Artykuł metodologiczny

Urządzenie typu "zrób to sam" do odzyskiwania próbek kriokonserwowanych przypadkowo wrzuconych do kriogenicznych zbiorników magazynowych

DOI:

10.3791/3903

⸱

11 maja 2012

 ,  , 
1Molecular and Microbiology Department and Center for the Study of Genomics in Liver Diseases, George Mason University, 2Translational Research Institute, Inova Health System, 3Research Center for Medical Genetics RAMS

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy tanie, trwałe urządzenie kriotolerancyjne do pobierania próbek ze zbiorników Dewara wypełnionych ciekłym azotem. Łatwość budowy i modułowa budowa urządzenia sprawia, że proces pobierania próbek ze zbiorników kriogenicznych jest bezpieczny i łatwy.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ciekły azot to bezbarwna, bezwonna, ekstremalnie zimna (-196 °C) ciecz utrzymywana pod ciśnieniem. Jest powszechnie stosowany jako płyn kriogeniczny do długotrwałego przechowywania materiałów biologicznych, takich jak krew, komórki i tkanki 1,2. Kriogeniczny charakter ciekłego azotu, choć idealny do konserwacji próbek, może powodować szybkie zamarzanie żywych tkanek w kontakcie – znane jako "oparzenie kriogeniczne"2, co może prowadzić do poważnych odmrożeń u osób ściśle zaangażowanych w przechowywanie i pobieranie próbek od Dewarsa. Dodatkowo, gdy ciekły azot odparowuje, zmniejsza stężenie tlenu w powietrzu i może powodować uduszenie, szczególnie w zamkniętych przestrzeniach2.

W laboratoriach próbki biologiczne są często przechowywane w kriowialach lub krioboxach ułożonych w stojakach ze stali nierdzewnej w zbiornikach Dewara1. Te regały magazynowe są wyposażone w długi wałek, który zapobiega wysuwaniu się pudełek z regałów na dno Dewarsa podczas rutynowej obsługi. Zbyt często jednak pudełka lub fiolki z cennymi próbkami wyślizgują się i opadają na dno zbiornika wypełnionego ciekłym azotem. W takich przypadkach pobieranie próbek może być żmudne po przeniesieniu ciekłego azotu do zapasowego pojemnika lub wyrzuceniu go. Pudełka i fiolki można następnie stosunkowo bezpiecznie odzyskać z opróżnionego Dewara. Jednak kriogeniczny charakter ciekłego azotu i szybkość jego rozszerzania się sprawiają, że pobieranie zatopionych próbek jest niebezpieczne. Urzędy ds. Bezpieczeństwa powszechnie zalecają, aby pobieranie próbek nigdy nie było wykonywane przez jedną osobę. Inną alternatywą jest użycie dostępnych w handlu chłodnych chwytaków lub szczypiec do wyciągania fiolek3. Jednak ograniczona widoczność w ciemnych Dewarach wypełnionych płynem stanowi poważne ograniczenie w ich stosowaniu.

W tym artykule opisujemy budowę kriotolerancyjnego urządzenia do samodzielnego pobierania, które sprawia, że pobieranie próbek z płynów kriogenicznych Dewara jest zarówno bezpieczne, jak i łatwe.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Montaż urządzenia kriotolerancyjnego do pobierania krioboxów

  1. Za pomocą szczypiec wyprostuj jedną stronę 3-stronnego mocnego opaski (Rysunek 1A), aby utworzyć mocne wiązanie w kształcie litery L pokazane na rysunku 1B. nuta: Wymiary mocnego wiązania można dobrać w zależności od średnicy szyjki Dewara.
  2. Zabezpiecz dwie takie mocne opaski za pomocą mocnego paska w kształcie litery T (Rysunek 2) za pomocą nakrętki koronowej, podkładki i, aby utworzyć podstawę Cryoscoop, jak pokazano na rysunku 3 (A-B). nuta: Zastosowano dwa mocne wiązania, aby umożliwić odzyskanie 5 1/2 cala. X 5 1/2 cala krioboxy.
  3. Za pomocą płytki szczelinowej (Rysunek 4) wyrównaj szczeliny na mocnym pasku T ze szczelinami na jednym końcu płyty szczelinowej i zabezpiecz je razem za pomocą nakrętki i Hillman (Rysunek 5). nuta: Jeśli płyta szczelinowa i mocne opaski nie są wyposażone w wstępnie wywiercone otwory, będziesz musiał wywiercić otwory za pomocą wiertła z węglika spiekanego.
  4. Zegnij drugi koniec płytki szczelinowej za pomocą szczypiec, jak pokazano na rysunku 6. (Ten krok jest opcjonalny).
  5. Owiń uchwyt pianką, aby lepiej chwycić urządzenie w ciekłym azocie, jak pokazano na rysunku 6. (Opcjonalnie) nuta: Usuń piankę przed autoklawowaniem.

2. Montaż urządzenia kriotolerancyjnego do pobierania kriowialików

Urządzenie do samodzielnego pobierania kriotolerantów może być również przystosowane do pobierania kriowialiów. Polega to na zastąpieniu płaskiej podstawy sitkiem ze stali nierdzewnej, jak pokazano, zmienionym do nabierania fiolek z ciekłego azotu (rysunek 7).

  1. Odkręć nakrętki koronowe i mocujące mocny pasek T do płytki szczelinowej.
  2. Przed przymocowaniem sitka ze stali nierdzewnej do płyty szczelinowej delikatnie zegnij szyjkę sitka za pomocą szczypiec, aby ustawić podstawę pod kątem przypominającym (Rysunek 8). nuta: Jeśli sitko jest dostarczane z wargą, użyj szczypiec, aby zgiąć wargę w dół; Ułatwi to manewrowanie z urządzeniem.
  3. Dopasuj otwór w uchwycie filtra siatkowego do otworów w płycie szczelinowej i zabezpiecz sitko za pomocą nakrętek i Hillman, jak pokazano na rysunku 8. Uwaga: jeśli filtr siatkowy nie jest wyposażony w wstępnie wywiercone otwory, należy zaaranżować wiercenie otworów wiertłem z węglika spiekanego.

3. Odzyskiwanie krioboxów i kriofiali od Dewara

  1. Na początek załóż rękawice kriogeniczne i wyjmij 1 lub 2 stojaki zamrażarki z Dewara, aby zapewnić miejsce do manewrowania.
  2. Delikatnie zeskrob dno Dewara za pomocą pionowego kriotolerancyjnego urządzenia do samodzielnego odzyskiwania wyposażonego w mocną podstawę paska T (Rysunek 5) i zbierz pudełko upadłe na dno zbiornika Dewara. nuta: Ciekły azot wrze natychmiast w kontakcie z cieplejszym obiektem, otaczając go gazowym azotem izolacyjnym (efekt Leidenfrosta). Aby schłodzić urządzenie przed pobraniem próbek, powoli zanurz urządzenie w Dewarze i pozwól, aby ciekły azot wystarczająco ochłodził urządzenie przed wykonaniem powyższego kroku.
  3. Pociągnij urządzenie pionowo wzdłuż ścian Dewara, aby wyjąć zamrażarkę ze zbiornika.
  4. Chwyć pudełko wyjęte z dna Dewara.
  5. W celu wyjęcia kriowialiów delikatnie zeskrob spód Dewara za pomocą krioczerpaka wyposażonego w sitko (Rysunek 9).
  6. Podobnie jak w przypadku pobierania krioboxa, pociągnij urządzenie do pozycji pionowej i chwyć fiolki zebrane w sitku.

4. Reprezentatywne wyniki

Głównym wyzwaniem w badaniach ekspresji genów jest to, że jakość RNA zależy od warunków przechowywania zarówno zamrożonych próbek tkanek, jak i wyekstrahowanego RNA4. Rysunek 10 przedstawia wpływ obchodzenia się z próbką na integralność całkowitego RNA. Całkowite RNA z tego samego źródła tkankowego (ludzkiej tkanki tłuszczowej) poddano różnemu obchodzeniu się z próbką. Przed eksperymentem nienaruszony preparat całkowitego RNA wykazuje wyraźne prążki 28S i 18S rRNA z pasmem 28S rRNA około dwa razy intensywniejszym niż pasmo 18S rRNA (ryc. 10, tor 1). Ten stosunek 2:1 (28S:18S) wskazuje, że RNA jest nienaruszony, podczas gdy częściowo zdegradowany RNA pojawia się jako rozmaz lub jego stosunek intensywności 28S:18S odbiega od 2:15. Pasy 3-4 przedstawiają próbki RNA ze znaczną degradacją. Te próbki RNA poddano wielokrotnemu częściowemu rozmrażaniu przez krótkotrwałe pobieranie z Dewara (metoda A), modelując w ten sposób długoterminowe przechowywanie z okresowym dekantowaniem ze względu na konieczność odzyskania opadłych fiolek i pudełek (Figura 10, pas 3-4). Jednak próbki przechowywane w Dewarze serwisowane przy użyciu urządzenia DIY (metoda B), a zatem bez częściowego rozmrażania, zawierają nienaruszony RNA (ryc. 10, tor 2).

figure-protocol-1
Rysunek 1. A) Podstawa składa się z dwóch 3-stronnych mocnych krawatów o pokazanych wymiarach. Każdy mocny krawat zawiera jeden duży, wstępnie wywiercony otwór (solidna strzałka) i wiele mniejszych otworów (mała strzałka) na każdej powierzchni. Daje to możliwość mocowania za pomocą nakrętki i. Ponadto mniejsze otwory umożliwiają szybki odpływ ciekłego azotu podczas pobierania próbki. B) Jedna strona każdego z mocnych krawatów jest prostowana za pomocą szczypiec, aby uzyskać mocne wiązanie w kształcie litery L.

figure-protocol-2
Rysunek 2. Pasek T z mocnym wiązaniem służy do łączenia mocnych wiązań. Podobnie jak strong-tie, T-strap ma jeden duży wstępnie wywiercony otwór (solidna strzałka) i dwa mniejsze otwory (mała strzałka) w każdym rogu. Pozwala to na zabezpieczenie mocnych wiązań na całej długości paska T za pomocą nakrętek i. Umożliwia również mocowanie paska w kształcie litery T do płyty szczelinowej.

figure-protocol-3
Rysunek 3. A) Każdy mocny krawat jest przymocowany do jednego rogu paska w kształcie litery T, wzdłuż jego długości za pomocą nakrętek koronowych, i podkładek. B) Dwa mocne wiązania są zabezpieczone obok siebie, aby pomóc w odzyskaniu 5 1/2 cala. X 5 1/2 cala krioboxy. Do mniejszych krioboxów, takich jak 2 cale. X 2 cale. , pojedynczą mocną opaskę można przymocować bezpośrednio do płyty szczelinowej bez paska T.

figure-protocol-4
Rysunek 4. Jako uchwyt używana jest płaska płyta szczelinowa. Długość płyty szczelinowej zależy od głębokości Dewara. W tym przypadku użyto 4 stóp płyty szczelinowej. Grubość płyty szczelinowej ma kluczowe znaczenie, ponieważ cienkie płytki szczelinowe (<14 gauge) sprawiają, że urządzenie jest cienkie podczas pobierania próbek z ciekłego azotu Dewara.

figure-protocol-5
Rysunek 5. Płaska podstawa składająca się z mocnych taśm i paska T jest następnie mocowana na jednym końcu płytki szczelinowej. Większy otwór w pozostałym rogu paska T jest wyrównany ze szczeliną na płaskiej płycie i mocowany za pomocą sześciokątnej i nakrętki. To urządzenie może być teraz używane do odzyskiwania krioboxów od Dewara.

figure-protocol-6
Rysunek 6. Jeden koniec płaskiej płytki szczelinowej jest wygięty za pomocą szczypiec i pokryty pianką, aby zapewnić lepszą przyczepność, szczególnie w przypadku głębokich Dewarów, jak pokazano w tym przypadku.

figure-protocol-7
Rysunek 7. Sitko z siatką drucianą i uchwytem ze stali nierdzewnej służy do pobierania kriowiali od Dewara. Jeśli uchwyt nie jest wyposażony w szczelinę, do wywiercenia otworu wymagane będzie wiertło z węglika spiekanego.

figure-protocol-8
Rysunek 8. Aby ułatwić pobieranie kriowialiów, sitko jest wygięte wzdłuż szyjki za pomocą szczypiec, aby uzyskać sitko w kształcie. Jeśli sitko jest wyposażone w wargę, tak jak w tym przypadku, do jego zgięcia można użyć szczypiec. Dzięki temu sitko nie zostanie złapane w Dewara.

figure-protocol-9
Rysunek 9. Sitko jest przymocowane do płaskiej płyty szczelinowej na jednym końcu za pomocą nakrętki sześciokątnej i.

figure-protocol-10
Rysunek 10. Integralność próbki całkowitego RNA poddanej różnym warunkom obchodzenia się z próbką. Aby zbadać, w jaki sposób warunki obchodzenia się z próbką wpływają na jakość RNA, zestaw próbek RNA z tego samego źródła poddano dwóm metodom obchodzenia się z nimi. Metoda A polegała na przechowywaniu RNA w Dewarze poddanym pobieraniu próbek za pomocą urządzenia DIY, a więc bez częściowego rozmrażania. Metoda B polegała na przechowywaniu RNA w Dewarze poddanym wielokrotnemu częściowemu rozmrażaniu poprzez krótkoterminowe pobieranie z Dewara, modelując w ten sposób długoterminowe przechowywanie z okresowym dekantowaniem w celu pobrania opadłych próbek. Całkowita integralność RNA została następnie przeanalizowana za pomocą elektroforezy żelowej. Pas 1: Próbka przed przechowywaniem w Dewar; Tor 2: Próbka od Dewara poddana pobraniu metodą A; Tor 3, 4: Próbka od Dewara poddana pobraniu metodą B; M: drabina 100 pz.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jedną z najczęstszych metod wydobywania krioboxów i kriowialiów z dna zbiornika Dewara jest dekantacja ciekłego azotu do zapasowego pojemnika i wyciągnięcie próbek pozostałych w kolbie lub unoszących się w zdekantowanym ciekłym azocie. Jest to jednak niebezpieczna praktyka, która może spowodować oparzenia kriogeniczne lub uduszenie z powodu długotrwałego narażenia na opary ciekłego azotu2. Innym powszechnym sposobem wydobywania upadłych kriowiali jest użycie szczypiec kriowialnych3. Jednak ograniczo...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

DIY kriogeniczne urządzenie do pobierania zostało przetestowane w trakcie projektów "Modelowanie prenylacji białek bakteryjnych w komórkach eukariotycznych przy użyciu bioinformatyki i podejść molekularnych" sponsorowanych przez Mary Louise Andrews Award for Cancer Research program, Virginia Academy of Science, "Fizjologiczne znaczenie edycji RNA w komórkach dendrytycznych plazmy" sponsorowane przez The Thomas F. Jeffress and Kate Miller Jeffress Memorial Trust i State Contract 16.740.11.0364 (Ministerstwo Nauki i Edukacja, Rosja). Chcielibyśmy podziękować Beth Eom za pomoc w eksperymencie z integralnością RNA.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kittel, P. Advances in Cryogenic Engineering. , Springer. 41(1996).
  2. Edeskuty, F. J., Walter, F. Stewart Safety in the handling of cryogenic fluids. , Plenum Press. New York. (1996).
  3. Council, N. R. Prudent Practices in the Laboratory: Handling and Management of Chemical Hazards. , National Academies Press. (2011).
  4. Muyal, J., Muyal, V., Kaistha, B., Seifart, C., Fehrenbach, H. Systematic comparison of RNA extraction techniques from frozen and fresh lung tissues: checkpoint towards gene expression studies. Diagnostic Pathology. 4, 9(2009).
  5. Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular cloning: a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2001).
  6. Holland, N. T., Smith, M. T., Eskenazi, B., Bastaki, M. Biological sample collection and processing for molecular epidemiological studies. Mutation Research/Reviews in Mutation Research. 543, 217-234 (2003).
  7. Lynch, P. T. CELL, TISSUE AND ORGAN CULTURE | Storage and Cryopreservation. Encyclopedia of Rose Science. , 106-111 (2003).
  8. Crawford, R. J. Plastics Engineering. , Elsevier Butterworth-Heinemann. (1998).
  9. Gorenc, B., Tinyou, R., Syam, A. Steel designers' handbook. , University of New South Wales Press. (1996).
  10. Harper, C. A., Petrie, E. M. Plastics materials and processes: a concise encyclopedia. Wiley-Interscience. , (2003).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Samodzielnie wykonane urz dzenie do odzyskiwania pr bek kriotolerancyjneprzechowywanie w ciek ym azocieodzyskiwanie pr bek kriogenicznychodzyskiwanie z naczynia typu Dewarmetoda odzyskiwania krioprobektechnika odzyskiwania kriopude ekmonta mocnego wi zaniamodyfikacja p yty szczelinowejadaptacja sita ze stali nierdzewnejbezpiecze stwo r kawic kriogenicznych

Powiązane artykuły