Eksperymentalny model zapalenia wsierdzia gronkowca złocistego opornego na metycylinę (MRSA) u szczura

Summary

Eksperymentalny model zapalenia wsierdzia u szczurów spowodowany opornym na metycylinę S. aureus.

Abstract

Infekcje wewnątrznaczyniowe, w tym zapalenie wsierdzia, to zagrażające życiu zespoły zakaźne^1-3. Staphylococcus aureus jest najczęstszą na świecie przyczyną takich zespołów, z niedopuszczalnie wysoką zachorowalnością i śmiertelnością, nawet przy odpowiednim leczeniu środkami przeciwbakteryjnymi^4-6. Wzrost liczby zakażeń wywołanych przez opornego na metycylinę S. aureus (MRSA), wysoki odsetek niepowodzeń klinicznych leczenia wankomycyną oraz rosnące problemy z opornością na linezolid i daptomycynę dodatkowo skomplikowały postępowanie z pacjentami z takimi zakażeniami i doprowadziły do wysokich kosztów opieki zdrowotnej^{7, 8}. Ponadto należy podkreślić, że większość najnowszych badań dotyczących wyników leczenia antybiotykami opiera się na warunkach klinicznych, a zatem mogą mieć na nie wpływ czynniki gospodarza, które różnią się w zależności od pacjenta. W związku z tym odpowiedni zwierzęcy model infekcji wewnątrznaczyniowej, w którym czynniki gospodarza są podobne u różnych zwierząt, ma większe znaczenie dla zbadania patogenezy drobnoustrojów, a także skuteczności nowych środków przeciwdrobnoustrojowych. Zapalenie wsierdzia u szczurów jest dobrze ugruntowanym eksperymentalnym modelem zwierzęcym, który jest bardzo zbliżony do ludzkiego natywnego zapalenia wsierdzia zastawki. Model ten został wykorzystany do zbadania roli poszczególnych czynników wirulencji gronkowcowej oraz skuteczności schematów leczenia antybiotykami w gronkowcowym zapaleniu wsierdzia. W niniejszym raporcie opisujemy eksperymentalny model zapalenia wsierdzia wywołanego przez MRSA, który można wykorzystać do zbadania patogenezy bakterii i odpowiedzi na antybiotykoterapię.

Protocol

1. Przygotowanie szczepów MRSA do infekcji

1. Zaszczepić pętlę kultury MRSA z probówki podstawowej w temperaturze -80 °C na płytkę z tryptykazą sojową z krwi owczej (TSA) (patrz Tabela konkretnych odczynników i sprzętu) i inkubować w temperaturze 37 °C przez noc.
2. Sprawdź czystość kultury na płytce z agarem z krwią (podobne fenotypy kolonii), aby upewnić się, że nie ma zanieczyszczenia.
3. Wybierz jedną rodzinę z płytki TSA z krwią owczą i zaszczep ją w 5 ml bulionu sojowego z tryptykazy (TSB) w 15-mililitrowej probówce z zatrzaskową nakrętką.
4. Inkubować w temperaturze 37 °C przez noc, wytrząsając przy 200 obr./min.

2. Przygotowanie cewników chirurgicznych

Wytnij rurkę polietylenową (PE10; Becton Dickinson, nr zamówienia 427401) do 10 cm długości i stopić jeden koniec, naciskając końcówkę sterylnymi kleszkami. Celem uszczelnienia jednego końca cewnika jest uniknięcie krwawienia podczas cewnikowania.

3. Przygotowanie przedoperacyjne i znieczulenie

1. Szczura Sprague-Dawley (Harlan, Indianapolis, Ind. samica, 250-300 gramów) umieścić w komorze zawierającej mieszaninę izofluoranu i tlenu gazowego (50%:50%) do momentu działania znieczulenia (np. mięśnie są rozluźnione i nie ma odruchów pedałowania) i utrzymuj zwierzęta w stanie znieczulonym podczas operacji za pomocą mieszaniny gazów.
2. Oczyść obszar szyi od podbródka do tuż pod mostkiem za pomocą betadyny i 70% etanolu.

4. Zabieg chirurgiczny

1. Stosuj sterylną technikę przez cały czas trwania operacji. Wykonaj nacięcie (1-1,5 cm) pionowo tylko przez warstwę skóry szyi powyżej mostka.
2. Za pomocą rozwarstwienia oddziel powięź, aby odsłonić prawą tętnicę szyjną za pomocą 2 par zakrzywionych kleszczy zębatych.
3. Delikatnie wyciągnij tętnicę z jamy szyjnej i umieść dwa 10-centymetrowe jedwabne szwy pod tętnicą i zwiąż tętnicę na odsłoniętym końcu głowowym, umieść klips na tętnicy, aby zapobiec krwawieniu.
4. Wykonaj mały otwór w górnej części tętnicy za pomocą wprowadzacza cewnika (Becton Dickinson, nr zamówienia 406999), wprowadź cewnik z kleszczami przez otwór w tętnicy, zdejmij klips i popchnij cewnik w dół w kierunku serca, aż do napotkania oporu.
5. Zawiąż luźny szew wokół ogonowego końca tętnicy i zabezpiecz cewnik na miejscu za pomocą jedwabnego szwu, gdy cewnik jest na swoim miejscu, zgodnie z: i) długością wprowadzonego cewnika (4-5 cm); ii) opór przed dalszym postępem; oraz iii) pulsacja cewnika wraz z biciem serca. Pozostaw cewnik na miejscu do końca eksperymentu.
6. Odetnij nadmiar szwów i końcówek cewnika i upewnij się, że nie ma krwawienia z cewnika. Wsuń luźne końce pod skórę szyi i zamknij skórę klipsami do skóry.
7. Umieść szczura w klatce w ciepłym miejscu do czasu wyzdrowienia ze znieczulenia i zapewnij mu jedzenie i wodę. Często sprawdzaj szczura w trakcie i po wyzdrowieniu ze znieczulenia.
8. Ta operacja jest zabiegiem "kategorii E". Zabiegi wywołujące ból nie są łagodzone przez leki przeciwbólowe, ponieważ infekcje MRSA towarzyszą stresowi zwierząt.

5. Zakażenie MRSA

1. Infekcja może być wykonana od 1 do 7 dni po operacji, ale należy zachować spójność w ramach eksperymentów.
2. Oczyść ogon szczura 70% etanolem i wstrzyknij 0,5 ml MRSA przy żądanej liczbie komórek (10,⁴ - 10,⁶ jtk/zwierzę dla większości szczepów S. aureus) za pomocą igły 27 G 1/2 cala dożylnie z żyły ogonowej. Ostrzeżenie: Hodowla MRSA należy do poziomu bezpieczeństwa biologicznego 2 (BSL2) i stanowi umiarkowane potencjalne zagrożenie dla personelu i środowiska.
3. Utrzymuj ciśnienie w miejscu, aż wystąpi hemostaza przed powrotem szczura do klatki.

6. Szczury ofiarne i tkanki docelowe kultury

1. Uśmiercać szczury przez wstrzyknięcie pentobarbitalu sodu (200 mg / kg) po 1 do 6 dni po zakażeniu.
2. Połóż szczura na plecach i przetrzyj klatkę piersiową 70% etanolem.
3. Wykonaj nacięcie w kształcie litery V w klatce piersiowej poniżej mostka i przetnij chrząstkę żeber po obu stronach mostka, aby odsłonić serce.
4. Delikatnie pociągnij serce do góry i przetnij tkankę serca w pobliżu aorty i wypreparuj, aby uwolnić serce.
5. Umieść serce na sterylnej szalce Petriego z gazą 4x4 cale w środku, wykonaj nacięcie przez wewnętrzną ścianę lewej komory i otwórz lewostronną komorę.
6. Sprawdź wzrokowo, czy cewnik jest umieszczony. Zbadaj i usuń roślinność z zaworu za pomocą nożyczek i kleszczy.
7. Zważyć i homogenizować wegetacje, a następnie wykonać seryjne rozcieńczenia PBS w celu hodowli ilościowej.

7. Reprezentatywne wyniki

Natychmiast po wprowadzeniu cewnika do tętnicy i przesunięciu cewnika w dół o około 4-5 cm w kierunku serca, wystąpi opór. Jeśli nie zostanie wyczuwany żaden opór, cewnik mógł nie zostać pomyślnie wprowadzony po lewej stronie komory serca, co może mieć wpływ na umieszczenie cewnika. Prawidłowe umieszczenie cewnika opublikowane wcześniej⁹ pokazano na rycinie 1.

Część próbek infekcji MRSA musi być poddana hodowli ilościowej, aby upewnić się, że próbka infekcji ma dokładną liczbę bakterii zdolnych do życia i czystość infekcji. Ponadto organizmy odzyskane z wegetacji powinny być takie same, jak te użyte w inokulum.

Tabela 1 przedstawia przykład zjadliwości szczepu S. aureus w modelu zapalenia wsierdzia szczura, który został opublikowany wcześniej⁹. U wszystkich zwierząt, którym podano inokulację 10,⁵ i 10,⁶ jtk i które uśmiercono między 3 a 6 dni po zakażeniu, rozwinęły się wsierdzia o wysokim zagęszczeniu S. aureus w roślinach sercowych, a także w nerkach i śledzionie (Tabela 1). Szczury ze sterylnymi kulturami zastawek są uważane za niezakażone.

Rysunek 1. Cewnik znajduje się we właściwym miejscu (lewa strona komory serca), a wokół zastawek aortalnych widoczne są liczne wegetacje⁹.

Inokulum (liczba animas) Średnia log₁₀ jtk/g tkanki ± SD^a w:   roślinność nerka śledziona 10⁶ jtk/zwierzę (9) 10,36 ± 0,85 7,30 ± 0,64 6,70 ± 0,57 10⁵ jtk/zwierzę (8) 9,93 ± 0,53 7,14 ± 0,53 6,44 ± 0,63 10⁴ jtk/zwierzę (7) 3,46 ± 0,50* 1,81 ± 0,74* 1,58 ± 0,59*

a SD, ^odchylenie standardowe. P < 0,001 w odniesieniu do 10,⁵ lub 10⁶ zwierząt z niepełnosprawnością CFU.

Tabela 1. Gęstość S. aureus w roślinach sercowych z różnymi inokulami w modelu zapalenia wsierdzia szczura⁹.

Discussion

Zapalenie wsierdzia u szczurów jest ważnym i dobrze scharakteryzowanym modelem zwierzęcym do badań in vivo nad patogenezą i środkami przeciwdrobnoustrojowymi w leczeniu zakażeń bakteryjnych ^9-11. Ponadto model zapalenia wsierdzia szczura stanowi połączenie ostrych i podostrych infekcji i ściśle naśladuje ludzki odpowiednik i ludzkie natywne zapalenie wsierdzia zastawki. Co więcej, w połączeniu z cewnikiem w domu, stanowi klasyczną infekcję związaną z biofilmem, co jest częstym i trudnym problemem w wa...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Talerz agarowy z krwią, 5% krwi owczej w tryptykazie Agar sojowy (TSA)	Hardy Diagnostics	A10BX
Tryptyka Rosół sojowy (TSB)	BD Biosciences	211825
Inkubator z wytrząsaniem	Labnet International	I5311-DS
Rurka polietylenowa	BD Biosciences	427401
Wprowadzenie cewnika	BD Biosciences	6999
Isofluorance	Western Medical Suppy, Inc	2147	Postępuj zgodnie z informacjami dotyczącymi bezpieczeństwa i obsługi
Instrumenty chirurgiczne	Narzędzia do nauk ścisłych i instrumenty do badań biomedycznych, Inc.		Znajdź instrumenty obu firm odpowiadające Twoim potrzebom