Monitorowanie zmian wewnątrzkomórkowego stężenia wapnia i skuteczności synaptycznej u mięczaka Aplysia

Podsumowanie

Prezentujemy sposób jednoczesnego monitorowania zmian stężenia wewnątrzkomórkowego wolnego wapnia oraz skuteczności synaptycznej w preparacie zwojowym Aplysia. Obrazujemy wapń wewnątrzkomórkowy z wykorzystaniem barwnika fluorescencyjnego Calcium Orange, a transmisję synaptyczną indukujemy i monitorujemy za pomocą elektrod ostrych (wewnątrzkomórkowych).

Streszczenie

Sugeruje się, że zmiany poziomu wapnia wewnątrzkomórkowego pośredniczą w indukcji wielu istotnych form plastyczności synaptycznej (np. facylitacji homosynaptycznej) ¹. Hipotezy te można zweryfikować poprzez jednoczesne monitorowanie zmian stężenia wapnia wewnątrzkomórkowego oraz zmian skuteczności synaptycznej. Demonstrujemy, w jaki sposób można to osiągnąć, łącząc obrazowanie wapnia z technikami rejestracji wewnątrzkomórkowej. Nasze eksperymenty są prowadzone w zwoju gębowym mięczaka Aplysia californica. Preparat ten posiada szereg zalet eksperymentalnych: zwoje można łatwo wyizolować z Aplysia, a w badaniach wykorzystuje się dojrzałe neurony, które tworzą prawidłowe połączenia synaptyczne i charakteryzują się typowym rozkładem kanałów jonowych. Ze względu na niski metabolizm zwierzęcia oraz stosunkowo niskie temperatury (14-16 °C), które są naturalne dla Aplysia, preparaty pozostają stabilne przez długi czas.

Aby wykryć zmiany w wewnątrzkomórkowym wolnym wapniu, zastosujemy wersję Calcium Orange ² nieprzenikającą przez błony komórkowe, którą można łatwo wprowadzić do neuronu drogą iontoforezy. Gdy ten barwnik fluorescencyjny o długiej fali wiąże się z wapniem, intensywność fluorescencji wzrasta. Calcium Orange charakteryzuje się szybką kinetyką ³ i, w przeciwieństwie do barwników ratiometrycznych (np. Fura 2), nie wymaga koła filtrowego do obrazowania. Jest on dość fotostabilny i mniej fototoksyczny niż inne barwniki (np. fluo-3) ^2,4. Podobnie jak wszystkie barwniki nieratiometryczne, Calcium Orange wskazuje względne zmiany stężenia wapnia. Jednak ze względu na brak możliwości uwzględnienia zmian stężenia barwnika wynikających z jego wprowadzania i dyfuzji, nie można go skalibrować w celu wyznaczenia bezwzględnych stężeń wapnia.

Do obrazowania neuronów wykorzystano pionowy mikroskop złożony ze stałym stolikiem oraz kamerę CCD zdolną do rejestracji około 30 klatek na sekundę. W przypadku Aplysia taka rozdzielczość czasowa jest w pełni wystarczająca, aby wykryć zmianę wewnątrzkomórkowego stężenia wapnia wywołaną nawet pojedynczym potencjałem czynnościowym. Jednocześnie stosuje się mikroelektrody do indukowania i rejestrowania transmisji synaptycznej w zidentyfikowanych neuronach presynaptycznych i postsynaptycznych. Po zakończeniu każdej próby specjalny skrypt łączy dane z elektrofizjologii i obrazowania. Aby zapewnić odpowiednią synchronizację, wykorzystujemy impuls świetlny z diody LED zamontowanej w porcie kamery mikroskopu. Manipulacja poziomami wapnia presynaptycznego (np. poprzez wstrzyknięcie wewnątrzkomórkowego EGTA) pozwala nam testować konkretne hipotezy dotyczące roli wapnia wewnątrzkomórkowego w mediowaniu różnych form plastyczności.

Protokół

1. Przygotowanie

1. Zanurz zwierzę w znieczuleniu poprzez wstrzyknięcie 75-100 ml izotonicznego roztworu chlorku magnezu. Aplysia wykorzystywane do obrazowania mają zazwyczaj masę 150-200 g i są pozyskiwane z firmy Marinus Scientific.
2. Przymocuj znieczulone zwierzę szpilkami do naczynia pokrytego woskiem. W tym celu dobrze sprawdzają się igły strzykawki; techniki sterylne nie są wymagane. Używając kleszczy anatomicznych i standardowych nożyczek, wykonaj nacięcie w stopie zwierzęcia i odsłoń masę gębową. Zlokalizuj zwoje gębowe. Za pomocą nożyczek sprężynowych i precyzyjnych pincet ostrożnie uwolnij zwoje, przecinając wszystkie nerwy gębowe.
3. Wyjmij zwoje i umieść je w naczyniu pokrytym Sylgardem, zawierającym sztuczną wodę morską. Przez nerwy gębowe wprowadź kilka szpilek entomologicznych, aby ustabilizować zwoje. Usuń osłonkę zwojów gębowych za pomocą ultraprecyzyjnych pincet i nożyczek sprężynowych, aby odsłonić neurony do rejestracji wewnątrzkomórkowej. Następnie ponownie przymocuj zwoje, używając około 15 drobnych szpilek entomologicznych (minutien). Zwoje muszą być mocno unieruchomione, ponieważ jakikolwiek ruch będzie utrudniał obrazowanie.

2. Przygotowanie elektrod

1. Wytnij elektrody, używając szklanych kapilar z włóknem (np. WPI TW100F-4) oraz wyciągarki. Ustawienia powinny zostać dobrane indywidualnie w celu uzyskania elektrod o wymaganej rezystancji. W przypadku napełnienia 3 M KAc (octanem potasu) rezystancja naszych elektrod wynosi zazwyczaj około 10 MOhms, jeśli elektrody mają zostać ścięte, lub około 5 MOhms, jeśli pominięto etap ścięcia.
2. Napełnij jeden zestaw elektrod roztworem zawierającym 3 M KAc/30 mM KCl, używając strzykawki i igły microfil. Elektrody te będą wykorzystywane do elektrofizjologii.
3. Napełnij drugi zestaw elektrod barwnikiem wskaźnikowym wapnia, zanurzając tylny koniec elektrody w barwniku, który wcześniej zrekonstytuowano przy użyciu ok. 40 μl wody destylowanej na 500 μg barwnika. Po napełnieniu końcówki elektrody, dopełnij ok. 1/4 cala końcówki elektrody 200 mM KCl, aby zapewnić dobry kontakt elektryczny.
4. Zaleca się ścięcie końcówek elektrod, ponieważ ułatwia to wstrzykiwanie barwnika i zmniejsza uszkodzenia powstałe w wyniku wielokrotnego przebijania błony. Używamy autorskiego urządzenia do ścięcia, które generuje strumień zawiesiny wody zasolonej i proszku alumynowego. Elektrodę montuje się w uchwycie, a jej końcówka wchodzi w strumień pod kątem 45°. Rezystancja elektrody jest stale monitorowana, a proces ścięcia kończy się, gdy rezystancja osiągnie około 5 MOhm dla elektrod napełnionych KAc. Elektrody napełnione barwnikiem są ścięte przez taki sam czas i zazwyczaj mają rezystancję 15-20 MOhm.

3. Obciążanie barwnikiem wskaźnikiem wapnia

1. Umieść preparat w układzie elektrofizjologicznym i zlokalizuj wizualnie interesujący neuron presynaptyczny. Wiele z naszych eksperymentów przeprowadzono z wykorzystaniem zidentyfikowanego neuronu sensorycznego uczestniczącego w żerowaniu, B21 ^{5, 6}. Stosunkowo stała pozycja, rozmiar (~100 μm) i wydłużony kształt somy B21 ułatwiają jego lokalizację.
2. Nakłuj interesujący neuron elektrodą zawierającą barwnik wskaźnikowy wapnia. Tożsamość B21 można zweryfikować, nakłuwając neuron postsynaptyczny B8. Depolaryzacja B21 prądem o natężeniu ~8 nA wywoła kolce i spowoduje ułatwienie PSP w B8 ⁷.
3. Wstrzyknij barwnik do interesującego neuronu presynaptycznego, przykładając impulsy hiperpolaryzujące (zazwyczaj -15 nA, 1 Hz, cykl pracy 75%) przez około 30 minut. Jeśli załadowanie barwnika przebiegło pomyślnie, soma neuronu nabierze bladego różowego koloru. Usuń elektrodę z barwnikiem, powoli wycofując ją z neuronu.
4. Pozostaw preparaty na około 30 minut, aby barwnik mógł dyfundować do cienkich wypustek, które tworzą kontakty synaptyczne z neuronami następczymi.

4. Obrazowanie wapnia i rejestracja elektrofizjologiczna

1. Umieść preparat na mikroskopie obrazującym. Szalka z preparatem jest mocowana do platformy chłodzącej za pomocą kawałków uszczelniającego sznura Permagum, który w przeciwieństwie do gliny pozostaje lepki po namoczeniu. Mikroskop z nieruchomym stolikiem ustawia ostrość poprzez przesuwanie obiektywu. Stolik pozostaje nieruchomy, co umożliwia zamocowanie manipulatorów z magnesami. Ponieważ przy dużym powiększeniu drgania (zwłaszcza ruchy boczne) stanowią problem, cały zestaw obrazujący powinien zostać umieszczony na platformie izolującej od wibracji.
2. Wbij elektrody zawierające standardowy roztwór elektrolitu w neurony presynaptyczne i postsynaptyczne.
3. Wybierz blok filtrów odpowiedni do obrazowania Calcium Orange (podświetlenie 549 nm, emisja 576 nm) ⁸ i dostosuj ustawienia kamery. Większość naukowych kamer CCD pozwala badaczowi wybrać podzbiór odczytywanych komórek CCD. Dodatkowo komórki mogą być łączone (binning). Wybór mniejszego podzbioru zwiększa prędkość, natomiast binning zwiększa czułość. Te dwa ustawienia, wraz z czasem ekspozycji, określają częstotliwość odświeżania klatek, czyli liczbę obrazów, które można uzyskać na sekundę. Odpowiednie ustawienia pozwolą na obrazowanie obszaru o wymiarach 580 x 350 μm² z rozdzielczością 500 x 300 pikseli (przy użyciu obiektywu 10x i adaptera kamery 0,5x). Dodaj filtry neutralnej gęstości do drogi światła, aby dostosować intensywność oświetlenia do minimalnej wartości zapewniającej poprawną ekspozycję przy czasie ekspozycji <25 ms. Ustawienia te powinny skutkować częstotliwością klatek około 30 Hz – co w przypadku Aplysia jest wystarczająco szybkie, aby obrazować zmiany poziomu wapnia wywołane pojedynczym potencjałem czynnościowym. Na koniec przymknij przysłonę pola, aby oświetlony był tylko obrazowany obszar.
4. W oprogramowaniu do obrazowania zaznacz obszary neuronów, które chcesz zmierzyć. W oprogramowaniu Elements AR wykonuje się to w sekcji „Time Measurement” poprzez wyznaczenie obszarów zainteresowania (ROI). B21 jest neuronem bipolarnym, a wcześniejsze prace wykazały, że jego wypustka boczna kontaktuje się z interesującym nas neuronem postsynaptycznym ⁹. Zazwyczaj obrazujemy gałęzie pierwotne, wtórne i trzeciorzędne wypustki bocznej, umieszczając ROI nad każdą częścią neuronu. Dodatkowo mierzy się ROI obok neuronu wypełnionego barwnikiem, aby uzyskać wartość tła, która jest następnie odejmowana od wszystkich pozostałych punktów danych.
5. Skonfiguruj system akwizycji elektrofizjologicznej (w tych eksperymentach Spike II), aby oczekiwał sygnału wyzwalającego generowanego przez sygnał „frame readout” kamery. Uruchom akwizycję obrazu (Elements AR); Spike II rozpocznie teraz automatycznie rejestrację, gdy kamera zrobi pierwszą klatkę. Można również wykorzystać wyjście TTL urządzenia Power 1401 do krótkotrwałego włączenia diody LED zamontowanej w porcie kamery mikroskopu. Zapewni to sygnał do późniejszej synchronizacji danych obrazowych i elektrofizjologicznych.
6. Stymuluj neuron presynaptyczny, wstrzykując serię krótkich depolaryzujących impulsów prądowych z wybraną częstotliwością. Ważne jest monitorowanie każdego impulsu (np. za pomocą oscyloskopu wyzwalanego stymulatorem), aby określić, czy potencjał czynnościowy został pomyślnie wygenerowany. Chociaż Calcium Orange jest bardzo fotostabilny w porównaniu z innymi barwnikami, warto zarejestrować próbę kontrolną bez stymulacji, aby sprawdzić stopień blaknięcia barwnika.
7. W eksperymentach, w których manipuluje się wewnątrzkomórkowymi stężeniami wapnia, do neuronu presynaptycznego wprowadza się lek taki jak EGTA, a następnie powtarza kroki stymulacji i akwizycji danych opisane powyżej.

5. Analiza reprezentatywnych danych

1. Wyeksportuj dane obrazowania (listę zmierzonych wartości intensywności dla każdego ROI), zapisując je w pliku tekstowym. Następnie za pomocą niestandardowego skryptu w programie Spike II można zaimportować ten plik tekstowy. Skrypt ten normalizuje również wartości względem powierzchni poszczególnych sond i odejmuje wartość sondy tła. Punkty danych są następnie naniesione na wykres obok danych elektrofizjologicznych jako „wirtualny kanał RealWave”. Funkcja „channel process / time shift” w programie Spike II służy do precyzyjnego dopasowania punktów danych obrazowania z wykorzystaniem sygnału LED jako referencji.
2. Aby uzyskać wartości jako procentową zmianę, przeanalizuj dane obrazowania, obliczając względną zmianę fluorescencji jako dF/F_o= (F-F_o)/ F_o. F_o oznacza poziom fluorescencji bezpośrednio przed bodźcem, a F fluorescencję podczas bodźca.

6. Reprezentatywne wyniki

Rycina 1. Ogólny schemat eksperymentu. Doświadczenia są prowadzone na preparacie zwoju Aplysia. Zmiany poziomu wapnia wewnątrzkomórkowego są obrazowane za pomocą barwnika fluorescencyjnego, który zostaje wprowadzony do neuronu presynaptycznego drogą jontoforezy. Następnie neurony pre- i postsynaptyczne są przebite ostrymi elektrodami, aby możliwe było wywołanie i monitorowanie transmisji synaptycznej.

Rysunek 2. Obrazowanie wapnia i rejestracja wewnątrzkomórkowa z zidentyfikowanych neuronów w zwoju jawnym Aplysia. (A) Zdjęcie obrazowanego odgałęzienia bocznego neuronu B21. Ramka wskazuje mierzony obszar zainteresowania (ROI). (B1) Stymulacja wewnątrzkomórkowa B21 wywołuje potencjały czynnościowe (dolny ślad) oraz ułatwiające potencjały postsynaptyczne (PSPs) w postsynaptycznym neuronie następczym B8 (środkowy ślad), co powoduje również generowanie przez niego potencjałów czynnościowych. Wzrosty fluorescencji wapnia presynaptycznego przedstawiono na górnym śladzie. (B2) Wpływ presynaptycznego EGTA na ułatwienie homosynaptyczne. EGTA wstrzyknięto do wnętrza B21 około 15 minut przed stymulacją wewnątrzkomórkową. Przyjmuje się, że EGTA jest wolno działającym chelatorem wapnia, który w niskich stężeniach nie działa wystarczająco szybko, by zahamować przekaźnictwo synaptyczne. Zauważalny jest spadek rozległego sygnału wapniowego i odpowiadający mu spadek amplitudy PSP. (C) Amplituda PSP koreluje z presynaptycznym sygnałem wapniowym. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony rysunek.

Dyskusja

Prezentujemy techniki, które mogą być wykorzystane do jednoczesnego monitorowania wewnątrzkomórkowego stężenia wapnia oraz oceny skuteczności transmisji synaptycznej. Techniki te są przydatne w określaniu mechanizmów pośredniczących w różnych formach plastyczności krótkotrwałej.

Obrazowanie jest przeprowadzane przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego i kamery CCD. Wymagania sprzętowe są stosunkowo niewielkie w porównaniu do większości układów do obrazowania funkcjonalnego. Technika ta jest pro...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Calcium Orange	Invitrogen	C-3013
EGTA	Sigma	E-4378
Zestaw buforów do kalibracji wapnia	Invitrogen	C-3008MP	Przydatne do testowania czułości i zakresu dynamicznego sygnału
Tabela 1. Wykorzystane odczynniki.
pionowy mikroskop fluorescencyjny FN-1	Nikon Instruments	z użyciem stolika Narishige ITS-FN1
Manipulatory NMN-21	Narishige	zamocowany na stoliku za pomocą magnesów
CoolSNAP HQ2 kamera CCD	Fotometria
Elementy NIS AR	Nikon Instruments	użyliśmy wersji 3.22
obiektyw Plan Fluor 10X/0.3w	Nikon Instruments	ten obiektyw immersyjny posiada bardzo dużą odległość roboczą wynoszącą 3,5 mm
lampy metalohalogenowej X-Cite 120 PC	EXFO	stosowany do obrazowania fluorescencyjnego
lampa halogenowa LS-DWL	Sumica
zestaw filtrów ET-CY3	Chroma Technology
Przetwornik A/C Power 1401	Cambridge Electronic Design	próbkowanie odbywało się z częstotliwością 3 kHz
Oprogramowanie Spike II	Cambridge Electronic Design	użyliśmy wersji 7.07
wzmacniacz SEC-10 LX	elektronika NPI	stosowane z przedwzmacniaczem głowicowym 10X
Wzmacniacz model 410	precyzja Brownlee	wykorzystywane do wzmacniania i filtrowania sygnału
WS-4	technologia minus k	izolacja wibracyjna w obrazowaniu
platforma chłodząca	wykonany na zamówienie	mosiężna płyta, przez którą pompowana jest lodowata woda ze zmienną prędkością przepływu
Tabela 2. Wykorzystany sprzęt.