Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Charakterystyka fenotypowa i funkcjonalna komórek endotelialnych tworzących kolonie pochodzących z krwi pępowinowej człowieka

16.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/3872

⸱

13 kwietnia 2012

 ,  , 
1Herman B Wells Center for Pediatric Research, Indiana University School of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Komórki endotelialne tworzące kolonie (ECFCs) to krążące komórki endotelialne o silnym potencjale proliferacyjnym klonalnym, które wykazują wrodzone in vivo zdolność do tworzenia naczyń. Fenotypowa i funkcjonalna charakterystyka komórek śródbłonka wyhodowanych z krwi pępowinowej jest istotna dla ich identyfikacji i izolacji bona fide ECFCy do potencjalnych zastosowań klinicznych w naprawie uszkodzonych tkanek.

Streszczenie

W literaturze niedawno przeanalizowano utrwalone poglądy na temat powstawania nowych naczyń krwionośnych poprzez angiogenezę, waskulogenezę i arteriogenezę1. Obecność krążących komórek progenitorowych śródbłonka (EPCs) w obwodowej krwi ludzi dorosłych została po raz pierwszy zidentyfikowana przez Asaharę et al. w 1997 roku 2, co zapoczątkowało szereg nowych hipotez i strategii w zakresie regeneracji i naprawy naczyń. EPCs to rzadkie, lecz normalne składniki krążącej krwi, które migrują do miejsc powstawania naczyń krwionośnych lub przebudowy naczyniowej i wspomagają postnatalną waskulogenezę, angiogenezę lub arteriogenezę, głównie poprzez stymulację paracrynną komórek pochodzących ze ścian istniejących naczyń3. Nie zidentyfikowano specyficznego markera pozwalającego rozpoznać pojedynczą komórkę EPC, a obecny stan wiedzy wskazuje, że w stymulację procesu angiogenezy w różnych modelach zwierzęcych przedklinicznych oraz u ludzi w wielu stanach chorobowych zaangażowanych jest wiele typów komórek, w tym proangiogenne hematopoetyczne komórki macierzyste i progenitorowe, krążące komórki angiogenne, monocyty Tie2+, mieloidalne komórki progenitorowe, makrofagi związane z nowotworem oraz makrofagi aktywowane do fenotypu M24, 5. Komórki tworzące kolonie śródbłonka (ECFCs) to rzadkie, krążące, żywe komórki śródbłonka, które charakteryzują się silnym potencjałem do proliferacji klonalnej, zdolnością do tworzenia wtórnych i trzeciorzędnych kolonii po przesiewaniu oraz zdolnością do tworzenia wewnątrzpochodnych naczyń in vivo po transplantacji do myszy z niedoborem odporności6-8. Choć ECFCs zostały z sukcesem wyizolowane z krwi obwodowej zdrowych dorosłych, krwi pępowinowej (CB) zdrowych noworodków oraz ze ścian wielu ludzkich naczyń tętniczych i żylnych 6-9, krew pępowinowa wykazuje najwyższą częstotliwość występowania ECFCs7, które wykazują najsilniejszy potencjał do proliferacji klonalnej i tworzą trwałe oraz funkcjonalne naczynia krwionośne in vivo8, 10-13. Mimo że przedstawiono metody pozyskiwania ECFC z krwi obwodowej dorosłych14, 15, w niniejszej pracy opisujemy metodologię pozyskiwania, klonowania, ekspansji oraz charakterystyki in vitro i in vivo ECFCs z ludzkiej krwi pępowinowej (CB).

Protokół

Odczynniki i roztwory

pożywka EMG-2 (Lonza, nr kat. cc-3162 zawierająca pożywkę podstawową EBM-2 oraz suplementy i czynniki wzrostu z zestawu EGM-2 SingleQuot)

EBM-2 (Lonza, nr kat. cc-3156) uzupełniony o komplet dodatków i czynników wzrostu z zestawu SingleQuot (Lonza, nr kat. cc-4176), 10% (v/v) płodowej surowicy bydlęcej (FBS) oraz 1% (v/v) penicyliny (10 000 U/ml)/streptomycyny (10 000 μg/ml)/amfoterycyny (25 μg/ml). Przechowywać do 1 miesiąca w temperaturze 4 °C. Rekomendowane objętości EGM-2 do hodowli ECFC to 500 μl/dołek dla płytek 24-dołkowych, 2 ml/dołek dla płytek 6-dołkowych, 5 ml dla kolb 25-cm2 oraz 10 ml dla kolb 75-cm2, chyba że protokół stanowi inaczej.

Roztwór kolagenu typu I

Rozcieńczyć 0,575 ml octowego kwasu lodowatego (17,4N) w 495 ml sterylnej wody destylowanej (stężenie końcowe 0,02 N). Rozcieńczony kwas octowy przefiltrować sterylnie za pomocą systemu filtracji próżniowej z filtrem 0,22-μm. Do rozcieńczonego kwasu octowego dodać 25 mg kolagenu typu I z ogona szczura, aby uzyskać stężenie końcowe 50 μg/ml. Ilość dodanego kolagenu będzie zależeć od stężenia roztworu stokowego kolagenu. Przechowywać do miesiąca w temperaturze 4 °C.

Przygotowanie powierzchni hodowli tkankowych powlekanych kolagenem I

Nanieś 1 ml roztworu kolagenu I do każdej studni 6-dołkowej płytki do hodowli tkanek (w przypadku płytek 24-dołkowych użyj 300 μl/studnię, dla kolbek 25-cm2 3 ml, a dla kolbek 75-cm2 8 ml). Inkubuj przez 1 godzinę lub przez noc w temperaturze 37 °C. Usuń roztwór kolagenu I i przemyj powierzchnię dwukrotnie, za każdym razem używając PBS (w przypadku płytek 24-dołkowych użyj 500 μl/studnię, dla płytek 6-dołkowych 2 ml/studnię, dla kolbek 25-cm2 5 ml oraz dla kolbek 75-cm2 10 ml). Płytki należy użyć niezwłocznie do hodowli komórkowych.

Bufor do barwienia FACS

Fosforanowy bufor solny (PBS) uzupełniony o 2% (v/v) płodowej surowicy bydlęcej (FBS). Przechowywać do 2 tygodni w temperaturze 4 °C.

A. Namnażanie, klonowanie i ekspansja ECFC

  1. Pobrać krew pępowinową (CB) z użyciem heparyny (10 U heparyny/ml krwi) lub EDTA jako przeciwkrzepliwego i przetransportować do laboratorium w temperaturze pokojowej, a następnie niezwłocznie (w ciągu 2 godzin od narodzin noworodka) poddać próbkę procesowi izolacji komórek mononuklearnych (MNC).
  2. Odmierzyć 15 ml CB do każdej stożkowej probówki wirówki o pojemności 50 ml, dodać 20 ml PBS do każdej probówki z CB i wymieszać, pipetując kilka razy. Nabrać 15 ml Ficoll-Paque do strzykawki 20-ml i założyć igłę 20G lub kaniulę do mieszania. Umieścić końcówkę kaniuli na dnie probówki z rozcieńczoną krwią i ostrożnie nałożyć 15 ml Ficoll-Pague. Wirować probówki przez 30 min przy 740 x g w temperaturze pokojowej, z wyłączoną funkcją hamowania podczas zwalniania.
  3. Za pomocą pipety transferowej usunąć mątną warstwę MNC o niskiej gęstości znajdującą się na styku Ficoll-Paque i rozcieńczonej plazmy. Przenieść MNC do stożkowej probówki 50-ml zawierającej 10 ml pożywki EGM-2. Wirować MNC przez 10 min przy 515 x g w temperaturze pokojowej, z wysokim ustawieniem hamowania podczas zwalniania.
  4. Ostrożnie odessać i usunąć nadsącz. Przemyć osad komórkowy dwa razy pożywką EGM-2 (10 min przy 515 x g) i resuspendować MNC w EGM-2 w stężeniu 1,25 x 107 komórek/ml. Przygotować 6-dołkowe płytki do hodowli tkankowej pokryte kolagenem I, dodając 1 ml kolagenu typu I z ogona szczura (50 μg/ml) na dołek i inkubując płytkę przez noc. Pipetować 4 ml tej zawiesiny MNC do każdego dołka i umieścić komórki w inkubatorze z nawilżaniem, w temperaturze 37 °C i przy 5% CO2. A.1.5) Po 24 godzinach (dzień 1) powoli usunąć zużytą pożywkę (nie zakłócając słabo przylegających komórek) z dołka za pomocą pipety, powoli dodać 4 ml EGM-2 do dołka i zwrócić płytkę do inkubatora. W dniu 2 odświeżyć pożywkę, powoli usuwając ją z dołka pipetą (nie zakłócając słabo przylegających komórek) i dodając 4 ml EGM-2 do każdego dołka. Powtarzać wymianę pożywki codziennie do 7. dnia, a następnie co drugi dzień, aż pojawią się kolonie ECFC do klonowania. Zazwyczaj kolonie pojawiają się między 5. a 14. dniem7(Ryc. 1).
  5. Wizualizować typowe kolonie ECFC o morfologii brukowej za pomocą mikroskopu odwróconego (powiększenie 10x) i zaznaczyć granice kolonii markerem na spodzie dołka, aby wskazać położenie każdej kolonii.
  6. W 14. dniu przemyć te pierwotne kolonie 2 razy PBS i zebrać poszczególne kolonie za pomocą cylindrów do klonowania i ilości TrypLE express wystarczającej do pokrycia komórek wewnątrz cylindrów. Po odessaniu końcowego przemycia PBS, umieścić sterylny cylindr do klonowania pokryty żelem wokół każdej kolonii i mocno docisnąć do płytki za pomocą sterylnej pęsety. Dodać 2-3 krople ciepłego TrypLE express do każdego cylindra do klonowania i inkubować przez 3-5 min, aż komórki wewnątrz cylindra zaczną się odrywać. Dodać około 250 μl pożywki EGM-2 do wnętrza cylindra i pipetować w górę i w dół, aby uzyskać zawiesinę pojedynczych komórek. Przenieść zawiesinę pojedynczych komórek z każdego cylindra osobno do oddzielnej probówki do mikro-wirówki.
  7. Przemyć obszar wewnątrz cylindra 2-3 razy około 250 μl pożywki EGM-2, aby zebrać wszystkie pozostałe komórki, i przenieść przemycia z każdego cylindra do odpowiedniej probówki do mikro-wirówki. Wirować komórki z dużą prędkością (≤300 x g) w wirówce stołowej przez 5 min.
  8. Usunąć nadsącz i resuspendować osad komórkowy w 1,5 ml świeżej pożywki EGM-2. Przenieść zawiesinę komórkową (zawierającą wszystkie komórki z poszczególnych kolonii) z każdej probówki do jednego dołka 24-dołkowej płytki do hodowli tkankowej uprzednio pokrytej 500 μL kolagenem I z ogona szczura (50 μg/ml).
  9. Umieścić w inkubatorze w celu ekspansji, wymieniając pożywkę co drugi dzień.
  10. Gdy komórki osiągną 80-90% konfluencji, usunąć zużytą pożywkę, przemyć komórki 2 razy PBS i dodać 500 μl pożywki TrypLE express do każdego dołka 24-dołkowej płytki do hodowli tkankowej. Umieścić płytkę w inkubatorze na 3-5 min, aż komórki zaczną się zaokrąglać i odrywać. Dodać 1 ml EGM-2 (z 10% zdefiniowanego FBS) do każdego dołka, aby zebrać komórki poprzez przemywanie i przenieść je do probówki 15 ml. Przemyć dołek 1 ml pożywki EGM-2, aby zebrać wszystkie pozostałe komórki i przenieść przemycia z każdego dołka do odpowiedniej probówki 15 ml. Wirować komórki przy 300 x g przez 5 min.
  11. Usunąć pożywkę i resuspendować osad komórkowy w 1 ml świeżej pożywki EGM-2 (z 10% zdefiniowanego FBS). Ustalić liczbę żywych komórek w aliquocie za pomocą hemocytometru i metody wykluczania błękitu trypanu.
  12. Ekspandować komórki, wysiewając około 5000 komórek/cm2 na powierzchnie do hodowli tkankowej uprzednio pokryte kolagenem I w pożywce EGM-2, wymieniając pożywkę co drugi dzień, aż komórki osiągną 80-90% konfluencji przed kolejną subkulturą.

B. Charakterystyka fenotypowa ECFC in vitro: ekspresja antygenów powierzchniowych komórek śródbłonka i test pojedynczej komórki w celu oceny klonalnego potencjału proliferacyjnego

  1. W celu oceny ekspresji antygenów powierzchniowych komórek śródbłonka należy oddzielić komórki za pomocą TrypLE express, a następnie zebrać je, stosując metody opisane dla klonowania i ekspansji ECFC.
  2. Ponownie zawiesić komórki w buforze do barwienia FACS (10 x 106 komórek/ 1 ml buforu do barwienia FACS), a następnie dodać odczynnik blokujący FcR (20 μl/ 10 X 106 komórki), delikatnie wymieszać i inkubować w lodzie przez 10 min.
  3. Aliquota 100 μl tę zawiesinę komórkową do probówek do mikrocentryfugi dla każdego antygenu powierzchni endothelialnych oraz kontroli izotypowych. Dodać odpowiednią ilość znakowanych fluorochromem ludzkich przeciwciał monoklonalnych rozpoznających antygeny endothelialne (CD31, CD144, CD146 i CD105) lub antygeny hematopoetyczne (CD45 i CD14) i pozostawić w lodzie przez 30 min, chroniąc przed światłem. Uwaga: 1 X 106 komórki nie są wymagane dla każdego testu. Autorzy zazwyczaj przygotowują od 0,5 do 1 x 105 komórek/probówkę, aby uzyskać 2 X 104 analizowane zdarzenia. Ponadto, Należy przestrzegać zaleceń producenta dotyczących ilości przeciwciał do zastosowania w każdym teście. Niektóre przeciwciała mogą wymagać miareczkowania w celu ustalenia optymalnego stężenia. Wszystkie barwienia wykonane przez autorów były barwieniami jednobarwnymi.
  4. Po 30-minutowej inkubacji w lodzie każdą probówkę należy odwirować z dużą prędkością w wirówce stołowej przez 5 min, następnie usunąć nadpływ i resuspender osad komórkowy w buforze do FACS.
  5. Przeanalizuj próbki za pomocą cytometru przepływowego, aby określić procent komórek wykazujących pozytywne lub negatywne barwienie dla każdego antygenu. ECFC wykazują jednolicie pozytywne barwienie dla CD31, CD144 i CD146, natomiast negatywne dla CD45 i CD14 w porównaniu z odpowiednimi kontrolami izotypowymi.
  6. W celu przeprowadzenia analizy pojedynczych komórek w celu zbadania klonalnego potencjału proliferacyjnego, odseparuj komórki z wczesnych pasaży (2-3) przy użyciu TrypLE express, aby zebrać komórki metodami podobnymi do tych opisanych dla klonowania i ekspansji ECFC.
  7. Zainfekuj te komórki lentiwirusami wykazującymi ekspresję wzmocnionego zielonego białka fluorescencyjnego (EGFP) 16 oraz zebrać komórki wykazujące ekspresję EGFP za pomocą cytometrii przepływowej. Uwaga: Praca z lentiwirusami jest uznawana za zagrożenie biologiczne i należy przestrzegać wszystkich środków ostrożności w zakresie bezpieczeństwa biologicznego.
  8. Hodować je zgodnie z opisem hodowli ECFC zawartym w sekcji dotyczącej ekspansji ECFC.
  9. Przygotować płytki 96-dołkowe powlekane kolagenem I, dodając 50 μl kolagen typu I z ogona szczura (50 μg/ml) na studzienkę i inkubować płytkę przez noc. Zebrać EGFP+ ECFC odseparowano za pomocą TrypLE express i zawieszono w medium EGM-2 do uzyskania końcowego stężenia ~106 komórek/ml.
  10. Użyj analizatora FACS Vantage (Becton Dickson) lub innego porównywalnego sortera z niską prędkością przepływu wynoszącą 20 komórek/sekundę, aby wyizolować pojedynczą komórkę EGFP.+ ECFC na studzienkę płytki 96-dołkowej i dostosować objętość końcową do 200 μl na studzienkę pożywką EGM-2. Należy użyć odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego, aby upewnić się, że w każdej studzience znajduje się tylko jedna komórka. Alternatywnie można sortować pojedyncze komórki na podstawie parametrów FSC i SSC, a do oceny i ilościowego oznaczenia komórek można wykorzystać barwienie jąder komórkowych barwnikiem Sytox w koloniach.
  11. Inkubować płytkę przez dwa tygodnie, wymieniając pożywkę dwukrotnie (200 μl EGM-2 za pomocą pipety wielokanałowej) przeprowadzono w 5. i 10. dniu. W 14. dniu hodowli należy przepłukać każdą studzienkę za pomocą 100 μl PBS przed utrwaleniem komórek za pomocą 100 μl w 4% paraformaldehydzie przez 30 min. W przypadku ECFC niewykazujących ekspresji EGFP, po fiksacji paraformaldehydem należy dodać odczynnik Sytox, zielony fluorescencyjny barwnik jądrowy, i inkubować w 4 °C na noc.
  12. Użyj mikroskopu fluorescencyjnego do zbadania każdej studni w celu ilościowego określenia liczby komórek śródbłonka, które namnożyły się z pojedynczej komórki hodowanej przez 14 dni. W analizie ilościowej studnie zawierające 2 lub więcej komórek śródbłonka zaklasyfikuj jako pozytywne (pod kątem proliferacji), a następnie przeprowadź dalszą analizę w celu ustalenia całkowitej liczby komórek śródbłonka poprzez wizualne liczenie pod mikroskopem fluorescencyjnym.
  13. W celu prezentacji uzyskanych danych dolegi z liczbą komórek śródbłonka wynoszącą odpowiednio: od 2 do 50, 51–2000 oraz 2001 i więcej, uznaje się za: skupiska komórek śródbłonka, ECFC o niskim potencjale proliferacyjnym (LPP) oraz ECFC o wysokim potencjale proliferacyjnym (HPP). ECFC wykazują pełną hierarchię klonalnego potencjału proliferacyjnego, dając początek skupiskom śródbłonka, LPP oraz HPP podczas hodowli w pojedynczych komórkach przez 14 dni.7

C. Funkcjonalna charakterystyka ECFC in vivo: test tworzenia naczyń in vivo w celu zbadania potencjału ECFC do waskulogenezy

  1. Przygotować zkomórkowione implanty żelowe, obliczając całkowitą objętość (ml) każdego z poniższych materiałów żelowych (z końcowym stężeniem w nawiasie) niezbędną do odlania 1 ml żelu (który zostanie później podzielony na pół w celu uzyskania 2 implantów): FBS (10%), EBM-2 10:1 (dostosować objętość końcową do 1 ml), wodorowęglan sodu (1,5 mg/ml), NaOH (dostosować pH do 7,4), HEPES (25 mM), fibronektyna (100 μg/ml) oraz kolagen I (1,5 mg/ml).
  2. Po obliczeniu ilości materiałów żelowych odłączyć komórki za pomocą TrypLE express, aby zebrać je metodami podobnymi do tych opisanych dla klonowania i ekspansji ECFC. Wyznaczyć liczbę żywych komórek w alikwocie przy użyciu hemocytometru i błękitu trypanu. Przenieść 2,4 miliona żywych komórek do stożkowej probówki 50 ml i zpelletować komórki poprzez wirowanie przy 515 x g w temperaturze pokojowej. Jednocześnie przygotować roztwór macierzy żelowej, dodając obliczone objętości HEPES, wodorowęglanu sodu, EBM-2 10:1, FBS, fibronektyny i kolagenu do schłodzonej do temperatury lodowej stożkowej probówki 50 ml (w kolejności, w jakiej zostały wymienione). Wymieszać dokładnie i dostosować pH do 7,4 za pomocą NaOH, utrzymując roztwór w lodzie.
  3. Odlać nadsącz z komórek po wirowaniu i resuspender osad w 360 μl ciepłego EGM-2, a następnie dodać do niego 840 μl roztworu macierzy żelowej o dostosowanym pH, tak aby końcowa objętość implantu żelowego wynosiła 1 ml. Powoli wymieszać komórki z roztworem macierzy żelowej, aż komórki zostaną całkowicie zawieszone w roztworze żelu.
  4. Przenieść 1 ml tej zkomórkowanej zawiesiny żelowej do jednej studni 12-dołkowej płytki hodowlanej i inkubować przez 20-30 min do czasu polimeryzacji żelu. Ostrożnie przykryć żel 2 ml ciepłego EGM-2 i inkubować przez noc.
  5. Bezpośrednio przed implantacją podzielić inkubowany przez noc żel na dwie równe części za pomocą nożyczek irydowych i umieścić fragmenty żelu w tej samej studni hodowlanej zawierającej medium EGM-2.
  6. W sali zabiegowej dla zwierząt uśpić zwierzę (myszy NOD/SCID w wieku 5-6 tygodni) poprzez podanie anestetyku izofluranu. Ogolić dolną część brzucha i dokładnie oczyścić miejsce operacyjne za pomocą gazików nasączonych alkoholem i betadyną lub innym środkiem antyseptycznym. Następnie odizolować obszar za pomocą chust sterylnych zgodnie z wytycznymi IACUC i wytycznymi instytucjonalnymi.
  7. Za pomocą sterylnych, ostrych nożyczek irydowych wykonać nacięcie o długości około 5 mm w dolnej ćwiartce brzucha, odsłaniając przestrzeń podskórną między skórą a mięśniami brzucha. Wykonać rozczepienie tępe przez warstwę skóry od mięśni brzucha, aby utworzyć kieszeń o szerokości 15-20 mm prowadzącą górą do górnej ćwiartki brzucha. Powtórzyć analogiczną procedurę w celu utworzenia podobnej otwartej kieszeni po drugiej stronie brzucha tej samej myszy.
  8. Wprowadzić jedną połowę żelu do jednej strony kieszeni brzusznej, a drugą połowę żelu do drugiej strony kieszeni brzusznej, podnosząc warstwę skóry tuż gudałnie od nacięcia.
  9. Po wprowadzeniu żeli zamknąć każde nacięcie 2-3 szwami, używając nici polipropylenowej 5-0 na igle tnącej. Odpowiednio oznakować karty klatek, przeprowadzić monitorowanie pooperacyjne i podać leki przeciwbólowe zgodnie z wymaganiami instytucjonalnymi i protokołem, a następnie odczekać 14 dni, aby komórki w tych implantowanych żelach wytworzyły unaczynienie de novo.
  10. Ostatecznie pobranie implantów żelowych wykonuje się zazwyczaj 14 dni po implantacji, po uśpieniu myszy.
  11. Przetrzeć obszar brzucha gazikami z alkoholem i naciąć skórę brzucha gudałnie od pierwotnej linii nacięcia. Ostrożnie wypreparować implant, wycinając płat skóry gudałnie od prawdopodobnej lokalizacji żelu. Wyciąć implant, wykonując cięcie okrężne wokół żelu, a następnie umieścić go w utrwalaczu cynkowym (BD Biosciences, postępując zgodnie z zaleceniami producenta w celu uzyskania optymalnych wyników) i pozostawić do utrwalenia na 1-2 godziny w temperaturze pokojowej.
  12. Przygotować żele zatopione w parafinie, korzystając ze standardowych protokołów histochemicznych, i wykonać przekroje o grubości 5 μm na szkiełkach przedmiotowych w celu przeprowadzenia barwienia hematoksyliną i eozyną, przeciwciałami anty-human CD31 lub anty-mouse CD31, aby zwizualizować unaczynienie wewnątrz żelu. ECFC podlegają waskulogenezie de novo w celu wytworzenia naczyń zhumanizowanych w zkomórkowanych implantach żelowych wprowadzonych do immunodeficyjnych myszy na 14 dni 4,8,11.

D. Reprezentatywne wyniki

Stosując tę technikę wyprowadzania ECFC, zaobserwowaliśmy wzrost pierwotnych kolonii już w 5. dniu (Ryc. 1). Kolonie ECFC po wyprowadzeniu wykazywały typowy wygląd brukowy i dawały początek >40 podwojeń populacji podczas długotrwałej ekspansji po pobraniu kolonii metodą klonowania. Rozrośnięte kolonie wykazywały ekspresję antygenów śródbłonkowych, ale nie wykazywały ekspresji antygenów krwiotwórczych (Rys. 2). Co istotne, wykazały one pełną hierarchię klonalnego potencjału proliferacyjnego na poziomie pojedynczej komórki (Ryc. 3). Co więcej, ECFC stworzyły zhumanizowane naczynia krwionośne, które po implantacji u myszy z niedoborem odporności zostały ukrwione krwinkami czerwonymi gospodarza.4, 6, 8, 11 (Rys. 4).

Izolacja i wysiew MNC z krwi; schemat tworzenia kolonii ECFC do analizy komórkowej.
Rysunek 1. Izolacja komórek mononuklearnych (MNCs) z krwi pępowinowej i wzrost komórek endotelialnych tworzących kolonie (ECFCs) z hodowanych MNCs. MNCs tworzą warstwę tzw. buffy coat podczas separacji komórek krwi pępowinowej metodą gradientu gęstości Ficoll-Pague. Izolacja warstwy buffy coat w celu hodowli MNCs na płytkach pokrytych kolagenem I z ogona szczura prowadzi do wzrostu kolonii ECFC w ciągu od 5 do 14 dni. Wyrośnięta kolonia ECFC (wskazana grotami strzałek) wykazuje morfologię brukowaną7.

Histogramy cytometrii przepływowej; intensywność fluorescencji; znaczniki APC, PE; analiza populacji komórek.
Rysunek 2. Reprezentatywna ocena fenotypowa in vitro ekspresji antygenów powierzchniowych komórek śródbłonka i komórek krwiotwórczych. Immunofenotypowanie ECFC pochodzących z krwi pępowinowej wykazało, że ECFC wykazują ekspresję antygenów śródbłonkowych CD31, CD34, CD144, CD146, Flt-1, Flk-1, Flt-4 oraz Nrp2, ale nie wykazują ekspresji antygenów krwiotwórczych CD45, CD14, CD11b, cKit, CXCR4 lub AC1337, 8.

Wyniki wysiewania komórek; wykres słupkowy i obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej; analiza proliferacji komórek.
Rysunek 3. Reprezentatywne ilościowe oznaczenie in vitro potencjału klonogennego i proliferacyjnego ECFC pochodzących z krwi pępowinowej. (A) ECFC pochodzące z krwi pępowinowej wykazują klonalny potencjał proliferacyjny z hierarchią kolonii obejmującą od skupisk 2-50 komórek do kolonii liczących >2001. (B) Mikrografie hierarchii kolonii (kolonie barwione Sytox, zielonym fluorescencyjnym barwnikiem jądrowym w celu uzyskania obrazów lepszej jakości) uzyskane po hodowli ECFC pochodzących z krwi pępowinowej w pojedynczej warstwie komórek przez 14 dni. Pasek skali reprezentuje 100μm7, 8.

Porównanie histologiczne: barwienie H&E vs barwienie CD31, morfologia tkanki, obraz mikroskopowy.
Rysunek 4. Reprezentatywna funkcjonalna charakterystyka in vivo ECFC pochodzących z krwi pępowinowej. A) Barwienie H&E implantów z żelu zunifikowanego z ECFC pochodzącymi z krwi pępowinowej wykazało tworzenie się mikronaczyń (wypełnionych erytrocytami gospodarza) w żelu kolagenowo-fibronektynowym po 14 dniach od implantacji. B) Barwienie przeciwciałami anty-CD31 przeciwko ludzkim antygenom (barwienie brązowe) dodatkowo potwierdza ludzkie pochodzenie tych naczyń.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Charakterystyka fenotypowa i funkcjonalna domniemanych komórek progenitorowych śródbłonka jest istotna dla zidentyfikowania bona fide ECFC, które są zdolne do klonalnego i seryjnego przesiewania w kulturze oraz do tworzenia trwałych i funkcjonalnych naczyń krwionośnych możliwych do implantacji in vivo. Krew z pępowiny człowieka jest bogata w ECFC, a stężenie tych krążących komórek spada wraz z wiekiem lub w przebiegu chorób10. Niedawne badania sugerują, że ECFC mogą odgrywać ważną rolę w napr...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Dr Yoder jest konsultantem w firmie EndGenitor Technologies, Inc. oraz członkiem zarządu firmy Rimedion Technologies, Inc.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Wstrzyknięcie heparyny sodowej, USPAPP Pharmaceuticals504031
Ficoll-PaqueAmersham17-1440-03
Kaniula mieszającaMaersk Medical500.11.012
EGM-2Lonza Inc.CC-3162
Zdefiniowana FBSHycloneSH30070.03
TrypLE expressGIBCO, by Life Technologies12605
Kolagen typu I szczuraBD Biosciences354236
MatrigelBD Biosciences356234
Blokada FcRMiltenyi Biotec130-059-901
hCD31, koniugowany z FITCBD Biosciences555445
hCD45, sprzężone z FITCBD Biosciences555482
hCD14, sprzężone z FITCBD Biosciences555397
hCD144, koniugowany z PEeBioscience12-1449-80
hCD146, sprzężony z PEBD Biosciences550315
hCD105, koniugowany z PEInvitrogenMHCD10504
Ksiądz IgG (Ms IgG)1,k przeciwciało koniugowane z FITCBD Biosciences555748
mysia IgG1,k przeciwciało sprzężone z PEBD Biosciences559320
anty-IgG mysie2a,k przeciwciało sprzężone z FITCBD Biosciences555573
Przeciwciało przeciwko ludzkiemu CD31Dakoklon JC70/A
Przeciwciało przeciwko mysiemu CD31BD Biosciences553370
0.22-μsystem filtracji próżniowej mEMD MilliporeSCGPU05RE
Kwas octowy lodowaty, 17,4 NFisher ScientificA38-500
Antybiotyk-środek przeciwgrzybiczyInvitrogen15240-062
płodowa surowica bydlęca (FBS)HycloneSH30070.03
Fiksatywa cynkowa do IHCBD Biosciences550523
Odczynnik Sytox GreenInvitrogenS33025
Cylindry do klonowania, sterylneFisher Scientific07-907-10

Bibliografia

  1. Carmeliet, P., Jain, R. K. Molecular mechanisms and clinical applications of angiogenesis. Nature. 473, 298-307 (2011).
  2. Asahara, T. Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis. Science. 275, 964-967 (1997).
  3. Urbich, C., Dimmeler, S. Endothelial progenitor cells: characterization and role in vascular biology. Circ. Res. 95, 343-353 (2004).
  4. Critser, P. J., Voytik-Harbin, S. L., Yoder, M. C. Isolating and defining cells to engineer human blood vessels. Cell. Prolif. 44, 15-21 (2011).
  5. Matthias, M., David, N., Josef, N. From bench to bedside: what physicians need to know about endothelial progenitor cells. Am. J. Med. 124, 489-4897 (2011).
  6. Ingram, D. A. Vessel wall-derived endothelial cells rapidly proliferate because they contain a complete hierarchy of endothelial progenitor cells. Blood. 105, 2783-276 (2005).
  7. Ingram, D. A. Identification of a novel hierarchy of endothelial progenitor cells using human peripheral and umbilical cord blood. Blood. 104, 2752-2760 (2004).
  8. Yoder, M. C. Redefining endothelial progenitor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cell principals. Blood. 109, 1801-1809 (2007).
  9. Reinisch, A., Strunk, D. Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells (ECFCs. J. Vis. Exp. (32), e1525(2009).
  10. Au, P. Differential in vivo potential of endothelial progenitor cells from human umbilical cord blood and adult peripheral blood to form functional long-lasting vessels. Blood. 111, 1302-135 (2008).
  11. Critser, P. J., Kreger, S. T., Voytik-Harbin, S. L., Yoder, M. C. Collagen matrix physical properties modulate endothelial colony forming cell-derived vessels in vivo. Microvasc. Res. 80, 23-30 (2010).
  12. Melero-Martin, J. M. Engineering robust and functional vascular networks in vivo with human adult and cord blood-derived progenitor cells. Circ. Res. 103, 194-202 (2008).
  13. Melero-Martin, J. M. In vivo vasculogenic potential of human blood-derived endothelial progenitor cells. Blood. 109, 4761-4768 (2007).
  14. Hofmann, N. A., Reinisch, A., Strunk, D. Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells. J. Vis. Exp. (32), e1524(2009).
  15. Lin, Y., Weisdorf, D. J., Solovey, A., Hebbel, R. P. Origins of circulating endothelial cells and endothelial outgrowth from blood. J. Clin. Invest. 105, 71-77 (2000).
  16. Witting, S. R. Efficient Large Volume Lentiviral Vector Production Using Flow Electroporation. Hum. Gene. Ther. , (2011).
  17. Yoon, C. H. Synergistic neovascularization by mixed transplantation of early endothelial progenitor cells and late outgrowth endothelial cells: the role of angiogenic cytokines and matrix metalloproteinases. Circulation. , 112-1618 (2005).
  18. Dubois, C. Differential effects of progenitor cell populations on left ventricular remodeling and myocardial neovascularization after myocardial infarction. J. Am. Coll. Cardiol. 55, 2232-2243 (2010).
  19. Medina, R. J., O'Neill, C. L., Humphreys, M. W., Gardiner, T. A., Stitt, A. W. Outgrowth endothelial cells: characterization and their potential for reversing ischemic retinopathy. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 51, 5906-5913 (2010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Klonowy potencjał proliferacyjnyanaliza pojedynczych komórektworzenie naczyń in vivocytometria przepływowamikroskopia fluorescencyjnaimplantacja macierzy żelowejmyszy Nod Scidmarkery CD31 CD34
Charakterystyka fenotypowa i funkcjonalna komórek endotelialnych tworzących kolonie pochodzących z krwi pępowinowej człowieka
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.