Identyfikacja i izolacja wolno dzielących się komórek w ludzkim glejaku wielopostaciowym z wykorzystaniem karboksyfluoresceiny w postaci estru sukcynimidylowego (CFSE)

Podsumowanie

Niniejszy protokół wideo demonstruje zastosowanie barwnika fluorescencyjnego estru succinimidylowego karboksyfluoresceiny (CFSE) do identyfikacji i separacji różnych subpopulacji komórek w ludzkim glejaku wielopostaciowym na podstawie częstotliwości podziałów komórkowych.

Streszczenie

Heterogeniczność nowotworu stanowi fundamentalną cechę wspierającą jego odporność i stanowi główną przeszkodę w opracowywaniu strategii terapeutycznych¹. Aby rozwiązać problem heterogeniczności nowotworów, niezbędne jest opracowanie testów i narzędzi umożliwiających fenotypową, (epi)genetyczną i funkcjonalną identyfikację oraz charakterystykę subpopulacji nowotworowych, które napędzają specyficzne patologie choroby i stanowią istotne klinicznie cele. Obecnie wiadomo, że nowotwory wykazują wyraźne subfrakcje komórek o różnej częstotliwości podziałów, a funkcjonalne kryterium powolnego cyklu komórkowego jest dodatnio skorelowane ze zdolnością do tworzenia nowotworów w kilku typach raka, w tym w nowotworach mózgu, piersi, skóry i trzustki, a także w białaczkach^2-8. Fluorescencyjny barwnik ester karboksyfluoresceiny suksynimidylowy (CFSE) jest wykorzystywany do śledzenia częstotliwości podziałów komórek in vitro oraz in vivo w nowotworach krwi oraz nowotworach litych, takich jak glejak wielopostaciowy^2,7,8. Przenikający przez błony komórkowe, niefluorescencyjny prolek CFSE jest przekształcany przez wewnątrzkomórkowe esterazy w związek fluorescencyjny, który pozostaje w komórkach, wiążąc się kowalencyjnie z białkami poprzez reakcję grupy suksynimidylowej z wewnątrzkomórkowymi grupami aminowymi, tworząc trwałe wiązania amidowe⁹. Barwnik fluorescencyjny jest równomiernie rozdzielany między komórki potomne podczas podziałów, co prowadzi do zmniejszenia intensywności fluorescencji o połowę przy każdym podziale komórki. Umożliwia to śledzenie częstotliwości cyklu komórkowego do ośmiu-dziesięciu rund podziałów¹⁰. Zdolność do retencji CFSE została wykorzystana w komórkach nowotworu mózgu do identyfikacji i izolacji powoli dzielącej się subpopulacji (górne 5% komórek zatrzymujących barwnik), w której wykazano wzbogacenie w aktywność komórek macierzystych nowotworu².

Niniejszy protokół opisuje technikę barwienia komórek barwnikiem CFSE oraz izolację poszczególnych populacji o różnym tempie podziałów w hodowli komórek pochodzących z glejaka wielopostaciowego (GBM) u ludzi z wykorzystaniem cytometrii przepływowej². Technika ta posłużyła do identyfikacji i izolacji wolno dzielącej się populacji komórek guza mózgu dzięki ich zdolności do utrzymywania znakowania CFSE.

Protokół

1. Przygotowanie zawiesiny pojedynczych komórek glejaka wielopostaciowego

1. Kulturę gliomasfery tworzy się i utrzymuje przy użyciu testu neurosfer (NSA), zgodnie z wcześniejszymi opisami^2,11,12.
2. W odpowiednim czasie do pasażowania gliomasfer, medium zawierające sfery usuwa się, przenosi do sterylnej probówki do hodowli tkanek o odpowiedniej pojemności i wiruje przy 800 rpm (110 g) przez 5 min w temperaturze pokojowej.
3. Nadosad usuwa się, a pellet sfer resuspendsuje w 1 ml 0,05% trypsyny-EDTA i inkubuje w kąpieli wodnej w temperaturze 37 °C przez 3-5 min.
4. Następnie stosuje się taką samą objętość inhibitora trypsyny sojowej, aby zatrzymać aktywność trypsyny.
5. Zawiesinę komórkową delikatnie pipetuje się w górę i w dół, aby zapewnić homogeniczność oraz całkowitą neutralizację aktywności trypsyny.
6. Zawiesinę komórkową ponownie wiruje się przy 800 rpm przez 5 min. Nadosad usuwa się, a komórki resuspendsuje w 1 ml NeuroCult NSC Basal Medium.
7. W celu przeprowadzenia odliczania komórek, 10 μl zawiesiny pojedynczych komórek miesza się z 90 μl błękitu trypanu.

2. Barwienie zielonym barwnikiem fluorescencyjnym Cell Trace Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester (CFSE)

1. Na każdy milion komórek przeznaczonych do barwienia przygotowuje się 1 ml odczynnika barwiącego, dodając 1 μl barwnika Cell Trace CFSE 5 mM (Molecular Probes, Invitrogen) do 1 ml pożywki NeuroCult NSC Basal Medium, aby uzyskać końcowe stężenie barwnika 5 μM.
2. Odczynnik barwiący zawierający komórki miesza się dokładnie do uzyskania homogeniczności i inkubuje w temperaturze pokojowej przez 10 min.
3. Podczas inkubacji przygotowuje się lodowatą pożywkę NeuroCult NSC Basal Medium, która posłuży jako roztwór przerywający reakcję.
4. Aby zatrzymać proces barwienia, do komórek obciążonych CFSE dodaje się około 5-10 objętości lodowatego roztworu przerywającego.
5. Następnie roztwór wirowano z prędkością 800 rpm przez 5 min i odrzuca się nadsącz.
6. Na tym etapie na dnie probówki powinien pojawić się osad komórek o jasnozielonej barwie, co wskazuje na pomyślne przeprowadzenie barwienia.
7. Komórki przemywa się, resuspendując osad w 1-2 ml świeżej pożywki NeuroCult NSC Basal Medium, wirowując z prędkością 800 rpm przez 5 min i odrzucając nadsącz. Procedurę tę powtarza się łącznie trzy razy.
8. Po trzecim przemyciu komórki resuspenduje się w 1 ml pożywki NeuroCult NSC Basal Medium i wykonuje zliczenie komórek.
9. Komórki zabarwione CFSE wysiewa się następnie do sterylnych kolb hodowlanych z odpowiednią gęstością [50 000 komórek/ml] i umieszcza w inkubatorze z nawilżaniem w temperaturze 37 °C i 5% CO2.

3. Weryfikacja ładowania CFSE

1. Komórki wysiane w kulturze NSA można monitorować pod mikroskopem fluorescencyjnym, aby zweryfikować barwienie CFSE. Na tym etapie wszystkie komórki wykazują intensywny zielony kolor (Rycina 1). Alternatywnie, kroplę zawiesiny komórek zabarwionych CFSE można umieścić na szkiełku mikroskopowym i przykryć szkiełkiem nakrywkowym, aby zwizualizować komórki pod mikroskopem fluorescencyjnym.
2. Prawidłowe znakowanie CFSE potwierdza się następnie za pomocą cytometrii przepływowej. Do weryfikacji barwienia CFSE wystarczy od 1-5 x 10⁵ komórek z każdej grupy. Komórki obciążone CFSE oraz komórki kontrolne negatywne, nieobciążone, resuspensuje się odpowiednio w 1 x -PBS lub NeuroCult NSC Basal Medium do całkowitej objętości 500 μl i umieszcza w osobnych probówkach do FACS.
3. Cytometr przepływowy dostraja się zgodnie z instrukcją obsługi dla odpowiednich parametrów. CFSE posiada maksimum wzbudzenia przy długości fali 492 nm i maksimum emisji przy 517 nm.
4. W pierwszej kolejności analizuje się nieobciążone komórki kontrolne, a zarejestrowane zdarzenia zapisuje się na wykresach rozpraszania światła w przód i w bok (FSC vs. SSC) oraz na histogramach, a następnie wyznacza bramkę dla głównej populacji komórek (Rycina 2A).
5. Analogicznie analizuje się komórki obciążone CFSE, stosując te same parametry, które zastosowano dla komórek kontrolnych (Rycina 2B).

4. Izolacja populacji komórek wolno dzielących się [tj. zatrzymujących CFSE] przy użyciu fluorescencyjnego sortowania komórek aktywowanego laserem (FACS)

1. Po podziale intensywność CFSE maleje, a komórki hGBM tworzą gliomasfery składające się z komórek wykazujących różny poziom intensywności fluorescencji zielonej (Rycina 3). Gdy gliomasfery osiągną średnią wielkość około 150-200 μm średnicy (około 5 do 10 dni po obciążeniu CFSE, w zależności od tempa wzrostu linii komórkowej), medium zawierające sfery jest usuwane, przenoszone do sterylnej probówki do hodowli tkankowej o odpowiedniej wielkości i wirowane przy 800 rpm przez 5 min w temperaturze pokojowej.
2. Zawiesinę jednokomórkową przygotowuje się zgodnie z opisem w poprzednich krokach, a komórki resuspendsuje się w PBS w celu wykonania odliczania komórek, aby przygotować zawiesinę o gęstości do 10⁷ komórek na mililitr.
3. Po resuspensji komórek w odpowiedniej objętości PBS, dodaje się jodek propidyny (PI, Sigma, 500 μg/ml) w stężeniu 1 μl/ml zawiesiny komórkowej, aby wykluczyć martwe komórki podczas sortowania/analizy metodą cytometrii przepływowej.
4. Do zebrania posortowanych komórek wolno dzielących się (komórek zatrzymujących CFSE) oraz komórek szybko dzielących się (komórek rozcieńczających CFSE) wykorzystuje się dwie sterylne probówki do hodowli tkankowej o pojemności 15 ml, z których każda zawiera 1 ml kompletnego medium NeuroCult NSC.
5. W pierwszej kolejności zawiesinę komórkową z grupy komórek nieobciążonych przepuszcza się przez cytometr przepływowy.
6. Komórki (zdarzenia) są przedstawiane na wykresie rozrzutu w funkcji rozpraszania w przód (FSC) względem rozpraszania bocznego (SSC), a parametry napięcia dla obu tych wartości są dostosowywane tak, aby większość komórek znalazła się w obrębie wykresu przepływu.
7. W celu wykluczenia komórek martwych lub uszkodzonych, komórki są przedstawiane na wykresie SSC względem reaktywności na PI, a następnie bramkuje się pojedynczą populację żywych komórek (PI negatywnych).
8. Następnie, na podstawie rozpraszania w przód (FSC) względem rozpraszania bocznego (SSC), wybiera się jednorodną populację komórek.
9. Jednorodna populacja pojedynczych żywych komórek jest następnie przedstawiana na histogramie częstotliwości komórek względem intensywności CFSE w skali logarytmicznej. Intensywność lasera CFSE jest dostosowywana tak, aby sygnał negatywny znajdował się w przedziale od 0 do 100.
10. Przy użyciu tych samych parametrów i podobnej strategii bramkowania, komórki znakowane CFSE są przepuszczane przez cytometr przepływowy i analizowane (Rycina 4C).
11. Następnie, na podstawie zdolności do zatrzymywania CFSE, identyfikuje się populację komórek wolno dzielących się oraz populację ogólną (komórki szybciej dzielące się) (odpowiednio CFSE^high – górne 5% i CFSE^low – dolne 85%).
12. Te różne populacje komórek są następnie sortowane do osobnych sterylnych probówek do hodowli tkankowej o pojemności 15 ml zawierających 1 ml kompletnego medium NSC.
13. Posortowane komórki są następnie wirowane przy 800 rpm przez 5 min.
14. Nadsącz jest usuwany, a osad resuspendsuje się w odpowiedniej objętości medium (w zależności od liczby wyizolowanych zdarzeń lub wielkości osadu) i wykonuje odliczanie komórek.
15. Komórki z różnych posortowanych populacji są następnie wysiewane w gęstości 50 000 komórek na mililitr do odpowiedniej sterylnej kolby do hodowli tkankowej i umieszczane w inkubatorze z wilgotną atmosferą w temperaturze 37 °C / 5% CO2 na 5-10 dni przed pasażowaniem seryjnym lub wykorzystaniem w dalszych eksperymentach.

5. Reprezentatywne wyniki

Po obciążeniu CFSE wszystkie komórki wykazują intensywną zieloną fluorescencję w obrazie mikroskopowym (Rysunek 1). Ten zielony odcień jest widoczny nawet gołym okiem (patrz wideo). Analiza tych komórek metodą cytometrii przepływowej również wykazuje bardzo intensywną zieloną fluorescencję w porównaniu z komórkami kontrolnymi (Rysunek 2). Po wysianiu komórek obciążonych CFSE w kulturze neurosfer, komórki te proliferują i w ciągu 5-10 dni tworzą gliomasfery o średnicy 150-200 μm. Wraz z proliferacją komórek, barwnik fluorescencyjny rozkłada się równomiernie między komórki potomne podczas podziałów, co prowadzi do zmniejszenia intensywności fluorescencji o połowę przy każdym podziale komórkowym. Glejaki są funkcjonalnie heterogenne i składają się z komórek proliferujących w różnym tempie. Metoda opisana w niniejszym protokole umożliwia identyfikację i izolację komórek dzielących się szybko i wolno dzięki ich zdolności do odpowiednio rozcieńczania lub zatrzymywania CFSE (Rysunek 3, patrz również wideo).

Analiza cytometryczna przepływowa dysocjowanych gliomasfer wygenerowanych z komórek obciążonych CFSE w porównaniu z komórkami nieobciążonymi wykazuje zróżnicowane właściwości retencji CFSE (Rysunek 4). Komórki szybko dzielące się (dolne 85%) lub komórki wolno dzielące się (górne 5% - CFSE^high) wykazują zdolność do tworzenia gliomasfer podczas hodowli w warunkach testu neurosferowego (Rysunek 5).

Rysunek 1. Rozdzielone komórki nowotworowe bezpośrednio po obciążeniu barwnikiem CFSE. Komórki wykazują jasny zielony kolor, co świadczy o pomyślnym znakowaniu. Powiększenie oryginalne; 10 x.

Rysunek 2. Potwierdzenie obciążenia CFSE przy użyciu cytometrii przepływowej. A) komórki nieobciążone, B) komórki obciążone CFSE oraz C) porównanie intensywności fluorescencji CFSE w komórkach obciążonych i nieobciążonych. Należy zauważyć, że różnica w intensywności fluorescencji między komórkami znakowanymi a nieznakowanymi wynosi kilka rzędów wielkości.

Rysunek 3. Reprezentatywna gliomasfera pochodząca z komórki obciążonej CFSE 6 dni po wysianiu. Niektóre komórki wykazują bardzo intensywne barwienie CFSE. Powiększenie oryginalne: 63 x.

Rycina 4. Reprezentatywne wykresy/histogramy z cytometrii przepływowej dla izolacji komórek dzielących się szybko i wolno 6 dni po barwieniu CFSE. A) FSC vs. SSC w celu przedstawienia całej populacji komórek, B) SSC vs. reaktywność PI w celu wykluczenia komórek martwych lub uszkodzonych, C) FSC vs. SSC w celu wyznaczenia bramki dla jednorodnej populacji żywych komórek, D) Wykazuje obecność komórek zatrzymujących CFSE 6 dni po znakowaniu CFSE, co potwierdzono większą intensywnością fluorescencji w porównaniu z kontrolą negatywną. Histogram pokazuje również, że intensywność CFSE malała w czasie. E) Histogram przedstawiający strategię bramkowania w celu identyfikacji komórek zatrzymujących CFSE (górne 5%) i komórek z rozcieńczonym CFSE (dolne 85%).

Rycina 5. Reprezentatywne gliomasfery wygenerowane z A) szybko dzielących się komórek (CFSE^low) oraz B) wolno dzielących się komórek (CFSE^high). Powiększenie oryginalne: odpowiednio 10x i 20x. C) Reprezentatyczna liczba komórek uzyskana z hodowli pochodzącej z szybko lub wolno dzielących się komórek w czasie pasażowania. P<0.05, t-test. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną rycinię.

Dyskusja

Coraz więcej badań wykazuje znaczenie wolno dzielącej się subpopulacji komórek w nowotworach, która przyczynia się do tworzenia guzów oraz oporności na leczenie^2-8. Dlatego kluczowe jest opisanie i standaryzacja metod eksperymentalnych umożliwiających badanie tej specyficznej subpopulacji komórek lub, bardziej ogólnie, porównywanie subpopulacji o różnych tempach wzrostu. Wykorzystanie CFSE do identyfikacji i izolacji subfrakcji komórek na podstawie tempa ich podziałów stanowi punkt wyjścia do dalszej charakter...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Podłoże podstawowe NeuroCult NSC (ludzkie)	Stem Cell Technologies	05750
Suplementy do proliferacji NeuroCult NSC (ludzkie)	Stem Cell Technologies	05753
%0,05 trypsyna-EDTA	GIBCO, by Life Technologies	25300-062
Inhibitor trypsyny z soi	Sigma-Aldrich	T6522
Penicylina/Streptomycyna	GIBCO, by Life Technologies	15140-122
Kolba T25	Nalge Nunc international	136196
Kolba T80	Nalge Nunc international	178905
Probówki 15 ml	BD Biosciences	352096
Probówki 50 ml	BD Biosciences	352070
EGF	R&D Systems	2028-EG
Zestaw do badania proliferacji komórek CellTrace CFSE	Molecular Probes, Life Technologies	C34554