Opisano mysi model przezskórnej elektrycznej stymulacji nerwowo-mięśniowej (NMES), bezpiecznej i niedrogiej metody klinicznej, zastosowany do mięśni przedziału przedniego. Model ten ma tę zaletę, że wykorzystuje zmodyfikowane, powszechnie dostępne urządzenie kliniczne w celu wywołania ukierunkowanych i specyficznych skurczów mięśni u myszy.
Artykuł metodologiczny
Mysi model treningu mięśniowego za pomocą neuromuskularnej stymulacji elektrycznej
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Neuromięśniowa stymulacja elektryczna (NMES) jest powszechną metodą kliniczną, szeroko stosowaną w celu przywrócenia1, utrzymania2 lub poprawy3-5 funkcjonalnej wydolności mięśni. Przezskórna stymulacja powierzchniowa mięśni szkieletowych polega na przepływie prądu między katodą a anodą, co indukuje pobudzenie jednostki motorycznej i otaczających ją włókien mięśniowych.
NMES jest atrakcyjną metodą oceny adaptacyjnych odpowiedzi mięśni szkieletowych z kilku powodów. Po pierwsze, zapewnia ona powtarzalny model eksperymentalny, w którym dobrze udokumentowane są adaptacje fizjologiczne, takie jak przerost włókien mięśniowych i wzmacnianie mięśni6, angiogeneza7-9, wydzielanie czynników wzrostu9-11 oraz aktywacja komórek prekursorowych mięśni12. Takie reakcje fizjologiczne mogą być precyzyjnie miareczkowane poprzez zastosowanie różnych parametrów stymulacji (w sprawie przeglądu Cochrane patrz 13). Ponadto NMES rekrutuje jednostki motoryczne nieselektywnie, w sposób przestrzennie stały i czasowo synchroniczny14, co daje korzyść w postaci wywierania efektu terapeutycznego na wszystkie włókna, niezależnie od ich typu. Chociaż w populacjach klinicznych istnieją określone przeciwwskazania do stosowania NMES, np. zaburzenia żylne obwodowe lub nowotwory złośliwe, metoda ta jest bezpieczna i wykonalna nawet w przypadku osób chorych i/lub przykuta do łóżka, a także w grupach, dla których intensywne ćwiczenia mogą być zbyt dużym wyzwaniem.
W niniejszym materiale prezentujemy protokół adaptacji komercyjnie dostępnych elektrod oraz przeprowadzania procedury NMES z wykorzystaniem modelu mysiego. Model ten ma tę zaletę, że pozwala na użycie urządzenia dostępnego w praktyce klinicznej i zapewnia natychmiastową informację zwrotną dotyczącą rozmieszczenia elektrod w celu wywołania pożądanego efektu skurczu mięśnia. Na potrzeby niniejszej publikacji opisujemy protokół stymulacji mięśni przedniego przedziała kończyny tylnej myszy.
Protokół
1. Przygotowanie elektrody
- Wytnij fragment płytki stykowej (vector circuit board) o wymiarach 1 cm x 1 cm.
- Ustabilizuj 2 piny wirewrap za pomocą szczypiec zaciskowych, zachowując odstęp około 3,5 mm między pinami. Rozwidlone końce pinów powinny być skierowane do góry.
- Zgnij piny wirewrap pod kątem 90°, mniej więcej w połowie ich długości, używając szczypiec półokrągłych.
- Odsłoń miedziane druty konektorów, około 7 cm od miejsca połączenia przewodów, usuwając izolację.
- Przylutuj jeden z miedzianych drutów do rozwidlonego końca jednego z pinów wirewrap. Powtórz czynność lutowania dla drugiego pinu wirewrap.
- Nasuń rurkę termokurczliwą na miejsce lutowania miedzianych drutów z pozłacanymi pinami w celu izolacji i stabilizacji. Podgrzej rurkę za pomocą grota lutownicy.
- Włóż przylutowane końce pinów wirewrap w sąsiednie otwory płytki stykowej.
- Upewnij się, że piny wirewrap są równoległe i wystają z płytki stykowej w taki sposób, aby ich końce znajdowały się w tej samej odległości po umieszczeniu w płytce.
- Zatop przylutowane końce pinów w przezroczystej żywicy epoksydowej. Pozostaw żywicę do utwardzenia przez około 10 minut lub do całkowitego wyschnięcia.
- Powtarzaj nakładanie żywicy, aż piny i płytka stykowa zostaną całkowicie zatopione, aby zapewnić stabilność konstrukcji i odciążyć przewody doprowadzające.
- Oszlifuj żywicę za pomocą metalowego pilnika, aby odsłonić końce pozłacanych pinów.
- Użyj multimetru, aby upewnić się, że dwa przewody nie są zwarte elektrycznie i że zachowana jest prawidłowa ciągłość przewodów.
- Podłącz przewody elektrod z urządzenia NMES do żeńskiego 2-biegunowego konektora (przewód pomiarowy Pomona).
2. Przygotowanie zwierząt
- Zwierzęta poddaje się znieczuleniu wziewnemu przy użyciu 2% isofluranu (Abbott Laboratories, North Chicago, IL) w 100% gazie O2. Zwierzę powinno pozostawać pod wpływem znieczulenia przez cały czas trwania sesji NMES.
- Przed rozpoczęciem protokołu NMES należy przeprowadzić próbę uszczypnięcia palca, aby upewnić się, że zwierzę jest w pełni znieczulone.
- Należy regularnie sprawdzać reakcję zwierzęcia na stymulację, aby upewnić się, że poziom znieczulenia jest wystarczający. Znieczulenie należy dostosować w razie potrzeby. W celu monitorowania głębokości znieczulenia należy regularnie oceniać ruchy inne niż ruch stymulowanej kończyny, zmiany w głębokości oddechu oraz kolor błon śluzowych.
- Ustaw zwierzę w pozycji bocznej.
- Nanieś smar okulistyczny na oczy, aby zapobiec wysychaniu rogówki podczas procedury.
- Ogól obszar kończyny tylnej, która będzie poddana zabiegowi, a następnie przemyj go alkoholem.
- Przetrzyj elektrodę 3% wybielaczem, a następnie wypłucz wodą.
- Nanieś warstwę żelu przewodzącego w miejscu, w którym zostanie umieszczona elektroda. Ponawiaj aplikację w razie potrzeby w trakcie protokołu NMES, aby zapewnić przepływ prądu między elektrodą a skórą.
- W celu utrzymania prawidłowej temperatury głębokiej ciała należy stosować lampę grzewczą lub cyrkulacyjny koc wodny.
- Uwaga: Wszystkie procedury zostały przejrzane i zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Use Committee Uniwersytetu w Pittsburghu oraz przeprowadzone w programach i placówkach zatwierdzonych przez PHS i akredytowanych przez AAALAC Int.
3. Stymulacja
- Umiejscowienie elektrod:
- W celu stymulacji mięśni przedziału przedniego, w tym mięśnia piszczelowego przedniego oraz mięśnia prostownika długiego palców, należy umieścić elektrodę powierzchniową bezpośrednio nad głębokim nerwem strzałkowym zwierzęcia, który jest gałęzią dystalną wspólnego nerwu strzałkowego i znajduje się tuż przed głową kości strzałkowej.
- W przypadku stymulacji mięśni przedziału przedniego, prawidłowe umiejscowienie elektrody potwierdza fakt, że stymulacja wywołuje pełne zgięcie grzbietowe stawu skokowego oraz pełne wyprostowanie palców. Z kolei zgięcie grzbietowe bez wyprostu palców sugeruje, że stymulowany jest wyłącznie mięsień piszczelowy przedni. Taka ukierunkowana odpowiedź skurczowa może być pożądana, w zależności od projektu badania.
- Skurcz mięśnia jest podzielony na 2 fazy stymulacji: fazę koncentryczną z wolnym ruchem, która występuje podczas pierwszych ~0,5 sekundy. W tej pierwszej fazie łapa przemieszcza się z pozycji spoczynkowej do maksymalnego zgięcia grzbietowego i wyprostu palców. Druga faza stymulacji to skurcz izometryczny utrzymywany przy końcowym zakresie zgięcia grzbietowego i wyprostu palców.
- Parametry stymulacji:
- Ten model NMES wykorzystuje wielofunkcyjne urządzenie do elektroterapii 300 PV Empi, które zapewnia 2 kanały konwencjonalnego NMES (patrz Tabela). Na potrzeby tego modelu używany jest tylko 1 kanał.
- Zastosowane parametry obejmują symetryczny przebieg fali, czas trwania impulsu 150 μs oraz częstotliwość 50Hz. Czas stymulacji ustawiono na 5 sekund, z 0,5 sekundowym czasem narastania (ramp up) i 0,5 sekundowym czasem opadania (ramp down). Pozwoli to mięśniowi na bardziej stopniową aklimatyzację do stymulacji. W obecnym protokole czas przerwy między skurczami ustawiono na 10 sekund, ale może on zostać dostosowany w zależności od pożądanego efektu. Skrócenie czasu przerwy doprowadzi do szybszego wystąpienia zmęczenia mięśni. Parametry stymulacji te oparto na protokołach klinicznych zaprojektowanych w celu zwiększenia siły mięśniowej za pomocą neuromięśniowej stymulacji elektrycznej, bez wywoływania znaczących uszkodzeń mięśni szkieletowych 1, 15, 16.
- Myszy wykonują dwa zestawy po 10 skurczów, z 5-minutową przerwą między zestawami.
- Dla zwierząt dorosłych intensywność NMES jest zazwyczaj rozpoczynana od 9 mA. Z naszego doświadczenia wynika, że jest to przybliżona maksymalna intensywność początkowa, która nie powoduje zauważalnego upośledzenia chodu bezpośrednio po stymulacji. W kolejnych sesjach NMES intensywność jest zwiększana o 1 mA za każdym razem, gdy zwierzęta są w stanie wykonać 20 pełnych zgięć grzbietowych.
- Po zakończeniu protokołu stymulacji i wybudzeniu z narkozy zwierzęta zazwyczaj wykazują prawidłowy chód i postawę. Chód powinien pozostać nieupośledzony przez cały czas trwania programu NMES.
4. Reprezentatywne wyniki
Protokół NMES opisany w tym artykule został zaimplementowany u kilku szczepów myszy, w tym: typu dzikiego (B6/10), B6.SCID oraz myszy mdx/SCID. Przedstawiono reprezentatywne wyniki NMES przeprowadzonych przez 4 tygodnie (20 sesji) u myszy mdx/SCID w wieku 3-5 miesięcy.
Zwierzęta zostały humanitarnie uśpione poprzez zwichnięcie stawu głównego w znieczuleniu. Pobrano mięsień piszczelowy przedni, który natychmiast zamrożono w 2-metylobutanie schłodzonym w ciekłym azocie, a następnie przechowywano w temperaturze -80 °C. Wykonano seryjne przekroje poprzeczne (10 μm), które zamocowano na szkiełkach przedmiotowych. Analizy statystyczne przeprowadzono przy użyciu standardowych pakietów oprogramowania statystycznego (SPSS, wersja 19.0). W pierwszej kolejności zastosowano test Levene'a w celu oceny jednorodności wariancji. Następnie przeprowadzono t-test dla prób niezależnych, aby zbadać różnice między grupą NMES a grupą kontrolną.
Wykonano barwienie hematoksyliną i eozyną (H&E), aby zbadać, czy protokół NMES spowoduje zwiększenie uszkodzeń w mięśniu dystroficznym. Wybrano jeden przekrój, a obrazy uzyskano za pomocą mikroskopu świetlnego (Nikon Eclipse E800; Nikon, Japonia). Całkowitą liczbę włókien oraz liczbę włókien z centralnie położonymi jądrami policzono ręcznie przy użyciu oprogramowania do analizy obrazu Image J, opracowanego przez National Institutes of Health (NIH). Nie odnotowano istotnego wzrostu wskaźnika regeneracji (liczba włókien z centralnie położonym jądrem/całkowita liczba włókien) u zwierząt poddanych NMES w porównaniu z grupą kontrolną (p=0.802; Rysunek 1). Sugeruje to, że zastosowanie NMES nie nasila kaskady degeneracji i regeneracji obserwowanej u zwierząt z dystrofią i w związku z tym prawdopodobnie nie indukuje zwiększonych uszkodzeń mięśni.
Przeprowadzono barwienie immunofluorescencyjne na CD31, aby zbadać wpływ 4-tygodniowego protokołu NMES na ukrwienie mięśni. W skrócie, przekroje mięśni utrwalono w 4% formalinie i zablokowano przy użyciu 5% surowicy konia (HS). Przekroje inkubowano z pierwszorzędowym przeciwciałem szczurzym przeciwko mysi (rozcieńczenie 1:300 w 5% HS), a następnie poddano działaniu wtórnego przeciwciała koziego przeciwko szczurowi znakowanego barwnikiem 555 (rozcieńczenie 1:300 w 5% HS). W celu ilościowego oznaczenia całkowitej liczby komórek CD31-dodatnich wybrano jeden przekrój i sfotografowano go przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej (Nikon Eclipse E800; Japonia). Całkowitą liczbę naczyń kapilarnych policzono ręcznie za pomocą oprogramowania Northern Eclipse (Empix Imaging Inc.). Odnotowano istotny wzrost liczby komórek CD31-dodatnich u zwierząt poddanych NMES w porównaniu z grupą kontrolną (p<0.01; Rysunek 2), co wskazuje, że opisany protokół NMES promuje angiogenezę w mięśniach szkieletowych.
In situ badanie kurczliwości: Cztery tygodnie po zakończeniu protokołu NMES przeprowadzono badanie kurczliwości mięśni przedziału przedniego przy użyciu aparatury do badań in situ (Model 809B, Aurora Scientific Inc, Canada), stymulatora (Model 701C, Aurora Scientific Inc, Canada) oraz przetwornika siły (Aurora Scientific Inc, Canada). W skrócie, u znieczulonych zwierząt wyizolowano nerw strzałkowy poprzez niewielkie nacięcie boczne w okolicy kolana. Myszy ułożono następnie na plecach na platformie, a badaną stopę umieszczono na płytce stopowej. Kończynę tylną wykorzystywaną do badania stabilizowano taśmą tkaninową w obrębie kolana i stopy. Mięśnie stymulowano za pomocą elektrod hakowych wprowadzonych pod skórę. Kurcz tężcowy mięśnia badano przy częstotliwości 150Hz przez 350ms, aby sprawdzić, czy 4-tygodniowy protokół NMES spowoduje poprawę siły mięśni. Wyniki znormalizowano do masy mokrej mięśnia. Odnotowano około 30% wzrostu kurczu tężcowego u zwierząt poddanych NMES w porównaniu z grupą kontrolną (p=0,005) (Rycina 3), co sugeruje, że opisany protokół poprawia siłę mięśni szkieletowych u zwierząt mdx/SCID.
Rysunek 1. Barwienie hematoksyliną i eozyną mięśni szkieletowych myszy dystroficznych (mdx)/immunodeficientnych (4-5 miesięcy) (powiększenie 10x): A) kontrola nieleczona, B) po 4 tygodniach NMES.
Rycina 2. Immunofluorescencja CD31 (czerwona), jako marker unaczynienia mięśni szkieletowych, w mięśniach szkieletowych myszy dystroficznych (mdx)/ immunodeficyjnych (4-5 miesięcy) (powiększenie 20x) A) nieleczone kontrolne, B) po 4 tygodniach NMES.
Rysunek 3. Testy skurczowe mięśni przedniego przedziała u zwierząt z grupy kontrolnej oraz leczonych NMES przez 4 tygodnie. mNm= mili Newtonometry. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony rysunek.
Dyskusja
Wyniki te sugerują, że opracowany przez nas mysi model NMES promuje angiogenezę w mięśniach szkieletowych (Rysunek 2) oraz ich wzmocnienie (Rysunek 3), ale nie wywołuje uszkodzeń mięśni szkieletowych (Rysunek 1).
Należy zauważyć, że opisane tutaj parametry stymulacji zostały zaprojektowane w celu wywołania przeciążenia mięśni przedziału przedniego. Podobnie jak w scenariuszach klinicznych, rozmieszczenie elektrod można dostosować w celu stymulacji innych grup mięśniowych, choć odpowiedź mięśni na NMES może być różna, w zależności od składu typów włókien. Czas trwania NMES, całkowita liczba sesji terapeutycznych oraz całkowita liczba powtórzeń mogą być modyfikowane zgodnie z planem badania.
Jak w przypadku każdego protokołu, metoda ta posiada pewne ograniczenia, które należy odnotować. W niniejszym badaniu stymulacja była przeprowadzana nad głębokim nerwem strzałkowym. Jednak w praktyce klinicznej stymulację zazwyczaj podaje się bezpośrednio w jednostce motorycznej. W modelu zwierzęcym stymulacja nerwu wymagałaby niższej intensywności w celu wywołania pełnego skurczu mięśnia. Kolejnym ograniczeniem zaprezentowanego modelu jest brak możliwości uzyskania informacji na temat poziomu komfortu podczas stosowania NMES, ze względu na zastosowanie u zwierząt znieczulenia. W związku z tym trudna jest ocena tolerancji porównywalnych intensywności w populacji klinicznej. Niemniej jednak nasze wyniki histologiczne sugerują, że opisany model NMES nie powoduje uszkodzeń mięśni.
Opracowanie modeli zwierzęcych, które naśladują metody powszechnie stosowane w praktyce klinicznej, dostarcza nam użytecznych narzędzi laboratoryjnych umożliwiających lepsze zrozumienie odpowiedzi komórkowych i molekularnych na interwencje terapeutyczne. Ponadto modele te są przydatne w prowadzeniu badań przedklinicznych, służących zarówno doprecyzowaniu istniejących protokołów rehabilitacyjnych, jak i opracowywaniu nowych wskazań.
Oświadczenia
Nie mamy nic do ujawnienia.
Podziękowania
Praca ta była finansowana przez National Institutes of Health (NIH) K12 for Physical and Occupational Therapists-Comprehensive Opportunities in Rehabilitation Research Training (K12 HD055931), Foundation for Physical Therapy oraz Pittsburgh Claude D. Pepper Older Americans Independence Center (P30 AG024827).
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Słupki do owijania przewodów Vector z rozgałęzionym terminalem lutowniczym | Newark Inc | T68 | |
| Płytka drukowana Vector | Newark Inc | 3662-2 | |
| Kabel patchcord Pomona | Newark Inc | P-36-0 | |
| Epoksyd 5-minutowy | VO Baker Co. | 4001 | |
| Żel elektrodowy Spectra 360 | Milliken Medical | MR41217 | |
| Przenośne urządzenie do stymulacji nerwowo-mięśniowej | EMPI | 300pv |
Bibliografia
- Snyder-Mackler, L., Delitto, A., Bailey, S. L., Stralka, S. W. Strength of the quadriceps femoris muscle and functional recovery after reconstruction of the anterior cruciate ligament. A prospective, randomized clinical trial of electrical stimulation. Journal of Bone & Joint Surgery - American. 77, 1166-1173 (1995).
- Gibson, J. N., Smith, K., Rennie, M. J. Prevention of disuse muscle atrophy by means of electrical stimulation: maintenance of protein synthesis. Lancet. 2, 767-770 (1988).
- Malatesta, D., Cattaneo, F., Dugnani, S., Maffiuletti, N. A. Effects of electromyostimulation training and volleyball practice on jumping ability. Journal of Strength & Conditioning Research. 17, 573-579 (2003).
- Maffiuletti, N. A., Dugnani, S., Folz, M., Di Pierno, E., Mauro, F. Effect of combined electrostimulation and plyometric training on vertical jump height. Med. Sci. Sports Exerc. 34, 1638-1644 (2002).
- Pichon, F., Chatard, J. C., Martin, A., Cometti, G. Electrical stimulation and swimming performance. Med. Sci. Sports Exerc. 27, 1671-1676 (1995).
- Gondin, J., Guette, M., Ballay, Y., Martin, A. Electromyostimulation training effects on neural drive and muscle architecture. Med. Sci. Sports Exerc. 37, 1291-1299 (2005).
- Mathieu-Costello, O., Agey, P. J., Wu, L., Hang, J., Adair, T. H. Capillary-to-fiber surface ratio in rat fast-twitch hindlimb muscles after chronic electrical stimulation. Journal of Applied Physiology. 80, 904-909 (1996).
- Ebina, T., Hoshi, N., Kobayashi, M. Physiological angiogenesis in electrically stimulated skeletal muscle in rabbits: characterization of capillary sprouting by ultrastructural 3-D reconstruction study. Pathology International. 52, 702-712 (2002).
- Zhao, M., Huai, B., Wang, E., Forrester, J. V., McCaig, C. D. Electrical stimulation directly induces pre-angiogenic responses in vascular endothelial cells by signaling through VEGF receptors. Journal of Cell Science. 117, 397-405 (2004).
- Nagasaka, M., Kohzuki, M., Fujii, T. Effect of low-voltage electrical stimulation on angiogenic growth factors in ischaemic rat skeletal muscle. Clinical & Experimental Pharmacology & Physiology. 33, 623-627 (2006).
- Brutsaert, T. D., Gavin, T. P., Fu, Z. Regional differences in expression of VEGF mRNA in rat gastrocnemius following 1 hr exercise or electrical stimulation. BMC Physiology. 2, 8(2002).
- Putman, C. T., Dusterhoft, S., Pette, D. Changes in satellite cell content and myosin isoforms in low-frequency-stimulated fast muscle of hypothyroid rat. Journal of Applied Physiology. 86, 40-51 (1999).
- Monaghan, B., Caulfield, B., O'Mathuna, D. P. Surface neuromuscular electrical stimulation for quadriceps strengthening pre and post total knee replacement. Cochrane Database Syst. Rev. CD007177, (2010).
- Jubeau, M., Gondin, J., Martin, A., Sartorio, A., Maffiuletti, N. A. Random motor unit activation by electrostimulation. Int. J. Sports Med. 28, 901-904 (2007).
- Piva, S. R., Goodnite, E. A., Azuma, K. Neuromuscular electrical stimulation and volitional exercise for individuals with rheumatoid arthritis: a multiple-patient case report. Physical Therapy. 87, 1064-1077 (2007).
- Delitto, A., Rose, S. J., McKowen, J. M., Lehman, R. C., Thomas, J. A., Shively, R. A. Electrical stimulation versus voluntary exercise in strengthening thigh musculature after anterior cruciate ligament surgery.[erratum appears in Phys Ther 1988 Jul;68(7):1145]. Physical Therapy. 68, 660-663 (1988).
Przedruki i uprawnienia
