Wykorzystanie jaj Schistosoma mansoni jako modelu in vivo stanu zapalnego płuc wywołanego przez helminty

Podsumowanie

Schistosoma mansoni jaja są silnymi stymulatorami odpowiedzi immunologicznej typu Th2 (T helper type 2), charakterystycznej dla infekcji pasożytniczych, astmy i zapalenia alergicznego. Niniejszy protokół wykorzystuje wstrzykiwanie jaj S. mansoni w celu wywołania indukowanej cytokinami CD4 Th2 odpowiedzi zapalnej w płucach, charakteryzującej się tworzeniem ziarniaków wokół jaj, eozynofilią oraz alternatywną aktywacją makrofagów.

Streszczenie

Schistosoma to przywry krwi, które zakażają szacunkowo 200 milionów ludzi na całym świecie ¹. W przebiegu przewlekłej infekcji Schistosoma ciężka patologia, obejmująca włóknienie wątroby i splenomegalię, jest wywoływana przez odpowiedź immunologiczną na jaja pasożyta, a nie przez samego pasożyta ². Jaja pasożyta indukują odpowiedź Th2 charakteryzującą się produkcją IL-4, IL-5 i IL-13, alternatywną aktywacją makrofagów oraz rekrutacją eozynofilów. W niniejszej pracy opisujemy wstrzykiwanie jaj Schistosoma mansoni jako model do badania specyficznych dla pasożyta odpowiedzi cytokinowych Th2 w płucach i drenujących węzłach chłonnych, tworzenia ziarniniaków płucnych otaczających jajo oraz stanu zapalnego dróg oddechowych.

Po sensytyzacji domięśniowej i wyzwaniu dożylnym, jaja S. mansoni są transportowane do płuc poprzez tętnice płucne, gdzie zostają uwięzione w miąższu płuc w obrębie ziarniniaków składających się z limfocytów, eozynofili oraz alternatywnie aktywowanych makrofagów ^3-6. Z tworzeniem ziarniniaków wiąże się obserwowany stan zapalny w przestrzeniach pęcherzykowo-oskrzelowych, powiększenie drenujących węzłów chłonnych oraz aktywacja limfocytów T CD4. W niniejszym materiale szczegółowo opisujemy protokół izolacji jaj Schistosoma mansoni z zakażonych wątrób (zmodyfikowany na podstawie ⁷), sensytyzacji i wyzwania myszy, a także pobierania organów (płukanie pęcherzykowo-oskrzelowe (BAL), płuca i drenujące węzły chłonne) do analizy. Przedstawiamy również reprezentatywne dane histologiczne i immunologiczne oraz sugestie dotyczące dodatkowych analiz immunologicznych.

Ogólnie rzecz biorąc, metoda ta dostarcza modelu in vivo do badania odpowiedzi immunologicznych indukowanych przez helmintów w płucach, który znajduje szerokie zastosowanie w badaniach nad chorobami zapalnymi typu Th2, w tym nad zakażeniami helmintami, chorobami włóknistymi, zapaleniami alergicznymi oraz astmą. Zalety tego modelu w badaniu zapalenia typu 2 w płucach obejmują powtarzalność silnej odpowiedzi zapalnej Th2 w płucach i drenujących węzłach chłonnych, łatwość oceny stanu zapalnego poprzez badanie histologiczne ziarniniaków otaczających jaja oraz możliwość długoterminowego przechowywania jaj pasożyta.

Protokół

1. Oczyszczanie jaj Schistosoma mansoni

1. Zakaź myszy Swiss-Webster церkariami schistosomów, które stanowią infekcyjny etap cyklu życiowego Schistosoma ⁸. Alternatywnie można pozyskać myszy zakażone schistosomami z NIAID Schistosomiasis Resource Center (http://www.schisto-resource.org/). Pozostawić myszy na 6-7 tygodni po zakażeniu; w tym czasie jaja pojawiają się w wątrobie i mogą zostać wyizolowane zgodnie z poniższym opisem (patrz Rys. 1).
2. Uśmiercić myszy za pomocą CO₂ i zwilżyć 70% etanolem. Położyć mysz na plecach. Za pomocą tępych pęset i nożyc wyciąć skórę oraz leżącą pod nią otrzewną. Wyciąć wątrobę, znajdującą się poniżej klatki piersiowej i przepony.
3. Wątroby drobno posiekać i dodać 20 mL na każdą wątrobę mieszaniny do trawienia, składającej się z kolagenazy/dispazy (0,5 mg/mL), penicyliny (100 U/mL) i streptomycyny (100 μg/mL) w PBS. Przenieść mieszaninę do probówki Falcon 50 mL i inkubować przez noc w wytrząsarce w temperaturze 37 °C.
4. Odwirować mieszaninę przy 400 x g / 3 min / 20 °C. Delikatnie odlać nadmiar cieczy i napełnić probówkę PBS. Ponownie odwirować i powtórzyć przemywanie PBS. Po ostatnim wirowaniu resuspender osad w 25 mL PBS.
5. Przecisnąć resuspenderowany osad przez standardowe metalowe sito kuchenne (używając tłoka strzykawki 50 mL, aby rozgnieść kawałki wątroby i przenieść je do zlewki szklanej), a następnie przepuścić mieszaninę przez gęste sito (używając strzykawki 10 mL, aby przepchnąć mieszaninę przez gęste sito do drugiej zlewki szklanej).
6. Przenieść przesianą mieszaninę do probówki Falcon 50 mL. Odwirować przy 400 x g / 5 min / 20 °C. Ostrożnie odlać supernatant, nie tracąc osadu. Resuspender osad w 3 mL PBS.
7. Delikatnie nanieść mieszaninę na gradient 20% Percoll o objętości 40 mL, składający się z 8 mL Percoll i 32 mL sacharozy 0,25M (masa cząsteczkowa FW=342,3, zatem 8,56 g sacharozy/100 mL H₂O).
8. Wirować przez 10 min / 800 x g / 20 °C. Odessać i odrzucić żelowatą górną warstwę komórek wątroby. Pobrać osad z jaj z dna za pomocą pipety transferowej i przenieść do probówki Falcon 15 mL.
9. Przemyć osad 3 razy w 10 mL PBS/1 mM EDTA/1 mM EGTA, stosując następujące parametry wirowania: 3 min / 30 x g / 20 °C. Resuspender w 500 μL PBS.
10. Nanieść mieszaninę na nowy gradient 25% Percoll o objętości 10 mL (2,5 mL Percoll i 7,5 mL sacharozy 0,25M), stosując następujące parametry wirowania: 10 min / 800 x g / 20 °C.
11. Przemyć 3 razy w 10 mL PBS, stosując parametry wirowania: 3 min / 30 x g / 20 °C.
12. Podczas ostatniego przemywania w 10 mL pobrać 100 μL w celu policzenia jaj. Jaja szybko opadają na dno, dlatego przed pobraniem próbki probówka Falcon musi zostać dobrze wymieszana. Rozcieńczyć próbkę 100 μL w 900 μL PBS. 100 μL mieszaniny należy policzyć jako kropelki na szkiełku przedmiotowym pod mikroskopem stereotypowym (rozcieńczenie 1:10). Należy używać końcówek do pipet o szerokim otworze.
13. Resuspender jaja w PBS do stężenia 50 000 jaj/mL. Jaja mogą być przechowywane przez kilka miesięcy w temperaturze -80 °C i rozmrażane raz lub dwa razy w celu użycia. Przed użyciem sprawdzić pod mikroskopem, czy jaja są nadal nienaruszone (patrz Rys. 1).

2. Sensytyzacja domięśniowa jajami S. mansoni: dzień 0

1. Przygotować jaja w stężeniu 5 000 jaj/100 μL PBS w probówce typu snapcap o pojemności 5 mL. Do iniekcji przygotować o 50% więcej jaj niż jest wymagane.
2. Napełnić igłę o rozmiarze 23 gauge^3/4inch oraz strzykawkę 1 mL ilością 100 μL zawiesiny jaj na jedną mysz. Ze względu na sedymentację jaj, należy napełniać igłę bezpośrednio przed użyciem.
3. Przed każdą iniekcją delikatnie potrząsnąć strzykawką w celu wymieszania jaj, a następnie wstrzyknąć dojszywnie 100 μL zawiesiny na każdą mysz.

3. Dożylne podanie jaj S. mansoni drogą retroorbitalną: dzień 14.

1. Przygotować jaja zgodnie z powyższą instrukcją w stężeniu 5 000 jaj/100 μL.
2. Zanurzyć myszy w anestezji w specjalnej komorze przy użyciu izofluranu (4%) lub podać wewnątrzbrzusznie ksylazynę (10 mg/kg) i ketaminę (120 mg/kg). Głębokość anestezji należy określić poprzez ściśnięcie poduszeczki stopy i upewnienie się, że nie występuje reakcja fizyczna.
3. Po napełnieniu strzykawki o objętości 1 mL z igłą 23G^3/4cala zawiesiną jaj, za pomocą pęsety zagiąć igłę pod kątem 90°, tak aby ścięcie było skierowane w dół w stronę kąta zgięcia. Należy upewnić się, że w strzykawce nie ma pęcherzyków powietrza.
4. Położyć mysz na boku. Odciągnąć skórę tak, aby gałka oczna wystawała, a następnie wstrzyknąć 100 μL do naczyń za gałką oczną pod kątem 45° względem nosa.
5. Wyjąć igłę i zastosować lekki ucisk w celu zahamowania krwawienia.

Wszystkie te procedury muszą być przeprowadzane z zachowaniem należytej staranności, a myszy należy monitorować do czasu wybudzenia z anestezji. Protokoły te zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Pensylwanii.

4. Pobranie materiału eksperymentalnego: Dzień 22

1. Uśmiercić myszy za pomocą CO₂.
2. Zwilżyć mysz 70% etanolem i położyć na grzbiecie.
3. Używając tępych pęset, uchwycić brzuch myszy i wykonać niewielkie nacięcie skóry. Ostrożnie usunąć skórę nożyczkami, aby odsłonić klatkę piersiową i otrzewną.
4. Rozciąć otrzewną. Przeciąć aortę brzuszną, aby pobrać krew za pomocą pipety Pasteura. Przechowywać na lodzie.
5. Przesunąć wątrobę w dół, aby odsłonić przeponę. Za pomocą cienkich nożyczek rozciąć przeponę. Ostrożnie rozciąć klatkę piersiową, aby odsłonić tkankę płuc.
6. Pobrać pęsetą cienką węzły chłonne przygrasicze drenujące płuca. Znajdują się one pod klatką piersiową, po obu stronach grasicy ⁹. Przechowywać na lodzie w 1mL sterylnego medium (DMEM uzupełniony o 10% inaktywowanego ciepłem płodowego surowicy cielęcej, 100 U/mL penicyliny, 100 μg/mL streptomycyny, 2 mM L-glutaminy, 50 μM 2-merkaptoetanolu, wszystkie dostępne od Invitrogen).
7. W celu pobrania BAL i napowietrzenia płuc do analizy histologicznej należy przeprowadzić intubację wewnątrz tchawicy. Odsłonić tchawicę, przesuwając ślinianki na bok i umieszczając cienką pęsetę pod tchawicą. Za pomocą cienkich nożyczek wyciąć otwór w środkowej części tchawicy i wprowadzić cewnik do płuc. Zabezpieczyć cewnik, zawiązując go nicią chirurgiczną.
8. Podłączyć do cewnika strzykawkę 1 mL wypełnioną PBS i napowietrzyć płuca 1 mL PBS. Ostrożnie pobrać płuczynkę BAL za pomocą strzykawki. Przechowywać na lodzie.
9. Podłączyć do cewnika strzykawkę 1 mL wypełnioną 4% paraformaldehydem (PFA) w PBS i napowietrzyć płuca.
10. Usunąć cewnik i mocno zawiązać nić chirurgiczną, aby zapobiec wyciekowi PFA.
11. Ostrożnie wypreparować tkankę płuc i umieścić w probówce Falcon 50 mL z 5 mL 4% PFA.

5. Przygotowanie odzyskanych tkanek

1. Surowica: Po przechowywaniu na lodzie od 30 min do 2 h w celu skrzepnięcia krwi, surowicę otrzymuje się z krwi poprzez wirowanie (13000 x g / 10 min / 4 °C). Surowicę przechowuje się w temperaturze -20 °C i można ją wykorzystać do testów ELISA na cytokiny lub testów ELISA na przeciwciała IgG specyficzne dla antygenu jaj S. mansoni ^{6, 10}.
2. Węzły chłonne: Przygotowuje się zawiesiny pojedynczych komórek, a liczbę komórek wykorzystuje się do oceny wielkości odpowiedzi immunologicznej. Aby zbadać polaryzację komórek Th2, komórki poddaje się ponownej stymulacji antygenem jaj S. mansoni przez 72 godziny. Barwienie wewnątrzkomórkowe cytokin można badać za pomocą cytometrii przepływowej, a nadnadnadkomórki można odzyskać i przechowywać w temperaturze -20 °C do analizy cytokin Th2 (IL-4, IL-5, IL-13) metodą ELISA ⁶.
3. BAL: Komórki są pelletowane (400 x g / 5 min / 4 °C). Płyn BAL jest odzyskiwany i przechowywany w temperaturze -20 °C do analizy cytokin Th2 metodą ELISA. Liczba komórek BAL służy jako wskaźnik stanu zapalnego dróg oddechowych. Preparaty z cytocentryfugi zawierające 10 000-100 000 komórek (500 rpm / 5 min / 4 °C), a następnie barwienie Diffquik, pozwalają na zliczenie nacieku zapalnego ^{4, 6}. Alternatywnie komórki BAL można badać za pomocą cytometrii przepływowej ⁶.
4. Tkanka płucna: Tkankę płucną przechowuje się przez noc w temperaturze 4 °C. Utrwaloną tkankę zatapia się w parafinie, wykonuje przekroje i osadza na szkiełkach do analizy histologicznej i immunofluorescencyjnej.

6. Reprezentatywne wyniki

Niniejszy protokół szczegółowo opisuje wszystkie kroki niezbędne do (i) przygotowania oczyszczonych jaj Schistosoma mansoni do zastosowania in vivo (Ryc. 1), (ii) uczulenia i wywołania reakcji u myszy za pomocą tych jaj oraz (iii) pobrania organów w celu zbadania odpowiedzi zapalnej w płucach. Ten model in vivo w sposób powtarzalny indukuje silną odpowiedź zapalną typu Th2 w płucach. Przejawia się to stanem zapalnym dróg oddechowych i eozynofilią, co obrazują wyniki zliczania komórek BAL oraz preparaty z cytocentryfugi (Ryc. 2). Przekroje płuc barwione H&E mogą być badane pod kątem ziarniniaków indukowanych przez jaja (Ryc. 3a), a barwienie immunofluorescencyjne przekrojów płuc pozwala na wizualizację alternatywnie aktywowanych makrofagów oraz genów indukowanych przez cytokiny Th2, takich jak cząsteczka podobna do rezystyny (RELM) α (Ryc. 3b). Antygenowo swoista odpowiedź cytokinowa CD4 Th2 jest badana za pomocą testów ELISA dla IL-5, IL-4 i IL-13 w komórkach węzłów chłonnych przygrasicy stymulowanych antygenem (Ryc. 4).

Rysunek 1. Model wstrzykiwania jaj Schistosoma mansoni. Przedstawiono reprezentatywne zdjęcia wątrób ziarniniakowych, charakterystycznych dla dużego obciążenia jajami S. mansoni, oraz zdjęcia jaj S. mansoni – średni rozmiar (L) 120 μm na (W) 50 μm.

Rysunek 2. S. mansoni wstrzyknięcie jaj indukuje zapalenie dróg oddechowych. A. Liczba komórek BAL (x10⁵) u myszy naiwnych (N) lub po wstrzyknięciu jaj S.mansoni (Sm). *P<0.05. B. Preparat komórek BAL wykonany metodą cytocentryfugacji. Mac, MAKROFAG; Eos, EOZYNOFIL; LYMPH, limfocyt. Pasek, 10 μm.

Rysunek 3. Wizualizacja ziarniniaków płucnych i alternatywnie aktywowanych makrofagów otaczających jaja S.mansoni. A. Ziarniniak płucny otaczający jajo Sm (czarna strzałka) zobrazowany w przekrojach płuc barwionych H&E. B. Barwienie immunofluorescencyjne na RELMα (zielony), receptor mannozy (czerwony) i DAPI (niebieski) ujawnia alternatywnie aktywowane makrofagi (biała strzałka) w ziarniniaku otaczającym autofluorescencyjne jajo Sm (czarna strzałka). Pasek skali, 50 μm.

Rysunek 4. Odpowiedź cytokinowa Th2 specyficzna dla antygenu jaj S.mansoni. Komórki drenażowych węzłów chłonnych przytymusowych od myszy naiwnych (N) lub wstrzykniętych jajami Sm stymulowano antygenem jaj Sm przez 72 godziny, po czym wykonano test ELISA supernatantów pod kątem obecności IL-4, IL-5 i IL-13. Skala, ng/mL.*P<0.05.

Dyskusja

W niniejszym opracowaniu opisano model z wykorzystaniem jaj Schistosoma mansoni do indukowania stanu zapalnego płuc typu 2. Charakterystyczne cechy tego modelu obejmują silną odpowiedź immunologiczną Th2, zapalenie dróg oddechowych oraz tworzenie ziarniniaków płucnych. Ponieważ parametry te są zależne od odpowiedzi komórek CD4 Th2 ¹¹, jest to użyteczny model do badania wpływu delecji specyficznych dla białka lub linii komórkowej na odpowiedzi komórek Th2. W tym przypadku odczyty obejmowałyby ilościowe...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Kolagenaza/Dyspaza		Roche Applied Science	11 097 113 001 (500 mg)
Zestaw barwiący Diff Quik Hema 3	Zestaw	Fisher Scientific Co. LLC	122-911
DMEM	ciecz	Gibco	11965
Probówka Falcon 50 ml	Opakowanie	Sokół	352070
Przewody PE Intramedic		Becton Dickinson and Co.	427410 (0,58 mm)
Izofluran		Abbot Animal Health	52600405 (250 ml)
Ketamina		Fort Dodge, Animal Health	100 mg/ml
Przeciwciało przeciwko receptorowi mannozy	Biotyna	AbD Serotec	MCA2235B
Sito metalowe	Standardowe sito kuchenne	Cel	Laurentiis
Paraformaldehyd		Electron Microsc. Sciences	15710 (16%)
Penicylina/streptomycyna		Gibco	15070 (100x)
Percoll		GE Healthcare Biosciences	17 0891 01 (1 litr)
RELMα przeciwciało		Peprotech	500-P214 (50μg)
Nici chirurgiczne		Surgical Specialties Corp.	SP118 (2,0 USP 100 jardów)
Igła do strzykawki		BD Vacutainer Lab. Med.	305143 (23g, 3/4 cala)
Sito testowe wg standardu USA		W.S. Tyler, Inc.	150μm, 0,0059" ASTME-11, Spec. nr 100
Ksylazyna		Butler	20 mg/ml