Monitorowanie zmian wewnątrzkomórkowego stężenia wapnia i skuteczności synaptycznej u Aplysia

Summary

Pokazujemy, jak zmiany w wewnątrzkomórkowym stężeniu wolnego wapnia i skuteczności synaptycznej mogą być jednocześnie monitorowane w preparatach ganglionowych Aplysia. Obrazujemy wewnątrzkomórkowy wapń za pomocą barwnika fluorescencyjnego Calcium Orange oraz indukujemy i monitorujemy transmisję synaptyczną za pomocą ostrych (wewnątrzkomórkowych) elektrod.

Abstract

Sugerowano, że zmiany w wewnątrzkomórkowym wapniu pośredniczą w indukcji wielu ważnych form plastyczności synaptycznej (np. ułatwienia homosynaptycznego) ¹. Hipotezy te można przetestować, monitorując jednocześnie zmiany wewnątrzkomórkowego wapnia i zmiany skuteczności synaptycznej. Pokazujemy, jak można to osiągnąć, łącząc obrazowanie wapnia z technikami zapisu wewnątrzkomórkowego. Nasze eksperymenty prowadzone są w zwoju policzkowym Aplysia californica. Preparat ten ma szereg korzystnych eksperymentalnie cech: Ganglia może być łatwo usunięta z Aplysia, a eksperymenty wykorzystują dorosłe neurony, które tworzą normalne połączenia synaptyczne i mają normalny rozkład kanałów jonowych. Ze względu na niskie tempo przemiany materii zwierzęcia i stosunkowo niskie temperatury (14-16 °C), które są naturalne dla Aplyzji, preparaty są stabilne przez długi czas.

Aby wykryć zmiany w wewnątrzkomórkowym wolnym wapniu, użyjemy nieprzewidzianej dla komórek wersji Calcium Orange ², która jest łatwo 'ładowana' do neuronu poprzez jonoforezę. Kiedy ten barwnik fluorescencyjny o długiej długości fali wiąże się z wapniem, intensywność fluorescencji wzrasta. Oranż wapniowy ma szybkie właściwości kinetyczne ³ i w przeciwieństwie do barwników ratiometrycznych (np. Fura 2) nie wymaga koła filtrującego do obrazowania. Jest dość stabilny fotostabilnie i mniej fototoksyczny niż inne barwniki (np. fluo-3) ^2,4. Podobnie jak wszystkie barwniki nieratiometryczne, Calcium Orange wskazuje na względne zmiany stężenia wapnia. Ponieważ jednak nie jest możliwe uwzględnienie zmian stężenia barwnika spowodowanych obciążeniem i dyfuzją, nie można go skalibrować w celu zapewnienia bezwzględnych stężeń wapnia.

Pionowy, nieruchomy mikroskop złożony został użyty do obrazowania neuronów za pomocą kamery CCD, która jest w stanie rejestrować około 30 klatek na sekundę. W przypadku leku Aplysia ta czasowa rozdzielczość jest więcej niż wystarczająca do wykrycia nawet pojedynczej zmiany stężenia wapnia w wewnątrzkomórkowym stężeniu wapnia wywołanej przez skok. Ostre elektrody są jednocześnie używane do indukowania i rejestrowania transmisji synaptycznej w zidentyfikowanych neuronach pre- i postsynaptycznych. Na zakończenie każdej próby niestandardowy skrypt łączy dane elektrofizjologiczne i obrazowe. Aby zapewnić prawidłową synchronizację, wykorzystujemy impuls świetlny z diody LED zamontowanej w porcie kamery mikroskopu. Manipulowanie presynaptycznym poziomem wapnia (np. poprzez wewnątrzkomórkową iniekcję EGTA) pozwala na przetestowanie konkretnych hipotez, dotyczących roli wewnątrzkomórkowego wapnia w pośredniczeniu w różnych formach plastyczności.

Protocol

1. Przygotowanie

1. Znieczulić zwierzę, wstrzykując 75-100 ml izotonicznego roztworu chlorku magnezu. Aplysia, której używamy do obrazowania, ma zazwyczaj 150-200 gramów i jest uzyskiwana z Marinus Scientific.
2. Przypnij znieczulone zwierzę do naczynia pokrytego woskiem. Do tego celu dobrze sprawdzają się igły strzykawkowe; Sterylne techniki nie są konieczne. Za pomocą kleszczy grubych i standardowych nożyczek wykonaj nacięcie w stopie zwierzęcia i odsłonić masę policzkową. Zlokalizuj zwój policzkowy. Za pomocą nożyczek sprężynowych i cienkich kleszczy ostrożnie uwolnij ganglion, przecinając wszystkie nerwy policzkowe.
3. U....

Discussion

Demonstrujemy techniki, które można wykorzystać do jednoczesnego monitorowania wewnątrzkomórkowego stężenia wapnia i oceny skuteczności transmisji synaptycznej. Techniki te są przydatne do określenia, w jaki sposób pośredniczą różne formy krótkotrwałej plastyczności.

Obrazowanie odbywa się za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego i kamery CCD. Te wymagania sprzętowe są stosunkowo skromne w porównaniu z większością funkcjonalnych zestawów do obrazowania. Technika jest prosta i łatwa do nauczenia.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Calcium Orange	Invitrogen	C-3013
EGTA	Sigma	E-4378
Zestaw bufora kalibracyjnego wapnia	Invitrogen	C-3008MP	Przydatny do testowania czułości i zakresu dynamicznego sygnału
Tabela 1. Użyte odczynniki.
FN-1 pionowy mikroskop fluorescencyjny	Instrumenty firmy Nikon ze	stolikiem Narishige ITS-FN1 Manipulatory
NMN-21	Narishige	montowany na stoliku z magnesami
CoolSNAP HQ2 Kamera CCD	Fotometria
Elementy NIS AR	Nikon Instrumenty	, których używaliśmy, wersja 3.22
10X/0,3w Plan Fluor	Instrumenty Nikon	ta soczewka zanurzeniowa w wodzie ma bardzo dużą odległość roboczą 3,5 mm
Lampa metalohalogenkowa X-Cite 120 PC		EXFO używana do obrazowania
Lampa halogenowa LS-DWL	Sumica
ET-CY3	Chroma Technology
Power 1401	Cambridge Electronic Design	zostało wykonane przy 3 kHz
Oprogramowanie Spike II	Cambridge Electronic Design	użyliśmy wersji 7.07
SEC-10 LX amplifier	NPI elektronika używana	z 10X wzmacniaczem headstage
Model 410	precyzja Brownlee	używana do wzmacniania i filtrowania sygnału
WS-4	minus k Technologia	izolacji drgań do obrazowania
platforma chłodząca	wykonana na zamówienie	mosiężna płyta, przez którą pompowana jest woda lodowata ze zmienną prędkością
Tabela 2. Używany sprzęt.