Przedstawiamy niskokosztowe, trwałe i kriotolerancyjne urządzenie do pobierania próbek z nioy Dewar wypełnionych ciekłym azotem. Prostota konstrukcji oraz modułowa budowa urządzenia sprawiają, że proces wyjmowania próbek z zbiorników kriogenicznych jest bezpieczny i łatwy.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Urządzenie typu DIY do odzyskiwania kriokonserwowanych próbek przypadkowo upuszczonych do kriogenicznych zbiorników magazynowych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Azot ciekły to bezbarwna, bezwonna, ekstremalnie zimna (-196 °C) ciecz przechowywana pod ciśnieniem. Jest on powszechnie stosowany jako czynnik kriogeniczny do długoterminowego przechowywania materiałów biologicznych, takich jak krew, komórki i tkanki 1,2. Kriogeniczne właściwości azotu ciekłego, choć idealne do konserwacji próbek, mogą powodować gwałtowne zamrażanie żywych tkanek w momencie kontaktu – znane jako „oparzenie kriogeniczne”2, co może prowadzić do poważnych odmrożeń u osób bezpośrednio zaangażowanych w przechowywanie i wyjmowanie próbek z naczyń Dewara. Ponadto, podczas parowania azot ciekły obniża stężenie tlenu w powietrzu, co może doprowadzić do uduszenia, szczególnie w zamkniętych pomieszczeniach2.
W laboratoriach próbki biologiczne są często przechowywane w krioprobowkach lub krioszalkach, ułożonych w stalowych regałach wewnątrz naczyń typu Dewar1. Regały do przechowywania te są wyposażone w długi trzpień, który ma zapobiegać wysunięciu się szalek z regałów i ich wpadnięciu na dno naczyń Dewar podczas rutynowej obsługi. Niestety, bardzo często zdarza się, że szalki lub probówki z cennymi próbkami wysuwają się i opadają na dno zbiornika wypełnionego ciekłym azotem. W takich przypadkach próbki można mozolnie odzyskać po przelaniu ciekłego azotu do zapasowego pojemnika lub jego wylaniu. Wtedy szalki i probówki można stosunkowo bezpiecznie wyłowić z opróżnionego naczynia Dewar. Jednak kriogeniczna natura ciekłego azotu oraz stopień jego rozprężania sprawiają, że odzyskiwanie zatopionych próbek jest niebezpieczne. Biura Bezpieczeństwa zazwyczaj zalecają, aby odzyskiwanie próbek nigdy nie było przeprowadzane przez jedną osobę. Alternatywą jest użycie dostępnych w handlu chwytaków kriogenicznych lub szczypiec do wyciągania probówek3. Jednak ograniczona widoczność w ciemnych, wypełnionych cieczą naczyniach Dewar stanowi główną przeszkodę w ich zastosowaniu.
W niniejszym artykule opisujemy konstrukcję niskokosztowego (DIY) urządzenia do wyciągania próbek odpornego na niskie temperatury, które sprawia, że wyjmowanie próbek z naczynia Dewar z płynami kriogenicznymi jest bezpieczne i łatwe.
Protokół
1. Montaż urządzenia kriotolerancyjnego do wyjmowania kriopudełek
- Za pomocą szczypiec wyprostować jedną stronę trójkątnego kątownika (Rysunek 1A), aby utworzyć kątownik w kształcie litery L, jak pokazano na Rysunku 1B. Uwaga: Wymiary kątownika można dobrać w zależności od średnicy szyjki naczynia Dewara.
- Przymocować dwa takie kątowniki za pomocą poprzeczki w kształcie litery T (Rysunek 2), używając nakrętki, podkładki i śruby Crown, aby stworzyć podstawę Cryoscoop, jak pokazano na Rysunku 3(A-B). Uwaga: Zastosowanie dwóch kątowników umożliwia wyciąganie cryoboxów o wymiarach 5 ½ in. X 5 ½ in.
- Używając płyty z otworami (Rysunek 4), dopasować otwory w poprzeczce w kształcie litery T do otworów na jednym końcu płyty i połączyć oba elementy za pomocą nakrętek i śrub Hillman (Rysunek 5). Uwaga: Jeśli płyta z otworami i kątowniki nie posiadają fabrycznych otworów, należy je wywiercić za pomocą wiertła z węglika spiekanego.
- Zagiąć drugi koniec płyty z otworami za pomocą szczypiec, jak pokazano na Rysunku 6. (Krok ten jest opcjonalny).
- Owinąć uchwyt pianką, aby ułatwić chwytanie urządzenia w ciekłym azocie, jak pokazano na Rysunku 6. (opcjonalnie) Uwaga: Przed autoklawowaniem należy usunąć piankę.
2. Montaż urządzenia kriotolerancyjnego do wyjmowania krioprowetek
Urządzenie do odzyskiwania Cryotolerant DIY można również przystosować do wyjmowania krioprobówek. Wiąże się to z zastąpieniem płaskiej podstawy sitkiem ze stali nierdzewnej, zmodyfikowanym w celu wyławiania probówek z ciekłego azotu (Rysunek 7).
- Odkręć nakrętki i śruby Crown mocujące pas T strong-tie do płyty z otworami.
- Przed przymocowaniem sita ze stali nierdzewnej do płyty z otworami, delikatnie wygnij szyjkę sita za pomocą szczypiec, aby ustawić podstawę pod kątem, nadając jej kształt przypominający chochlę (Rycina 8). Uwaga: Jeśli sito posiada rantu, użyj szczypiec, aby zgiąć go w dół; ułatwi to manewrowanie urządzeniem.
- W wyrównaj otwór w uchwycie sita z otworami w płycie i zabezpiecz sito za pomocą nakrętek i śrub Hillman, jak pokazano na Rycynie 8. Uwaga: Jeśli sito nie posiada fabrycznie wywierconych otworów, należy je wywiercić przy użyciu wiertła z węglika spiekanego.
3. Wyjmowanie kriopudełek i krioprowetek z naczynia Dewara
- Na początek należy założyć rękawice kriogeniczne i wyjąć z naczynia Dewara 1 lub 2 regały zamrażarki, aby zapewnić miejsce do manewrowania.
- Należy delikatnie przesunąć po dnie naczynia Dewara pionowo ustawione urządzenie DIY do odzyskiwania próbek, odporne na niskie temperatury, wyposażone w podstawę z mocnego paska T (Rysunek 5), i zebrać pudełko, które wpadło na dno zbiornika Dewara. Uwaga: ciekły azot wrze natychmiast po kontakcie z cieplejszym obiektem, otaczając go izolującym gazem azotowym (efekt Leidenfrosta). Aby schłodzić urządzenie przed odzyskaniem próbek, należy powoli zanurzyć je w naczyniu Dewara i pozwolić, aby ciekły azot wystarczająco je schłodził przed przystąpieniem do powyższego kroku.
- Należy wyciągnąć urządzenie pionowo wzdłuż ścianek naczynia Dewara, aby wyłowić pudełko zamrażarki ze zbiornika.
- Należy chwycić pudełko odzyskane z dna naczynia Dewara.
- W celu odzyskania krioprobówek należy delikatnie przesunąć po dnie naczynia Dewara krioczerpak wyposażony w sito (Rysunek 9).
- Podobnie jak w przypadku odzyskiwania kriopudełek, należy wyciągnąć urządzenie pionowo i chwycić probówki zebrane w sicie.
4. Reprezentatywne wyniki
Głównym wyzwaniem w badaniach nad ekspresją genów jest fakt, że jakość RNA zależy od warunków przechowywania zarówno zamrożonych próbek tkanek, jak i wyekstrahowanego RNA4. Rysunek 10 przedstawia wpływ sposobu postępowania z próbkami na integralność całkowitego RNA. Całkowite RNA z tego samego źródła tkankowego (tłuszczowa tkanka ludzka) poddano różnym procedurom obsługi. Przed rozpoczęciem eksperymentu nienaruszony preparat całkowitego RNA wykazuje wyraźne prążki rRNA 28S i 18S, przy czym prążek rRNA 28S jest około dwukrotnie intensywniejszy niż prążek rRNA 18S (Rysunek 10, ścieżka 1). Ten stosunek 2:1 (28S:18S) świadczy o tym, że RNA jest nienaruszone, podczas gdy częściowo zdegradowane RNA pojawia się w formie rozmycia (smear) lub jego stosunek intensywności 28S:18S odbiega od 2:15. Ścieżki 3-4 przedstawiają próbki RNA z istotną degradacją. Próbki te były poddawane wielokrotnemu częściowemu rozmrażaniu poprzez krótkotrwałe wyjmowanie z naczynia Dewara (Metoda A), co modelowało długoterminowe przechowywanie z okresowym przelewaniem zawartości wynikającym z konieczności wyjęcia upadłych probówek i pudełek (Rysunek 10, ścieżki 3-4). Natomiast próbki przechowywane w naczyniu Dewara obsługiwanym za pomocą urządzenia DIY (Metoda B), a zatem bez częściowego rozmrażania, zawierają nienaruszone RNA (Rysunek 10, ścieżka 2).
Rycina 1. A) Podstawa składa się z dwóch trójściennych kątowników o pokazanych wymiarach. Każdy kątownik posiada jeden duży, nawiercony otwór (pełna strzałka) oraz kilka mniejszych otworów (mała strzałka) na każdej ściance. Umożliwia to mocowanie za pomocą nakrętek i śrub. Mniejsze otwory zapewniają również szybki odpływ ciekłego azotu podczas wyjmowania próbek. B) Jedna strona każdego kątownika zostaje wyprostowana za pomocą szczypiec w celu uzyskania kształtu litery L.
Rysunek 2. Taśma T do mocnych połączeń (Strong-tie T strap) służy do zabezpieczenia mocnych połączeń razem. Podobnie jak element mocujący, taśma T posiada jeden duży otwór nawiercony fabrycznie (pełna strzałka) oraz dwa mniejsze otwory (mała strzałka) w każdym narożniku. Pozwala to na zabezpieczenie mocnych połączeń wzdłuż długości taśmy T za pomocą nakrętek i śrub. Umożliwia to również przymocowanie taśmy T do płyty szczelinowej.
Rycina 3. A) Każde mocne wiązanie jest przymocowane do jednego narożnika paska w kształcie T wzdłuż jego długości za pomocą nakrętek koronowych, śrub i podkładek. B) Dwa mocne wiązania są zamocowane obok siebie, aby ułatwić wyjmowanie cryoboxów o wymiarach 5 ½ in. X 5 ½ in. W przypadku mniejszych cryoboxów, takich jak 2 in. X 2 in., pojedyncze mocne wiązanie może zostać przymocowane bezpośrednio do płyty z otworami bez użycia paska w kształcie T.
Rysunek 4. Jako uchwyt zastosowano szczelinową płytkę płaską. Długość płytki szczelinowej zależy od głębokości naczynia Dewara. W tym przypadku użyto 4 stóp płytki szczelinowej. Grubość płytki szczelinowej jest krytyczna, ponieważ cienkie płytki (<14 gauge) sprawiają, że urządzenie staje się niestabilne podczas wyjmowania próbek z naczynia Dewara wypełnionego ciekłym azotem.
Rycina 5. Płaska podstawa składająca się z mocnych wiązań i paska w kształcie litery T zostaje następnie przymocowana do jednego końca szczelinowej płytki. Większy otwór w pozostałym narożniku paska w kształcie litery T zostaje wyrównany ze szczeliną w płaskiej płytce i przymocowany za pomocą śruby imbusowej i nakrętki. Urządzenie to może być teraz wykorzystane do wyjmowania cryoboxów z naczynia Dewara.
Rycina 6. Jeden koniec naciętej płaskiej płytki jest zgięty za pomocą szczypiec i pokryty pianką w celu zapewnienia lepszego uchwytu, szczególnie w przypadku głębokich naczyń Dewara, jak pokazano w tym przypadku.
Rycina 7. Sitko z drucianą siatką i uchwytem ze stali nierdzewnej służy do wyjmowania krio probówek z naczynia Dewara. Jeśli uchwyt nie posiada otworu, konieczne będzie użycie wiertła z węglika do wywiercenia otworu.
Rycina 8. Aby ułatwić wyjmowanie krioprobówek, sitko jest wyginane wzdłuż szyjki za pomocą szczypiec, aby uzyskać kształt czerpaka. Jeśli sitko posiada krawędź, jak w tym przypadku, do jego wygięcia można użyć szczypiec. Zapewnia to, że sitko nie zablokuje się wewnątrz naczynia Dewara.
Rysunek 9. Cedzak jest przymocowany jednym końcem do szczelinowej płaskiej płyty za pomocą nakrętki sześciokątnej i śruby.
Rycina 10. Integralność próbek całkowitego RNA poddanych różnym warunkom manipulacji. Aby zbadać, w jaki sposób warunki manipulacji próbkami wpływają na jakość RNA, zestaw próbek RNA z tego samego źródła poddano dwóm metodom postępowania. Metoda A polegała na przechowywaniu RNA w naczyniu Dewara i wyjmowaniu próbek za pomocą urządzenia DIY, co zapobiegało częściowemu rozmrożeniu. Metoda B polegała na przechowywaniu RNA w naczyniu Dewara i wielokrotnym częściowym rozmrażaniu poprzez krótkotrwałe wyjmowanie próbek z naczynia, co modelowało długotrwałe przechowywanie z okresowym zlewanie w celu odzyskania opadłych próbek. Integralność całkowitego RNA analizowano następnie za pomocą elektroforezy żelowej. Ścieżka 1: Próbka przed przechowywaniem w naczyniu Dewara; Ścieżka 2: Próbka z naczynia Dewara wyjęta metodą A; Ścieżki 3, 4: Próbki z naczynia Dewara wyjęte metodą B; M: drabinka 100 bp.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Jedną z najczęstszych metod wyjmowania kriopudełek i kriosprobek z dna naczynia Dewara jest przelewanie ciekłego azotu do zapasowego pojemnika i wyciąganie próbek pozostałych w kolbie lub pływających w odlanym ciekłym azocie. Jest to jednak niebezpieczna praktyka, która może prowadzić do oparzeń kriogenicznych lub uduszenia w wyniku przedłużonej ekspozycji na opary ciekłego azotu2. Innym powszechnym sposobem odzyskiwania upuszczonych kriosprobek jest stosowanie szczypiec do kriosprobek3. Jednak ogra...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Samodzielnie wykonane urządzenie do kriogenicznego odzyskiwania próbek zostało przetestowane w ramach projektów „Modeling bacterial protein prenylation in eukaryotic cells using bioinformatics and molecular approaches” sponsorowanego przez program Mary Louise Andrews Award for Cancer Research, Virginia Academy of Science, oraz „Physiological Meaning of RNA Editing in Plasma Dendritic Cells” sponsorowanego przez The Thomas F. Jeffress and Kate Miller Jeffress Memorial Trust oraz kontrakt państwowy 16.740.11.0364 (Ministerstwo Nauki i Edukacji, Rosja). Chcielibyśmy podziękować Beth Eom za pomoc przy eksperymencie dotyczącym integralności RNA.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Bibliografia
- Kittel, P. Advances in Cryogenic Engineering. , Springer. 41(1996).
- Edeskuty, F. J., Walter, F. Stewart Safety in the handling of cryogenic fluids. , Plenum Press. New York. (1996).
- Council, N. R. Prudent Practices in the Laboratory: Handling and Management of Chemical Hazards. , National Academies Press. (2011).
- Muyal, J., Muyal, V., Kaistha, B., Seifart, C., Fehrenbach, H. Systematic comparison of RNA extraction techniques from frozen and fresh lung tissues: checkpoint towards gene expression studies. Diagnostic Pathology. 4, 9(2009).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular cloning: a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2001).
- Holland, N. T., Smith, M. T., Eskenazi, B., Bastaki, M. Biological sample collection and processing for molecular epidemiological studies. Mutation Research/Reviews in Mutation Research. 543, 217-234 (2003).
- Lynch, P. T. CELL, TISSUE AND ORGAN CULTURE | Storage and Cryopreservation. Encyclopedia of Rose Science. , 106-111 (2003).
- Crawford, R. J. Plastics Engineering. , Elsevier Butterworth-Heinemann. (1998).
- Gorenc, B., Tinyou, R., Syam, A. Steel designers' handbook. , University of New South Wales Press. (1996).
- Harper, C. A., Petrie, E. M. Plastics materials and processes: a concise encyclopedia. Wiley-Interscience. , (2003).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
Tagi
Samor bcze urz dzenie do wyci gania pr bek odporne na niskie temperaturyprzechowywanie w ciek ym azocieodzyskiwanie pr bek kriogenicznychwyci ganie z naczynia typu Dewarmetoda odzyskiwania krioeprob wektechnika wyci gania kriopude ekmonta mocnych opasekmodyfikacja p yty szczelinowejadaptacja sita ze stali nierdzewnejbezpiecze stwo przy u yciu r kawic kriogenicznych
