Monitorowanie zmian wewnątrzkomórkowego stężenia wapnia i skuteczności synaptycznej u Aplysia

Summary

Pokazujemy, jak zmiany w wewnątrzkomórkowym stężeniu wolnego wapnia i skuteczności synaptycznej mogą być jednocześnie monitorowane w preparatach ganglionowych Aplysia. Obrazujemy wewnątrzkomórkowy wapń za pomocą barwnika fluorescencyjnego Calcium Orange oraz indukujemy i monitorujemy transmisję synaptyczną za pomocą ostrych (wewnątrzkomórkowych) elektrod.

Abstract

Sugerowano, że zmiany w wewnątrzkomórkowym wapniu pośredniczą w indukcji wielu ważnych form plastyczności synaptycznej (np. ułatwienia homosynaptycznego) ¹. Hipotezy te można przetestować, monitorując jednocześnie zmiany wewnątrzkomórkowego wapnia i zmiany skuteczności synaptycznej. Pokazujemy, jak można to osiągnąć, łącząc obrazowanie wapnia z technikami zapisu wewnątrzkomórkowego. Nasze eksperymenty prowadzone są w zwoju policzkowym Aplysia californica. Preparat ten ma szereg korzystnych eksperymentalnie cech: Ganglia może być łatwo usunięta z Aplysia, a eksperymenty wykorzystują dorosłe neurony, które tworzą normalne połączenia synaptyczne i mają normalny rozkład kanałów jonowych. Ze względu na niskie tempo przemiany materii zwierzęcia i stosunkowo niskie temperatury (14-16 °C), które są naturalne dla Aplyzji, preparaty są stabilne przez długi czas.

Aby wykryć zmiany w wewnątrzkomórkowym wolnym wapniu, użyjemy nieprzewidzianej dla komórek wersji Calcium Orange ², która jest łatwo 'ładowana' do neuronu poprzez jonoforezę. Kiedy ten barwnik fluorescencyjny o długiej długości fali wiąże się z wapniem, intensywność fluorescencji wzrasta. Oranż wapniowy ma szybkie właściwości kinetyczne ³ i w przeciwieństwie do barwników ratiometrycznych (np. Fura 2) nie wymaga koła filtrującego do obrazowania. Jest dość stabilny fotostabilnie i mniej fototoksyczny niż inne barwniki (np. fluo-3) ^2,4. Podobnie jak wszystkie barwniki nieratiometryczne, Calcium Orange wskazuje na względne zmiany stężenia wapnia. Ponieważ jednak nie jest możliwe uwzględnienie zmian stężenia barwnika spowodowanych obciążeniem i dyfuzją, nie można go skalibrować w celu zapewnienia bezwzględnych stężeń wapnia.

Pionowy, nieruchomy mikroskop złożony został użyty do obrazowania neuronów za pomocą kamery CCD, która jest w stanie rejestrować około 30 klatek na sekundę. W przypadku leku Aplysia ta czasowa rozdzielczość jest więcej niż wystarczająca do wykrycia nawet pojedynczej zmiany stężenia wapnia w wewnątrzkomórkowym stężeniu wapnia wywołanej przez skok. Ostre elektrody są jednocześnie używane do indukowania i rejestrowania transmisji synaptycznej w zidentyfikowanych neuronach pre- i postsynaptycznych. Na zakończenie każdej próby niestandardowy skrypt łączy dane elektrofizjologiczne i obrazowe. Aby zapewnić prawidłową synchronizację, wykorzystujemy impuls świetlny z diody LED zamontowanej w porcie kamery mikroskopu. Manipulowanie presynaptycznym poziomem wapnia (np. poprzez wewnątrzkomórkową iniekcję EGTA) pozwala na przetestowanie konkretnych hipotez, dotyczących roli wewnątrzkomórkowego wapnia w pośredniczeniu w różnych formach plastyczności.

Protocol

1. Przygotowanie

1. Znieczulić zwierzę, wstrzykując 75-100 ml izotonicznego roztworu chlorku magnezu. Aplysia, której używamy do obrazowania, ma zazwyczaj 150-200 gramów i jest uzyskiwana z Marinus Scientific.
2. Przypnij znieczulone zwierzę do naczynia pokrytego woskiem. Do tego celu dobrze sprawdzają się igły strzykawkowe; Sterylne techniki nie są konieczne. Za pomocą kleszczy grubych i standardowych nożyczek wykonaj nacięcie w stopie zwierzęcia i odsłonić masę policzkową. Zlokalizuj zwój policzkowy. Za pomocą nożyczek sprężynowych i cienkich kleszczy ostrożnie uwolnij ganglion, przecinając wszystkie nerwy policzkowe.
3. Usuń ganglion i umieść go w naczyniu pokrytym Sylgardem zawierającym sztuczną wodę morską. Umieść kilka szpilek owadów przez nerwy policzkowe, aby ustabilizować ganglion. Osłonij zwój policzkowy za pomocą ultracienkich kleszczy i nożyczek sprężynowych, aby odsłonić neurony do zapisu wewnątrzkomórkowego. Następnie ponownie przypnij ganglion za pomocą około 15 drobnych szpilek na owady (minucji). Zwój musi być mocno trzymany na miejscu, ponieważ każdy ruch będzie problematyczny podczas obrazowania.

2. Przygotuj elektrody

1. Wyciągnij elektrody za pomocą szklanej rurki kapilarnej z żarnikiem (np. WPI TW100F-4) i ściągacza. Ustawienia należy ustalić indywidualnie, aby stworzyć elektrody o wymaganej rezystancji. Po napełnieniu 3 M KAc (octan potasu) nasza rezystancja elektrody wynosi zwykle około 10 MOhms, jeśli elektrody mają być ukosowane, lub około 5 MOhms, jeśli pominięto etap ukosowania.
2. Napełnij jeden zestaw elektrod roztworem zawierającym 3 M KAc/30 mM KCl za pomocą strzykawki i igły do mikrofilu. Elektrody te będą wykorzystywane do elektrofizjologii.
3. Napełnij drugi zestaw elektrod barwnikiem wskaźnikowym wapnia, zanurzając tylny koniec elektrody w barwniku, uprzednio odtworzonym w ok. 40 μl wody destylowanej na 500 μg barwnika. Gdy końcówka elektrody zostanie napełniona, napełnij z powrotem około 1/4 cala końca elektrody 200 mM KCl, aby zapewnić dobry kontakt elektryczny.
4. Korzystne jest ukosowanie elektrod, ponieważ ułatwia to wstrzykiwanie barwnika i zmniejsza uszkodzenia spowodowane wielokrotnymi penetracjami membrany. Używamy niestandardowej ukosowarki, która generuje strumień zawiesiny soli wodnej / tlenku glinu w proszku. Elektroda jest zamontowana w uchwycie, a jej końcówka wchodzi do strumienia pod kątem 45°. Rezystancja elektrody jest stale monitorowana, a ukosowanie kończy, gdy rezystancja osiągnie około 5 MOhm dla elektrod wypełnionych KAc. Elektrody wypełnione barwnikiem są fazowane przez równy czas i zwykle mają rezystancję 15-20 MOhm.

3. Ładowanie barwnika wskaźnika wapnia

1. Umieść preparat na stanowisku do elektrofizjologii i wizualnie zlokalizuj interesujący Cię neuron presynaptyczny. Wiele z naszych eksperymentów przeprowadza się na zidentyfikowanym neuronie czuciowym wykorzystywanym podczas karmienia, B21 ^{5, 6}. Stosunkowo stała pozycja, rozmiar (~100 μm) i wydłużony kształt somy B21 ułatwiają jej zlokalizowanie.
2. Przebij interesujący neuron elektrodą zawierającą barwnik wskaźnikowy wapnia. Tożsamość witaminy B21 można zweryfikować, przebijając neuron postsynaptyczny B8. Depolaryzacja B21 prądem ~8 nA wywoła skoki i spowoduje ułatwienie PSP w B8 ⁷.
3. Wstrzyknąć barwnik do neuronu presynaptycznego, który Cię interesuje, przepuszczając impulsy hiperpolaryzacyjne (zwykle -15 nA, 1 Hz, 75% cyklu pracy) przez około 30 minut. Jeśli ładowanie barwnikiem powiedzie się, soma neuronu nabierze słabego różowego koloru. Usuń elektrodę zawierającą barwnik, powoli wycofując ją z neuronu.
4. Pozostaw preparaty na około 30 minut, aby barwnik mógł dyfundować do drobnych procesów, które tworzą kontakt synaptyczny z neuronami podążającymi.

4. Obrazowanie wapnia i zapis elektrofizjologiczny

1. Umieścić preparat na mikroskopie obrazowym. Naczynie z preparatem trzymane jest na platformie chłodzącej z kawałkami sznurka uszczelniającego Permagum, który w przeciwieństwie do gliny pozostaje lepki, gdy jest mokry. Mikroskop ze stałym stopniem ustawia ostrość, przesuwając obiektyw. Stolik pozostaje nieruchomy, co pozwala na zamocowanie manipulatorów montowanych na magnesie. Ponieważ duże powiększenie sprawia, że drgania (zwłaszcza ruchy boczne) stanowią problem, cały zestaw obrazowania powinien być umieszczony na platformie izolującej drgania.
2. Przebić neurony presynaptyczne i postsynaptyczne elektrodami zawierającymi normalny roztwór elektrolitu.
3. Wybierz blok filtra odpowiedni do obrazowania pomarańczy wapniowej (wzbudzenie 549 nm, emisja 576 nm) ⁸ i wyreguluj kamerę. Większość naukowych kamer CCD pozwala badaczowi wybrać podzbiór komórek CCD, które są odczytywane. Dodatkowo ogniwa mogą być łączone (binowane). Wybranie mniejszego podzbioru zwiększa szybkość, a grupowanie zwiększa czułość. Te dwa ustawienia, wraz z czasem ekspozycji, określają liczbę klatek na sekundę, tj. liczbę obrazów, które można uzyskać w ciągu sekundy. Odpowiednie ustawienia spowodują zobrazowanie obszaru o wymiarach 580 x 350 μm² z 500 x 300 pikseli (przy użyciu obiektywu 10x i adaptera aparatu 0,5x). Dodaj filtry o neutralnej gęstości do ścieżki światła, aby dostosować intensywność oświetlenia do minimalnej wartości, która zapewnia prawidłową ekspozycję przy czasie ekspozycji <25 ms. Te ustawienia powinny skutkować częstotliwością odświeżania około 30 Hz - co w Aplysia jest wystarczająco szybkie, aby zobrazować pojedyncze zmiany wapnia wywołane przez pojedynczy skok. Na koniec zamknij przysłonę pola, aby oświetlić tylko obrazowany obszar.
4. W oprogramowaniu do obrazowania zaznacz obszary neuronu, które chcesz zmierzyć. W oprogramowaniu Elements AR odbywa się to w sekcji "Pomiar czasu" poprzez umieszczenie obszarów zainteresowania (ROI). B21 jest neuronem dwubiegunowym, a wcześniejsze prace wykazały, że jego proces boczny kontaktuje się z neuronem postsynaptycznym ^będącym przedmiotem zainteresowania 9. Na ogół obrazujemy pierwszorzędowe, drugorzędowe i trzeciorzędowe gałęzie procesu bocznego, umieszczając ROI nad każdą częścią neuronu. Mierzony jest dodatkowy zwrot z inwestycji obok neuronu wypełnionego barwnikiem, aby zapewnić wartość tła, która jest później odejmowana od wszystkich innych punktów danych.
5. Poinstruuj akwizycję elektrofizjologiczną (w tych eksperymentach Spike II), aby czekała na sygnał wyzwalający dostarczony przez sygnał "odczytu klatki" przez kamerę. Rozpocznij akwizycję obrazu (Elements AR); Spike II będzie teraz automatycznie rozpoczynał nagrywanie, gdy kamera wykona pierwszą klatkę. Możesz również użyć wyjścia TTL Power 1401, aby na krótko włączyć diodę LED zamontowaną w porcie kamery mikroskopu. Zapewni to sygnał do późniejszej synchronizacji danych obrazowych i elektrofizjologicznych.
6. Stymuluj neuron presynaptyczny poprzez wstrzyknięcie serii krótkich depolaryzujących impulsów prądu o pożądanej częstotliwości. Ważne jest, aby monitorować każdy impuls (np. za pomocą oscyloskopu wyzwalanego bodźcem), aby określić, czy potencjał czynnościowy został pomyślnie wygenerowany. Chociaż Calcium Orange jest bardzo stabilny pod względem fotostabilnym w porównaniu z innymi barwnikami, dobrym pomysłem jest nagranie próby kontrolnej bez stymulacji, aby sprawdzić, jak bardzo następuje bielenie barwnika.
7. W eksperymentach, w których manipuluje się wewnątrzkomórkowymi stężeniami wapnia, lek taki jak EGTA jest wprowadzany do neuronu presynaptycznego, a opisane powyżej etapy stymulacji i pozyskiwania danych są powtarzane.

5. Analiza reprezentatywnych danych

1. Eksportuj dane obrazowania (listę zmierzonych wartości intensywności dla każdego ROI), zapisując je w pliku tekstowym. Niestandardowy skrypt w Spike II może następnie zaimportować plik tekstowy. Ten skrypt normalizuje również wartości z obszarem pojedynczej sondy i odejmuje wartość sondy w tle. Punkty danych są następnie wykreślane wraz z danymi elektrofizjologicznymi jako "wirtualny kanał RealWave". "Funkcja procesu kanałowego / przesunięcia w czasie" w Spike II służy do precyzyjnego wyrównania punktów danych obrazowania, wykorzystując sygnał LED jako odniesienie.
2. Aby uzyskać wartości jako zmianę procentową, przeanalizuj dane obrazowania, obliczając względną zmianę fluorescencji jako dF/F_o= (F-F_o)/ F_o. F_o oznacza poziom fluorescencji tuż przed bodźcem, a F fluorescencję podczas bodźca.

6. Reprezentatywne wyniki

Rysunek 1. Ogólny schemat eksperymentu. Eksperymenty prowadzone są w preparacie ganglionowym Aplysia. Zmiany w wewnątrzkomórkowym wapniu są obrazowane za pomocą barwnika fluorescencyjnego, który jest jonoforetycznie wprowadzany do neuronu presynaptycznego. Neurony pre- i postsynaptyczne są następnie nabijane ostrymi elektrodami, aby można było indukować i monitorować transmisję synaptyczną.

Rysunek 2. Obrazowanie wapnia i zapis wewnątrzkomórkowy ze zidentyfikowanych neuronów w zwoju policzkowym Aplysia. (A) Zdjęcie zobrazowanej bocznej gałęzi neuronu B21. Pole wskazuje mierzony obszar zainteresowania. (B1) Wewnątrzkomórkowa stymulacja witaminy B21 wywołuje potencjały czynnościowe (ślad dolny) i ułatwia potencjały postsynaptyczne (PSP) w postsynaptycznym neuronie naśladującym B8 (ślad środkowy), powodując również wyzwalanie potencjałów czynnościowych. Wzrost presynaptycznej fluorescencji wapnia pokazano w górnym śladzie. (B2) Wpływ presynaptycznego EGTA na ułatwienie homosynaptyczne. EGTA wstrzyknięto domięśniowo do witaminy B21 ~ 15 minut przed stymulacją wewnątrzkomórkową. Uważa się, że EGTA jest wolno działającym chelatatorem wapnia, który przy niskich stężeniach nie jest wystarczająco szybki, aby stłumić przekaźnictwo synaptyczne. Zwróć uwagę na zmniejszenie rozpowszechnionego sygnału wapniowego i odpowiadający mu spadek amplitudy PSP. (C) Amplituda PSP koreluje z presynaptycznym sygnałem wapniowym. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą postać.

Discussion

Demonstrujemy techniki, które można wykorzystać do jednoczesnego monitorowania wewnątrzkomórkowego stężenia wapnia i oceny skuteczności transmisji synaptycznej. Techniki te są przydatne do określenia, w jaki sposób pośredniczą różne formy krótkotrwałej plastyczności.

Obrazowanie odbywa się za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego i kamery CCD. Te wymagania sprzętowe są stosunkowo skromne w porównaniu z większością funkcjonalnych zestawów do obrazowania. Technika jest prosta i łatwa do nauczenia...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Calcium Orange	Invitrogen	C-3013
EGTA	Sigma	E-4378
Zestaw bufora kalibracyjnego wapnia	Invitrogen	C-3008MP	Przydatny do testowania czułości i zakresu dynamicznego sygnału
Tabela 1. Użyte odczynniki.
FN-1 pionowy mikroskop fluorescencyjny	Instrumenty firmy Nikon ze	stolikiem Narishige ITS-FN1 Manipulatory
NMN-21	Narishige	montowany na stoliku z magnesami
CoolSNAP HQ2 Kamera CCD	Fotometria
Elementy NIS AR	Nikon Instrumenty	, których używaliśmy, wersja 3.22
10X/0,3w Plan Fluor	Instrumenty Nikon	ta soczewka zanurzeniowa w wodzie ma bardzo dużą odległość roboczą 3,5 mm
Lampa metalohalogenkowa X-Cite 120 PC		EXFO używana do obrazowania
Lampa halogenowa LS-DWL	Sumica
ET-CY3	Chroma Technology
Power 1401	Cambridge Electronic Design	zostało wykonane przy 3 kHz
Oprogramowanie Spike II	Cambridge Electronic Design	użyliśmy wersji 7.07
SEC-10 LX amplifier	NPI elektronika używana	z 10X wzmacniaczem headstage
Model 410	precyzja Brownlee	używana do wzmacniania i filtrowania sygnału
WS-4	minus k Technologia	izolacji drgań do obrazowania
platforma chłodząca	wykonana na zamówienie	mosiężna płyta, przez którą pompowana jest woda lodowata ze zmienną prędkością
Tabela 2. Używany sprzęt.