Prezentujemy sposób jednoczesnego monitorowania zmian stężenia wewnątrzkomórkowego wolnego wapnia oraz skuteczności synaptycznej w preparacie zwojowym Aplysia. Obrazujemy wapń wewnątrzkomórkowy z wykorzystaniem barwnika fluorescencyjnego Calcium Orange, a transmisję synaptyczną indukujemy i monitorujemy za pomocą elektrod ostrych (wewnątrzkomórkowych).
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Monitorowanie zmian wewnątrzkomórkowego stężenia wapnia i skuteczności synaptycznej u mięczaka Aplysia
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Sugeruje się, że zmiany poziomu wapnia wewnątrzkomórkowego pośredniczą w indukcji wielu istotnych form plastyczności synaptycznej (np. facylitacji homosynaptycznej) 1. Hipotezy te można zweryfikować poprzez jednoczesne monitorowanie zmian stężenia wapnia wewnątrzkomórkowego oraz zmian skuteczności synaptycznej. Demonstrujemy, w jaki sposób można to osiągnąć, łącząc obrazowanie wapnia z technikami rejestracji wewnątrzkomórkowej. Nasze eksperymenty są prowadzone w zwoju gębowym mięczaka Aplysia californica. Preparat ten posiada szereg zalet eksperymentalnych: zwoje można łatwo wyizolować z Aplysia, a w badaniach wykorzystuje się dojrzałe neurony, które tworzą prawidłowe połączenia synaptyczne i charakteryzują się typowym rozkładem kanałów jonowych. Ze względu na niski metabolizm zwierzęcia oraz stosunkowo niskie temperatury (14-16 °C), które są naturalne dla Aplysia, preparaty pozostają stabilne przez długi czas.
Aby wykryć zmiany w wewnątrzkomórkowym wolnym wapniu, zastosujemy wersję Calcium Orange 2 nieprzenikającą przez błony komórkowe, którą można łatwo wprowadzić do neuronu drogą iontoforezy. Gdy ten barwnik fluorescencyjny o długiej fali wiąże się z wapniem, intensywność fluorescencji wzrasta. Calcium Orange charakteryzuje się szybką kinetyką 3 i, w przeciwieństwie do barwników ratiometrycznych (np. Fura 2), nie wymaga koła filtrowego do obrazowania. Jest on dość fotostabilny i mniej fototoksyczny niż inne barwniki (np. fluo-3) 2,4. Podobnie jak wszystkie barwniki nieratiometryczne, Calcium Orange wskazuje względne zmiany stężenia wapnia. Jednak ze względu na brak możliwości uwzględnienia zmian stężenia barwnika wynikających z jego wprowadzania i dyfuzji, nie można go skalibrować w celu wyznaczenia bezwzględnych stężeń wapnia.
Do obrazowania neuronów wykorzystano pionowy mikroskop złożony ze stałym stolikiem oraz kamerę CCD zdolną do rejestracji około 30 klatek na sekundę. W przypadku Aplysia taka rozdzielczość czasowa jest w pełni wystarczająca, aby wykryć zmianę wewnątrzkomórkowego stężenia wapnia wywołaną nawet pojedynczym potencjałem czynnościowym. Jednocześnie stosuje się mikroelektrody do indukowania i rejestrowania transmisji synaptycznej w zidentyfikowanych neuronach presynaptycznych i postsynaptycznych. Po zakończeniu każdej próby specjalny skrypt łączy dane z elektrofizjologii i obrazowania. Aby zapewnić odpowiednią synchronizację, wykorzystujemy impuls świetlny z diody LED zamontowanej w porcie kamery mikroskopu. Manipulacja poziomami wapnia presynaptycznego (np. poprzez wstrzyknięcie wewnątrzkomórkowego EGTA) pozwala nam testować konkretne hipotezy dotyczące roli wapnia wewnątrzkomórkowego w mediowaniu różnych form plastyczności.
Protokół
1. Przygotowanie
- Znieczul zwierzę, wstrzykując 75-100 ml izotonicznego roztworu chlorku magnezu. Aplysia wykorzystywane do obrazowania mają zazwyczaj masę 150-200 g i są pozyskiwane z firmy Marinus Scientific.
- Przytwierdź znieczulone zwierzę do naczynia pokrytego woskiem. W tym celu dobrze sprawdzają się igły strzykawkowe; techniki sterylne nie są wymagane. Używając kleszczy chirurgicznych i standardowych nożyczek, wykonaj nacięcie w stopie zwierzęcia i odsłoń masę bukkalną. Zlokalizuj zwoj bukkalny. Za pomocą nożyczek sprężynowych i precyzyjnych pęset ostrożnie uwolnij zwoj, przecinając wszystkie nerwy bukkalne.
- Wyjmij zwoj i umieść go w naczyniu powleczonym Sylgardem zawierającym sztuczną wodę morską. Przez nerwy bukkalne przebij zwoj kilkoma szpilkami entomologicznymi, aby go ustabilizować. Usuń osłonkę zwoju bukkalnego za pomocą ultraprecezyjnej pęsety i nożyczek sprężynowych, aby odsłonić neurony do rejestracji wewnątrzkomórkowej. Następnie ponownie przymocuj zwoj, używając około 15 drobnych szpilek entomologicznych (minutien). Zwoj musi być mocno unieruchomiony, ponieważ jakikolwiek ruch będzie utrudniał obrazowanie.
2. Przygotowanie elektrod
- Wytwarzaj elektrody, wykorzystując szklane kapilary z włóknem (np. WPI TW100F-4) oraz wyciągacz. Ustawienia urządzenia należy dobrać indywidualnie, aby uzyskać elektrody o wymaganej rezystancji. Po napełnieniu 3 M KAc (octan potasu) rezystancja naszych elektrod wynosi zazwyczaj około 10 MOhms w przypadku elektrod ściętych lub około 5 MOhms, jeśli pominięto etap ścięcia końcówki.
- Napełnij jeden zestaw elektrod roztworem zawierającym 3 M KAc/30 mM KCl, używając strzykawki i igły microfil. Elektrody te będą wykorzystywane do elektrofizjologii.
- Napełnij drugi zestaw elektrod barwnikiem wskaźnikiem wapnia, zanurzając tylny koniec elektrody w barwniku, uprzednio rozpuszczonym w ok. 40 μl wody destylowanej na 500 μg barwnika. Po napełnieniu końcówki elektrody, wypełnij ok. 1/4 cala tylnego końca elektrody roztworem 200 mM KCl, aby zapewnić dobry kontakt elektryczny.
- Zaleca się ścięcie końcówek elektrod, ponieważ ułatwia to wstrzykiwanie barwnika i zmniejsza uszkodzenia powodowane przez wielokrotne penetracje błony. Używamy specjalistycznego urządzenia do ścięcia, które generuje strumień zawiesiny wody zasolonej i proszku tlenku glinu. Elektrodę montuje się w uchwycie, a jej końcówka wchodzi w strumień pod kątem 45°. Rezystancja elektrody jest stale monitorowana, a proces ścięcia kończy się, gdy rezystancja osiągnie około 5 MOhm dla elektrod napełnionych KAc. Elektrody napełnione barwnikiem są ścięte przez taki sam czas i zazwyczaj mają rezystancję 15-20 MOhm.
3. Obciążanie barwnikiem wskaźnikowym wapnia
- Umieść preparat na zestawie do elektrofizjologii i zlokalizuj wizualnie interesujący Cię neuron presynaptyczny. Wiele z naszych eksperymentów przeprowadzono z wykorzystaniem zidentyfikowanego neuronu sensorycznego biorącego udział w karmieniu, B21 5, 6. Stosunkowo stała pozycja, rozmiar (~100 μm) i wydłużony kształt somy B21 ułatwiają jego lokalizację.
- Wbij elektrodę zawierającą barwnik wskaźnikowy wapnia w interesujący Cię neuron. Tożsamość B21 można zweryfikować, wbijając elektrodę w neuron postsynaptyczny B8. Depolaryzacja B21 prądem ~8 nA wywoła potencjały czynnościowe i spowoduje ułatwienie PSP w B8 7.
- Wstrzyknij barwnik do interesującego Cię neuronu presynaptycznego, podając impulsy hiperpolaryzujące (zazwyczaj -15 nA, 1 Hz, cykl pracy 75%) przez około 30 minut. Jeśli załadowanie barwnika przebiegnie pomyślnie, soma neuronu nabierze bladoróżowego koloru. Usuń elektrodę z barwnikiem, powoli wycofując ją z neuronu.
- Pozostaw preparaty na około 30 minut, aby barwnik mógł dyfundować do cienkich wypustek, które tworzą kontakty synaptyczne z neuronami następnymi.
4. Obrazowanie wapnia i rejestracja elektrofizjologiczna
- Umieść preparat na mikroskopie obrazującym. Szalkę z preparatem mocuje się na platformie chłodzącej za pomocą kawałków uszczelniającego sznura Permagum, który w przeciwieństwie do gliny pozostaje lepki po namoczeniu. Mikroskop ze stałym stolikiem ustawia ostrość poprzez przesuwanie obiektywu. Stolik pozostaje nieruchomy, co umożliwia zamocowanie manipulatorów z magnesami. Ponieważ przy dużym powiększeniu problemem stają się wibracje (zwłaszcza ruchy boczne), cały układ obrazujący powinien zostać umieszczony na platformie izolującej od wibracji.
- Wprowadź elektrody zawierające standardowy roztwór elektrolitu do neuronów presynaptycznych i postsynaptycznych.
- Wybierz blok filtrów odpowiedni do obrazowania Calcium Orange (pobudzenie 549 nm, emisja 576 nm) 8 i dostrój kamerę. Większość naukowych kamer CCD pozwala badaczowi na wybór podzbioru odczytywanych komórek CCD. Dodatkowo komórki mogą być łączone (binning). Wybór mniejszego podzbioru zwiększa szybkość, natomiast binning zwiększa czułość. Te dwa ustawienia, wraz z czasem naświetlania, określają częstotliwość klatek, czyli liczbę obrazów, jakie można pozyskać w ciągu sekundy. Odpowiednie ustawienia pozwolą na obrazowanie obszaru 580 x 350 μm2 przy rozdzielczości 500 x 300 pikseli (przy użyciu obiektywu 10x i adaptera kamery 0,5x). Dodaj filtry neutralnoprzepuszczalne do toru światła, aby dostosować intensywność oświetlenia do minimalnej wartości zapewniającej poprawną ekspozycję przy czasie naświetlania <25 ms. Ustawienia te powinny skutkować częstotliwością klatek około 30 Hz – co w przypadku Aplysia jest wystarczająco szybkie, aby obrazować zmiany poziomu wapnia wywołane pojedynczym kolcem. Na koniec przymknij przysłonę pola, aby oświetlony był tylko obrazowany obszar.
- W oprogramowaniu do obrazowania zaznacz obszary neuronów, które chcesz zmierzyć. W oprogramowaniu Elements AR wykonuje się to w sekcji „Time Measurement”, wyznaczając obszary zainteresowania (ROI). B21 jest neuronem bipolarnym, a wcześniejsze prace wykazały, że jego wypustka boczna kontaktuje się z badanym neuronem postsynaptycznym 9. Zazwyczaj obrazujemy gałęzie pierwotne, wtórne i trzeciorzędne wypustki bocznej, umieszczając ROI nad każdą częścią neuronu. Dodatkowo mierzy się ROI obok neuronu wypełnionego barwnikiem, aby uzyskać wartość tła, która jest później odejmowana od wszystkich pozostałych punktów danych.
- Skonfiguruj system akwizycji elektrofizjologicznej (w tych eksperymentach Spike II), aby oczekiwał sygnału wyzwalającego dostarczanego przez sygnał „frame readout” kamery. Rozpocznij akwizycję obrazu (Elements AR); program Spike II automatycznie rozpocznie rejestrację w momencie, gdy kamera wykona pierwszą klatkę. Można również wykorzystać wyjście TTL modułu Power 1401 do krótkotrwałego włączenia diody LED zamontowanej w porcie kamery mikroskopu. Dostarczy to sygnału do późniejszej synchronizacji danych obrazowych i elektrofizjologicznych.
- Stymuluj neuron presynaptyczny, wstrzykując serię krótkich depolaryzujących impulsów prądowych z pożądaną częstotliwością. Ważne jest monitorowanie każdego impulsu (np. za pomocą oscyloskopu wyzwalanego stymulacją), aby określić, czy potencjał czynnościowy został pomyślnie wygenerowany. Chociaż Calcium Orange jest bardzo fotostabilny w porównaniu z innymi barwnikami, warto przeprowadzić próbę kontrolną bez stymulacji, aby sprawdzić stopień wybielania barwnika.
- W eksperymentach, w których manipuluje się wewnątrzkomórkowym stężeniem wapnia, do neuronu presynaptycznego wprowadza się lek, taki jak EGTA, a następnie powtarza się opisane powyżej kroki stymulacji i akwizycji danych.
5. Analiza reprezentatywnych danych
- Eksportuj dane obrazowania (listę zmierzonych wartości intensywności dla każdego ROI), zapisując je w pliku tekstowym. Następnie za pomocą niestandardowego skryptu w Spike II można zaimportować ten plik tekstowy. Skrypt ten normalizuje również wartości względem powierzchni poszczególnych sond oraz odejmuje wartość sondy tła. Punkty danych są następnie naniesione obok danych elektrofizjologicznych jako kanał „virtual RealWave”. Do precyzyjnego wyrównania punktów danych obrazowania, z wykorzystaniem sygnału LED jako referencji, służy funkcja „channel process / time shift” w programie Spike II.
- Aby uzyskać wartości jako procentową zmianę, przeanalizuj dane obrazowania, obliczając względną zmianę fluorescencji jako dF/Fo= (F-Fo)/ Fo. Fo oznacza poziom fluorescencji tuż przed stymulacją, a F fluorescencję podczas stymulacji.
6. Reprezentatywne wyniki
Rysunek 1. Ogólny schemat eksperymentu. Eksperymenty są prowadzone na preparacie zwoju Aplysia. Zmiany stężenia wapnia wewnątrzkomórkowego są obrazowane za pomocą barwnika fluorescencyjnego, który jest wprowadzany do neuronu presynaptycznego metodą jontoforezy. Następnie neurony presynaptyczne i postsynaptyczne są nakłuwane ostrymi elektrodami, aby umożliwić indukcję i monitorowanie transmisji synaptycznej.
Rysunek 2. Obrazowanie wapnia i rejestracja wewnątrzkomórkowa z zidentyfikowanych neuronów w zwoju gębowym Aplysia. (A) Zdjęcie obrazowanej gałęzi bocznej neuronu B21. Ramka wskazuje mierzony obszar zainteresowania (ROI). (B1) Stymulacja wewnątrzkomórkowa B21 wywołuje potencjały czynnościowe (dolny ślad) i ułatwiające potencjały postsynaptyczne (PSP) w postsynaptycznym neuronie naśladowczym B8 (środkowy ślad), co powoduje, że on również generuje potencjały czynnościowe. Wzrosty fluorescencji wapnia presynaptycznego przedstawiono na górnym śladzie. (B2) Wpływ presynaptycznego EGTA na ułatwienie homosynaptyczne. EGTA wstrzyknięto wewnątrzkomórkowo do B21 około 15 minut przed stymulacją wewnątrzkomórkową. Przyjmuje się, że EGTA jest wolno działającym chelatorem wapnia, który w niskich stężeniach nie działa wystarczająco szybko, aby zahamować transmisję synaptyczną. Zauważalny jest spadek rozległego sygnału wapnia oraz odpowiadający mu spadek amplitudy PSP. (C) Amplituda PSP koreluje z presynaptycznym sygnałem wapnia. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy rysunek.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Prezentujemy techniki, które mogą być wykorzystane do jednoczesnego monitorowania wewnątrzkomórkowego stężenia wapnia oraz oceny skuteczności transmisji synaptycznej. Techniki te są przydatne w określaniu mechanizmów pośredniczących w różnych formach plastyczności krótkotrwałej.
Obrazowanie jest przeprowadzane przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego i kamery CCD. Wymagania sprzętowe są stosunkowo niewielkie w porównaniu do większości układów do obrazowania funkcjonalnego. Technika ta jest pro...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie mamy nic do ujawnienia.
Podziękowania
Praca ta była wspierana przez grant PHS (MH51393). Część wykorzystanych przez nas Aplysia została udostępniona przez National Resource for Aplysia na Uniwersytecie w Miami w ramach grantu RR10294 z National Center for Research Resources, NIH.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Calcium Orange | Invitrogen | C-3013 | |
| EGTA | Sigma | E-4378 | |
| Zestaw buforów do kalibracji wapnia | Invitrogen | C-3008MP | Przydatne do testowania czułości i zakresu dynamicznego sygnału |
Tabela 1. Wykorzystane odczynniki. | |||
| pionowy mikroskop fluorescencyjny FN-1 | Nikon Instruments | z użyciem stolika Narishige ITS-FN1 | |
| Manipulatory NMN-21 | Narishige | zamocowany na stoliku za pomocą magnesów | |
| CoolSNAP HQ2 kamera CCD | Fotometria | ||
| Elementy NIS AR | Nikon Instruments | użyliśmy wersji 3.22 | |
| obiektyw Plan Fluor 10X/0.3w | Nikon Instruments | ten obiektyw immersyjny posiada bardzo dużą odległość roboczą wynoszącą 3,5 mm | |
| lampy metalohalogenowej X-Cite 120 PC | EXFO | stosowany do obrazowania fluorescencyjnego | |
| lampa halogenowa LS-DWL | Sumica | ||
| zestaw filtrów ET-CY3 | Chroma Technology | ||
| Przetwornik A/C Power 1401 | Cambridge Electronic Design | próbkowanie odbywało się z częstotliwością 3 kHz | |
| Oprogramowanie Spike II | Cambridge Electronic Design | użyliśmy wersji 7.07 | |
| wzmacniacz SEC-10 LX | elektronika NPI | stosowane z przedwzmacniaczem głowicowym 10X | |
| Wzmacniacz model 410 | precyzja Brownlee | wykorzystywane do wzmacniania i filtrowania sygnału | |
| WS-4 | technologia minus k | izolacja wibracyjna w obrazowaniu | |
| platforma chłodząca | wykonany na zamówienie | mosiężna płyta, przez którą pompowana jest lodowata woda ze zmienną prędkością przepływu | |
Tabela 2. Wykorzystany sprzęt. |
Bibliografia
- Zucker, R. S., Regehr, W. G. Short-term synaptic plasticity. Annu. Rev. Physiol. 64, 355-405 (2002).
- Eberhard, M., Erne, P. Calcium binding to fluorescent calcium indicators: Calcium green, calcium orange and calcium crimson. Biochem. Biophysical Res. Comm. 180, 209-215 (1991).
- Escobar, A. L., Velez, P., Kim, A. M., Cifuentes, F., Fill, M., Vergata, J. L. Kinetic properties of DM-nitrophen and calcium indicators: rapid transient response to flash photolysis. Eur. J. Physiol. 434, 615-631 (1997).
- Ivanov, A. I., Calabrese, R. L. Modulation of spike-mediated synaptic transmission by presynaptic background Ca2+ in leech heart interneurons. J. Neurosci. 23, 1206-1218 (2003).
- Rosen, S. C., Miller, M. W., Evans, C. G., Cropper, E. C., Kupfermann, I. Diverse synaptic connections between peptidergic radula mechanoafferent neurons and neurons in the feeding system of Aplysia. J. Neurophysiol. 83, 1605-1620 (2000).
- Ludwar, B. C. h, Evans, C. G., Jing, J., Cropper, E. C. Two distinct mechanisms mediate potentiating effects of depolarization on synaptic transmission. J. Neurophysiol. 102, 1976-1983 (2009).
- Evans, C. G., Ludwar, B. C. h, Askansas, J., Cropper, E. C. Effect of holding potential on the dynamics of homosynaptic facilitation. J. Neurosci. 31, 11039-11043 (2011).
- Haugland, R. P. The Handbook. , 10th edition, Invitrogen. (2005).
- Borovikov, D., Evans, C. G., Jing, J., Rosen, S. C., Cropper, E. C. A proprioceptive role for an exteroceptive mechanoafferent neuron in Aplysia. J. Neurosci. 20, 1990-2002 (2000).
- Goldberg, J. H., Yuste, R. Chapter 38: A practical guide: Two-photon calcium imaging of spines and dendrites. Imaging in Neuroscience and Development. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2005).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
