L., Sztul, E. ER-associated complexes (ERACs) containing aggregated cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) are degraded by autophagy. Eur. J. Cell. Biol. 88, 215-226 (2009).
  8. Sun, F. Derlin-1 promotes the efficient degradation of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) and CFTR folding mutants. J. Biol. Chem. 281, 36856-36863 (2006).
  9. Zhang, Y., Michaelis, S., Brodsky, J. L. CFTR expression and ER-associated degradation in yeast. Methods Mol. Med. 70, 257-2565 (2002).
  10. Drew, D. GFP-based optimization scheme for the overexpression and purification of eukaryotic membrane proteins in Saccharomyces cerevisiae. Nat. Protoc. 3, 784-798 (2008).
  11. Knight, A. W., Billinton, N. Seeing the wood through the trees: A review of techniques for distinguishing green fluorescent protein from endogenous autofluorescence. Anal. Biochem. 291, 175-197 (2001).
  12. Robinson, K. M., Lemire, B. D. Isolation and nucleotide sequence of the Saccharomyces cerevisiae gene for the succinate dehydrogenase flavoprotein subunit. J. Biol. Chem. 267, 10101-10107 (1992).
  13. Gnann, A., Riordan, J. R., Wolf, D. H. Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator degradation depends on. the lectins Htm1p/EDEM and the Cdc48 protein complex in. 15, 4125-4135 (2004).
  14. Yoo, J. S. Non-conventional trafficking of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator through the early secretory pathway. J. Biol. Chem. 277, 11401-11409 (2002).
  15. Zhang, L. Architecture of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator protein and structural changes associated with phosphorylation and nucleotide binding. Journal of Structural Biology. 167, 242-251 (2009).
  16. Wellhauser, L. A small-molecule modulator interacts directly with deltaPhe508-CFTR to modify its ATPase activity and conformational stability. Mol. Pharmacol. 75, 1430-148 (2009).
  17. Ramjeesingh, M. A monomer is the minimum functional unit required for channel and ATPase activity of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. Biochemistry. 40, 10700-10706 (2001).
  18. Huang, P., Liu, Q., Scarborough, G. A. Lysophosphatidylglycerol: a novel effective detergent for solubilizing and purifying the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. Anal. Biochem. 259, 89-97 (1998).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Ekspresja CFTRekspresja w dro d achoczyszczanie bia kaprzygotowanie mikrosom wchromatografia powinowactwa do metalichromatografia wykluczania elowegoznakowanie GFPmikroskopia fluorescencyjna
Ekspresja i oczyszczanie białka regulatora przewodnictwa przezbłonowego w mukowiscydozie w Saccharomyces cerevisiae
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.