Artykuł metodologiczny

Izotachoforeza na chipie do rozdzielania jonów i oczyszczania kwasów nukleinowych

28K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/3890

⸱

2 marca 2012

 ,  ,  , 
1Mechanical Engineering, Stanford University

W tym artykule

Podsumowanie

Izotachforeza (ITP) jest wydajną elektrokinetyczną techniką rozdziału i prekonecentracji, znajdującą zastosowanie w wielu obszarach, od detekcji toksyn po przygotowanie próbek. W niniejszym opracowaniu omawiamy zasady fizyczne ITP oraz metodologię zastosowania tej techniki w dwóch konkretnych przykładach: rozdziału i detekcji małych cząsteczek oraz oczyszczaniu kwasów nukleowych z lizatu kultur komórkowych.

Streszczenie

Techniki elektrokinetyczne są podstawą zastosowań w mikroskali ze względu na ich wyjątkową zdolność do przeprowadzania różnorodnych procesów fluidycznych i elektroforetycznych w prostych, kompaktowych systemach bez ruchomych części. Izotachoforeza (ITP) jest prostą i bardzo niezawodną techniką elektrokinetyczną, która pozwala na milionkrotną prekonecentrację1,2 oraz wydajne rozdzielanie i ekstrakcję w oparciu o ruchliwość jonową.3 Na przykład zademonstrowaliśmy zastosowanie ITP do rozdzielania i czułego wykrywania nieoznakowanych cząsteczek jonowych (np. toksyn, DNA, rRNA, miRNA) przy niewielkim przygotowaniu próbki lub całkowicie bez niego4-8, a także do ekstrakcji i oczyszczania kwasów nukleinowych z złożonych matryc, w tym z kultur komórkowych, moczu i krwi.9-12

ITP umożliwia ogniskowanie i rozdział dzięki zastosowaniu pola elektrycznego oraz dwóch buforów w obrębie mikroprzepływowego układu kanałów. W przypadku analitów anionowych bufor elektrolitu prowadzącego (LE) jest dobierany tak, aby jego aniony miały wyższą efektywną ruchomość elektroforetyczną niż aniony buforu elektrolitu podążającego (TE) (ruchomość efektywna opisuje obserwowalną prędkość dryfu jonu i uwzględnia stan jonizacji jonu, co zostało szczegółowo opisane przez Persat et al.13). Po utworzeniu granicy między TE a LE przyłożone zostaje pole elektryczne w taki sposób, aby jony LE przemieszczały się z dala od obszaru zajmowanego przez jony TE. Jony próbki o pośredniej ruchomości efektywnej wyprzedzają jony TE, ale nie mogą wyprzedzić jonów LE, w związku z czym ogniskują się na granicy LE-TE (zwanej dalej „granicą ITP”). Ponadto TE i LE tworzą obszary odpowiednio niskiej i wysokiej przewodności, co generuje stromy gradient pola elektrycznego na granicy ITP. Gradient ten powoduje prekondensację składników próbki podczas ich ogniskowania. Odpowiedni dobór TE i LE pozwala na ogniskowanie i oczyszczanie docelowych składników z innych składników nieogniskowanych, a w konsekwencji na rozdział i segregację składników próbki.

W niniejszym opracowaniu omawiamy zasady fizyczne leżące u podstaw ITP oraz dyskutujemy dwa standardowe tryby pracy: tryb „szczytowy” (peak) oraz tryb „płaskowyżowy” (plateau). W trybie szczytowym stosunkowo rozcieńczone jony próbki ogniskują się wspólnie w nakładających się na siebie wąskich szczytach na interfejsie ITP. W trybie płaskowyżowym jony próbki występujące w większej ilości osiągają stężenie stanu stacjonarnego i rozdzielają się na sąsiadujące strefy o charakterze płaskowyżu, uporządkowane według ich ruchomości efektywnej. Tryby szczytowy i płaskowyżowy wynikają z tych samych podstaw fizycznych, ale reprezentują odmienne reżimy, które różnią się początkowym stężeniem analitytu i/lub czasem przeznaczonym na akumulację próbki.

W pierwszej kolejności szczegółowo opisujemy modelowy eksperyment w trybie szczytowym (peak mode), a następnie prezentujemy analizę w tym trybie służącą do ekstrakcji kwasów nukleinowych z hodowli komórkowej E. coli. Na koniec przedstawiamy analizę w trybie plateau, w której wykorzystujemy gatunek nieogniskującego znacznika (NFT) do wizualizacji rozdziału oraz przeprowadzenia ilościowego oznaczenia aminokwasów.

Protokół

1. Fizyka ITP

ITP tworzy wyraźną, przemieszczającą się granicę między jonami o tym samym ładunku. Technikę tę można stosować do próbek anionowych lub kationowych, jednak niniejszy wstęp koncentruje się na anionowej ITP, przy czym te same zasady mają zastosowanie do ITP kationowej. Dobieramy bufory LE i TE w taki sposób, aby jony LE miały wyższą wartość efektywnej ruchliwości elektroforetycznej. Ruchliwość elektroforetyczna, μ = U/E, jest stałą proporcjonalności między przyłożonym polem elektrycznym, E, a prędkością dryfu jonów, U.13 Tworzymy rozproszony interfejs między LE a TE i przykładamy pole elektryczne skierowane z obszaru LE o wysokiej przewodności do obszaru TE o niskiej przewodności. Ze względu na niejednorodny profil przewodności system szybko ustanawia silny gradient pola elektrycznego na interfejsie ITP. Zgodnie z nazwą (z greckiego „isos” oznacza „równy”, „takhos” oznacza „prędkość”), jony TE i LE poruszają się z tą samą, jednostajną prędkością w wyniku działania niejednorodnego pola elektrycznego i zachowania prądu (jest to tzw. „warunek ITP”, patrz. Rysunek 1).

Interfejs ITP jest samowyostrzający: jony LE dyfundujące do strefy TE doświadczają silnego strumienia przywracającego i powracają do strefy wiodącej (i analogicznie dla jonów TE w strefie LE). Jony próbki ogniskują się na tym interfejsie, jeśli ich efektywna mobilność w strefie TE jest większa niż mobilność ko-jonów TE, a ich efektywna mobilność w strefie LE jest mniejsza niż mobilność ko-jonów LE (patrz Rysunek 1). Właściwości samowyostrzania i ogniskowania ITP przyczyniają się do odporności tej techniki i sprawiają, że ITP jest stosunkowo niewrażliwa na zaburzenia interfejsu (np. wynikające z przepływu napędzanego ciśnieniem lub zmian geometrii, takich jak zwężenia, rozszerzenia i zakręty).

W trybie szczytowym ITP (patrz Rysunek 2a i Filmy 1-2), stężenia jonów próbki są w każdym momencie znacznie niższe niż stężenia jonów LE i TE, w związku z czym wnoszą one pomijalny wkład do lokalnej przewodności. Rozkład jonów próbki jest określany przez samowyostrzający się interfejs między sąsiadującymi strefami (tutaj TE i LE) oraz wartość efektywnej ruchliwości próbki względem tych stref.14 Wiele jonów próbki skupia się w obrębie tego samego wąskiego obszaru interfejsu ITP w postaci w dużej mierze nakładających się szczytów. Szerokości interfejsu i szczytów, a także powiązany z nimi czynnik prekonientropczony, skalują się odwrotnie proporcjonalnie do przyłożonego prądu (patrz doświadczenia na Rysunku 2b).14

Przy odpowiednio wysokich początkowych stężeniach próbki i wystarczającym czasie akumulacji jony próbki osiągają progową wartość stężenia. Dla gatunków w pełni zjonizowanych wartość ta jest określana przez regulującą funkcję Kohlrauscha (KRF).15 Dla słabych elektrolitów jest ona określana przez funkcje Albertiego i Jovina.16,17 W trybie plateau, przedstawionym na Rysunku 3 i Filmie 3, jony próbki rozdzielają się i oczyszczają w strefy lokalnie jednorodnego i stałego stężenia w kolejności wynikającej z ich mobilności efektywnej. Bardzo rozcieńczone jony mogą nadal ogniskować się w trybie piku pomiędzy strefami plateau. W ITP jony próbki mogą być wprowadzane w formie ograniczonego wtrysku pomiędzy TE a LE (patrz Rysunek 3) lub naprzemiennie mieszane z TE i/lub LE (patrz Rysunek 2). Mieszanie w strefie TE określamy mianem wtrysku „półnieskończonego”, który może być wykorzystany do ciągłej akumulacji jonów analitycznych. Ciągła akumulacja próbki zwiększa czułość w analizach prowadzonych zarówno w trybie piku, jak i w trybie plateau. Jednakże wtryski ograniczone są częściej stosowane w trybie plateau. Prawdopodobnie wynika to z tego, że wysokie początkowe stężenia analitu w wtrysku półnieskończonym mogą znacznie zwiększyć przewodność TE i obniżyć szybkość ogniskowania. Ponadto w wtrysku półnieskończonym nie jest możliwe pełne oczyszczenie (ponieważ w TE pozostaje skończone stężenie).

2. Czyszczenie i przygotowanie urządzenia

Do analiz przedstawionych w niniejszym protokole wykorzystujemy izotropowo trawione na mokro szklane układy mikroprzepływowe (z przekrojem poprzecznym w przybliżeniu w kształcie litery D) o konstrukcji z kanałami krzyżującymi się (patrz Rysunek 1). Poniższy protokół czyszczenia i przygotowania został zoptymalizowany dla kanałów borokrzemianowych i z topionego szkła kwarcowego, ale może być również stosowany w przypadku układów szklanych/PDMS. Należy przeprowadzić tę procedurę czyszczenia przed eksperymentami, aby zapewnić powtarzalność wyników między poszczególnymi pomiarami oraz prawidłowe naniesienie powłok dynamicznych niezbędnych do stłumienia przepływu elektroosmotycznego (EOF). Pominięcie tego protokołu może doprowadzić do silnej dyspersji granicy ITP.14

  1. Aby odkazić kanał, należy napełnić zbiorniki północny, wschodni i południowy 10-20 μL 10% wybielacza i zastosować próżnię w zbiorniku zachodnim przez 2 min. W przypadku korzystania ze standardowego uchwytu na chipy Caliper, próżnię można skutecznie zastosować, po prostu mocując szeroki koniec końcówki pipety 200 μL (niefiltrowanej) do zbiornika chipa i podłączając linię próżni do rurki o średnicy wewnętrznej 2 mm.
  2. Należy opróżnić zbiorniki i wypłukać kanał (podobnie jak w kroku 1) 1 M wodorotlenkiem sodu przez 2 min. Powoduje to delikatne trawienie ścianek kanału, co pozwala uzyskać czystą powierzchnię borokrzemianową, pomagającą w ustanowieniu jednolitych właściwości powierzchniowych.
  3. Należy opróżnić zbiorniki i oczyścić wodą dejonizowaną (DI), a następnie wypłukać kanał przy użyciu LE przez ok. 2 min. W tym czasie właściwości powierzchniowe i powłoki dynamiczne ulegają equilibracji wewnątrz kanału.

3. Fokuszowanie fluoroforu w trybie szczytowym ITP

  1. Przygotować 1 mL buforu LE składającego się ze 100 mM HCl, 200 mM trisu oraz 1% PVP.
  2. Przygotować 1 mL buforu TE składającego się ze 100 mM HEPES i 200 mM trisu. Połączyć 90 μl TE z 10 μl 1 μM Alexa Fluor 488 (AF488).
  3. Po wypłukaniu buforem LE zgodnie z opisem w części 2, opróżnić zachodni zbiornik i kilkukrotnie przemyć go wodą DI, aby rozcieńczyć pozostały w zbiorniku bufor LE. Napełnić ten zbiornik 20 μL TE zawierającego AF488.
  4. Umieścić elektrodę dodatnią w wschodnim zbiorniku, a elektrodę uziemiającą (ujemną) w zachodnim zbiorniku i przyłożyć prąd 2 μA (prąd stały). Piki próbki będą migrować ze stałą prędkością z zachodniego zbiornika do wschodniego (patrz Rycina 1), a napięcie między tymi zbiornikami będzie rosło w miarę napełniania kanału buforem TE o niższej przewodności.

4. Ekstrakcja i oczyszczanie kwasów nukleinowych z hodowli E. coli

Zdolność do selektywnego ogniskowania jonów sprawia, że ITP jest idealną techniką do przygotowania próbek biologicznych. Oczyszczamy kwasy nukleinowe z nieobrobionego lizatu komórkowego poprzez wybór anionu prowadzącego, którego wartość bezwzględna ruchliwości efektywnej jest niższa niż w przypadku docelowego kwasu nukleinowego, lecz wyższa niż w przypadku kowonowych inhibitorów PCR (np. detergentów anionowych, białek i rozpuszczalników organicznych, nawet jeśli występują one w wysokim stężeniu). Kationowe inhibitory PCR (np. metale alkaliczne, białka kationowe i detergenty) migrują w przeciwnym kierunku, a zatem również zostają w tyle. ITP ekstrahuje i ogniskuje docelowe kwasy nukleinowe z rezerwuaru próbki, pozostawiając w tyle wolniej migrujące gatunki hamujące reakcję PCR (patrz Rysunek 4).

  1. Przygotuj próbkę lub kulturę komórek E. coli o gęstości przekraczającej 108 CFU/mL.
  2. Przenieś 1 mL kultury komórkowej do probówki typu microcentrifuge z bezpiecznym zamknięciem i odwirowaj osad w wiroworce przy 4000g przez 6 min.
  3. Resuspenduj osad w 80 μL wody wolnej od RNazy i dodaj 10 μL czynnika litycznego składającego się z 10 mM trycyny, 10 mM bis-trisu, 2 mM EDTA, 0,1% Triton-X oraz 5 mg/mL lizozymu. Delikatnie wymieszaj i inkubuj przez 5 min. w temperaturze pokojowej (protokół lizy zaadaptowany z Bercovici et al.11).
  4. Dodaj 10 μL 1 M wodorotlenku sodu, aby podnieść pH lizatu do ~12,5. Delikatnie pipetuj roztwór w górę i w dół, aż stanie się on klarowny, co oznacza zakończenie procesu lizy.
  5. Połącz 10 μL lizatu z 90 μL 50 mM trycyny i 100 mM bis-trisu. Roztwór ten może być teraz używany jako bufor TE.
  6. Przygotuj 1 mL buforu LE składającego się z 500 mM bis-trisu, 250 mM HCl, 1% PVP i 1X SYBR Green II. Wypełnij chip mikroprzepływowy buforem LE zgodnie z opisem w Części 3.
  7. Aby wyekstrahować oczyszczony kwas nukleinowy do analizy poza chipem po ITP, zastąp zawartość zbiornika East buforem LE kompatybilnym z PCR, zawierającym 50mM bis-trisu, 25 mM HCl i 0,1% PVP. Przyłóż napięcie 1000 V pomiędzy studzienkami East i West, aby rozpocząć eksperyment. Natężenie prądu między tymi zbiornikami będzie spadać.
  8. Na koniec eksperymentu próbka zostanie wymyta do zbiornika LE. Równocześnie z tym wymywaniem zależność natężenia prądu od czasu dla tego układu zazwyczaj osiąga wartość plateau (ponieważ oporność jest teraz zdominowana przez jony TE równomiernie rozłożone w kanale). Delikatnie wymieszaj zawartość zbiornika poprzez wielokrotne pipetowanie i pobierz objętość 5 μL do analizy za pomocą ilościowego RT-PCR.

5. Rozdział aminokwasów z wykorzystaniem kationowego trybu plateau ITP oraz nieogniskującego znacznika (NFT) do wizualizacji

ITP może być wykorzystywane do rozdzielania i ogniskowania małych jonów w sąsiadujących i wykrywalnych plateau pomiędzy TE a LE. Pozwala to na detekcję i identyfikację w oparciu o właściwości fizykochemiczne, takie jak lokalna przewodność, absorbancja UV, pomiar temperatury lub współczynnik załamania światła. Tutaj przedstawiamy test z użyciem tracera nieogniskującego (NFT), w którym do LE dodawany jest fluorescencyjny gatunek ko-jonowy. Gatunek fluorescencyjny ten nie ulega ogniskowaniu, lecz jego stężenie dostosowuje się do lokalnego pola elektrycznego, co umożliwia wizualizację oczyszczonych stref plateau (patrz Rysunek 5).

  1. Przygotować 1 mL buforu LE składającego się z 100 mM etanolaminy, 200 mM trycyny, 1% PVP oraz 100 μM kationowego fluoroforu Rhodamine 6G.
  2. Przygotować 1 mL buforu TE składającego się z 20 mM TRIS i 40 mM trycyny. Przygotować próbkę, mieszając 90 μL buforu TE z 10 μL 50 mM argininy oraz 10 μL 50 mM lizyny.
  3. Nanieść 20 μL buforu LE do zbiorników zachodniego (West) i północnego (North) oraz próbkę do zbiornika wschodniego (East). Zastosować próżnię w zbiorniku południowym (South) przez 1 min.
  4. Przepłukać otwór wschodni (East) wodą destylowaną (DI), a następnie zastąpić ją buforem TE (bufor TE bez próbki).
  5. Przyłożyć napięcie 500 V pomiędzy zbiorniki wschodni (East) i zachodni (West).

6. Reprezentatywne wyniki

Izotachoferezogramy eksperymentów w trybie piku przedstawiono na Rysunku 2b, a eksperymentów ekstrakcji kwasów nukleinowych na Rysunku 4. W eksperymentach w trybie piku z użyciem reportera fluorescencyjnego (np. AF488, SYBR Green II) całkowitą intensywność fluorescencji można zintegrować i porównać z krzywą kalibracyjną w celu uzyskania ilościowych informacji o stężeniu.12 Dodatkowo, w eksperymentach ekstrakcji kwasów nukleinowych próbkę pozwala się eluować do zbiornika LE, a następnie ekstrahuje pipetą w celu analizy metodą ilościowego RT-PCR.10,12 Izotachoferezogramy w trybie plateau dla rozdziału aminokwasów przedstawiono na Rysunku 5. Intensywność fluorescencji (w stosunku do intensywności stref LE lub TE) może służyć do identyfikacji stref, natomiast szerokości stref umożliwiają kwantyfikację.

Schemat izotachoforezy z równaniami i detektorem do analizy rozdziału mobilności jonowej.
Rysunek 1. Izotachoforeza (ITP) jest techniką elektrokinetyczną stosowaną w aplikacjach mikroprzepływowych do czułej detekcji i rozdziału jonów. ITP umożliwia rozdział, selektywne ogniskowanie oraz prekoniukcentrację. Ponadto jest niezwykle odporna na zakłócenia fizyczne dzięki swojej właściwości samowyostrzenia. Jony próbki ulegają selektywnemu ogniskowaniu pomiędzy elektrolitem wiodącym (LE) a elektrolitem kończącym (TE) i przemieszczają się przez mikrokanał ze stałą prędkością, wyznaczoną przez prędkość jonów wiodących w strefie LE. Jony próbki ulegają ogniskowaniu, jeśli ich efektywna ruchliwość elektroforetyczna mieści się w przedziale ograniczonym przez efektywną ruchliwość jonów LE i TE. Schemat przedstawia modelowy eksperyment ITP, w którym próbka ulega ciągłemu ogniskowaniu pomiędzy strefami LE i TE.

Izotachoforeza w trybie szczytowym, schemat, układ elektroforetyczny, rozdział jonów, analiza ogniskowania fluoroforu.
Rysunek 2. Ogniskowanie jonów rozcieńczonej próbki w ITP w „trybie szczytowym”. a) Dwa różne rozcieńczone (csample << cLE) gatunki ogniskują się w trybie szczytowym na granicy fazy utworzonej między strefami LE i TE. Pole elektryczne jest determinowane wyłącznie przez LE i TE, ponieważ gatunki z próbki nie wnoszą istotnego wkładu do natężenia prądu. Jony próbki są mieszane z TE (w przypadku wstrzyknięcia półnieskończonego) i ogniskują się wspólnie w szczycie o kształcie zbliżonym do rozkładu Gaussa na granicy ITP. Kryterium ogniskowania (przedstawione jako nierówności) dotyczy gatunków silnie zjonizowanych. b) Eksperymenty wykazujące ogniskowanie Alexa Fluor 488 (AF488) w trybie szczytowym dla zakresu zastosowanych natężeń prądu (patrz również Wideo 1). Szerokość szczytu próbki jest odwrotnie proporcjonalna do natężenia prądu (przy pomijalnej dyspersji adwekcyjnej wynikającej z przepływu elektroosmotycznego).14 Samowyostrzaca się granica fazy jest odporna na dyspersję wywołaną przepływem pod ciśnieniem (patrz Wideo 2).

Schemat izotachoforezy w trybie plateau ilustrujący rozdział jonów, ruchliwość elektroforetyczną i ogniskowanie.
Rycina 3. Jony próbki przy dostatecznie wysokim stężeniu ogniskują się w „trybie plateau” i determinują lokalną przewodność. Zazwyczaj wprowadzamy jony próbki w postaci ograniczonego wstrzyknięcia pomiędzy TE a LE. W tym trybie jony próbki rozdzielają się i ustawiają zgodnie z ich efektywną ruchliwością elektroforetyczną (patrz Wideo 3). W przypadku gatunków silnie zjonizowanych stężenia TE i strefy plateau są określone przez regulacyjną funkcję Kohlrauscha (KRF, niezmiennik ustalony początkowo przez strefę LE). Rzadkie jony nadal ogniskują się w trybie piku pomiędzy strefami plateau ograniczającymi ich efektywną ruchliwość. Kryterium ogniskowania (przedstawione jako nierówności) odnosi się do gatunków silnie zjonizowanych.

Schemat oczyszczania DNA/RNA; elektroforeza, qRT-PCR, krzywe amplifikacji, proces oczyszczania.
Rycina 4. Przygotowanie lizatu i ekstrakcja kwasów nukleinowych z wykorzystaniem trybu szczytowego ITP. Kwasy nukleinowe są ekstrahowane z hodowli komórkowej E. coli przy użyciu lizy alkalicznej wspomaganej lizozymem i oczyszczane poprzez selektywne ogniskowanie elektroforetyczne via ITP. Bufor TE zmieszany z lizatem (kolor brązowy) zawiera docelowy kwas nukleinowy (kolor zielony), białka oraz potencjalne związki hamujące PCR. Odpowiedni dobór jonów podążających (trailing) i prowadzących (leading) umożliwia selektywne ogniskowanie docelowego kwasu nukleinowego przy jednoczesnym usunięciu inhibitorów PCR. Szczyt ITP całkowitego kwasu nukleinowego często ma kształt nieidealny, co pokazano na powiększeniu. W ramach demonstracji tej metody wyekstrahowano całkowity kwas nukleinowy z bakterii gram-ujemnych, Escherichia coli (lizowanych wyłącznie roztworem wodorotlenku sodu), oczyszczono kwas nukleinowy z lizatu za pomocą ITP, zebrano wyekstrahowany materiał genetyczny i przeprowadzono analizy qRT-PCR, aby potwierdzić skuteczne oczyszczanie 16S rRNA (kolor czerwony) oraz 16S rDNA (kolor zielony) z hodowli bakteryjnej. Cykle progowe dla kontroli negatywnej dla 16S rRNA (kolor niebieski) i 16S rDNA (kolor żółty) przekroczyły w obu przypadkach 30 cykli. Analizę qRT-PCR przeprowadzono przy użyciu zestawu Power SYBR Green RNA-to-CT 1-Step Kit firmy Applied Biosystems z zastosowaniem starterów forward (5'-CGGATTGGAGTCTGCAACTCG) i reverse (5'-CACAAAGTGGTAAG CGCCCTC) w stężeniu 150 nM, zgodnie z zalecanymi warunkami cyklicznego ogrzewania i chłodzenia.

Analiza z użyciem znacznika niefokusującego, kationowa separacja ITP; schemat przedstawiający układ elektroforetyczny i fluorescencję.
Rysunek 5. Analiza z użyciem znacznika niefokusującego (NFT) w celu separacji i detekcji nieoznaczonych aminokwasów. a) Schemat analizy NFT. Ograniczona objętość próbek jonów jest wprowadzana do kanału wschodniego. Mieszamy LE z kationowym fluoroforem znacznikiem o mobilności efektywnej niższej niż jony TE (μtracer < μTE). Fluorofor ten pełni rolę „znacznika o niskiej prędkości”. W miarę jak fluorofor migruje elektroforetycznie z LE do stref zajętych obecnie przez plateau próbki i TE, napotyka silniejsze pole elektryczne, co prowadzi do wzrostu jego stężenia. Ta zmiana stężenia tworzy stopnie na izotachoferogramie. b) Separacja dwóch aminokwasów, argininy i lizyny, z wykorzystaniem analizy NFT z użyciem Rodaminy 6G jako fluorescencyjnego znacznika o niskiej prędkości. Niewielki piki pomiędzy TE a argininą jest częstym zjawiskiem w ITP, nie jest w pełni wyjaśniony i w tym przypadku nie zakłóca detekcji ani kwantyfikacji plateau.

Dodatkowy film 1. Kliknij tutaj, aby obejrzeć dodatkowy film.

Dodatkowy film 2. Kliknij tutaj, aby obejrzeć dodatkowy film.

Film uzupełniający 3. Kliknij tutaj, aby obejrzeć film uzupełniający.

Dyskusja

Metody ITP przedstawione w niniejszej pracy umożliwiają szybką, czułą i stabilną detekcję oraz manipulację cząsteczkami jonowymi. Głównym wyzwaniem w zastosowaniu ITP jest właściwy dobór buforów LE i TE. W anionowym ITP zazwyczaj wybieramy chlorek jako anion wiodący, ponieważ jest on silnym kwasem o bardzo wysokiej mobilności bezwzględnej, a zatem posiada bardzo przewidywalne właściwości. W związku z tym dobór bufora w anionowym ITP sprowadza się zazwyczaj do wyboru odpowiedniego TE i przeciwjonu. W eksperymentach z selektywnym ogniskowaniem wybór TE jest krytyczny dla wyeliminowania jonów zanieczyszczających. W zastosowaniach, w których nie występują zanieczyszczenia, niższa mobilność efektywna TE prowadzi do szybszego tempa ogniskowania. Zalecamy stosowanie następujących, stosunkowo stabilnych anionowych jonów TE: MES, MOPS, HEPES, tricine. Wybór przeciwjonu wpływa zarówno na pH układu, jak i na mobilność efektywną TE. Typowymi przeciwjonami są tris (pKa 8,1) i bis-tris (pKa 6,4). W przypadku analiz wymagających niższego lub wyższego pH zalecamy odpowiednio pirydynę (pKa 5,25) i etanolaminę (pKa 9,5). W Tabelach 1 i 2, odpowiednio dla anionowego i kationowego ITP, podsumowujemy kilka przydatnych przykładów buforów. Przyjmujemy HCl jako anionowy jon LE oraz sód jako kationowy jon LE, zakładając 100 mM mocno jonową bufora LE.

Czytelnik zauważy, że siła jonowa buforu w naszych protokołach (oraz w Tabelach 1–2) jest zawsze większa lub równa 10 mM. Chociaż teoretycznie fizyka ITP ma zastosowanie przy sile jonowej niższej niż 10 mM, naturalne zanieczyszczenia (np. kwas węglowy powstający w reakcji wody z dwutlenkiem węgla z atmosfery) na poziomie bliskim 1 mM często ograniczają praktyczne zastosowanie buforów o niskiej sile jonowej.

Zauważamy, że mechanizm transdukcji sygnału nie ogranicza się do analiz przedstawionych w niniejszym protokole. Jak krótko omówiono w Części 5, w trybie plateau oczyszczone strefy można wykrywać poprzez zmiany lokalnej przewodności, absorbancji UV, temperatury lub współczynnika załamania światła. W naszej grupie opracowaliśmy metodę wykorzystującą fluorescencyjne amfolity nośnikowe do czułego wykrywania i identyfikacji nieznanych analitów.5 W eksperymentach w trybie peak do znakowania sfokusowanych analitów można użyć specyficznych sond. W jednym z przykładów stosujemy molekularne latarnie (molecular beacons) – sondy oligonukleotydowe, które fluorescują po hybrydyzacji z sekwencją docelową – aby z wysoką specyficznością wykrywać docelowe cząsteczki DNA lub RNA.11,18

Choć ITP jest stosunkowo odporne na dyspersję spowodowaną przepływem wymuszonym ciśnieniem oraz EOF, nadmierny EOF może prowadzić do stagnacji interfejsu ITP w punkcie, w którym średnia prędkość EOF staje się równa prędkości ITP.14 Tak silny EOF występuje szczególnie w warunkach wysokiego pH i niskiej siły jonowej. Z tego powodu zalecamy stosowanie buforów o pH 8 lub niższym i sile jonowej rzędu 100 mM, jeśli jest to możliwe. Według naszego doświadczenia PVP jest najskuteczniejszą powłoką do tłumienia EOF w chipach borokrzemianowych. Jednak ze względu na właściwości przesiewające, PVP może być niewłaściwe dla niektórych zastosowań, takich jak ogniskowanie genomowego DNA. W eksperymentach obserwujemy, że dodanie PVP może znacznie zredukować bezwzględną mobilność genomowego DNA (do stopnia, w którym nie ulega ono ogniskowaniu). W takich przypadkach powłoka silanolowa, taka jak Sigmacote, w połączeniu z surfaktantem (np. Triton-X 100), może również być skuteczna w redukcji EOF.10

 Anion TE (pKa -1)
Buforujący przeciwjon (pKa +1)MES (6.10)MOPS (7.20)HEPES (7.50)tricyna (8.15)
etanolamina (9.50)21.4120.4017.3822.85
tris (8.08)21.0019.2315.8417.56
bis-tris (6.40)18.2210.417.305.23
pirydyna (5.18)1.013.722.421.48

Tabela 1. Wielkość ruchomości efektywnej (× 10-9 m2/V/s) dostrojonej strefy czystego anality w anionowej ITP, gdzie LE to 100 mM HCl i 200 mM buforowego przeciwjonu.

 Kation TE (pKa +1)
Buforowy przeciwjon (pKa -1)etanolamina (9,50)tris (8,08)bis-tris (6,40)pirydyna (5,18)
MES (6,10)35,5721,9616,3910,45
MOPS (7,20)35,4720,929,763,93
HEPES (7,50)35,3519,977,772,88
Tricyna (8,15)34,7716,724,501,44

Tabela 2. Wartość ruchomości efektywnej (× 10-9 m2/V/s) skorygowanej strefy czystego anality w kationowej ITP, gdzie LE to 100 mM sodu i 200 mM buforującego przeciwjonu.

Oświadczenia

Nie mamy nic do ujawnienia.

Podziękowania

Z wdzięcznością potwierdzamy finansowanie z funduszy DARPA w ramach centrum Micro/Nano Fluidics Fundamentals Focus (MF3) na podstawie umowy nr N66001-10-1-4003 oraz z grantu DARPA nr N660001-09-C-2082.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Woda destylowanaGIBCO, by Life Technologies10977Wolna od RNazy/DNazy
Clorox UltraClorox02489CT
wodorotlenek sodu (NaOH)Mallinckrodt Baker Inc.7708
kwas solny (HCl)EMD MilliporeHX0603-4
Trizma base (tris)Sigma-AldrichT6066
poliwinylobutyral (PVP)Polysciences, Inc.06067MW 1,000,000
HEPESSigma-AldrichH-4034
Kwas karboksylowy Alexa Fluor 488InvitrogenA20000
tricynaSigma-AldrichT-9784
bis-trisSigma-AldrichB4429
EDTAGIBCO, by Life TechnologiesAM9260G
Triton-X 100Sigma-AldrichX100
lizozymSigma-AldrichL6876
SYBR Green IIInvitrogenS7564
etanolaminaSigma-Aldrich411000
Rodamina 6GAcros OrganicsCAS 989-38-8
L-aminokwasySigma-AldrichLAA21
Power SYBR Green RNA-to-CT 1-Step KitApplied Biosystems4389986
Startery PCRIntegrated DNA Technologies
Borokrzemianowy chip mikroprzepływowyCaliper Life SciencesNS12ADostarczany z plastikowym uchwytem lub bez niego
Pompa próżniowaGast Manufacturing, Inc.DOA-P104-AA
SourcemeterKeithley2410Tryby pracy ze stałym prądem i stałym napięciem
Odwrócony mikroskop epifluorescencyjnyOlympus CorporationIX70Do oświetlenia należy użyć lampy rtęciowej (Olympus) lub LED (Thorlabs)
Kostka filtrującaOmega Engineering, Inc.XF115-2Wzbudzenie/emisja: niebieski/zielony
Probówki do mikrocentryfugi z blokadą Safe-lockEppendorf022363204Pojemność 1.5mL
WirówkaEppendorf5417C
Tabela 3. Specyficzne odczynniki i sprzęt.

Bibliografia

  1. Jung, B., Bharadwaj, R., Santiago, J. G. On-chip millionfold sample stacking using transient isotachophoresis. Anal. Chem. 78 (7), 2319-2319 (2006).
  2. Jung, B., Zhu, Y., Santiago, J. G. Detection of 100 am fluorophores using a high-sensitivity on-chip CE system and transient isotachophoresis. Anal. Chem. 79 (1), 345-345 (2007).
  3. Everaerts, F. M., Beckers, J. L., Verheggen, T. P. E. M. Isotachophoresis: Theory, instrumentation, and applications. Elsevier Science & Technology. , (1976).
  4. Khurana, T. K., Santiago, J. G. Preconcentration, separation, and indirect detection of nonfluorescent analytes using fluorescent mobility markers. Anal. Chem. 80 (1), 279-279 (2008).
  5. Bercovici, M., Kaigala, G. V., Backhouse, C. J., Santiago, J. G. Fluorescent carrier ampholytes assay for portable, label-free detection of chemical toxins in tap water. Anal. Chem. 82 (5), 1858-1858 (2010).
  6. Bercovici, M., Kaigala, G. V., Santiago, J. G. Method for analyte identification using isotachophoresis and a fluorescent carrier ampholyte assay. Anal. Chem. 82 (5), 2134-2134 (2010).
  7. Kaigala, G. V. Miniaturized system for isotachophoresis assays. Lab Chip. 10 (17), 2242-2242 (2010).
  8. Chambers, R. D., Santiago, J. G. Imaging and quantification of isotachophoresis zones using nonfocusing fluorescent tracers. Anal. Chem. 81 (8), 3022-3022 (2009).
  9. Schoch, R. B., Ronaghi, M., Santiago, J. G. Rapid and selective extraction, isolation, preconcentration, and quantitation of small RNAs from cell lysate using on-chip isotachophoresis. Lab Chip. 9 (15), 2145-2145 (2009).
  10. Persat, A., Marshall, L. A., Santiago, J. G. Purification of nucleic acids from whole blood using isotachophoresis. Anal. Chem. 81 (22), 9507-9507 (2009).
  11. Bercovici, M. Rapid detection of urinary tract infections using isotachophoresis and molecular beacons. Anal. Chem. 83 (11), 4110-4110 (2011).
  12. Marshall, L. A., Santiago, J. G. Extraction of DNA from malaria-infected erythrocytes using isotachophoresis. Anal. Chem. 83 (24), 9715-9715 (2011).
  13. Persat, A., Chambers, R. D., Santiago, J. G. Basic principles of electrolyte chemistry for microfluidic electrokinetics. Part I: Acid-base equilibria and pH buffers. Lab Chip. 9 (17), 2437-2437 (2009).
  14. Garcia-Schwarz, G., Bercovici, M., Marshall, L. A., Santiago, J. G. Sample dispersion in isotachophoresis. J. Fluid Mech. 1 (1), 1-1 (2011).
  15. Kohlrausch, F. Über concentrations-verschiebungen durch electrolyse im inneren von lÖsungen und lÖsungsgemischen. Ann. Phys. 298 (10), 209-209 (1897).
  16. Alberty, R. A. Moving boundary systems formed by weak electrolytes. Theory of simple systems formed by weak acids and bases. J. Am. Chem. Soc. 72 (6), 2361-2361 (1950).
  17. Jovin, T. M. Multiphasic zone electrophoresis. I. Steady-state moving-boundary systems formed by different electrolyte combinations. Biochem. 12 (5), 871-871 (1973).
  18. Persat, A., Santiago, J. G. MicroRNA profiling by simultaneous selective isotachophoresis and hybridization with molecular beacons. Anal. Chem. , (2011).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Mikroprzep ywowe ITPekstrakcja kwas w nukleinowychoczyszczanie aminokwas wITP w trybie szczytowymITP w trybie plateauprekonecentracja pr bkiruchliwo elektroforetycznaelektrolit prowadz cyelektrolit pod aj cy
Izotachoforeza na chipie do rozdzielania jonów i oczyszczania kwasów nukleinowych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.