Charakterystyka fenotypowa i funkcjonalna komórek tworzących kolonie śródbłonka pochodzących z ludzkiej krwi pępowinowej

Podsumowanie

Komórki tworzące kolonie śródbłonka (ECFC) to krążące komórki śródbłonka o silnym potencjał proliferacyjny klonalnym, które wykazują wewnętrzną zdolność do tworzenia naczyń in vivo. Charakterystyka fenotypowa i funkcjonalna komórek śródbłonka wyrastających z CB jest ważna dla identyfikacji i wyizolowania ECFC w dobrej wierze do potencjalnego zastosowania klinicznego w naprawie uszkodzonych tkanek.

Streszczenie

Ostatnio przejrzano wieloletnie poglądy na temat tworzenia nowych naczyń krwionośnych poprzez angiogenezę, waskulogenezę i arteriogenezę¹. Obecność krążących śródbłonkowych komórek progenitorowych (EPC) została po raz pierwszy zidentyfikowana w krwi obwodowej dorosłego człowieka przez Asaharę i in. w 1997 roku2^{, przynosząc} infuzję nowych hipotez i strategii regeneracji i naprawy naczyń krwionośnych. EPC są rzadkimi, ale normalnymi składnikami krążącej krwi, które są domem dla miejsc tworzenia naczyń krwionośnych lub przebudowy naczyń krwionośnych i ułatwiają poporodową waskulogenezę, angiogenezę lub arteriogenezę, głównie poprzez stymulację parakrynną istniejących komórek pochodzących ze ściany naczynia³. Nie zidentyfikowano żadnego specyficznego markera do identyfikacji EPC, a obecnie stan tej dziedziny polega na zrozumieniu, że liczne typy komórek, w tym proangiogenne hematopoetyczne komórki macierzyste i progenitorowe, krążące komórki angiogenne, monocyty Tie2⁺, mieloidalne komórki progenitorowe, makrofagi związane z nowotworem i makrofagi aktywowane M2 uczestniczą w stymulowaniu procesu angiogennego w różnych przedklinicznych systemach modeli zwierzęcych oraz u ludzi w licznych stanach ^{chorobowych4, 5}. Komórki tworzące kolonie śródbłonka (ECFC) są rzadkimi krążącymi żywotnymi komórkami śródbłonka, charakteryzującymi się silnym potencjałem proliferacyjnym klonalnym, zdolnością do tworzenia kolonii drugorzędowych i trzeciorzędowych po ponownym posiewie oraz zdolnością do tworzenia wewnętrznych naczyń in vivo po przeszczepie myszom z niedoborem odporności^6-8. Podczas gdy ECFC zostały z powodzeniem wyizolowane z krwi obwodowej zdrowych dorosłych osób, krwi pępowinowej (CB) zdrowych noworodków oraz ścian naczyń wielu ludzkich naczyń tętniczych i żylnych ^6-9, CB posiada najwyższą częstość ECFC⁷, które wykazują najsilniejszy klonalny potencjał proliferacyjny i tworzą trwałe i funkcjonalne naczynia krwionośne in vivo^{8, 10-13}. Podczas gdy wyprowadzenie ECFC z dorosłej krwi obwodowej zostało przedstawione^{14, 15}, tutaj opisujemy metodologie wyprowadzania, klonowania, ekspansji i in vitro oraz charakterystyki in vivo ECFC z ludzkiej pępowiny.

Protokół

Odczynniki i roztwory

EMG-2 media (Lonza, Cat. Nie. cc-3162 zawierający pożywkę podstawową EBM-2 i zestaw EGM-2 SingleQuot Suplementy i czynniki wzrostu)

EBM-2 (Lonza, Kat. Nie. cc-3156) uzupełniony o cały zestaw suplementów i czynników wzrostu SingleQuot (Lonza, Cat. Nie. cc-4176), 10% (v/v) płodowa surowica bydlęca (FBS) i 1% (v/v) penicylina (10 000 U/ml)/streptomycyna (10 000 μg/ml)/amfoterycyna (25 μg/ml). Przechowywać do 1 miesiąca w temperaturze 4 °C. Zalecane objętości EGM-2 do hodowli ECFC to 500 μl/basenik dla płytek 24-dołkowych, 2 ml/basenik dla płytek 6-dołkowych, 5 ml/25 cm² kolby i 10 ml/75 cm² kolby, chyba że w protokole określono inaczej.

Roztwór kolagenu I

Rozcieńczyć 0.575 ml lodowatego kwasu octowego (17.4N) w 495 ml sterylnej wody destylowanej (0.02 N stężenie końcowe). Sterylny przefiltrować rozcieńczony kwas octowy za pomocą systemu filtracji próżniowej 0,22 μm. Dodać 25 mg kolagenu I z ogona szczura do rozcieńczonego kwasu octowego do końcowego stężenia 50 μg/ml. Ilość dodanego kolagenu będzie się różnić w zależności od stężenia zapasów kolagenu. Przechowywać do miesiąca w temperaturze 4 °C.

Przygotowanie powierzchni kultur tkankowych pokrytych kolagenem I

Umieść 1 ml roztworu kolagenu I w każdym dołku 6-dołkowej płytki do hodowli tkankowej (użyj 300 μl/studzienka dla płytek 24-dołkowych, 3ml/25-cm² kolby i 8 ml/75-cm² kolby). Inkubować przez 1 godzinę do nocy w temperaturze 37 °C. Usunąć roztwór kolagenu I i przemyć powierzchnię dwa razy, za każdym razem PBS (użyć 500 μl/dołek dla płytek 24-dołkowych, 2 ml/dołek dla płytek 6-dołkowych, 5 ml/25^{cm 2} kolby i 10 ml/75 cm² kolby). Do hodowli komórkowych należy natychmiast użyć płytek.

Bufor do barwienia FACS

Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) uzupełniona 2% (v/v) płodową surowicą bydlęcą (FBS). Przechowywać do 2 tygodni w temperaturze 4 °C.

A. ECFC Outgrowth, klonowanie i ekspansja

1. Pobrać CB z heparyną (10 j.m. heparyny/ml krwi) lub EDTA jako antykoagulantem i przetransportować do laboratorium w temperaturze pokojowej i natychmiast (w ciągu 2 godzin od porodu) przetworzyć próbkę do izolacji komórek jednojądrzastych (MNC).
2. Porcjować 15 ml CB do każdej stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml i dodać 20 ml PBS do każdej probówki CB i kilkakrotnie pipetować w celu wymieszania. Pobrać 15 ml Ficoll-Paque do strzykawki o pojemności 20 ml i założyć igłę 20G lub kaniulę mieszającą. Umieść końcówkę kaniuli mieszającej na dnie probówki z rozcieńczoną krwią i ostrożnie połóż 15 ml Ficoll-Pague. Odwirować probówki przez 30 minut przy 740 x g, w temperaturze pokojowej, bez ustawienia hamulca zwalniającego.
3. Za pomocą pipety transferowej usunąć zamgloną warstwę MNC o niskiej gęstości znajdującą się na granicy faz między Ficoll-Paque a rozcieńczonym osoczem. Dozować MNC do stożkowej probówki o pojemności 50 ml zawierającej 10 ml pożywki EGM-2. Odwirować MNC przez 10 minut przy 515 x g, w temperaturze pokojowej, z wysokim ustawieniem hamulca opóźniającego.
4. Ostrożnie odessać i wyrzucić supernatant. Umyj granulowane komórki EGM-2 dwukrotnie (10 min przy 515 x g) i ponownie zawiesić MNC w EGM-2 przy 1,25 x 10⁷ komórek/ml. Przygotuj 6-dołkowe płytki do hodowli tkankowych pokrytych kolagenem I, dodając 1 ml kolagenu typu I ze szczurzego ogona (50 μg/ml) na dołek i inkubując płytkę przez noc. Odpipetować 4 ml tej zawiesiny MNC do każdej studzienki i umieścić komórki w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO₂ Wilgot. A.1.5) Po 24 godzinach (dzień 1) powoli usunąć zużyte podłoże (nie naruszać luźno przylegających komórek) z dołka za pomocą pipety, powoli dodać 4 ml EGM-2 do studzienki i włożyć płytkę z powrotem do inkubatora. W dniu 2 odświeżyć pożywkę, powoli wyjmując pożywkę (nie naruszać luźno przylegających komórek) z dołka za pomocą pipety i dodając 4 ml EGM-2 do każdej studzienki. Powtarzaj zmianę pożywki codziennie do 7 dnia, a następnie co drugi dzień, aż pojawią się kolonie ECFC do klonowania. Zazwyczaj kolonie pojawiają się między 5 a 14 dniem⁷ (ryc. 1).
5. Wizualizuj typowe kolonie ECFC z morfologią kostki brukowej za pomocą odwróconego mikroskopu (powiększenie 10x) i zaznacz granice kolonii markerem na spodniej stronie studni, aby wskazać położenie każdej kolonii.
6. W dniu 14 umyj te pierwotne kolonie 2 razy PBS i zbierz pojedyncze kolonie za pomocą cylindrów do klonowania i tylko tyle ekspresu TrypLE, aby pokryć komórki wewnątrz cylindrów. Po zassaniu ostatniego przemywania PBS, umieścić sterylny cylinder klonujący pokryty żelem wokół każdej kolonii i mocno docisnąć do płytki za pomocą sterylnych kleszczyków. Dodaj 2-3 krople ciepłego ekspresu TrypLE do każdego cylindra klonującego i inkubuj przez 3-5 minut, aż komórki w cylindrze zaczną się odłączać. Dodaj około 250 μl pożywki EGM-2 do środka cylindra i pipetuj w górę iw dół, aby uzyskać zawiesinę pojedynczej komórki. Przenieść zawiesinę jednokomórkową z każdego cylindra klonującego oddzielnie do oddzielnej probówki do mikrowirówki.
7. Przemyć obszar w cylindrze 2-3 razy około 250 μl pożywki EGM-2, aby zebrać wszystkie pozostałe komórki i przenieść płukanie z każdej butli do odpowiedniej probówki mikrowirówki. Odwirować komórki na wysokich obrotach (≤300 x g) na wirówce stołowej przez 5 minut.
8. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórek w 1,5 ml świeżej pożywki EGM-2. Przenieść zawiesinę komórkową (zawierającą wszystkie komórki z poszczególnych kolonii) z każdej probówki do jednego dołka 24-dołkowej płytki do hodowli tkankowej wstępnie pokrytej 500 μl kolagenu ze szczurzego ogona I (50 μg/ml).
9. Umieścić w inkubatorze w celu rozbudowy z wymianą pożywki wykonywaną co drugi dzień.
10. Gdy komórki zbliżają się do 80-90% zbieżności, usuń zużytą pożywkę, a następnie umyj komórki 2 razy PBS i dodaj 500 μl pożywki ekspresowej TrypLE do każdej studzienki 24-dołkowej płytki do hodowli tkankowej. Umieść płytkę w inkubatorze na 3-5 minut, aż komórki zaczną się zaokrąglać i odłączać. Dodać 1 ml EGM-2 (z 10% zdefiniowanym FBS) do każdego dołka, aby zebrać komórki przez przemycie i przenieść je do probówki o pojemności 15 ml. Przemyć studzienkę 1 ml pożywki EGM-2, aby zebrać wszystkie pozostałe komórki i przenieść popłuczynę z każdej studzienki do odpowiedniej probówki o pojemności 15 ml. Odwirować komórki przy sile 300 x g przez 5 minut.
11. Usunąć pożywkę i ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 ml świeżej pożywki EGM-2 (z 10% zdefiniowanym FBS). Uzyskać liczbę żywotnych komórek podwielokrotności za pomocą hemacytometru i wykluczenia błękitu trypanowego.
12. Rozwiń komórki, wysiewając około 5000 komórek /^cm2 na powierzchniach hodowli tkankowych pokrytych kolagenem I w pożywce EGM-2 ze zmianą pożywki co drugi dzień, aż komórki zbliżą się do 80-90% zbiegu przed ponownym podkulturą.

B. Charakterystyka fenotypowa in vitro ECFC: ekspresja antygenu na powierzchni komórek śródbłonka i test pojedynczej komórki dla potencjału proliferacyjnego klonów

1. Aby uzyskać ekspresję antygenu na powierzchni komórki śródbłonka, odłącz komórki z ekspresją TrypLE w celu zebrania komórek przy użyciu metod opisanych dla klonowania i ekspansji ECFC.
2. Ponownie zawiesić komórki w buforze do barwienia FACS (10 X 10⁶ komórek / 1 ml buforu barwiącego FACS), a następnie dodać odczynnik blokujący FcR (20 μl / 10 X 10⁶ komórek), delikatnie wymieszać i umieścić na lodzie na 10 minut.
3. Podwielokrotność 100 μl tej zawiesiny komórkowej w probówce do mikrowirówki dla każdego antygenu powierzchniowego śródbłonka i kontroli izotypu. Dodać odpowiednią ilość znakowanych fluorochromem ludzkich przeciwciał monoklonalnych, które rozpoznają antygeny śródbłonka (CD31, CD144, CD146 i CD105) lub antygeny krwiotwórcze (CD45 i CD14) i pozostawić na lodzie na 30 minut, chroniąc przed światłem. Uwaga: 1 X 10⁶ komórek nie jest wymaganych do każdego testu. Autorzy zazwyczaj przygotowują 0,5 do 1 X 10⁵ komórek/probówkę, aby uzyskać 2 X 10⁴ analizowane zdarzenia. Należy również postępować zgodnie z zaleceniami producenta dotyczącymi ilości przeciwciał, które należy użyć do każdego testu. Niektóre przeciwciała mogą wymagać miareczkowania w celu określenia optymalnego stężenia przeciwciał. Wszystkie barwienia, które wykonali autorzy, są barwieniem jednokolorowym.
4. Po 30 minutach inkubacji na lodzie odwirować każdą probówkę z dużą prędkością na wirówce stołowej przez 5 minut, a następnie usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w buforze FACS.
5. Przeanalizuj próbki na cytometrze przepływowym, aby określić procent komórek, które barwią się dodatnio lub negatywnie dla każdego antygenu. ECFC barwią się jednolicie dodatnio dla CD31, CD144 i CD146, ale ujemne dla CD45 i CD14 w porównaniu z odpowiednimi kontrolami izotypu.
6. W przypadku testu pojedynczej komórki w celu zbadania klonalnego potencjału proliferacyjnego, odłącz komórki wczesnego pasażu (2-3) z ekspresją TrypLE, aby zebrać komórki przy użyciu metod podobnych do opisanych dla klonowania i ekspansji ECFC.
7. Zainfekuj te komórki wzmocnionym białkiem zielonej fluorescencji (EGFP) wykazującym ekspresję lentiwirusów ¹⁶ i zbierz komórki wyrażające EGFP za pomocą cytometrii fluorescencyjnej. Uwaga: Praca z lentiwirusem jest uważana za zagrożenie biologiczne i należy przestrzegać wszystkich środków ostrożności związanych z bezpieczeństwem biologicznym.
8. Hoduj je zgodnie z opisem dla hodowli ECFC w sekcji dotyczącej ekspansji ECFC.
9. Przygotuj 96-dołkowe płytki pokryte kolagenem I, dodając 50 μl kolagenu typu I ze szczurzego ogona (50 μg/ml) na dołek i inkubuj płytkę przez noc. Zebrać ECFC EGFP⁺ za pomocą ekspresu TrypLE i ponownie zawiesić je w pożywce EGM-2 o końcowym stężeniu ~10⁶ komórek / ml.
10. Użyj FACS Vantage (Becton Dickson) lub innego porównywalnego sortera o niskim natężeniu przepływu 20 komórek/sekundę, aby posortować jeden pojedynczy EGFP⁺ ECFC na studzienkę 96-dołkowej płytki i dostosować końcową objętość do 200 μl na studzienkę za pomocą EGM-2. Użyj odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego, aby upewnić się, że każda studnia otrzymała tylko jedną komórkę. Alternatywnie, pojedyncze komórki można sortować na podstawie FSC i SSC, a barwienie barwnikiem jądrowym Sytox kolonie można wykorzystać do oceny komórek i kwantyfikacji.
11. Inkubować płytkę przez okres dwóch tygodni z dwiema podmianami pożywki (200 μl EGM-2 przy użyciu pipetera wielokanałowego) wykonanymi w 5. i 10. dniu. W 14 dniu hodowli przemyć każdą studzienkę 100 μl PBS, a następnie utrwalić komórki 100 μl 4% paraformaldehydu przez 30 minut. W przypadku ECFC, w których nie dochodzi do ekspresji EGFP, dodać odczynnik Sytox, zielony fluorescencyjny barwnik jądrowy, po utrwaleniu paraformaldehydu i inkubować w temperaturze 4 °C przez noc.
12. Użyj mikroskopu fluorescencyjnego, aby zbadać każdą studzienkę, aby określić ilościowo liczbę komórek śródbłonka, które rozrosły się z pojedynczej komórki hodowanej przez 14 dni. W przypadku analizy ilościowej należy ocenić studzienki z 2 lub więcej komórkami śródbłonka jako dodatnimi (pod kątem proliferacji) i zbadać je dalej pod kątem całkowitej liczby komórek śródbłonka za pomocą wizualnego liczenia za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.
13. Aby wyświetlić uzyskane dane, studzienki o liczbie komórek śródbłonka wynoszącej: od 2 do 50, 51-2000 i 2001 lub więcej, są uważane odpowiednio za: klastry komórek śródbłonka, niski potencjał proliferacyjny (LPP)-ECFC i wysoki potencjał proliferacyjny (HPP)-ECFC. ECFC wykazują pełną hierarchię klonalnego potencjału proliferacyjnego, powodując powstawanie klastrów śródbłonka, LPP i HPP podczas hodowli na poziomie pojedynczej komórki przez 14 dni. ⁷

C. Charakterystyka funkcjonalna ECFC in vivo: Test tworzenia naczyń krwionośnych in vivo w celu zbadania potencjału ECFC w zakresie waskulogenezy

1. Przygotuj komórkowe implanty żelowe, obliczając całkowitą objętość (ml) każdego z następujących materiałów żelowych (z końcowym stężeniem w nawiasie) potrzebnych do odlania 1 ml żelu (który zostanie później przecięty na pół w celu wytworzenia 2 implantów): FBS (10%), EBM-2 10:1 (dostosować końcową objętość do 1 ml), wodorowęglan sodu (1,5 mg/ml), NaOH (dostosować pH do 7,4), HEPES (25 mM), fibronektyna (100 μg/ml) i kolagen I (1,5 mg/ml).
2. Po obliczeniu materiału żelowego odłącz komórki za pomocą ekspresji TrypLE, aby zebrać komórki przy użyciu metod podobnych do opisanych dla klonowania i ekspansji ECFC. Uzyskać liczbę żywotnych komórek podwielokrotności za pomocą hemacytometru i błękitu trypanowego. Przenieś 2,4 miliona żywych komórek do stożkowej probówki o pojemności 50 ml i zagnieżdż komórki przez odwirowanie w temperaturze pokojowej 515 x g. Jednocześnie przygotuj roztwór matrycy żelowej, dodając obliczone objętości HEPES, wodorowęglanu sodu, EBM-2 10:1, FBS, fibronektyny i kolagenu do lodowato zimnej stożkowej probówki o pojemności 50 ml (w tej samej kolejności, w jakiej są wymienione). Dokładnie wymieszaj i dostosuj pH do 7,4 za pomocą NaOH, utrzymując roztwór na lodzie.
3. Wyrzucić supernatant z komórek po odwirowaniu i ponownie zawiesić osad w 360 μl ciepłego EGM-2 i dodać do niego 840 μl roztworu matrycy żelowej o dostosowanym pH, co daje końcową objętość implantu żelowego 1 ml. Powoli mieszać komórki z roztworem matrycy żelowej, aż komórki zostaną dokładnie zawieszone w roztworze żelu.
4. Przenieś tę 1 ml komórkowej zawiesiny żelowej do jednego dołka 12-dołkowej płytki do hodowli tkankowej i inkubuj przez 20-30 minut, aż żel ulegnie polimeryzacji. Delikatnie przykryj żel 2 ml ciepłego EGM-2 i inkubuj przez noc.
5. Bezpośrednio przed implantacją należy podzielić inkubowany żel przez noc na dwie równe części za pomocą nożyczek do tęczówki i umieścić kawałki żelu z powrotem w tej samej pożywce zawierającej pożywkę EGM-2.
6. Użyj placówki chirurgicznej dla zwierząt, aby uspokoić zwierzę (5-6 tygodniowe myszy NOD / SCID), podając znieczulenie izofluranem. Ogolić dolną część brzucha i dokładnie oczyść miejsce operowane wacikami nasączonymi alkoholem i betadyną lub innym środkiem antyseptycznym. Następnie odizoluj obszar za pomocą zasłon zgodnie z wytycznymi IACUC i instytucjonalnymi.
7. Za pomocą sterylnych ostrych nożyczek do tęczówki wykonać około 5 mm nacięcie w dolnej ćwiartce brzucha, odsłaniając przestrzeń podskórną między skórą a mięśniami brzucha. Wykonaj wycięcie przez warstwę skórną z mięśnia brzucha, aby utworzyć kieszeń o szerokości 15-20 mm prowadzącą do górnej części kwadrantu brzucha. Powtórz podobną procedurę, aby utworzyć podobną otwartą kieszeń po drugiej stronie tego samego odwłoka myszy.
8. Włóż jedną połowę żelu po jednej stronie kieszeni brzusznej, a drugą pół części żelu po drugiej stronie kieszonki brzusznej, unosząc warstwę skórną tuż doogonowo do nacięcia.
9. Po wprowadzeniu żeli każde nacięcie należy zamknąć 2-3 szwami za pomocą nici polipropylenowej 5-0 na igle tnącej. Odpowiednio oznacz karty klatki i przeprowadź monitorowanie pooperacyjne i analgezję zgodnie z wymaganiami instytucjonalnymi i protokołem oraz pozwól komórkom w tych wszczepionych żelach na wytworzenie naczyń de novo.
10. Wreszcie, pobieranie implantów żelowych jest zwykle wykonywane 14 dni po implantacji po eutanazji myszy.
11. Przetrzyj okolicę brzucha wacikami nasączonymi alkoholem i przetnij skórę brzucha ogonową do pierwotnej linii nacięcia. Ostrożnie wypreparuj implant, wycinając płat skóry ogonowej do prawdopodobnej lokalizacji żelu. Wytnij implant, przecinając go obwodowo wokół żelu, a następnie umieść w utrwalaczu cynkowym (BD Biosciences, postępuj zgodnie z zaleceniami producenta w celu uzyskania optymalnych rezultatów) i pozwól im się utrwalić przez 1-2 godziny w temperaturze pokojowej.
12. Przygotuj żele zatopione w parafinie przy użyciu standardowych protokołów histochemicznych i przygotuj skrawki 5 μm na szkiełkach w celu przeprowadzenia barwienia hematoksyliną i eozyną, anty-ludzkim CD31 lub anty-mysim CD31 w celu wizualizacji układu naczyniowego w żelu. ECFC ulegają unaczynieniu de novo w celu wytworzenia humanizowanych naczyń w komórkowych implantach żelowych wprowadzanych myszom z niedoborem odporności na 14 dni ^4,8,11.

D. Reprezentatywne wyniki

Korzystając z tej techniki wyprowadzania ECFC, zaobserwowaliśmy wzrost pierwotnej kolonii już w 5 dniu (Rys. 1). Odkryte kolonie ECFC wykazywały typowy brukowany wygląd i spowodowały podwojenie populacji >40 po długotrwałej ekspansji po pozyskaniu kolonii przez klonowanie. Rozszerzone kolonie wykazywały ekspresję antygenów śródbłonka, ale nie wykazywały ekspresji antygenów krwiotwórczych (ryc. 2). Co ważne, wykazywały one pełną hierarchię klonalnego potencjału proliferacyjnego na poziomie pojedynczej komórki (ryc. 3). Co więcej, ECFC utworzyły humanizowane naczynia krwionośne, które są perfundowane przez erytrocyty gospodarza po wszczepieniu myszom z niedoborem odporności^{4, 6, 8, 11} (ryc. 4).

Rysunek 1. Izolacja komórek jednojądrzastych (MNC) z krwi pępowinowej i wyrastanie komórek tworzących kolonie śródbłonka (ECFC) z hodowanych MNC. MNC tworzą warstwę kożucha podczas separacji komórek krwi pępowinowej w gradiencie gęstości Ficoll-Pague. Izolacja warstwy kożucha kożuchowego do hodowli MNC na płytkach pokrytych kolagenem szczurzego ogona I powoduje wzrost kolonii ECFC w ciągu 5 do 14 dni. Kolonia ECFC (oznaczona grotami strzałek) wykazywała morfologię bruku⁷.

Rysunek 2. Reprezentatywna ocena fenotypowa in vitro ekspresji antygenu powierzchniowego śródbłonka i komórek krwiotwórczych. Immunofenotypowanie ECFC pochodzących z krwi pępowinowej wykazało, że ECFC wyrażały antygeny śródbłonka CD31, CD34, CD144, CD146, Flt-1, Flk-1, Flt-4 i Nrp2, ale nie wykazywały ekspresji antygenów krwiotwórczych CD45, CD14, CD11b, cKit, CXCR4 lub AC133^{7, 8}.

Rysunek 3. Reprezentatywne ilościowe oznaczanie in vitro potencjału klonogennego i proliferacyjnego ECFC pochodzących z CB. (A) ECFC pochodzące z krwi pępowinowej wykazują klonalny potencjał proliferacyjny z hierarchią kolonii od klastrów 2 do 50 komórek aż do kolonii >2001. (B) Mikrofotografie hierarchii kolonii (kolonie barwione Sytoxem, zielonym fluorescencyjnym barwnikiem jądrowym w celu uzyskania lepszej jakości zdjęć) uzyskane po ECFC pochodzącym z krwi pępowinowej hodowano na poziomie pojedynczej komórki przez 14 dni. Podziałka skali reprezentuje 100 μm^{7, 8}.

Rysunek 4. Reprezentatywna charakterystyka funkcjonalna in vivo ECFC pochodzących z krwi pępowinowej. A) Barwienie H&E ECFC pochodzącego z krwi pępowinowej zawierającego implanty żelu komórkowego wykazało tworzenie się mikronaczyń (wypełnionych erytrocytami gospodarza) w żelu kolagenowo-fibronektynowym po 14 dniach od implantacji. B) Anty-ludzkie barwienie CD31 (brązowe barwienie) dodatkowo potwierdza ludzkie pochodzenie tych naczyń.

Dyskusja

Charakterystyka fenotypowa i funkcjonalna przypuszczalnych komórek progenitorowych śródbłonka jest ważna dla identyfikacji ECFC w dobrej wierze , które są zdolne do klonalnego i seryjnego ponownego powlekania w hodowli i dają początek trwałym i funkcjonalnym wszczepialnym naczyniom krwionośnym in vivo. Ludzka krew pępowinowa jest wzbogacona w ECFC, a stężenie tych krążących komórek zmniejsza się wraz ze starzeniem się lub chorobą¹⁰. Ostatnie badania sugerują, że ECFC może odgrywać ważną rolę ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Heparyna sodowa do wstrzykiwań, USP	APP Pharmaceuticals	504031
Ficoll-Pague	Amersham	17-1440-03
Kaniula mieszająca	Maersk Medical	500.11.012
EGM-2	Lonza Inc.	CC-3162
Zdefiniowany hyklon FBS		SH30070.03
TrypLE express	GIBCO, firmy Life Technologies	12605
Kolagen typu I dla szczurów	BD Biosciences	354236
Matrigel	BD Biosciences	356234
Blok FcR	Miltenyi Biotec	130-059-901
hCD31, sprzężony z FITC	BD Biosciences	555445
hCD45, FITC	z BD Biosciences	555482
hCD14, FITC sprzężone	z BD Biosciences	555397
hCD144, PE sprzężone	eBioscience	12-1449-80
hCD146, PE sprzężone	z BD Biosciences	550315
hCD105, PE sprzężone	Invitrogen
przeciwciało Ms IgG1,k, FITC sprzężone	z BD Biosciences	555748
Ms Przeciwciało IgG1,k, PE sprzężone	z BD Biosciences	559320
Przeciwciało Ms IgG2a,k, FITC sprzężone	z BD Biosciences	555573
Anty-ludzki klon CD31	Dako	JC70/A
Anty-mysz CD31	BD Biosciences	553370
0,22-μ m system filtracji próżniowej	EMD Millipore	SCGPU05RE
Lodowaty kwas octowy, 17,4 N	Fisher Scientific	A38-500
Antybiotykowo-przeciwgrzybiczy	Invitrogen	15240-062
Płodowa surowica bydlęca (FBS)	Hyklon	SH30070.03
IHC Utrwalacz	BD Biosciences	550523
Zielony odczynnik Sytox	Invitrogen	S33025
Cylindry klonujące, sterylne	Fisher Scientific	07-907-10