Oczyszczanie i wizualizacja lipopolisacharydu z bakterii Gram-ujemnych za pomocą ekstrakcji gorącym roztworem wodnego fenolu

Summary

Opisujemy zmodyfikowaną metodę ekstrakcji gorącym wodnym fenolem do oczyszczania lipopolisacharydu (LPS) z bakterii Gram-ujemnych. Po ekstrakcji LPS może być następnie analizowany przez SDS-PAGE i wizualizowany za pomocą bezpośredniego barwienia lub Western immunoblot.

Abstract

Lipopolisacharyd (LPS) jest głównym składnikiem zewnętrznych błon bakterii Gram-ujemnych. Jest to trójdzielna cząsteczka składająca się z lipidu A, który jest osadzony w błonie zewnętrznej, oligosacharydu rdzenia i powtarzających się jednostek antygenu O, które rozciągają się na zewnątrz od powierzchni komórki^{1, 2}. LPS jest cząsteczką immunodominującą, która jest ważna dla zjadliwości i patogenezy wielu gatunków bakterii, w tym Pseudomonas aeruginosa, Salmonella i Escherichia coli^3-5, a różnice w składzie antygenu O LPS stanowią podstawę serotypowania szczepów. LPS bierze udział w przyłączaniu się do komórek gospodarza na początku infekcji i zapewnia ochronę przed zabijaniem za pośrednictwem dopełniacza; szczepy, które nie mają LPS, mogą być atenuowane do zjadliwości^6-8. Z tych powodów ważne jest, aby uwidocznić LPS, szczególnie z izolatów klinicznych. Wizualizacja wzorców prążków LPS i rozpoznawanie przez określone przeciwciała może być przydatnym narzędziem do identyfikacji linii szczepów i charakteryzowania różnych mutantów.

W tym raporcie opisujemy gorącą, wodną metodę fenolową do izolacji i oczyszczania LPS z komórek bakterii Gram-ujemnych. Protokół ten pozwala na ekstrakcję LPS z dala od kwasów nukleinowych i białek, które mogą zakłócać wizualizację LPS, która występuje przy krótszych, mniej intensywnych metodach ekstrakcji⁹. Tak przygotowany LPS można oddzielić za pomocą elektroforezy w żelu dodecylosiarczanowym (SDS) i poliakryloamidu (PAGE) i bezpośrednio wybarwić za pomocą barwienia węglowodanami/glikoproteinami lub standardowymi metodami barwienia srebrem. Wiele surowic odpornościowych przeciwko LPS zawiera przeciwciała, które reagują krzyżowo z białkami błony zewnętrznej lub innymi celami antygenowymi, które mogą utrudniać reaktywność obserwowaną po zachodnim immunoblocie surowych lizatów komórkowych oddzielonych SDS-PAGE. Samo traktowanie proteazą surowych lizatów komórkowych nie zawsze jest skutecznym sposobem usunięcia tego tła przy użyciu tej lub innych metod wizualizacji. Co więcej, intensywne leczenie proteazą w celu usunięcia tego tła może prowadzić do złej jakości LPS, który nie jest dobrze rozwiązany żadną z wyżej wymienionych metod. Z tych powodów uważamy, że poniższy protokół, zaadaptowany z Westpahl i Jann¹⁰, jest idealny do ekstrakcji LPS.

Protocol

1. Przygotowanie bakterii do ekstrakcji LPS

1. Rozpocznij posiew przez noc w 5 ml bulionu Luria (LB), uzupełnionego antybiotykami, jeśli to konieczne. Hodować kulturę przez noc (12-18 godzin) w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 37 °C i 200 obr./min.
2. Rozcieńczyć kulturę w stosunku 1:10 LB i dokonać odczytu OD₆₀₀ w spektrofotometrze. Na podstawie odczytu OD₆₀₀ przygotuj zawiesinę 1.5 ml bakterii do OD₆₀₀ 0.5.
3. Granuluj bakterie w mikrowirówce o wielkości 10 600 g przez 10 minut. Usunąć i wyrzucić sklarowany osad. Osad może być przechowywany w temperaturze -20 °C, jeśli LPS nie zostanie natychmiast wydobyty.

2. Ekstrakcja LPS

1. Najpierw przygotuj 2x bufor SDS. Przygotować 50 ml roztworu 4% β-merkaptoetanolu (BME), 4% SDS i 20% glicerolu w 0,1 M Tris-HCl, pH 6,8. Dodaj szczyptę błękitu bromofenolowego, aby zabarwić roztwór. Zrobić 1x bulion buforowy SDS, rozcieńczając 2X bulion 1:1 w sterylnym destylowanym_H2O. Można go przechowywać w temperaturze pokojowej.
2. Przygotować trzy oddzielne roztwory o stężeniu 10 mg/ml DNazy I, RNazy i proteinazy K w sterylnym destylowanym_H2O.
3. Zawiesić granulowane bakterie z kroku 1.3 w 200 μl 1x buforu SDS. Upewnij się, że osad został całkowicie ponownie zawieszony, powoli pipetując roztwór w górę iw dół. Nie wirować.
4. Gotuj zawieszone bakterie w łaźni wodnej przez 15 minut. Pozostaw roztwór do ostygnięcia w temperaturze pokojowej przez 15 minut.
5. Dodać 5 μl roztworów DNazy I i RNazy przygotowanych w 2.2. Próbki należy inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut. *Ten krok jest opcjonalny; różnica w jakości LPS między próbkami poddanymi działaniu nukleazy i niepoddanych działaniu nukleazy jest minimalna.
6. Dodać 10 μl roztworu proteinazy K przygotowanego w 2.2. Próbki inkubować w temperaturze 59 °C przez 3 godziny. Ten krok można wykonać w nocy, jeśli istnieją ograniczenia czasowe.
7. Do każdej próbki dodać 200 μl lodowatego fenolu nasyconego trisem (fenol nasycony wodą może być stosowany jako substytut, jeśli fenol nasycony trisem nie jest dostępny). Upewnij się, że nakrętki na probówkach są szczelnie zamknięte i wiruj każdą próbkę przez około 5 do 10 sekund.
8. Próbki inkubować w temperaturze 65 °C przez 15 minut, od czasu do czasu wirując. Po schłodzeniu do temperatury pokojowej dodać 1 ml eteru dietylowego o temperaturze pokojowej do każdej próbki i wirować przez 5 do 10 sekund. Pamiętaj, aby wykonać uchwyt eteru w dygestorium, ponieważ jest on lotny.
9. Odwirować próbki o masie 20 600 g przez 10 minut. Ostrożnie wyjmij próbki z wirówki i wyekstrahuj dolną niebieską warstwę. Pamiętaj, aby unikać górnej, przezroczystej warstwy. Pozostawienie niewielkiej ilości niebieskiej warstwy jest lepsze niż zanieczyszczenie górną warstwą.
10. Ponownie wyekstrahować próbki, powtarzając kroki 2.7 - 2.9. Zwykle wystarczą dwie ekstrakcje. Jeśli próbki wydają się mętne, można przeprowadzić więcej ekstrakcji. Dodać 200 μl 2x buforu SDS do każdej z wyekstrahowanych próbek przed rozdzieleniem za pomocą SDS-PAGE. Próbki można badać na żelach poliakrylamidowych SDS o stężeniu 8%-15%. Do wizualizacji zwykle wystarcza od pięciu do piętnastu μl LPS przygotowanych tą metodą.

3. Reprezentatywne wyniki

Próbki LPS przygotowane jak powyżej mogą być wizualizowane przez bezpośrednie barwienie po rozdzieleniu na SDS-PAGE przy użyciu standardowego protokołu barwienia srebrem lub dostępnego na rynku zestawu do barwienia LPS. Alternatywnie, LPS oddzielony na żelu poliakryloamidowym może zostać przeniesiony do membrany nitrocelulozowej i poddany zachodniemu immunoblottingowi przy użyciu surowic anty-swoistych dla LPS. Do tego protokołu użyliśmy zestawu do barwienia żelem lipopolisacharydowym Pro-Q Emerald 300 (sondy molekularne) i postępowaliśmy zgodnie z instrukcjami producenta.

Pokazane na rysunku 1 to Pro-Q Emerald 300 barwiony 12% żel poliakryloamidowy SDS. Każdy tor zawiera 15 μl LPS przygotowanego z różnych szczepów Burkholderia dolosa wyizolowanych z próbek plwociny pacjentów z mukowiscydozą. Przy użyciu tej metody widoczne są różne wzory drabinek pasmowych LPS, odzwierciedlające różną liczbę powtarzających się jednostek antygenu O przyłączonych do oligosacharydu rdzeniowego; Na przykład próbki na torze 1 i 6 mają podobne wzory pasm do siebie (oznaczone na czerwono).

Rysunek 1. Pro-Q Emerald 300 barwiony LPS z izolatów klinicznych Burkholderia dolosa. LPS z siedmiu szczepów B. dolosa z ogniska u pacjentów z mukowiscydozą wyizolowano zgodnie z opisem w niniejszym protokole. Piętnaście μl oddzielono na 12% żelu poliakryloamidowym SDS i wybarwiono Pro-Q Emerald 300, zgodnie z instrukcjami producenta. Rdzeń LPS jest oznaczony strzałką, a LPS pokazujący podobne wzorce pasm powtórzeń antygenu O są oznaczone na czerwono. M = marker masy cząsteczkowej.

Discussion

Opisaliśmy metodę oczyszczania LPS z innych składników komórkowych, w tym kwasów nukleinowych i białek. Metoda ta zapewnia wysokiej jakości LPS, który może być stosowany w wielu różnych metodach wizualizacji, w tym w barwieniu węglowodanowym żeli SDS-PAGE, jak pokazano na rysunku 1. Metoda ta może być stosowana do serotypowania LPS z różnych szczepów, przy użyciu specyficznych surowic odpornościowych, lub do wykazania pokrewieństwa między izolatami poprzez bezpośrednią wizualizację. Na przykład niedawny projekt sekwencj...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
DNaza I rekombinowana, wolna od RNaz	grupa Roche	04716728001
	A grupa Roche	10109169001
Proteinaza K	Fisher Scientific	BP1700
Trójnasycony fenol	Fisher Scientific	BP1750-100
Eter dietylowy	Thomas Scientific	C313K31
Pro-Q Emerald 300 Zestaw barwników żelowych lipopolisacharydowych	Sondy molekularne, Life Technologies	P20495