Mysi model treningu mięśni za pomocą elektrycznej stymulacji nerwowo-mięśniowej

1. Przygotowanie elektrody

• Wytnij odcinek płytki drukowanej wektora o wymiarach 1 cm x 1 cm.
• Ustabilizuj 2 kołki do owijania drutu za pomocą uchwytu imadła, z kołkami oddalonymi od siebie o około 3.5 mm. Rozwidlone końce kołków powinny być skierowane do góry.
• Zagiąć kołki do owijania drutu pod kątem 90°, mniej więcej w połowie ich długości, za pomocą szczypiec do igieł.
• Odsłoń przewody miedziane złączy, około 7 cm od połączenia przewodów, zdejmując izolację przewodu.
• jeden z drutów miedzianych do rozwidlonego końca jednego z kołków owijki. Powtórz krok dla drugiego pinu owijki.
• Pociągnij rurkę termokurczliwą na lutowanym połączeniu między drutami miedzianymi a złotymi pinami w celu zaizolowania i ustabilizowania. Podgrzej rurkę za pomocą grotu lutowniczego.
• Włóż nielutowane końcówki kołków do owijania drutu do sąsiednich otworów płytki drukowanej płytki stykowej.
• Upewnij się, że kołki do owijania drutu są równoległe do siebie i wbijają się w płytkę stykową tak, aby końcówki znajdowały się w tej samej odległości po umieszczeniu w płytce.
• Osadź przylutowane końce kołków w przezroczystej żywicy epoksydowej. Pozostaw żywicę epoksydową do utwardzenia przez około 10 minut lub do całkowitego wyschnięcia.
• Powtarzaj nakładanie żywicy epoksydowej, aż kołki i płytka drukowana wektora zostaną całkowicie osadzone, aby zapewnić integralność strukturalną i odciążenie przewodów doprowadzających.
• Przeszlifuj żywicę epoksydową za pomocą metalowego pilnika, aby odsłonić końcówki złotych szpilek.
• Użyj multimetru, aby upewnić się, że dwa przewody nie są zwarte elektrycznie i że przewody mają odpowiednią ciągłość
• Podłącz przewody elektrod z urządzenia NMES do żeńskiego złącza przewodu 2-drożnego (krosowy Pomona).

2. Przygotowanie zwierząt

• Zwierzęta są znieczulane poprzez inhalację przy użyciu 2% izofluoranu (Abbott Laboratories, North Chicago, IL) w 100% gazie_O2. Zwierzę powinno pozostać w znieczuleniu przez cały czas trwania sesji NMES.
• Przed rozpoczęciem protokołu NMES wykonaj uszczypnięcie palca u nogi, aby upewnić się, że zwierzę jest w pełni znieczulone.
• Zwierzę powinno być regularnie sprawdzane pod kątem reakcji na stymulację, aby upewnić się, że poziom środka znieczulającego jest wystarczający. W razie potrzeby znieczulenie należy dostosować. Ruchy inne niż stymulowana noga, zmiany głębokości oddychania i kolor błon śluzowych powinny być regularnie oceniane w celu monitorowania głębokości znieczulenia.
• Ustawić zwierzę w pozycji bocznej.
• Nałóż lubrykant okulistyczny na oczy, aby zapobiec wysuszeniu rogówki podczas zabiegu.
• Ogolić obszar kończyn tylnych, który ma być leczony, i przetrzeć alkoholem.
• Przetrzyj elektrodę 3% wybielaczem, a następnie spłucz wodą.
• Nałóż warstwę żelu przewodzącego na miejsce, w którym zostanie nałożona elektroda. W razie potrzeby nakładaj ponownie w całym protokole NMES, aby zapewnić przepływ prądu między elektrodą a skórą.
• Lampa grzewcza lub krążący koc wodny powinny być używane do utrzymania normalnych zakresów ciała.
• Uwaga: Wszystkie procedury zostały sprawdzone i zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Uniwersytetu w Pittsburghu i wykonane w programie i obiektach akredytowanych przez PHS i AAALAC Int.

3. Stymulacja

• Umieszczenie elektrody:
  • W celu stymulacji mięśni przedniego przedziału, w tym mięśnia piszczelowego przedniego i mięśnia prostownika długiego palca, należy umieścić elektrodę powierzchniową bezpośrednio nad głębokim nerwem strzałkowym zwierzęcia, który jest dystalną gałęzią od wspólnego nerwu strzałkowego i znajduje się tuż przed głową kości strzałkowej.
  • W przypadku stymulacji mięśni przednich przedziałów położenie elektrody jest potwierdzane, gdy stymulacja wywołuje pełne zgięcie grzbietowe kostki i pełne wyprostowanie palców. Z drugiej strony, zgięcie grzbietowe, przy braku wyprostu palca, sugeruje, że stymulowany jest tylko mięsień piszczelowy przedni. Taka ukierunkowana reakcja skurczowa może być pożądana, w zależności od projektu badania.
  • Skurcz mięśni podzielony jest na 2 fazy stymulacji: fazę swobodnego poruszania się, koncentryczną, która występuje w ciągu początkowych ~0,5 sekundy. Podczas tej pierwszej fazy łapa przesuwa się z pozycji spoczynkowej do maksymalnego zgięcia grzbietowego i wyprostu palca. Drugą fazą stymulacji jest skurcz izometryczny utrzymujący się przy zgięciu grzbietowym i wyprostu palca w końcowym zakresie.
• Parametry stymulacji:
  • Ten model NMES wykorzystuje wielofunkcyjne urządzenie do elektroterapii 300 PV Empi, które zapewnia 2 kanały konwencjonalnego NMES (patrz tabela). Na potrzeby tego modelu używany jest tylko 1 kanał.
  • Stosowane parametry obejmują symetryczny kształt fali, czas trwania impulsu 150 μs i częstotliwość 50 Hz. Czas stymulacji jest ustawiony na 5 sekund, z 0,5 sekundy wzrostem i 0,5 sekundy spadkiem. Pozwoli to mięśniom bardziej stopniowo przyzwyczajać się do stymulacji. W obecnym protokole czas przerwy między skurczami został ustawiony na 10 sekund, ale może to być dostosowane w zależności od pożądanego efektu. Skrócenie czasu pracy spowoduje szybszą inicjację zmęczenia mięśni. Te parametry stymulacji oparto na protokołach klinicznych zaprojektowanych w celu zwiększenia siły mięśni za pomocą elektrycznej stymulacji nerwowo-mięśniowej, bez wywoływania znacznego uszkodzenia mięśni szkieletowych ^{1, 15, 16}.
  • Myszy wykonują dwie serie po 10 skurczów, z 5-minutowym odpoczynkiem między seriami.
  • W przypadku dorosłych zwierząt intensywność NMES jest zwykle inicjowana przy 9 mA. Z naszego doświadczenia wynika, że jest to przybliżone do maksymalnej intensywności początkowej, która nie powoduje zauważalnego upośledzenia chodu bezpośrednio po stymulacji. W przypadku kolejnych sesji NMES intensywność jest zwiększana o 1 mA za każdym razem, gdy zwierzęta są w stanie wykonać 20 pełnych zgięć grzbietowych.
• Po zakończeniu protokołu stymulacji i powrocie do zdrowia po znieczuleniu zwierzęta zazwyczaj wykazują normalny chód i postawę. Chód powinien pozostać niezaburzony przez cały czas trwania programu NMES.

4. Reprezentatywne wyniki

Protokół NMES opisany w tym artykule został zaimplementowany w kilku odmianach myszy, w tym: Wild Type (B6/10), B6. Myszy SCID i mdx/SCID. Przedstawiono reprezentatywne wyniki NMES wykonanego w ciągu 4 tygodni (20 sesji) u 3-5 miesięcznych mdx/SCID.

Zwierzęta zostały humanitarnie poddane eutanazji przez zwichnięcie szyjki macicy podczas znieczulenia. Mięsień piszczelowy przedni pobrano i natychmiast zamrożono w 2 metylobutanie, wstępnie schłodzono w ciekłym azocie i przechowywano w temperaturze -80 °C. Uzyskano seryjne przekroje poprzeczne (10 μm) i zamontowano je na szkiełkach. Analizy statystyczne wykonano przy użyciu standardowych pakietów oprogramowania statystycznego (SPSS, oprogramowanie v19.0). Po pierwsze, test Levene'a został wykorzystany do oceny, czy istnieje równość wariancji. Następnie przeprowadzono test t na niezależnych próbach w celu zbadania różnic między grupami NMES i kontrolnymi.

Barwienie Hematoksyliną i Eozyną (H&E) zostało przeprowadzone w celu zbadania, czy protokół NMES spowoduje zwiększenie uszkodzeń mięśnia dystroficznego. Wybrano jeden wycinek, a zdjęcia uzyskano za pomocą mikroskopu świetlnego (Nikon Eclipse E800; Nikon, Japonia). Całkowita liczba włókien oraz liczba włókien z centralnie położonymi jądrami zostały ręcznie zliczone za pomocą National Institutes of Health (NIH) - opracowanego oprogramowania do analizy obrazu, Image J. Nie stwierdzono istotnego wzrostu wskaźnika regeneracji (liczba włókien jądrzastych centralnie/całkowita liczba włókien) u zwierząt poddanych NMES w porównaniu z grupą kontrolną (p = 0,802; Rysunek 1). Sugeruje to, że zastosowanie NMES nie zwiększa kaskady zwyrodnieniowo-regeneracyjnej obserwowanej u zwierząt dystroficznych, a zatem prawdopodobnie nie powoduje zwiększonego uszkodzenia mięśni.

Barwienie immunofluorescencyjne dla CD31 zostało przeprowadzone w celu zbadania wpływu 4-tygodniowego protokołu NMES na unaczynienie mięśni. Krótko mówiąc, sekcje mięśni utrwalono w 4% formalinie i zablokowano za pomocą 5% surowicy końskiej (HS). Sekcje inkubowano z pierwszorzędowym przeciwciałem przeciwko mysom szczura (rozcieńczenie 1:300 w 5% HS) i traktowano drugorzędowym przeciwciałem antyszczurzym znakowanym 555 kozim (rozcieńczenie 1:300 w 5% HS). Aby określić ilościowo całkowitą liczbę komórek CD31-dodatnich, wybrano jedną sekcję i sfotografowano ją za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej (Nikon Eclipse E800; Japonia). Całkowita liczba naczyń włosowatych została ręcznie zliczona za pomocą oprogramowania Northern Eclipse Software (Empix Imaging Inc.). Nastąpił znaczny wzrost liczby komórek CD31 dodatnich u zwierząt poddanych NMES w porównaniu z grupą kontrolną (p<0,01; Ryc. 2), co wskazuje, że opisany protokół NMES sprzyja angiogenezie mięśni szkieletowych.

Testy skurczowe in situ: Cztery tygodnie po zakończeniu protokołu NMES, przeprowadzono testy skurczu mięśni przedniego przedziału za pomocą aparatu do testowania in situ (Model 809B, Aurora Scientific Inc, Kanada), stymulatora (Model 701C, Aurora Scientific Inc, Kanada) i przetwornika siły (Aurora Scientific Inc, Kanada). Krótko mówiąc, nerw strzałkowy znieczulonych zwierząt został odizolowany przez małe nacięcie boczne od kolana. Myszy następnie umieszczono na wznak na platformie, a badaną stopę umieszczono na podnóżku. Tylna kończyna używana do badań była stabilizowana taśmą materiałową na kolanie i stopie. Mięśnie stymulowano za pomocą elektrod hakowych umieszczonych pod skórą. Skurcz tężcowy mięśni testowano z częstotliwością 150 Hz przez 350 ms, aby zbadać, czy 4-tygodniowy protokół NMES spowoduje poprawę siły mięśniowej. Wyniki zostały znormalizowane do mokrej masy mięśniowej. Nastąpił około 30% wzrost skurczu tężcowego u zwierząt poddanych NMES w porównaniu z grupą kontrolną (p = 0,005) (Figura 3), co sugeruje, że opisany protokół poprawia siłę mięśni szkieletowych u zwierząt mdx / SCID.

Rysunek 1. Barwienie mięśni szkieletowych hematoksyliny i eozyny u myszy dystroficznych (mdx) / z niedoborem odporności (4-5 miesięcy) (10-krotne powiększenie): A) nieleczone kontrole, B) po 4 tygodniach NMES.

Rysunek 2. Immunofluorescencja CD31 (czerwona), jako marker unaczynienia mięśni szkieletowych, w mięśniach szkieletowych myszy dystroficznych (MDX) / z niedoborem odporności (4-5 miesięcy) (20-krotne powiększenie) A) nieleczonych kontrol, B) po 4 tygodniach NMES.

Rysunek 3. Próba kurczliwości mięśni przedniego przedziału mięśniowego w grupie kontrolnej i u zwierząt leczonych NMES przez 4 tygodnie. mNm = miliniutonometry. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą postać.

Nie mamy nic do ujawnienia.