Oczyszczanie i wizualizacja lipopolisacharydu z bakterii Gram-ujemnych za pomocą ekstrakcji gorącą mieszaniną wodno-fenolową

Podsumowanie

Opisujemy zmodyfikowaną metodę ekstrakcji gorącym wodnym fenolem w celu oczyszczania lipopolisacharydu (LPS) z bakterii Gram-ujemnych. Po ekstrakcji LPS można następnie poddać analizie za pomocą SDS-PAGE i zwizualizować poprzez bezpośrednie barwienie lub Western immunoblot.

Streszczenie

Lipopolisacharyd (LPS) jest głównym składnikiem błon zewnętrznych bakterii Gram-ujemnych. Jest to cząsteczka trójdzielna, składająca się z lipidu A, który jest osadzony w błonie zewnętrznej, rdzeniowego oligosacharydu oraz powtarzających się jednostek antygenu O, które wystają na zewnątrz z powierzchni komórki.^{1, 2}LPS jest cząsteczką immunodominującą, która odgrywa istotną rolę w wirulencji i patogenezie wielu gatunków bakterii, w tym *Pseudomonas aeruginosa*, *Salmonella* gatunki, i Escherichia coli^3-5, a różnice w składzie antygenu O LPS stanowią podstawę serotypowania szczepów. LPS bierze udział w przyleganiu do komórek gospodarza w początkowej fazie infekcji oraz zapewnia ochronę przed zabijaniem zależnym od dopełniacza; szczepy pozbawione LPS mogą wykazywać osłabioną wirulencję.^6-8Z tych powodów istotna jest wizualizacja LPS, w szczególności pochodzącego z izolatów klinicznych. Wizualizacja wzorów prążkowania LPS oraz rozpoznawanie ich przez specyficzne przeciwciała mogą być użytecznymi narzędziami w identyfikacji linii szczepów oraz charakteryzacji różnych mutantów.

W niniejszym raporcie opisujemy metodę wykorzystującą gorący fenol wodny do izolacji i oczyszczania LPS z komórek bakterii Gram-ujemnych. Protokół ten umożliwia ekstrakcję LPS z oddzieleniem kwasów nukleinowych i białek, które mogą utrudniać wizualizację LPS w przypadku stosowania krótszych i mniej intensywnych metod ekstrakcji⁹. LPS przygotowany w ten sposób można rozdzielić za pomocą elektroforezy w żelu poliakryloamidowym z dodecylosiarczanem sodu (SDS-PAGE) i barwić bezpośrednio przy użyciu barwników do węglowodanów/glikoprotein lub standardowych metod barwienia srebrem. Wiele antyser l LPS zawiera przeciwciała, które wykazują reakcję krzyżową z białkami błony zewnętrznej lub innymi antygenowymi celami, co może utrudniać analizę reaktywności obserwowaną po Western blottingu surowych lizatów komórkowych rozdzielonych metodą SDS-PAGE. Sama obróbka surowych lizatów komórkowych proteazami nie zawsze jest skutecznym sposobem usunięcia tego tła przy zastosowaniu tej lub innych metod wizualizacji. Co więcej, intensywna obróbka proteazami w celu usunięcia tego tła może prowadzić do uzyskania LPS słabej jakości, który nie jest dobrze rozdzielany żadną z wyżej wymienionych metod. Z tych względów uważamy, że poniższy protokół, zaadaptowany od Westpahl i Jann¹⁰, jest optymalny dla ekstrakcji LPS.

Protokół

1. Przygotowanie bakterii do ekstrakcji LPS

1. Przygotować kulturę nocną w 5 mL pożywki Luria Broth (LB), uzupełnionej o antybiotyki, jeśli jest to konieczne. Hodować kulturę przez noc (12-18 godzin) w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 37 °C i przy 200 rpm.
2. Rozcieńczyć kulturę w pożywce LB w stosunku 1:10 i zmierzyć wartość OD₆₀₀ za pomocą spektrofotometru. Na podstawie odczytu OD₆₀₀ przygotować 1,5 mL zawiesiny bakterii o wartości OD₆₀₀ wynoszącej 0,5.
3. Odwirować bakterie w mikrowirówce przy 10 600x g przez 10 minut. Usunąć i odrzucić nadsącz. Osad można przechowywać w temperaturze -20 °C, jeśli ekstrakcja LPS nie będzie przeprowadzona natychmiast.

2. Ekstrakcja LPS

1. W pierwszej kolejności należy przygotować 2x bufor SDS. Przygotować 50 mL roztworu zawierającego 4% β-merkaptoetanolu (BME), 4% SDS i 20% glicerolu w 0,1 M Tris-HCl, pH 6.8. Dodać szczyptę błękitu bromofenolowego w celu zabarwienia roztworu. Przygotować zapas 1x buforu SDS poprzez rozcieńczenie zapasu 2x w stosunku 1:1 w sterylnej wodzie destylowanej H₂O. Roztwór ten można przechowywać w temperaturze pokojowej.
2. Przygotować trzy oddzielne roztwory DNazy I, RNazy oraz proteinazy K o stężeniu 10 mg/mL w sterylnej wodzie destylowanej H₂O.
3. Resuspender osad bakterii z kroku 1.3 w 200 μl 1x buforu SDS. Aby upewnić się, że osad został całkowicie resuspenderowany, powolnie pipetować roztwór w górę i w dół. Nie mieszać w wirówce typu vortex.
4. Gotować zawiesinę bakterii w łaźni wodnej przez 15 minut. Pozostawić roztwór do ochłodzenia w temperaturze pokojowej przez 15 minut.
5. Dodać po 5 μl roztworów DNazy I i RNazy przygotowanych w kroku 2.2. Inkubować próbki w temperaturze 37 °C przez 30 minut. *Krok ten jest opcjonalny; różnica w jakości LPS między próbkami traktowanymi nukleazami a nietraktowanymi jest minimalna.
6. Dodać 10 μl roztworu proteinazy K przygotowanego w kroku 2.2. Inkubować próbki w temperaturze 59 °C przez 3 godziny. W przypadku ograniczeń czasowych krok ten można przeprowadzić przez noc.
7. Do każdej próbki dodać 200 μl lodowatego fenolu nasyconego Tris (jeśli fenol nasycony Tris nie jest dostępny, można zastosować fenol nasycony wodą). Upewnić się, że zakrętki probówek są szczelnie zamknięte, a następnie mieszać każdą próbkę w wirówce typu vortex przez około 5 do 10 sekund.
8. Inkubować próbki w temperaturze 65 °C przez 15 minut, okazjonalnie mieszając w wirówce typu vortex. Po inkubacji ochłodzić do temperatury pokojowej, a następnie dodać 1 mL eteru dietylowego w temperaturze pokojowej do każdej próbki i mieszać w wirówce typu vortex przez 5 do 10 sekund. Eter należy obsługiwać w dygestorium, ponieważ jest on lotny.
9. Wirować próbki z prędkością 20 600x g przez 10 minut. Ostrożnie wyjąć próbki z wirówki i pobrać dolną niebieską warstwę. Należy unikać kontaktu z górną, przezroczystą warstwą. Pozostawienie niewielkiej ilości niebieskiej warstwy jest lepsze niż zanieczyszczenie jej warstwą górną.
10. Przeprowadzić ponowną ekstrakcję próbek, powtarzając kroki 2.7 – 2.9. Zazwyczaj wystarczające są dwie ekstrakcje. Jeśli próbki wydają się mętne, można przeprowadzić więcej ekstrakcji. Przed rozdzieleniem metodą SDS-PAGE dodać 200 μl 2x buforu SDS do każdej z ekstrahowanych próbek. Próbki można nanosić na 8%–15% żele poliakryloamidowe SDS. Do wizualizacji zazwyczaj wystarcza od pięciu do piętnastu μl LPS przygotowanego tą metodą.

3. Reprezentatywne wyniki

Próbki LPS przygotowane w powyższy sposób można wizualizować poprzez bezpośrednie barwienie po rozdziale w metodzie SDS-PAGE, stosując standardowy protokół barwienia srebrem lub komercyjnie dostępny zestaw do barwienia LPS. Alternatywnie, LPS rozdzielony na żelu poliakrylamidowym można przenieść na membranę nitrocelulozową i poddać analizie Western blot przy użyciu swoistych dla LPS antyser. W tym protokole zastosowano zestaw Pro-Q Emerald 300 Lipopolysaccharide Gel Stain Kit (Molecular Probes) zgodnie z instrukcjami producenta.

Na Rysunku 1 przedstawiono żel SDS-poliakryloamidowy o stężeniu 12% barwiony Pro-Q Emerald 300. Każda ścieżka zawiera 15 μl LPS przygotowanego z różnych szczepów Burkholderia dolosa wyizolowanych z próbek plwociny pacjentów z mukowiscydozą. Przy użyciu tej metody widoczne są różne wzory drabin prążków LPS, odzwierciedlające różną liczbę jednostek powtarzalnych antygenu O przyłączonych do oligosacharydu rdzenia; na przykład próbki w ścieżkach 1 i 6 mają podobne do siebie wzory prążkowania (obramowane na czerwono).

Rycina 1. LPS z izolatów klinicznych Burkholderia dolosa barwione barwnikiem Pro-Q Emerald 300. LPS z siedmiu szczepów B. dolosa pochodzących z ogniska choroby u pacjentów z mukowiscydozą wyizolowano zgodnie z opisem w niniejszym protokole. Ilość 15 μl rozdzielono na 12% żelu SDS-poliakryloamidowym, a następnie zabarwiono barwnikiem Pro-Q Emerald 300 zgodnie z instrukcją producenta. Rdzeń LPS jest zaznaczony strzałką, a LPS wykazujące podobne wzory prążkowania powtórzeń antygenu O zostały obramowane na czerwono. M = marker masy cząsteczkowej.

Dyskusja

Opisaliśmy metodę oczyszczania LPS od innych składników komórkowych, w tym kwasów nukleinowych i białek. Metoda ta pozwala uzyskać wysokiej jakości LPS, który może być wykorzystany w wielu różnych metodach wizualizacji, w tym w barwieniu węglowodanów w żelach SDS-PAGE, jak pokazano na Rysunku 1. Metoda ta może być stosowana do serotypowania LPS z różnych szczepów przy użyciu specyficznych antyserów lub do wykazania pokrewieństwa między izolatami poprzez bezpośrednią wizualizację. Na przykład niedawny projekt sekwencjonow...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Rekombinowana DNaza I, wolna od RNaz	Roche Group	04716728001
RNaza A	Roche Group	10109169001
Proteinaza K	Fisher Scientific	BP1700
Fenol nasycony Trisem	Fisher Scientific	BP1750-100
Eter dietylowy	Thomas Scientific	C313K31
Zestaw do barwienia żeli lipopolisacharydowych Pro-Q Emerald 300	Molecular Probes, Life Technologies	P20495