Mysi model treningu mięśniowego za pomocą neuromuskularnej stymulacji elektrycznej

Podsumowanie

Opisano mysi model przezskórnej elektrycznej stymulacji nerwowo-mięśniowej (NMES), bezpiecznej i niedrogiej metody klinicznej, zastosowany do mięśni przedziału przedniego. Model ten ma tę zaletę, że wykorzystuje zmodyfikowane, powszechnie dostępne urządzenie kliniczne w celu wywołania ukierunkowanych i specyficznych skurczów mięśni u myszy.

Streszczenie

Neuromięśniowa stymulacja elektryczna (NMES) jest powszechną metodą kliniczną, szeroko stosowaną w celu przywrócenia¹, utrzymania² lub poprawy^3-5 funkcjonalnej wydolności mięśni. Przezskórna stymulacja powierzchniowa mięśni szkieletowych polega na przepływie prądu między katodą a anodą, co indukuje pobudzenie jednostki motorycznej i otaczających ją włókien mięśniowych.

NMES jest atrakcyjną metodą oceny adaptacyjnych odpowiedzi mięśni szkieletowych z kilku powodów. Po pierwsze, zapewnia ona powtarzalny model eksperymentalny, w którym dobrze udokumentowane są adaptacje fizjologiczne, takie jak przerost włókien mięśniowych i wzmacnianie mięśni⁶, angiogeneza^7-9, wydzielanie czynników wzrostu^9-11 oraz aktywacja komórek prekursorowych mięśni¹². Takie reakcje fizjologiczne mogą być precyzyjnie miareczkowane poprzez zastosowanie różnych parametrów stymulacji (w sprawie przeglądu Cochrane patrz ¹³). Ponadto NMES rekrutuje jednostki motoryczne nieselektywnie, w sposób przestrzennie stały i czasowo synchroniczny¹⁴, co daje korzyść w postaci wywierania efektu terapeutycznego na wszystkie włókna, niezależnie od ich typu. Chociaż w populacjach klinicznych istnieją określone przeciwwskazania do stosowania NMES, np. zaburzenia żylne obwodowe lub nowotwory złośliwe, metoda ta jest bezpieczna i wykonalna nawet w przypadku osób chorych i/lub przykuta do łóżka, a także w grupach, dla których intensywne ćwiczenia mogą być zbyt dużym wyzwaniem.

W niniejszym materiale prezentujemy protokół adaptacji komercyjnie dostępnych elektrod oraz przeprowadzania procedury NMES z wykorzystaniem modelu mysiego. Model ten ma tę zaletę, że pozwala na użycie urządzenia dostępnego w praktyce klinicznej i zapewnia natychmiastową informację zwrotną dotyczącą rozmieszczenia elektrod w celu wywołania pożądanego efektu skurczu mięśnia. Na potrzeby niniejszej publikacji opisujemy protokół stymulacji mięśni przedniego przedziała kończyny tylnej myszy.

Protokół

1. Przygotowanie elektrody

• Wytnij fragment płytki drukowanej typu vector o wymiarach 1 cm x 1 cm.
• Ustabilizuj 2 piny wirewrap za pomocą szczypiec śrubowych, zachowując odstęp między pinami około 3,5 mm. Rozwidlone końce pinów powinny być skierowane do góry.
• Zegnij piny wirewrap pod kątem 90° w połowie ich długości, używając szczypiec półokrągłych.
• Odsłoń miedziane druty złączy, około 7 cm od punktu połączenia wyprowadzeń, usuwając izolację z drutów.
• Przylutuj jeden z miedzianych drutów do rozwidlonego końca jednego z pinów wirewrap. Powtórz czynność lutowania dla drugiego pinu wirewrap.
• Nasuń rurkę termokurczliwą na miejsce lutowania miedzianych drutów i złotych pinów w celu izolacji i stabilizacji. Podgrzej rurkę za pomocą grotu lutownicy.
• Włóż nieprzylutowane końce pinów wirewrap do sąsiednich otworów płytki stykowej.
• Upewnij się, że piny wirewrap są równoległe względem siebie i przebijają płytkę stykową tak, aby ich końcówki znajdowały się w tej samej odległości po przełożeniu przez płytkę.
• Zatop przylutowane końce pinów w przezroczystej żywicy epoksydowej. Pozostaw żywicę do utwardzenia na około 10 minut lub do całkowitego wyschnięcia.
• Powtarzaj nakładanie żywicy, aż piny i płytka drukowana typu vector zostaną całkowicie zatopione, aby zapewnić integralność strukturalną i odciążenie drutów wyprowadzeń.
• Wyszlifuj żywicę za pomocą pilnika do metalu, aby odsłonić końcówki złotych pinów.
• Użyj multimetru, aby upewnić się, że dwa wyprowadzenia nie są zwarte elektrycznie i że druty wyprowadzeń mają prawidłową ciągłość.
• Podłącz wyprowadzenia elektrod z urządzenia NMES do żeńskiego 2-stykowego złącza przewodowego (przewód pomiarowy Pomona).

2. Przygotowanie zwierząt

• Zwierzęta są znieczulane drogą wziewną przy użyciu 2% izofluranu (Abbott Laboratories, North Chicago, IL) w 100% gazie O₂. Zwierzę powinno pozostawać pod narkozą przez całą sesję NMES.
• Przed rozpoczęciem protokołu NMES należy wykonać test ucisku palca u stopy, aby upewnić się, że zwierzę jest w pełni znieczulone.
• Należy regularnie sprawdzać reakcję zwierzęcia na stymulację, aby upewnić się, że poziom znieczulenia jest wystarczający. Znieczulenie należy korygować w razie potrzeby. W celu monitorowania głębokości narkozy należy regularnie oceniać ruchy innych niż stymulowana kończyna, zmiany w głębokości oddechów oraz kolor błon śluzowych.
• Ułożyć zwierzę w pozycji bocznej.
• Nanieść do oczu lubrykant oftalmiczny, aby zapobiec wysychaniu rogówki podczas procedury.
• Ogolić obszar kończyny tylnej, która będzie poddawana zabiegowi, a następnie przetrzeć go alkoholem.
• Przetrzeć elektrodę 3% roztworem wybielacza, a następnie wypłukać wodą.
• Nanieść warstwę żelu przewodzącego w miejscu, w którym zostanie umieszczona elektroda. Ponawiać aplikację w razie potrzeby w trakcie trwania protokołu NMES, aby zapewnić przepływ prądu między elektrodą a skórą.
• W celu utrzymania prawidłowej temperatury wewnętrznej ciała należy stosować lampę grzewczą lub krążący koc wodny.
• Uwaga: Wszystkie procedury zostały przeanalizowane i zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Use Committee Uniwersytetu w Pittsburghu i przeprowadzone w programach oraz placówkach z zapewnieniem PHS i akredytacją AAALAC Int.

3. Stymulacja

• Rozmieszczenie elektrod:
  • W celu stymulacji mięśni przedziału przedniego, w tym mięśnia piszczelowego przedniego oraz mięśnia prostownika długiego palców, należy umieścić elektrodę powierzchniową bezpośrednio nad głębokim nerwem strzałkowym zwierzęcia, który jest gałęzią dystalną wspólnego nerwu strzałkowego i znajduje się tuż przed główką kości strzałkowej.
  • W przypadku stymulacji mięśni przedziału przedniego, prawidłowe rozmieszczenie elektrody potwierdza się, gdy stymulacja wywołuje pełne zgięcie grzbietowe stawu skokowego i pełne wyprostowanie palców. Z kolei zgięcie grzbietowe bez wyprostu palców sugeruje stymulację wyłącznie mięśnia piszczelowego przedniego. Taka ukierunkowana odpowiedź skurczowa może być pożądana, w zależności od projektu badania.
  • Skurcz mięśnia jest podzielony na 2 fazy stymulacji: fazę koncentryczną z wolnym ruchem, która występuje podczas początkowych ~0,5 sekundy. W tej pierwszej fazie łapa porusza się z pozycji spoczynkowej do maksymalnego zgięcia grzbietowego i wyprostu palców. Druga faza stymulacji to skurcz izometryczny utrzymywany w końcowym zakresie zgięcia grzbietowego i wyprostu palców.
• Parametry stymulacji:
  • W tym modelu NMES wykorzystuje się wielofunkcyjne urządzenie do elektroterapii 300 PV Empi, które zapewnia 2 kanały konwencjonalnej NMES (patrz Tabela). Na potrzeby tego modelu użyto tylko 1 kanału.
  • Zastosowane parametry obejmują symetryczny kształt fali, czas trwania impulsu 150 μs oraz częstotliwość 50Hz. Czas stymulacji ustawiono na 5 sekund, z 0,5 sekundy narastania (ramp up) i 0,5 sekundy opadania (ramp down). Pozwoli to mięśniowi na bardziej stopniową aklimatyzację do stymulacji. W obecnym protokole czas przerwy między skurczami ustawiono na 10 sekund, ale można go dostosować w zależności od pożądanego efektu. Skrócenie czasu przerwy spowoduje szybsze wystąpienie zmęczenia mięśni. Parametry stymulacji oparto na protokołach klinicznych opracowanych w celu zwiększenia siły mięśniowej za pomocą elektrycznej stymulacji nerwowo-mięśniowej, bez wywoływania istotnych uszkodzeń mięśni szkieletowych ^{1, 15, 16}.
  • Myszy wykonują dwa serie po 10 skurczów, z 5-minutową przerwą między seriami.
  • Dla zwierząt dorosłych intensywność NMES zazwyczaj rozpoczyna się od 9 mA. Z naszego doświadczenia wynika, że jest to w przybliżeniu maksymalna intensywność początkowa, która nie wywołuje zauważalnych zaburzeń chodu bezpośrednio po stymulacji. Podczas kolejnych sesji NMES intensywność jest zwiększana o 1 mA za każdym razem, gdy zwierzęta są w stanie wykonać 20 pełnych zgięć grzbietowych.
• Po zakończeniu protokołu stymulacji i wybudzeniu z narkozy zwierzęta zazwyczaj wykazują prawidłowy chód i postawę. Chód powinien pozostać niezakłócony przez cały czas trwania programu NMES.

4. Reprezentatywne wyniki

Protokół NMES opisany w niniejszym artykule został wdrożony u kilku szczepów myszy, w tym: typu dzikiego (B6/10), B6.SCID oraz myszy mdx/SCID. Przedstawiono reprezentatywne wyniki NMES przeprowadzonych przez 4 tygodnie (20 sesji) u myszy mdx/SCID w wieku 3-5 miesięcy.

Zwierzęta zostały humanitarnie uśmiercone poprzez zwichnięcie stawu kręgowego w znieczuleniu. Mięsień piszczelowy przedni został pobrany, natychmiast zamrożony w 2-metylobutanie schłodzonym w ciekłym azocie, a następnie przechowywany w temperaturze -80 °C. Wykonano seryjne przekroje poprzeczne (10 μm), które osadzono na szkiełkach przedmiotowych. Analizy statystyczne przeprowadzono przy użyciu standardowych pakietów oprogramowania statystycznego (oprogramowanie SPSS, v19.0). W pierwszej kolejności wykorzystano test Levene'a w celu oceny równości wariancji. Następnie przeprowadzono test t dla prób niezależnych, aby zbadać różnice między grupą NMES a grupą kontrolną.

Wykonano barwienie hematoksyliną i eozyną (H&E), aby zbadać, czy protokół NMES spowoduje zwiększenie uszkodzeń w mięśniu dystroficznym. Wybrano jeden przekrój i wykonano zdjęcia przy użyciu mikroskopu świetlnego (Nikon Eclipse E800; Nikon, Japonia). Całkowitą liczbę włókien oraz liczbę włókien z jądrami położonymi centralnie policzono ręcznie przy użyciu oprogramowania do analizy obrazu Image J, opracowanego przez National Institutes of Health (NIH). Nie odnotowano istotnego wzrostu indeksu regeneracji (liczba włókien z centralnie położonym jądrem/całkowita liczba włókien) u zwierząt poddanych NMES w porównaniu z grupą kontrolną (p=0.802; Rycina 1). Sugeruje to, że zastosowanie NMES nie nasila kaskady degeneracji i regeneracji obserwowanej u zwierząt z dystrofią, a zatem prawdopodobnie nie indukuje zwiększonych uszkodzeń mięśni.

W celu zbadania wpływu 4-tygodniowego protokołu NMES na unaczynienie mięśni wykonano barwienie immunofluorescencyjne dla CD31. W skrócie, przekroje mięśni utrwalono w 4% formalinie i zablokowano za pomocą 5% surowicy konia (HS). Przekroje inkubowano z przeciwciałem pierwszorzędowym szczura przeciwko myszy (rozcieńczenie 1:300 w 5% HS), a następnie potraktowano przeciwciałem wtórnym kozy przeciwko szczurowi znakowanym barwnikiem 555 (rozcieńczenie 1:300 w 5% HS). Aby określić całkowitą liczbę komórek CD31-dodatnich, wybrano jeden przekrój i wykonano jego zdjęcie za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego (Nikon Eclipse E800; Japonia). Całkowitą liczbę naczyń włosowatych policzono ręcznie przy użyciu oprogramowania Northern Eclipse (Empix Imaging Inc.). Odnotowano istotny wzrost liczby komórek CD31-dodatnich u zwierząt poddanych NMES w porównaniu z grupą kontrolną (p<0.01; Rycina 2), co wskazuje, że opisany protokół NMES promuje angiogenezę w mięśniach szkieletowych.

In situ badanie kurczliwości: Cztery tygodnie po zakończeniu protokołu NMES przeprowadzono badanie kurczliwości mięśni przedziału przedniego przy użyciu aparatu do badań in situ (Model 809B, Aurora Scientific Inc, Kanada), stymulatora (Model 701C, Aurora Scientific Inc, Kanada) oraz przetwornika siły (Aurora Scientific Inc, Kanada). W skrócie, nerw strzałkowy znieczulonych zwierząt wyizolowano poprzez niewielkie nacięcie boczne w obrębie kolana. Następnie myszy ułożono na plecach na platformie, a badaną stopę umieszczono na płytce stopowej. Kończynę tylną wykorzystywaną do badania ustabilizowano taśmą materiałową na wysokości kolana i stopy. Mięśnie stymulowano za pomocą elektrod hakowych wprowadzonych pod skórę. Skurcz tężcowy mięśni badano przy częstotliwości 150Hz przez 350ms, aby sprawdzić, czy 4-tygodniowy protokół NMES spowoduje poprawę siły mięśniowej. Wyniki znormalizowano względem masy mokrej mięśnia. Odnotowano około 30% wzrost skurczu tężcowego u zwierząt poddanych NMES w porównaniu z grupą kontrolną (p=0,005) (Rycina 3), co sugeruje, że opisany protokół poprawia siłę mięśni szkieletowych u zwierząt mdx/SCID.

Rysunek 1. Barwienie hematoksyliną i eozyną mięśni szkieletowych myszy dystroficznych (mdx)/immunodeficyjnych (4-5 miesięcy) (powiększenie 10x): A) kontrola nieleczona, B) po 4 tygodniach NMES.

Rycina 2. Immunofluorescencja CD31 (czerwony), jako marker unaczynienia mięśni szkieletowych, w mięśniach szkieletowych myszy dystroficznych (mdx)/immunodeficyjnych (4-5 miesięcy) (powiększenie 20x) A) kontrola nieleczona, B) po 4 tygodniach NMES.

Rycina 3. Badanie kurczliwości mięśni przedniego przedziała w grupie kontrolnej oraz u zwierząt leczonych za pomocą NMES przez 4 tygodnie. mNm = mili niutono-metry. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą rycinię.

Dyskusja

Wyniki te sugerują, że opracowany przez nas mysi model NMES promuje angiogenezę w mięśniach szkieletowych (Rysunek 2) oraz ich wzmocnienie (Rysunek 3), ale nie wywołuje uszkodzeń mięśni szkieletowych (Rysunek 1).

Należy zauważyć, że opisane tutaj parametry stymulacji zostały zaprojektowane w celu wywołania przeciążenia mięśni przedziału przedniego. Podobnie jak w scenariuszach klinicznych, rozmieszczenie elektrod można dostosować w celu stymulacji innych grup mięśniowych, choć odpowiedź mięśni na NMES może być różna, w zależności od składu typów włókien. Czas trwania NMES, całkowita liczba sesji terapeutycznych oraz całkowita liczba powtórzeń mogą być modyfikowane zgodnie z planem badania.

Jak w przypadku każdego protokołu, metoda ta posiada pewne ograniczenia, które należy odnotować. W niniejszym badaniu stymulacja była przeprowadzana nad głębokim nerwem strzałkowym. Jednak w praktyce klinicznej stymulację zazwyczaj podaje się bezpośrednio w jednostce motorycznej. W modelu zwierzęcym stymulacja nerwu wymagałaby niższej intensywności w celu wywołania pełnego skurczu mięśnia. Kolejnym ograniczeniem zaprezentowanego modelu jest brak możliwości uzyskania informacji na temat poziomu komfortu podczas stosowania NMES, ze względu na zastosowanie u zwierząt znieczulenia. W związku z tym trudna jest ocena tolerancji porównywalnych intensywności w populacji klinicznej. Niemniej jednak nasze wyniki histologiczne sugerują, że opisany model NMES nie powoduje uszkodzeń mięśni.

Opracowanie modeli zwierzęcych, które naśladują metody powszechnie stosowane w praktyce klinicznej, dostarcza nam użytecznych narzędzi laboratoryjnych umożliwiających lepsze zrozumienie odpowiedzi komórkowych i molekularnych na interwencje terapeutyczne. Ponadto modele te są przydatne w prowadzeniu badań przedklinicznych, służących zarówno doprecyzowaniu istniejących protokołów rehabilitacyjnych, jak i opracowywaniu nowych wskazań.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Słupki do owijania przewodów Vector z rozgałęzionym terminalem lutowniczym	Newark Inc	T68
Płytka drukowana Vector	Newark Inc	3662-2
Kabel patchcord Pomona	Newark Inc	P-36-0
Epoksyd 5-minutowy	VO Baker Co.	4001
Żel elektrodowy Spectra 360	Milliken Medical	MR41217
Przenośne urządzenie do stymulacji nerwowo-mięśniowej	EMPI	300pv