Artykuł metodologiczny

Zastosowanie cystometrii u małych gryzoni: badanie chemosensytywności pęcherza moczowego

23.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/3869

⸱

21 sierpnia 2012

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Experimental Urology, Department of Development and Regeneration, KU Leuven, Belgium, 2Laboratory for Ion Channel Research, Department of Cellular and Molecular Medicine, KU Leuven, Belgium, 3TRP Research Platform Leuven (TRPLe), KU Leuven, Belgium

W tym artykule

Podsumowanie

Cystometria jest wydajną techniką pomiaru funkcji pęcherza moczowego u małych zwierząt in vivo. Do pęcherza prowadzona jest ciągła infuzja z szybkością kontrolowaną poprzez cewnik wewnątrz pęcherza, podczas gdy cewka moczowa pozostaje wolna, aby umożliwić mikcję. Pozwala to na wielokrotne napełnianie i opróżnianie pęcherza, przy jednoczesnym rejestrowaniu ciśnienia wewnątrz pęcherza oraz objętości wydalonego moczu.

Streszczenie

Dolne drogi moczowe (LUT) pełnią funkcję dynamicznego zbiornika, który jest w stanie magazynować mocz i efektywnie go wydalać w dogodnym czasie. Podczas magazynowania moczu pęcherz jest jednak przez dłuższy czas narażony na kontakt z produktami przemiany materii. Dzięki działaniu jako szczelna bariera, wyściółka nabłonkowa LUT, czyli urothelium, zapobiega reabsorpcji szkodliwych substancji. Co więcej, drażniące substancje chemiczne stymulują unerwienie nocyceptywne pęcherza i inicjują skurcze mikcyjne, które usuwają jego zawartość. Co ciekawe, wrażliwość pęcherza na drażniące substancje chemiczne była z sukcesem wykorzystywana w praktyce klinicznej poprzez wlewanie do pęcherza agonistów TRPV1, takich jak kapsaicyna, w celu leczenia neurogennej nadaktywności pęcherza1. Podkreśla to zasadność postrzegania pęcherza jako organu chemosensorycznego i skłania do dalszych badań klinicznych. Jednak kwestie etyczne znacznie ograniczają możliwości przeprowadzania u ludzi inwazyjnych pomiarów, które są niezbędne do wyjaśnienia podstaw molekularnych farmakologii klinicznej LUT. Sposobem na przełamanie tego ograniczenia jest zastosowanie kilku modeli zwierzęcych2. W niniejszej pracy opisujemy wdrożenie cystometrii u myszy i szczurów – techniki umożliwiającej pomiar ciśnienia wewnątrz pęcherza w warunkach kontrolowanej perfuzji pęcherza.

Po laparotomii w kopule pęcherza moczowego implantuje się cewnik, który jest prowadzony podskórnie do obszaru międzyłopatkowego. Następnie pęcherz można napełniać w kontrolowanym tempie, pozostawiając cewkę moczową wolną do micturition. Podczas powtarzających się cykli napełniania i opróżniania można mierzyć ciśnienie wewnątrz pęcherza za pomocą zaimplantowanego cewnika. W ten sposób zmiany ciśnienia mogą zostać ilościowo określone i przeanalizowane. Co więcej, jednoczesny pomiar objętości wydalonego moczu pozwala odróżnić skurcze opróżniające od skurczów nieopróżniających3.

Warto zaznaczyć, że ze względu na różnice w kontroli mikcji między gryzoniami a ludźmi, pomiary cystometryczne u tych zwierząt mają ograniczoną wartość translacyjną4. Niemniej jednak są one niezwykle przydatne w badaniu patofizjologii i farmakologii pęcherza w eksperymentalnych warunkach przedklinicznych. Niedawne badania z wykorzystaniem tej techniki ujawniły kluczową rolę nowych cząsteczek w mechanicznych i chemicznych właściwościach sensorycznych pęcherza.

Protokół

1. Zwierzęta laboratoryjne

  1. Zwierzęta (myszy, szczury) są utrzymywane w specjalistycznym zwierzęciu w 12-godzinnym cyklu światło-ciemność z dostępem ad libitum do wody i standardowej karmy w formie peletu. Zarówno wiek, jak i płeć zwierząt są istotnymi parametrami, które należy zestandaryzować zgodnie z potrzebami. Zazwyczaj wykonujemy cystometrię u samic w wieku 10–12 tygodni5,6.
  2. Wszystkie eksperymenty na zwierzętach są przeprowadzane zgodnie z wytycznymi Rady Wspólnoty Unii Europejskiej i zostały zatwierdzone przez lokalny komitet etyczny.

2. Znieczulenie

  1. Do przeprowadzania małych zabiegów chirurgicznych stosuje się znieczulenie izofluranem, ponieważ dzięki krótkiemu okresowi półtrwania jest on łatwy do dawkowania. Podczas stosowania izofluranu niezbędne jest odpowiednie odprowadzanie gazów odlotowych.
    1. Zwierzęta umieszcza się w zamkniętym pudełku, w którym podaje się 5% izofluranu w czystym tlenie (1 l/min).
    2. Po indukcji odpowiedni poziom znieczulenia utrzymuje się za pomocą małej maski (odciętej strzykawki 10 ml), podając tlen z prędkością 0,8 - 1 l/min z dodatkiem 1 - 1,5% izofluranu.
  2. W przypadku myszy podczas rejestracji funkcjonalnych stosuje się znieczulenie uretanem (patrz poniżej). Znieczulenie uretanem jest stosowane podczas rejestracji funkcjonalnych, ponieważ w przeciwieństwie do większości innych środków znieczulających, nie znosi ono odruchu mikcyjnego4. Uretan w dawce 1,2 g/kg masy ciała podaje się podskórnie (s.c.) 60 min przed rozpoczęciem rejestracji. W razie potrzeby dawkę uretanu niezbędną do uzyskania właściwego znieczulenia można miareczkować, podając dodatkowe dawki (0,1 g/kg) podskórnie. Należy jednak zauważyć, że dodatkowe znieczulenie może zmienić efektywność opróżniania pęcherza, a w konsekwencji częstotliwość mikcji7,8. Dlatego też rejestracje cystometryczne powinny być ściśle monitorowane i odrzucane w przypadku zaobserwowania istotnych odchyleń od zachowania kontrolnego. Aby uniknąć błędnej interpretacji danych, nie należy podawać środków znieczulających w czasie aplikacji badanych związków.

3. Procedura chirurgiczna - implantacja cewnika pęcherza moczowego

  1. Narzędzia chirurgiczne przed użyciem należy wysterylizować w autoklawie. Brzuch zwierzęcia należy ogolić, zdezynfekować 70% etanolem i wykonać niską laparotomię w linii środkowej, aby odsłonić pęcherz moczowy.
  2. Pod mikroskopem chirurgicznym należy założyć szew pierścieniowy (tzw. purse-string suture) w kopule pęcherza, używając niewchłanialnej nici monofilamentowej (rozmiar 6-0).
  3. Wewnątrz szwu pierścieniowego należy wykonać niewielką cystostomię (preferencyjnie przy użyciu igły 18 G) i przez ten otwór wprowadzić cewnik polietylenowy PE 50 z niewielką mankietą na końcu (uzyskaną poprzez ostrożne podgrzanie rurki). W naszej praktyce cieńsze rurki (PE 10) wykazują wyższy i bardziej zmienny opór. Rurkę można zdezynfekować, zanurzając ją w 70% roztworze etanolu lub wysterylizować w autoklawie. Przed implantacją rurkę należy przepłukać solą fizjologiczną.
  4. Szew pierścieniowy należy zabezpieczyć wokół rurki za pomocą węzła chirurgicznego. Cewnik należy delikatnie wyciągnąć na zewnątrz, aż dzwonkowata końcówka znajdzie się bezpośrednio pod szwem. Aby zapobiec wyciekom, w stronę szwu należy wsunąć fragment cewnika 18 G.
  5. Należy delikatnie wprowadzić niewielką objętość soli fizjologicznej (100 - 200 μl), aby sprawdzić szczelność. W przypadku stwierdzenia wycieków należy założyć dodatkowy szew.
  6. Mięśnie brzucha należy zamknąć szwami monofilamentowymi, pozostawiając przejście dla cewnika w górnej części nacięcia.
  7. Rurkę należy przeprowadzić tunelem do obszaru międzymistrzowego za pomocą pustego w środku metalowego pręta, co zapobiegnie przegryzieniu rurki przez zwierzęta podczas eksperymentu.
  8. Skórę zamyka się niewchłanialnymi szwami monofilamentowymi. Implantowany cewnik należy przepłukać solą fizjologiczną w celu sprawdzenia jego drożności.
  9. Przed wybudzeniem zwierząt podaje się podskórnie leki przeciwbólowe (buprenorfina, 0.05 mg/kg).

4. Przygotowanie i cystometria

  1. W zależności od pytania badawczego (oraz gatunku zwierząt) cystometrię wykonuje się u zwierząt budzących się (unieruchomionych lub nie) lub znieczulonych uretanem. Podczas gdy cystometria jest w pełni możliwa do przeprowadzenia u świadomych szczurów, które zazwyczaj pozostają spokojne w środowisku unieruchomienia, w przypadku myszy zazwyczaj wykonujemy cystometrię w znieczuleniu uretanem (1,2 mg/kg, podskórnie)3,5,6,9.
  2. U znieczulonych myszy temperatura ciała jest stale monitorowana i utrzymywana na poziomie 36,5 °C ± 0,2 °C za pomocą sondy temperatury i lampy grzewczej.
  3. Układ jest kalibrowany przed każdym eksperymentem zgodnie z instrukcjami producenta.
  4. Zaimplantowany cewnik jest połączony za pomocą końcówki Luer z kranikiem trójdrożnym, który z jednej strony jest podłączony do przetwornika ciśnienia (Edwards Lifesciences), a z drugiej do pompy infuzyjnej (Harvard Apparatus). Przetwornik ciśnienia jest połączony poprzez wzmacniacz (monitor 78534c, Hewlett Packard) z systemem akwizycji danych (DI-730-USB, Dataq instruments) i komputerem. Do rejestracji można użyć oprogramowania Windaq/Lite.
  5. Uruchamia się pompę infuzyjną, umożliwiając infuzję soli fizjologicznej lub PBS, na przykład z prędkością 100 μl/min (u szczurów) lub 20 μl/min (u myszy). W ten sposób pęcherz jest napełniany ze stałą prędkością, podczas gdy rejestrowane jest ciśnienie wewnątrz pęcherza.
  6. Rysunek 5 przedstawia typowy zapis ciśnienia: podczas infuzji płynu w pęcherzu następuje powolny wzrost ciśnienia, aż do osiągnięcia określonej objętości/ciśnienia, czyli progu mikcji. Po osiągnięciu tego progu pęcherz ulega skurczowi, a następnie otwiera się zwieracz cewki moczowej, umożliwiając przepływ moczu przez cewkę. W ten sposób pęcherz zostaje opróżniony, skurcz ustaje, a ciśnienie ponownie spada do poziomu „podstawowego”.
  7. Ponieważ szczur jest umieszczony w klatce metabolicznej nad wagą cyfrową, można jednocześnie zmierzyć objętość wydalonego moczu, co dostarcza informacji o objętości mikcji. Ze względu na małe objętości wydalanego moczu u myszy, zastosowanie tego systemu może być bardzo trudne. Dlatego objętość wydalonego moczu określa się za pomocą małych papierów filtracyjnych ważonych przed i po mikcji.
  8. Zazwyczaj pozwalamy układowi na equilibrację przez 30 min, po czym następuje 30-minutowy okres rejestracji. Następnie leki mogą być podawane ogólnoustrojowo lub do pęcherza, a następnie rejestruje się kolejne 30 min.
  9. Zarejestrowane dane można wyeksportować do plików .csv, które można zaimportować do specjalistycznego oprogramowania do analizy ilościowej. Zazwyczaj używamy programu Origin (OriginLab Corporation, MA, USA).
  10. Po zakończeniu eksperymentów zwierzęta są uśmiercane poprzez zwichnięcie karku (myszy) lub zatrucie CO2 (szczury).

5. Reprezentatywne wyniki

Schemat anatomii myszy ilustrujący etapy i identyfikację narządów rozrodczych.
Rycina 1. Przegląd laparotomii. A) Umieszczenie szczura w pozycji na plecach. B) Ogolenie i antyseptyczne przygotowanie pola operacyjnego. C) Nacięcie skóry. D) Nacięcie mięśni brzusznych i odsłonięcie pęcherza moczowego.

Schemat elektrostatyki balonów; wizualizacja ładunku statycznego; ustawienie eksperymentu.
Rysunek 2. Szew kaloszowy.

Schemat cewnikowania pęcherza przedstawiający etapy nakłucia, wprowadzenia, szycia i uszczelniania.
Rycina 3. Implantacja cewnika.

Schemat procesu operacji u gryzoni: implantacja cewnika, zamknięcie mięśnia, tunelowanie, zamknięcie skóry.
Rycina 4. Tunelowanie cewnika.

Przykłady pomiarów ciśnienia uzyskane podczas wlewu dokanałowego soli fizjologicznej u świadomego szczura oraz znieczulonej myszy przedstawiono na Rysunku 5. Z sygnału ciśnienia można wyodrębnić wiele parametrów (np. odstęp między skurczami, ciśnienie podstawowe i ciśnienie progowe). Szczegółowe opisy tych parametrów znajdują się w publikacjach Andersson et al. (ref 4) oraz Yoshiyama et al. (ref 10).

Niedawno wykorzystaliśmy cystometrię do zidentyfikowania celów molekularnych olejku musztardowego (MO), wysoce reaktywnego związku, który od dawna jest stosowany w modelach eksperymentalnych zapalenia i hiperalgezji narządów trzewnych, takich jak pęcherz moczowy11,12. Wlewy dokanałowe 10 mM MO wywołały silny wzrost częstotliwości mikcji (skrócenie odstępu międzyskurczowego) u myszy typu dzikiego (Rycina 6A, B) oraz zmniejszenie objętości wydalonego moczu6. Co ciekawe, MO wywołało podobne zmiany u myszy z deficytem receptora MO TRPA1. Z kolei MO wywołało znacznie słabsze zmiany parametrów cystometrycznych u myszy Trpv1 KO niż u myszy WT i nie wywołało żadnego efektu u myszy Trpa1/Trpv1 KO. Wraz z pomiarami uwalniania peptydy związanego z genem kalcytoniny (CGRP)6, dane te wykazują, że TRPV1 może odgrywać kluczową rolę w podrażnieniu trzewnym indukowanym przez MO.

Analiza ciśnienia w pęcherzu świadomego szczura i znieczuplonej myszy; wykres przedstawia odstępy między skurczami.
Rysunek 5. Reprezentatywne zapisy ciśnienia wewnątrz pęcherza zarejestrowane u świadomej samicy szczura (A) oraz u znieczulonej samicy myszy (B). Najniższe ciśnienie zdefiniowano jako „ciśnienie bazowe” (czerwone strzałki). Ciśnienie na koniec fazy napełniania zaznaczono niebieskimi strzałkami. Objętość płynu wprowadzonego między tymi punktami, podzielona przez różnicę ciśnień, pozwala na obliczenie podatności ściany pęcherza (podatność = objętość wprowadzonego płynu/(ciśnienie progowe - ciśnienie bazowe). „Odstęp między skurczami” (ICI) to czas pomiędzy dwoma skurczami opróżniającymi.

Analiza ekspresji genów; wykres porównujący Trpa1, Trpv1, typ dziki; względna częstotliwość w czasie.
Rysunek 6. Wpływ wlewu dokanałowego olejku musztardowego na wzorzec cystometryczny u myszy typu dzikiego oraz myszy z nokautem Trpa1, Trpv1 i Trpa1/Trpv1. (A) Reprezentatywne przykłady zmian ciśnienia wewnątrz pęcherza zarejestrowane u myszy WT, Trpa1 KO, Trpv1 KO oraz Trpa1/Trpv1 KO w odpowiedzi na infuzję soli fizjologicznej i 10 mM MO. (B) Przebieg czasowy średniej chwilowej częstotliwości mikcji przed i podczas wlewu dokanałowego MO. Dla wszystkich myszy dane zostały znormalizowane do średniej częstotliwości uzyskanej podczas infuzji soli fizjologicznej. Dane te zostały zaadaptowane z pracy Everaerts et al. (ref 6), za zgodą wydawnictwa Elsevier.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Przedstawiona tutaj technika cystometrii pozwala na wykonywanie pomiarów funkcji pęcherza in vivo w modelach zwierzęcych. Szczury są prawdopodobnie najczęściej wykorzystywanym modelem zwierzęcym. Myszy są trudniejsze w obsłudze, ale oferują zaletę możliwości stosowania zwierząt manipulowanych genetycznie. Ze względu na trudności techniczne związane z wykorzystaniem myszy przytomnych, które mają tendencję do wysokiej aktywności, co prowadzi do poluzowania wszczepionego cewnika i zmian ciśnienia w jamie brzusznej,...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Praca ta była wspierana przez granty z rządu federalnego Belgii (IUAP P6/28), Fundacji Badawczej Flandrii (F.W.O.) (G.0565.07 oraz G.0686.09), nagrodę Astellas European Foundation Award 2009 oraz Radę Badawczą KU Leuven (GOA 2009/07, EF/95/010 oraz PFV/10/006). P.U. i W.E. są stypendystami doktoranckimi Fundacji Badawczej Flandrii (FWO). M.B. jest stypendystą programu Marie Curie, a D.D.R. stypendystą podstawowo-klinicznym FWO.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
uretanUrethane, Sigma-Aldrich315419karcynogen grupy 2B
izofluranIsoba, Schering-Plough Animal Health
cewnik polietylenowyPrzewody polietylenowe Intramedic PE50, Becton Dickinson427411
mikroskop chirurgicznyOp-Mi 6, Carl ZeissOp-Mi 6
szew typu woreczkowyProlene 6/0, Ethicon8610H
szew powięzi i skóryEthilon 4/0 lub 5/0, Ethicon662G lub 661G
pooperacyjne leki przeciwbóloweTemgesic, Schering-Plough Animal Healthdawka dla szczurów: 0,05 mg/kg
wzmacniaczmonitor 78534c, Hewlett Packard
wagi analityczne i oprogramowanie do akwizycji danych z wagFZ 300i, A&DFZ-300i
pompy infuzyjnepompa 33, Harvard apparatusHA33
system rejestracji cystometriiDataq instruments, seria DI-730 oraz Windaq/LiteDI-730-USB Windaq/Lite
rejestracja temperaturytermometr Fluke 52 KJ52 KJ
przetworniki ciśnieniaEdwards Lifesciences, zestaw do monitorowania ciśnieniaT322247A

Bibliografia

  1. Everaerts, W., Gevaert, T., Nilius, B., De Ridder, D. On the origin of bladder sensing: Tr(i)ps in urology. Neurourol. Urodyn. 27, 264-2673 (2008).
  2. Fry, C. H. Animal models and their use in understanding lower urinary tract dysfunction. Neurourol. Urodyn. 29, 603-608 (2010).
  3. Gevaert, T. Deletion of the transient receptor potential cation channel TRPV4 impairs murine bladder voiding. J. Clin. Invest. 117, 3453-3462 (2007).
  4. Andersson, K. E., Soler, R., Fullhase, C. Rodent models for urodynamic investigation. Neurourol. Urodyn. 30, 636-646 (2011).
  5. Everaerts, W. Inhibition of the cation channel TRPV4 improves bladder function in mice and rats with cyclophosphamide-induced cystitis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 19084-19089 (2010).
  6. Everaerts, W. The capsaicin receptor TRPV1 is a crucial mediator of the noxious effects of mustard oil. Curr. Biol. 21, 316-321 (2011).
  7. Yoshiyama, M., Roppolo, J. R., Thor, K. B., de Groat, W. C. Effects of LY274614, a competitive NMDA receptor antagonist, on the micturition reflex in the urethane-anaesthetized rat. Br. J. Pharmacol. 110, 77-86 (1993).
  8. Yoshiyama, M., Roppolo, J. R., de Groat, W. C. Effects of MK-801 on the micturition reflex in the rat--possible sites of action. J. Pharmacol. Exp. Ther. 265, 844-850 (1993).
  9. Boudes, M. Functional Characterization of a Chronic Cyclophosphamide-Induced Overactive Bladder Model in mice. Neurourol. Urodyn. , (2011).
  10. Yoshiyama, M. Sex-related differences in activity of lower urinary tract in response to intravesical acid irritation in decerebrate unanesthetized mice. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 295, R954-R960 (2008).
  11. McMahon, S. B., Abel, C. A model for the study of visceral pain states: chronic inflammation of the chronic decerebrate rat urinary bladder by irritant chemicals. Pain. 28, 109-127 (1987).
  12. Du, S., Araki, I., Yoshiyama, M., Nomura, T., Takeda, M. Transient receptor potential channel A1 involved in sensory transduction of rat urinary bladder through C-fiber pathway. Urology. 70, 826-831 (2007).
  13. Streng, T., Santti, R., Talo, A. Similarities and differences in female and male rat voiding. Neurourol. Urodyn. 21, 136-141 (2002).
  14. Igawa, Y. Cystometric findings in mice lacking muscarinic M2 or M3 receptors. J. Urol. 172, 2460-2464 (2004).
  15. Schroder, A., Newgreen, D., Andersson, K. E. Detrusor responses to prostaglandin E2 and bladder outlet obstruction in wild-type and Ep1 receptor knockout mice. J. Urol. 172, 1166-1170 (2004).
  16. Chen, Q. Function of the lower urinary tract in mice lacking alpha1d-adrenoceptor. J. Urol. 174, 370-374 (2005).
  17. May, V., Vizzard, M. A. Bladder dysfunction and altered somatic sensitivity in PACAP-/- mice. J. Urol. 183, 772-779 (2010).
  18. Thorneloe, K. S., Meredith, A. L., Knorn, A. M., Aldrich, R. W., Nelson, M. T. Urodynamic properties and neurotransmitter dependence of urinary bladder contractility in the BK channel deletion model of overactive bladder. Am. J. Physiol. Renal. Physiol. 289, 604-610 (2005).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

ci nienie wewn trz p cherzaimplantacja cewnikamodele gryzonicz stotliwo mikcjinokaut TRPV1nokaut TRPA1infuzja olejku musztardowegoprzetwornik ci nienia

Powiązane artykuły