Eksperymentalny model zapalenia wsierdzia wywołanego przez gronkowiec złocisty oporny na metycylinę (Staphylococcus aureus MRSA) u szczura

Podsumowanie

Eksperymentalny model zapalenia wsierdzia u szczura wywołanego przez gronkowiec złocisty (S. aureus) oporny na metycylinę.

Streszczenie

Zakażenia śródnaczyniowe, w tym zapalenie wsierdzia, są zagrażającymi życiu zespołami zakaźnymi^1-3. Staphylococcus aureus jest najczęstszą na świecie przyczyną takich zespołów, charakteryzujących się nieakceptowalnie wysoką zachorowalnością i śmiertelnością, nawet przy zastosowaniu odpowiedniego leczenia środkami przeciwdrobniczymi^4-6. Wzrost liczby zakażeń wywołanych przez metycylinooporne S. aureus (MRSA), wysoki odsetek niepowodzeń klinicznych w leczeniu wankomycyną oraz narastające problemy z opornością na linezolid i daptomycynę dodatkowo skomplikowały opiekę nad pacjentami z takimi zakażeniami i doprowadziły do wysokich kosztów opieki zdrowotnej^{7, 8}. Ponadto należy podkreślić, że większość najnowszych badań nad wynikami leczenia antybiotykami była prowadzona w warunkach klinicznych i w związku z tym mogła znajdować się pod wpływem czynników gospodarza, które różnią się od pacjenta do pacjenta. Dlatego też odpowiedni model zwierzęcy zakażenia śródnaczyniowego, w którym czynniki gospodarza są podobne u poszczególnych zwierząt, jest kluczowy dla badania patogenezy mikrobiologicznej, a także skuteczności nowych środków przeciwdrobniczych. Zapalenie wsierdzia u szczura to dobrze ugruntowany eksperymentalny model zwierzęcy, który ściśle odwzorowuje ludzkie zapalenie wsierdzia zastawek natywnych. Model ten był wykorzystywany do badania roli konkretnych czynników wirulencji gronkowców oraz skuteczności schematów leczenia antybiotykowego w zapaleniu wsierdzia wywołanym przez gronkowce. W niniejszym raporcie opisujemy eksperymentalny model zapalenia wsierdzia wywołanego przez MRSA, który może być wykorzystany do badania patogenezy bakteryjnej oraz odpowiedzi na leczenie antybiotykowe.

Protokół

1. Przygotowanie szczepów MRSA do zakażenia

1. Zaszczep pętlą kulturę MRSA z probówki z materiałem zapasowym przechowywanym w -80 °C na płytkę z agarem Trypticase Soy (TSA) z krwią owczą (patrz Tabela specyficznych odczynników i sprzętu) i inkubuj w 37 °C przez noc.
2. Sprawdź czystość kultury na płytce z agarem krwi (podobne fenotypy kolonii), aby upewnić się, że nie doszło do kontaminacji.
3. Wyizoluj jedną kolonię z płytki TSA z krwią owczą i zaszczep ją do 5 ml bulionu Trypticase Soy (TSB) w probówce z nakrętką typu snap o pojemności 15 ml.
4. Inkubuj w 37 °C przez noc z wstrząsaniem przy 200 rpm.

2. Przygotowanie cewników chirurgicznych

Przetnij rurkę polietylenową (PE10; Becton Dickinson, nr zamówienia 427401) na odcinki o długości 10 cm i stop jeden koniec, dociskając końcówkę sterylną pęsetą. Celem uszczelnienia jednego końca cewnika jest zapobieganie krwawieniu podczas cewnikowania.

3. Przygotowanie przedoperacyjne i znieczulenie

1. Umieść szczura Sprague-Dawley (Harlan, Indianapolis, Ind. samica, 250-300 g) w komorze z mieszanką gazową izofluranu i tlenu (50%:50%), aż środek znieczulający zacznie działać (np. mięśnie się rozluźnią, a odruchy stopowe zanikną), i utrzymuj zwierzę w stanie znieczulenia podczas zabiegu przy użyciu tej mieszanki gazowej.
2. Oczyść obszar szyi od podbródka do miejsca tuż poniżej mostka za pomocą Betadinu i 70% etanolu.

4. Procedura chirurgiczna

1. Przez cały czas trwania operacji stosować technikę sterylną. Wykonać nacięcie (1-1,5 cm) pionowo tylko przez warstwę skóry szyi nad mostkiem.
2. Za pomocą tępej dyssekcji oddzielić powięź, aby odsłonić prawą tętnicę szyjną, używając dwóch par zakrzywionych pęset ząbkowanych.
3. Delikatnie wyciągnąć tętnicę z jam szyjnej, umieścić dwa 10 cm odcinki nici jedwabnej pod tętnicą i zawiązać tętnicę na odsłoniętym końcu głowowym, a następnie założyć klips na tętnicę, aby zapobiec krwawieniu.
4. Wyonać niewielki otwór w górnej części tętnicy za pomocą wprowadzacza do cewnika (Becton Dickinson, nr zamówienia 406999), wprowadzić cewnik przez otwór w tętnicy za pomocą pęsety, zdjąć klips i przesuwać cewnik w dół w kierunku serca, aż do napotkania oporu.
5. Zawiązać luźną nić wokół końca ogonowego tętnicy i unieruchomić cewnik nicią jedwabną, gdy cewnik znajdzie się na miejscu, co określa się na podstawie: i) długości wprowadzonego cewnika (4-5 cm); ii) oporu przy dalszym przesuwaniu; oraz iii) pulsacji cewnika zgodnie z rytmem serca. Pozostawić cewnik na miejscu przez resztę eksperymentu.
6. Odciąć nadmiar nici i końce cewnika oraz upewnić się, że z miejsca wprowadzenia cewnika nie występuje krwawienie. Wsunąć wolne końce pod skórę szyi i zamknąć skórę za pomocą klipsów skórnych.
7. Umieścić szczura w klatce w ciepłym miejscu do czasu wybudzenia z narkozy oraz zapewnić dostęp do pokarmu i wody. Często sprawdzać stan szczura podczas i po wybudzaniu z narkozy.
8. Niniejszy zabieg jest procedurą „Kategorii E”. Ból wywołany procedurami nie jest łagodzony lekami przeciwbólowymi, ponieważ infekcje MRSA wiążą się z cierpieniem zwierząt.

5. Zakażenie MRSA

1. Zakażenie można przeprowadzić od 1 do 7 dni po operacji, jednak należy zachować spójność w obrębie poszczególnych eksperymentów.
2. Oczyścić ogon szczura 70% etanolem i wstrzyknąć dożylnie w żyłę ogonową 0,5 ml MRSA o pożądanej liczbie komórek (10⁴ - 10⁶ cfu/zwierzę dla większości szczepów S. aureus), używając igły 27 G o długości 1/2 cala. Uwaga: kultura MRSA należy do 2. poziomu bezpieczeństwa biologicznego (BSL2) i stanowi umiarkowane zagrożenie dla personelu oraz środowiska.
3. Uciskać miejsce wkłucia aż do uzyskania hemostazy przed umieszczeniem szczura z powrotem w klatce.

6. Uśmiercenie szczurów i hodowla tkanek docelowych

1. Uśmierć szczury poprzez wstrzyknięcie dootrzewnowe pentobarbitalu sodu (200 mg/kg) od 1 do 6 dni po zakażeniu.
2. Połóż szczura na plecach i przemyj klatkę piersiową 70% etanolem.
3. Wykonaj nacięcie w kształcie litery V w klatce piersiowej poniżej mostka i przetnij chrząstki żeber po obu stronach mostka, aby odsłonić serce.
4. Ostrożnie wyciągnij serce do góry, przetnij tkankę serca w pobliżu aorty i przeprowadź preparację, aby całkowicie uwolnić organ.
5. Umieść serce na sterylnej szalce Petriego z wyłożoną gazą o wymiarach 4x4 cale, wykonaj nacięcie wewnętrznej ściany lewej komory i otwórz komorę lewą.
6. Sprawdź wizualnie położenie cewnika. Odszukaj i usuń wegetacje z zastawki za pomocą nożyczek i pęsety.
7. Zważ i zhomogenizuj wegetacje, a następnie wykonaj rozcieńczenia seryjne w PBS w celu przeprowadzenia posiewu ilościowego.

7. Reprezentatywne wyniki

Bezpośrednio po wprowadzeniu cewnika do tętnicy i przesunięciu go o około 4-5 cm w stronę serca, odczuwalny będzie opór. Jeśli opór nie zostanie wyczuty, cewnik mógł nie zostać prawidłowo wprowadzony do lewej komory serca, co może wpłynąć na jego umiejscowienie. Prawidłowe umiejscowienie cewnika, opisane w poprzednich publikacjach⁹, przedstawiono na Rysunku 1.

Część próbek z zakażenia MRSA musi zostać poddana hodowli ilościowej, aby upewnić się co do dokładnej liczby żywych bakterii wywołujących zakażenie oraz czystości próbki zakażeniowej. Ponadto organizmy wyizolowane z wegetacji powinny być takie same, jak te użyte w inokulum.

Tabela 1 przedstawia przykład wirulencji szczepu S. aureus w modelu zapalenia wsierznika u szczurów, który został opublikowany wcześniej⁹. Wszystkie zwierzęta poddane zakażeniu dawkami 10⁵ i 10⁶ cfu i uśpione od 3 do 6 dni po zakażeniu rozwinęły zapalenie wsierznika z wysoką gęstością S. aureus w wegetacjach serca, a także w nerkach i śledzionie (Tabela 1). Szczury z jałowymi kulturami zastawek uznano za niezakażone.

Rysunek 1. Cewnik znajduje się w prawidłowym miejscu (lewa komora serca), a wokół zastawek aorty widoczne są liczne wegetacje⁹.

Inokulum (liczba zwierząt)	Średnia logarytmiczna10 CFU/g tkanki ± SDa w:
	Roślinność	Nerka	Śledziona
106 CFU/zwierzę (9)	10.36 ± 0.85	7.30 ± 0.64	6.70 ± 0.57
105 JCF/zwierzę (8)	9.93 ± 0.53	7.14 ± 0.53	6.44 ± 0.63
104 JCF/zwierzę (7)	3.46 ± 0.50*	1.81 ± 0.74*	1.58 ± 0.59*

^a SD, odchylenie standardowe. P < 0,001 w stosunku do zwierząt poddanych wyzwaniu 10⁵ lub 10⁶ CFU.

Tabela 1. S. aureus gęstość w naciekach serca przy różnych dawkach inokulum w szczurzym modelu zapalenia wsierdzia⁹.

Dyskusja

Zapalenie wsierdzia u szczura jest istotnym i dobrze scharakteryzowanym modelem zwierzęcym dla badań in vivo nad patogenezą oraz środkami przeciwmikrobowymi w leczeniu infekcji bakteryjnych ^9-11. Ponadto model zapalenia wsierdzia u szczura stanowi kompozycję infekcji ostrych i podostrych, ściśle naśladując odpowiednik ludzki oraz zapalenie wsierdzia natywnych zastawek u ludzi. Co więcej, dzięki obecności cewnika treściwego, model ten reprezentuje klasyczną infekcję związaną z biofilmem, co jest powsze...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Płytka z agarem krwi, 5% krwi owczej w agarze sojowym z tryptykazą (TSA)	Hardy Diagnostics	A10BX
Bulion sojowy z tryptykazą (TSB)	BD Biosciences	211825
Inkubator z wytrząsaniem	Labnet International	I5311-DS
Przewody polietylenowe	BD Biosciences	427401
Wprowadzacz cewnika	BD Biosciences	6999
Isofluorance	Western Medical Suppy, Inc	2147	Należy przestrzegać informacji dotyczących bezpieczeństwa i obchodzenia się z produktem
Instrumenty chirurgiczne	Fine Science Tools and Biomedical Research Instruments, Inc.		Należy dobrać instrumenty z oferty obu firm zgodnie z potrzebami