Obrazowanie na żywo w wysokiej rozdzielczości zachowania komórek w rozwijającym się neuroepitelium

Podsumowanie

Obrazowanie tkanki zarodkowej w czasie rzeczywistym przez długie okresy stanowi duże wyzwanie. Przedstawiamy tutaj metodę monitorowania zmian komórkowych i podkomórkowych w rdzeniu kręgowym kurczaka przez dłuższy czas z wysoką rozdzielczością przestrzenną i czasową. Technikę tę można zaadaptować do innych obszarów układu nerwowego oraz rozwijającego się zarodka.

Streszczenie

Zarodkowy rdzeń kręgowy składa się z cyklicznych neuralnych komórek progenitorowych, z których powstaje znaczny odsetek neuronów i komórek glejowych ośrodkowego układu nerwowego (OUN). Chociaż wiele wiadomo o mechanizmach molekularnych, które kształtują wzorzec rdzenia kręgowego i wywołują różnicowanie neuronalne^{1, 2}, brakuje nam głębokiego zrozumienia tych wczesnych zdarzeń na poziomie zachowania komórek. Krytyczne jest zatem badanie zachowania progenitorów neuralnych w czasie rzeczywistym podczas gdy przechodzą one proces neurogenezy.

W przeszłości obrazowanie tkanek wczesnego embrionu w czasie rzeczywistym było ograniczone żywotnością komórek i tkanek w kulturze, a także fototoksycznymi efektami obrazowania fluorescencyjnego. Przedstawiamy tutaj nowatorski test do obrazowania takich tkanek przez długi czas, wykorzystujący nowy protokół hodowli skrawków ex vivo oraz szerokopolową mikroskopię fluorescencyjną (Rys. 1). Podejście to umożliwia długoterminowy monitoring z lapsem czasowym komórek progenitorowych rdzenia kręgowego embrionu kurczaka z wysoką rozdzielczością przestrzenną i czasową.

Ten test można zmodyfikować w celu obrazowania różnych tkanek embrionalnych^{3, 4} Oprócz obserwacji zachowań komórkowych i podkomórkowych, opracowanie nowych i wysoce czułych reporterów aktywności genów (na przykład sygnalizacji Notch⁵) sprawia, że test ten jest potężnym narzędziem pozwalającym zrozumieć, w jaki sposób sygnalizacja reguluje zachowanie komórek podczas rozwoju embrionalnego.

Protokół

1. Przygotowanie naczynia

1. Szalki używane do hodowli skrawków są szklonne (z zakryweczką jako podstawą) (szalki WillCo). Są one umieszczane na chusteczkach do soczewek w szalce hodowlanej o średnicy 6 cm, aby utrzymać szklane dno w czystości.
2. W dniu poprzedzającym eksperyment należy dodać 2 ml 0,1% roztworu poli-L-lizyny do szalki z szklanym dnem i inkubować przez 5 min w temperaturze pokojowej, aby poli-L-lizyna pokryła szklane dno.
3. Usunąć roztwór poli-L-lizyny i wypłukać trzykrotnie wodą dejonizowaną, a następnie raz w 70% etanolu.
4. Pozostawić do wyschnięcia na noc. Szalki można również wysuszyć, delikatnie podgrzewając je w mikrofalówce na niskiej mocy przez 30-45 sekund.

2. Elektroporacja zarodków

1. Inkubować jaja w temperaturze 37 °C do stadium 10 według skali Hamburgera-Hamiltona (HH) (~36 godzin) (lub innego pożądanego stadium).
2. Przed rozpoczęciem przygotować szklane igły (stosujemy wyciągacz mikrokapilar Flaming/Brown model p87) i odłamać końcówkę igły za pomocą precyzyjnej pęsety pod mikroskopem stereoskopowym. Końcówka igły powinna być wystarczająco ostra, aby przebić zarodek, ale nie może być zbyt wąska, by nie utrudniać wstrzykiwania roztworu DNA.
3. Wyciąć okno w skorupce jaj oraz umieścić elektrody (w odstępie 5mm) po obu stronach zarodka.
4. Wstrzyknąć DNA (~0,025 - 0,5 μg/μl w wodzie dejonizowanej zabarwionej niewielką ilością barwnika fast green) do rurki neuralnej.
5. Przyłożyć prąd - 12-17 V trzykrotnie, przy długości impulsu 50ms i odstępie 950 ms między impulsami.
6. Stosujemy niskie stężenia DNA i niskie napięcia elektroporacji, aby uzyskać ekspresję mozaikową, co pozwala na śledzenie pojedynczych komórek.
7. Zakleić okno w skorupce jaja taśmą klejącą i upewnić się, że jest ono szczelne.
8. Pozostawić zarodki do regeneracji przez 3-4 godziny lub przez noc w temperaturze 37 °C.

3. Przygotowanie kolagenu i pożywki do hodowli skrawków

1. Przygotować mieszaninę kolagenu oraz pożywkę do hodowli plastrów na około godzinę przed etapem krojenia.
2. Do 300 μl kolagenu typu 1 dodać 100 μl 0,1% roztworu kwasu octowego oraz 100 μl pożywki 5 x L15. Po każdym dodaniu dokładnie wymieszać na wirówce typu vortex. Roztwór powinien zmienić kolor na żółty.
3. Następnie dodać 15-20 μl 7,5% wodorowęglanu sodu i dokładnie wymieszać na wirówce typu vortex. Roztwór powinien stać się lekko różowy; objętość wodorowęglanu sodu wymagana do osiągnięcia tego efektu może się różnić. Przechowywać w lodzie i przygotowywać świeżą porcję przed każdym użyciem.
4. Do 10 ml pożywki neurobasal dodać suplement B-27 oraz Glutamax do stężenia końcowego 1 x oraz 10 μl roztworu gentamycyny.
5. Umieścić pożywkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C z buforowaniem 5% CO₂. Pozostawić górną część pojemnika niezabezpieczoną, aby umożliwić wyrównanie poziomu CO₂.

4. Hodowla plastrów tkankowych

1. Wyjąć zarodki z jaj i przemyć w medium L15.
2. Umieścić je w naczyniu do hodowli tkankowej z warstwą sylgardu na dnie i rozpiąć poprzez otaczające błony pozazarodkowe tak, aby były mocno naciągnięte.
3. Za pomocą mikronoża przeciąć zarodek tak prosto, jak to możliwe, przez obszar zainteresowania. W przypadku rdzenia kręgowego przekroje powinny mieć grubość od 1 do 2 somytów. Pozostawić przekroje przyczepione do zarodka podczas krojenia pozostałych embrionów, aby ich nie zgubić.
4. Przygotować końcówkę do mikropipety 200 μl, odcinając ok. 1 mm jej wierzchołka i mocując ją do pipety p2 lub p10. Końcówka ta posłuży do przeniesienia przekrojów rdzenia kręgowego do naczynia z dnem szklanym. Końcówka 10 μl nie jest wystarczająco szeroka, aby pobrać przekroje.
5. Pokryć wnętrze końcówki kolagenem, pipetując 1 μl wcześniej przygotowanej mieszaniny kolagenowej. Pozostawić na 1-2 min, a następnie przepłukać medium L15. Zapobiegnie to przywieraniu tkanki do wewnętrznej strony końcówki.
6. Oddzielić przekrój od zarodka za pomocą mikronoża i usunąć z naczynia, używając pipety p2 lub p10 z założoną końcówką 200 μl ustawionej na 1 μl. Należy starać się pobrać jak najmniej medium.
7. Wymieszać mieszaninę kolagenową na vortexie i nanieść 5-8 μl na naczynie pokryte poli-L-lizyną.
8. Natychmiast umieścić przekrój zarodka w kolagenie i ustawić go za pomocą precyzyjnej pęsety. Przekroje powinny być ustawione tak, aby strona przeznaczona do obrazowania przylegała do szkiełka nakrywki. Tkanka powinna przylgnąć do powłoki z poli-L-lizyny na szkiełku nakrywce.
9. Powtarzać czynność, aż na szkiełku znajdzie się kilka przekrojów. Zazwyczaj na jednym naczyniu można umieścić od 6 do 9 przekrojów.
10. Po rozmieszczeniu wszystkich przekrojów przykryć naczynie i pozwolić kolagenowi stężeć przez 20 minut. Część z pierwszych naniesionych porcji kolagenu mogła już zacząć wysychać. Aby temu zapobiec, przed przykryciem dodać do nich niewielką ilość L15.
11. Po stężeniu ostrożnie dodać 2 ml medium do hodowli przekrojów, które było równoważone w 5% CO₂ w temperaturze 37 °C przez co najmniej godzinę. Należy zachować ostrożność, aby nie oderwać kolagenu od szkiełka nakrywki.
12. Umieścić w inkubatorze 37 ° / 5% CO₂ i pozwolić przekrojom na regenerację przez co najmniej 3 godziny przed obrazowaniem. W przypadku braku wilgoci umieścić naczynie w pudełku z pleksiglasu z niewielką ilością wilgotnego ręcznika papierowego w jednym z rogów.

5. Obrazowanie przekrojów zarodka

1. Do obrazowania skrawków wykorzystujemy mikroskop szerokopolowy DeltaVision Core wyposażony w komorę środowiskową WeatherStation. W komorze stale utrzymywana jest temperatura 37 °C, a aparat do perfuzji CO₂ zapewnia utrzymanie na stoliku mikroskopu atmosfery składającej się z 5% CO₂ / 95% powietrza.
2. Obrazowanie jest zazwyczaj przeprowadzane przy użyciu obiektywu imersyjnego olejowego 40 x / 1.30 NA, a obrazy są rejestrowane za pomocą chłodzonej kamery CCD CoolSnap HQ2.
3. Przekroje Z-stack są rejestrowane co 1.5 μm w obrębie tkanki o grubości 45 μm. Czas ekspozycji powinien być tak krótki, jak to możliwe. Zazwyczaj stosujemy ekspozycję od 5-50 ms dla każdego przekroju Z. Obrazy są rejestrowane co 7 minut, a dzięki funkcji precyzyjnego odwiedzania punktów w systemie DeltaVision można monitorować do 9 skrawków.

6. Reprezentatywne wyniki

Przykładowa sekwencja poklatkowa komórki progenitorowej rdzenia kręgowego jest przedstawiona na Ryc. 2a oraz w odpowiadającym jej Filmie 1. Obrazowanie rozpoczęto na skrawku rdzenia kręgowego z dwudniowego zarodka (stadium HH 12). Komórka ta została przetransfekowana konstruktem wykazującym ekspresję GFP-αTubulin. Na tym wczesnym etapie komórki progenitorowe neuronów ulegają głównie podziałom w trybie progenitor-progenitor, podczas których komórki dzielą się, tworząc dwie kolejne cykliczne komórki progenitorowe. Ryc. 2b oraz odpowiadający jej Film 2 przedstawiają komórkę przetransfekowaną GFP-GPI (GFP zakotwiczone przez GPI), która znakuje błonę komórkową. Komórka ta ulega podziałowi, podczas którego wypustka podstawna rozdziela się na dwie i jest równomiernie dziedziczona przez komórki córki.

Rycina 1. Protokół hodowli skrawków do obrazowania time-lapse.

Rysunek 2. Zachowanie komórek podczas prawidłowego rozwoju rdzenia kręgowego. (a) Wybrane klatki z Filmu 1. Komórka wykazująca ekspresję GFP-tubuliny dzieli się w płaszczyźnie podziału prostopadłej do powierzchni apikalnej (2 h 20 min), generując dwie komórki potomne, które dzielą się ponownie (24 h 23 min i 25 h 54 min). (b) Wybrane klatki z Filmu 2. Komórka przetransfekowana GFP-GPI przechodzi podział komórkowy, podczas którego wypustka basalna zostaje rozdzielona (białe strzałki) i równomiernie przejęta przez komórki potomne.

Film 1. Kliknij tutaj, aby obejrzeć film.

Film 2. Kliknij tutaj, aby obejrzeć film.

Dyskusja

Przedstawiamy nowatorski test obrazowania time-lapse służący do monitorowania zachowania komórek w kulturze skrawków embrionu kurczaka. Test ten umożliwia obrazowanie żywej tkanki w wysokiej rozdzielczości przez okres do 70 godzin, przy czym łatwiej jest rejestrować ramy czasowe między 24 a 48 godzinami. Zastosowanie obiektywu olejowego o wysokiej aperturze numerycznej (NA) oraz stosunkowo krótkich odstępów między punktami czasowymi pozwala na akwizycję obrazów w wysokiej rozdzielczości, a także na monitorowanie zachowań komórkowych, które często przebiegają szybko i mogą zostać przeoczone podczas konwencjonalnego obrazowania time-lapse z wykorzystaniem mikroskopii konfokalnej.

Główną zaletą tego testu jest możliwość obrazowania komórek przez długi czas. Kluczowe znaczenie ma tutaj zastosowanie mikroskopii szerokopolowej⁶ zamiast konfokalnej mikroskopii skaningowej⁷. Mikroskopia konfokalna tradycyjnie oferowała kilka zalet nad mikroskopią szerokopolową, w tym możliwość wykonywania przekrojów optycznych i bezpośredniego eliminowania informacji poza ogniskową⁷, jednak zastosowanie otworu przesłony (pinhole) prowadzi do utraty światła docierającego do detektora⁸, co wyklucza znaczną ilość informacji i wymusza dłuższy czas ekspozycji. Z kolei mikroskopia szerokopolowa wykorzystuje oświetlenie pełnego pola, a całe światło przechodzące przez obiektyw trafia do detektora. W połączeniu z chłodzoną kamerą o wysokiej wydajności kwantowej (CCD) zapewnia to obrazowanie z wysokim stosunkiem sygnału do szumu w porównaniu z mikroskopią konfokalną⁹, przy bardzo krótkich czasach ekspozycji. W naszej aplikacji musimy prowadzić obrazowanie przez długi czas, rejestrować stosy 3D i ostatecznie rozdzielić małe struktury, bliskie granicy dyfrakcyjnej. Choć mikroskopia konfokalna zapobiega docieraniu światła poza ogniskową do detektora, a tym samym znacząco redukuje tło w grubych, gęsto znakowanych próbkach^{7, 8}, użyteczny stosunek sygnału do szumu osiąga ona dopiero przy znacznie większym dopływie światła niż w mikroskopii szerokopolowej¹⁰. Dlatego w przypadku próbek bardzo światłoczułych i rzadko znakowanych, takich jak nasze elektroporowane skrawki rdzenia kręgowego, mikroskopia szerokopolowa sprawdza się lepiej niż mikroskopia konfokalna. W połączeniu z rekonstrukcją obrazu metodą dekonwolucji, która usuwa informacje poza ogniskową i poprawia kontrast, mikroskopia szerokopolowa jest szczególnie skuteczna w detekcji małych, słabo świecących obiektów¹¹. Choć podejście to nie jest odpowiednie dla każdego eksperymentu obrazowania tkanek, okazało się ono bardzo efektywne w naszej aplikacji obrazowania żywych komórek.

Wybór białka fluorescencyjnego jest istotnym czynnikiem, który może wpływać na przeżywalność komórek. Ustaliliśmy, że najlepsze wyniki uzyskuje się przy użyciu konstruktów wykorzystujących zielone białko fluorescencyjne (GFP)¹² jako marker. Obecnie oceniamy szereg czerwonych białek fluorescencyjnych, które mogą być skutecznie stosowane w połączeniu z GFP do obrazowania time-lapse w dwóch kanałach. Dostępnych jest wiele takich białek¹³. Chociaż wiele białek zachowuje stabilność jako fuzje z białkiem fluorescencyjnym, niektóre z nich mogą stać się niestabilne w wyniku fuzji, co prowadzi do obniżenia żywotności komórek. W takich przypadkach użyteczne jest zastosowanie konstruktów zawierających wewnętrzny miejsce wejścia rybosomu (IRES), aby oddzielić białko docelowe od białka fluorescencyjnego.

Podczas obrazowania skrawków rdzenia kręgowego należy zachować ostrożność, aby zminimalizować ekspozycję na światło fluorescencyjne. Okularów mikroskopu należy używać wyłącznie przy świetle przechodzącym (w polu jasnym) w celu zlokalizowania i odpowiedniego ustawienia skrawków. Obrazy fluorescencyjne powinny być zawsze pozyskiwane za pomocą oprogramowania mikroskopu przy minimalnym czasie ekspozycji. Czas ten powinien mieścić się w zakresie 5-50 ms; zaleca się również eksperymentowanie z użyciem filtrów neutralnych. Choć dłuższe czasy ekspozycji mogą początkowo dawać wyraźniejsze obrazy, fototoksyczne działanie światła fluorescencyjnego może prowadzić do śmierci komórek. Nie należy obrazować pierwszych 5-10 μm tkanki znajdującej się najbliżej szkiełka podstawowego, ponieważ obszar ten może zawierać tkankę uszkodzoną podczas krojenia.

Chociaż przedstawione tutaj przykłady dotyczą embrionów poddanych elektroporacji w stadium HH 10 i obrazowaniu 6-7 godzin później, metodę tę można stosować dla embrionów do stadium HH 18. W późniejszych stadiach tkanka rdzenia kręgowego jest znacznie większa, co utrudnia ręczne wykonywanie przekrojów. W takich przypadkach lepsze wyniki może przynieść zatopienie embrionów w agarozie o niskiej temperaturze topnienia i sekcjonowanie za pomocą wibratomu. Mimo że przedstawiamy ten test jako metodę obrazowania komórek w rozwijającym się rdzeniu kręgowym, podejście to zostało również zmodyfikowane w celu obrazowania innych tkanek embrionalnych, w tym placod sensorycznych³.