Zastosowanie cystometrii u małych gryzoni: badanie chemosensacji pęcherza moczowego

Summary

Cystometria jest skuteczną techniką pomiaru funkcji pęcherza moczowego u małych zwierząt in vivo. Pęcherz moczowy jest stale podawany w tempie kontrolowanym przez cewnik dopęcherzowy, podczas gdy cewka moczowa jest wolna do oddawania moczu. Pozwala to na wielokrotne napełnianie i opróżnianie pęcherza, podczas gdy rejestrowane jest ciśnienie śródpęcherzowe i objętość mikcji.

Abstract

Dolny układ moczowy (LUT) funkcjonuje jako dynamiczny zbiornik, który jest w stanie przechowywać mocz i skutecznie go wydalać w dogodnym czasie. Jednak podczas przechowywania moczu pęcherz jest narażony przez dłuższy czas na działanie produktów przemiany materii. Działając jako szczelna bariera, nabłonkowa wyściółka LUT, nabłonek dróg moczowych, zapobiega ponownemu wchłanianiu szkodliwych substancji. Co więcej, szkodliwe substancje chemiczne stymulują nocyceptywne unerwienie pęcherza moczowego i inicjują skurcze mikcji, które wydalają zawartość pęcherza. Co ciekawe, wrażliwość pęcherza na szkodliwe substancje chemiczne została z powodzeniem wykorzystana w praktyce klinicznej, poprzez dopęcherzowe podawanie agonisty TRPV1 kapsaicyny w leczeniu neurogennej nadczynności pęcherza^{moczowego 1}. Podkreśla to zalety postrzegania pęcherza moczowego jako narządu chemosensorycznego i skłania do dalszych badań klinicznych. Jednak kwestie etyczne poważnie ograniczają możliwości wykonywania u ludzi inwazyjnych pomiarów, które są niezbędne do rozwikłania molekularnych podstaw farmakologii klinicznej LUT. Sposobem na pokonanie tego ograniczenia jest użycie kilku modeli zwierzęcych². W tym miejscu opisujemy zastosowanie cystometrii u myszy i szczurów, techniki pozwalającej na pomiar ciśnienia śródpęcherzowego w warunkach kontrolowanej perfuzji pęcherza.

Po laparotomii, cewnik jest wszczepiany do kopuły pęcherza moczowego i tunelowany podskórnie do obszaru międzyłopatkowego. Następnie pęcherz może być napełniany w kontrolowanym tempie, podczas gdy cewka moczowa pozostaje wolna do oddawania moczu. Podczas powtarzających się cykli napełniania i oddawania moczu ciśnienie śródpęcherzowe można mierzyć za pomocą wszczepionego cewnika. W związku z tym zmiany ciśnienia mogą być określane ilościowo i analizowane. Co więcej, jednoczesny pomiar objętości mikcji pozwala na odróżnienie skurczów mikcji od skurczów niezwiązanych z mikcją3.

Ważne, ze względu na różnice w kontroli mikcji między gryzoniami a ludźmi, pomiary cystometryczne u tych zwierząt mają tylko ograniczoną wartość translacyjną⁴. Niemniej jednak są one bardzo pomocne w badaniach nad patofizjologią i farmakologią pęcherza moczowego w eksperymentalnych warunkach przedklinicznych. Niedawne badania z wykorzystaniem tej techniki ujawniły kluczową rolę nowych graczy molekularnych we właściwościach mechano- i chemosensorycznych pęcherza moczowego.

Protocol

1. Zwierzęta laboratoryjne

1. Zwierzęta (myszy, szczury) są trzymane w specjalistycznym pomieszczeniu dla zwierząt z 12-godzinnym cyklem światło-ciemność i dostępem ad libitum do wody i standardowych granulek żywności. Zarówno wiek, jak i płeć zwierząt są ważnymi parametrami, które powinny być standaryzowane w zależności od potrzeb. Najczęściej wykonujemy cystometrię u 10 - 12 tygodniowych samic w wieku^5,6 lat.
2. Wszystkie doświadczenia na zwierzętach są przeprowadzane zgodnie z wytycznymi Rady Wspólnoty Unii Europejskiej i zatwierdzane przez lokalną komisję etyczną.

2. Znieczulenie

1. Znieczulenie izofluranem jest stosowane do wykonywania drobnych zabiegów chirurgicznych, ponieważ jest łatwe do dozowania ze względu na krótki okres półtrwania. W przypadku stosowania izofluranu konieczne jest odpowiednie oczyszczanie gazów odlotowych.
   1. Zwierzęta umieszcza się w zamkniętym pudełku, gazuje izofluranem 5% w czystym tlenie (1 l/min).
   2. Po indukcji znieczulenie na odpowiednim poziomie jest utrzymywane przez małą maskę (naciętą strzykawkę o pojemności 10 ml) przez 0,8 - 1 l/min tlenu z 1 - 1,5% izofluranu.
2. W przypadku myszy podczas nagrań czynnościowych stosuje się znieczulenie uretanowe (por. Infra). Znieczulenie uretanowe stosuje się podczas nagrań czynnościowych, ponieważ w przeciwieństwie do większości innych środków znieczulających, odruch mikcji nie jest tłumiony przez ten środek znieczulający⁴. Uretan 1,2 g/kg masy ciała podaje się podskórnie (s.c.) na 60 minut przed rozpoczęciem zapisów. W razie potrzeby dawkę uretanu potrzebną do uzyskania odpowiedniego znieczulenia można stopniowo zwiększyć, podając dodatkowe dawki (0,1 g/kg) podskórnie. Należy jednak zauważyć, że dodatkowe znieczulenie może zmienić skuteczność mikcji, a co za tym idzie częstotliwość oddawania moczu^7,8. W związku z tym zapisy cystometryczne powinny być ściśle monitorowane i odrzucane za każdym razem, gdy obserwuje się znaczne odchylenia od zachowania kontrolnego. Nie należy podawać środków znieczulających podczas stosowania badanych związków, aby uniknąć błędnej interpretacji danych.

3. Zabieg chirurgiczny - implantacja cewnika do pęcherza moczowego

1. Narzędzia chirurgiczne są sterylizowane w autoklawie przed użyciem. Ogolić brzuch zwierzęcia, zdezynfekować etanolem 70% i wykonać laparotomię w dolnej linii środkowej, aby odsłonić pęcherz.
2. Pod mikroskopem chirurgicznym umieść szew ze sznurka torebkowego w kopule pęcherza moczowego za pomocą niewchłanialnego szwu z żyłki (rozmiar 6-0).
3. Wykonaj małą cystostomię (preferencyjnie używamy igły 18 G) wewnątrz sznurka torebki i wprowadź cewnik polietylenowy PE 50, z małym mankietem na końcu (uzyskanym przez ostrożne podgrzanie rurki) przez ten otwór. W naszych rękach cieńsze rurki (PE 10) mają wyższy i bardziej zmienny opór. Rurkę można zdezynfekować, umieszczając ją w 70% roztworze etanolu lub wysterylizować w autoklawie. Przed implantacją rurkę należy przepłukać solą fizjologiczną.
4. Zabezpiecz sznurek torebki wokół rurki za pomocą węzła chirurgicznego. Delikatnie pociągnij cewnik na zewnątrz, aż końcówka w kształcie dzwonu znajdzie się tuż pod szwem. Popchnij kawałek cewnika 18 G w kierunku szwu, aby zapobiec przeciekaniu.
5. Delikatnie zaparz niewielką ilość soli fizjologicznej (100 - 200 μl), aby sprawdzić, czy nie ma wycieków. W przypadku nieszczelności należy założyć dodatkowy szew.
6. Zamknij mięśnie brzucha za pomocą szwów monofilamentowych, pozostawiając przejście dla cewnika w górnej części nacięcia.
7. Tunel rurki do obszaru międzyłopatkowego za pomocą pustego metalowego pręta, zapobiegając w ten sposób gryzieniu rurki przez zwierzęta podczas eksperymentu.
8. Skóra zamykana jest za pomocą niewchłanialnych, monofilamentowych szwów. Wszczepiony cewnik przepłukuje się solą fizjologiczną w celu sprawdzenia jego przepuszczalności.
9. Przed obudzeniem zwierząt podaje się podskórnie leki przeciwbólowe (buprenorfina, 0,05 mg/kg).

4. Konfiguracja i cystometria

1. W zależności od pytania doświadczalnego (i użytego gatunku) cystometrię wykonuje się u zwierząt obudzonych (unieruchomionych lub nieskrępowanych) lub znieczulonych uretanem. Podczas gdy cystometria jest całkowicie wykonalna u przytomnych szczurów, które mają tendencję do zachowywania spokoju w ograniczonym środowisku, zwykle wykonujemy cystometrię w znieczuleniu uretanowym (1,2 mg / kg, podskórnie) przy użyciu myszy^3,5,6,9.
2. U znieczulonych myszy temperatura ciała jest stale monitorowana i utrzymywana na poziomie 36,5 °C ± 0,2 °C za pomocą sondy temperatury i lampy grzewczej.
3. Konfiguracja jest kalibrowana przed każdym eksperymentem zgodnie z instrukcjami producenta.
4. Wszczepiony cewnik jest połączony za pomocą króćca luer z 3-kierunkowym kranem, który jest połączony z przetwornikiem ciśnienia (Edwards Lifesciences) z jednej strony i pompą infuzyjną z drugiej (Harvard Apparatus). Przetwornik ciśnienia jest podłączony za pomocą wzmacniacza (monitor 78534c, Hewlett Packard) do systemu akwizycji danych (DI-730-USB, instrumenty Dataq) i komputera. Do nagrywania można użyć oprogramowania Windaq/Lite.
5. Uruchamiana jest pompa infuzyjna, która umożliwia infuzję soli fizjologicznej lub PBS z prędkością np. 100 μl/min (u szczurów) lub 20 μl/min (u myszy). W związku z tym pęcherz będzie napełniany ze stałą szybkością, podczas gdy rejestrowane jest ciśnienie śródpęcherzowe.
6. Rycina 5 przedstawia typowy ślad ciśnienia: podczas wlewu płynu następuje powolny wzrost ciśnienia w pęcherzu, aż do osiągnięcia określonej objętości/ciśnienia, progu mikcji. Po osiągnięciu tego progu pęcherz moczowy skurczy się, a następnie otworzy się zwieracz moczu, umożliwiając przepływ moczu przez cewkę moczową. W związku z tym pęcherz zostanie opróżniony, skurcz ustanie, a ciśnienie ponownie spadnie do "podstawowego" poziomu.
7. Ponieważ szczur jest umieszczany w klatce metabolicznej i znajduje się nad wagą cyfrową, objętość mikcji może być mierzona jednocześnie, dostarczając informacji o objętości mikcji. Ze względu na małe objętości mikcji u myszy, korzystanie z tego systemu może być bardzo trudne. Dlatego objętość pustej przestrzeni określa się za pomocą małych bibuł filtracyjnych zważonych przed i po opróżnieniu.
8. Zazwyczaj pozwalamy systemowi zrównoważyć się przez 30 minut, po czym następuje okres nagrywania wynoszący 30 minut. Następnie leki mogą być podawane ogólnoustrojowo lub dopęcherzowo i rejestrowane są kolejne 30 minut.
9. Zarejestrowane dane mogą być eksportowane jako pliki .csv, które można zaimportować do specjalistycznego oprogramowania do analizy ilościowej. Zazwyczaj korzystamy z Origin (OriginLab Corporation, MA, USA).
10. Po eksperymentach zwierzęta są uśmiercane przez zwichnięcie szyjki macicy (myszy) lub zatrucie CO₂ (szczury).

5. Reprezentatywne wyniki

Rysunek 1. Przegląd laparotomii. A) Ułóż szczura w pozycji leżącej. B) Ogolić i antyseptycznie przygotować miejsce operacji. C) Nacięcie skóry. D) Nacięcie mięśni brzucha i odsłonięcie pęcherza moczowego.

Rysunek 2. Szew ze sznurka do torebki.

Rysunek 3. Implantacja cewnika.

Rysunek 4. Tunelowanie cewnika.

Przykłady pomiarów ciśnienia uzyskanych podczas dopęcherzowej perfuzji soli fizjologicznej u przytomnego szczura i znieczulonej myszy są pokazane na rysunku 5. Z sygnału ciśnienia można wyodrębnić wiele parametrów (np. interwał skurczowy, ciśnienie podstawowe i ciśnienie progowe). Wyczerpujące opisy tych parametrów można znaleźć w Andersson et al. (ref 4) i Yoshiyama et al. (ref 10).

Ostatnio używaliśmy cystometrii do identyfikacji celów molekularnych oleju musztardowego (MO), wysoce reaktywnego związku, który od dawna jest używany w eksperymentalnych modelach stanów zapalnych i hiperalgezji narządów trzewnych, takich jak pęcherz moczowy^11,12. Wlew dopęcherzowy 10 mM MO indukował silny wzrost częstości oddawania moczu (zmniejszenie odstępu międzykurczliwego) u myszy typu dzikiego (ryc. 6A, B) i zmniejszenie objętości mikcji⁶. Co ciekawe, MO wywołał podobne zmiany u myszy z niedoborem receptora MO TRPA1. W przeciwieństwie do tego, MO indukował znacznie słabsze zmiany parametrów cystometrycznych u myszy Trpv1 KO niż u myszy WT i nie miał żadnego wpływu na myszy Trpa1 / Trpv1 KO. Wraz z pomiarami uwalniania peptydu związanego z genem kalcytoniny (CGRP)⁶, dane te wskazują, że TRPV1 może odgrywać kluczową rolę w podrażnieniu trzewnym wywołanym przez MO.

Rysunek 5. Reprezentatywne ślady ciśnienia dopęcherzowego zarejestrowane u przytomnej samicy szczura (A) i u znieczulonej samicy myszy (B). Najniższe ciśnienie definiuje się jako "ciśnienie podstawowe" (czerwone strzałki). Ciśnienie na końcu fazy napełniania jest oznaczone niebieskimi strzałkami. Objętość płynu podawanego między tymi punktami, podzielona przez różnicę ciśnień, pozwala na obliczenie podatności ściany pęcherza moczowego (podatność = objętość wlewu/(ciśnienie progowe - ciśnienie podstawowe). "Interwał międzyskurczowy" (ICI) to czas między dwoma skurczami mikcji.

Rysunek 6. Wpływ dopęcherzowego stosowania oleju musztardowego na wzorzec cystometrii u myszy typu dzikiego i myszy z nokautem Trpa1, Trpv1 i Trpa1/Trpv1. (A) Reprezentatywne przykłady zmian ciśnienia dopęcherzowego zarejestrowanych u myszy WT, Trpa1 KO, Trpv1 KO i Trpa1/Trpv1 KO w odpowiedzi na infuzję soli fizjologicznej i 10 mM MO. (B) Przebieg w czasie średniej chwilowej częstości oddawania moczu przed i podczas dopęcherzowej infuzji MO. W przypadku wszystkich myszy dane zostały znormalizowane do średniej częstości uzyskanej podczas infuzji soli fizjologicznej. Dane te zostały zaadaptowane z Everaerts et al. (ref 6), za zgodą Elsevier.

Discussion

Przedstawiona tu technika cystometrii pozwala na wykonywanie pomiarów in vivo funkcji pęcherza moczowego na modelach zwierzęcych. Szczury są prawdopodobnie najczęściej używanym modelem zwierzęcym. Myszy są trudniejsze w obsłudze, ale mają tę zaletę, że wykorzystują zwierzęta manipulowane genetycznie. Ze względu na trudności techniczne związane z używaniem przytomnych myszy, które mają tendencję do bycia bardzo aktywnymi, co skutkuje poluzowaniem wszczepionego cewnika i zmianami ciśnienia w jamie brzusznej, które...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
	uretan, Uretan, Sigma-Aldrich	315419	grupa 2B rakotwórczy
izofluran	Isoba, Schering-Plough Cewnik
	Intramedic Rurka polietylenowa PE50, Mikroskop chirurgiczny Becton Dickinson	427411
	Op-Mi 6, Carl Zeiss	Op-Mi 6
szew torebkowo-sznurkowy	Prolene 6/0, Ethicon	8610H
szew powięziowy i skórny	Ethilon 4/0 lub 5/0, Ethicon	662G lub 661G
pooperacyjne leki przeciwbólowe	Temgesic, Schering-Plough Animal Health		Dawkowanie dla szczurów: 0,05 mg/kg
wzmacniacz	monitor 78534c, wagi analityczne Hewlett Packard
i oprogramowanie do akwizycji danych wagowych	FZ 300i, A& D	FZ-300i
pompy infuzyjne	pompa 33, aparatura Harvard	HA33
	Przyrządy Dataq, seria DI-730 i Windaq/Lite	DI-730-USB Rejestracja temperatury Windaq/Lite
	Termometr Fluke 52 KJ	52 KJ
	Edwards Lifesciences, zestaw do monitorowania ciśnienia	T322247A