Obrazowanie na żywo w wysokiej rozdzielczości zachowania komórek w rozwijającym się nabłonku nerwowym

Summary

Obrazowanie tkanki embrionalnej w czasie rzeczywistym jest wyzwaniem przez długi czas. W tym miejscu przedstawiamy test do monitorowania zmian komórkowych i subkomórkowych w rdzeniu kręgowym piskląt przez długi czas z wysoką rozdzielczością przestrzenną i czasową. Technikę tę można dostosować do innych obszarów układu nerwowego i rozwijającego się zarodka.

Abstract

Embrionalny rdzeń kręgowy składa się z cyklicznych nerwowych komórek progenitorowych, które dają początek dużemu procentowi komórek neuronalnych i glejowych ośrodkowego układu nerwowego (OUN). Chociaż wiele wiadomo o mechanizmach molekularnych, które kształtują rdzeń kręgowy i wywołują różnicowanie neuronów^{1, 2}, brakuje nam głębokiego zrozumienia tych wczesnych zdarzeń na poziomie zachowania komórek. Dlatego tak ważne jest badanie zachowania neuronalnych komórek progenitorowych w czasie rzeczywistym, gdy przechodzą one neurogenezę.

W przeszłości obrazowanie w czasie rzeczywistym wczesnej tkanki embrionalnej było ograniczone przez żywotność komórek/tkanek w hodowli, jak również przez fototoksyczne efekty obrazowania fluorescencyjnego. W tym miejscu przedstawiamy nowatorski test do obrazowania takiej tkanki przez długi czas, wykorzystujący nowatorski protokół hodowli warstwowej ex vivo i szerokokątną mikroskopię fluorescencyjną (ryc. 1). Podejście to pozwala na długoterminowe monitorowanie poklatkowe komórek progenitorowych rdzenia kręgowego piskląt z wysoką rozdzielczością przestrzenną i czasową.

Ten test może być zmodyfikowany tak, aby obrazować szereg tkanek embrionalnych^{3, 4} Oprócz obserwacji zachowań komórkowych i subkomórkowych, opracowanie nowych i bardzo czułych reporterów aktywności genów (na przykład sygnalizacja Notch⁵) czyni ten test potężnym narzędziem, dzięki któremu można zrozumieć, jak sygnalizacja reguluje zachowanie komórki podczas rozwoju embrionalnego.

Protocol

1. Przygotowanie potrawy

1. Naczynia używane do hodowli plastrów są ze szklanym dnem (z szkiełkiem nakrywkowym jako podstawą) (naczynia WillCo). Umieszcza się je na tkance soczewki w naczyniu do hodowli tkankowej o średnicy 6 cm, aby utrzymać szklane dno w czystości.
2. W dniu poprzedzającym eksperyment dodać 2 ml 0,1% roztworu poli-L-lizyny do naczynia ze szklanym dnem i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej, aby poli-L-lizyna pokryła dno szklanki.
3. Usunąć roztwór poli-L-lizyny i spłukać trzy razy w wodzie dejonizowanej, a następnie raz w 70% etanolu.
4. Pozostaw do wyschnięcia na noc. Naczynia można również suszyć, delikatnie podgrzewając w kuchence mikrofalowej na małej mocy przez 30-45 sekund.

2. Elektroporacja zarodków

1. Inkubować jaja w temperaturze 37 °C do etapu Hamburger-Hamilton (HH) 10 (~36 godzin) (lub innego pożądanego etapu).
2. Przed rozpoczęciem należy przygotować szklane igły (używamy ściągacza do mikrokapilar Flaming/Brown model p87) i odłamać końcówkę igły za pomocą cienkich kleszczyków pod mikroskopem preparacyjnym. Koniec igły powinien być na tyle ostry, aby przebić zarodek, a jednocześnie nie powinien być na tyle wąski, aby utrudniał wstrzyknięcie roztworu DNA.
3. Umieść jaja w okienku i umieść elektrody (w odległości 5 mm od siebie) po obu stronach zarodka.
4. Wstrzyknij DNA (~0,025 - 0,5 μg/μl w wodzie dejonizowanej zabarwionej niewielką ilością szybkiej zieleni) do cewy nerwowej.
5. Zastosuj prąd - 12-17 V trzy razy, długość impulsu 50 ms z 950 ms między impulsami.
6. Używamy niskich stężeń DNA i niskich napięć elektroporacji, aby uzyskać ekspresję mozaiki, dzięki czemu możemy śledzić poszczególne komórki.
7. Przykryj okienko w skorupce jajka taśmą wiolonczelową i upewnij się, że jest szczelne.
8. Pozostawić zarodki do regeneracji przez 3-4 godziny lub na noc w temperaturze 37 °C.

3. Przygotowanie pożywki do hodowli kolagenu i plastrów

1. Przygotuj mieszankę kolagenową i pożywkę hodowlaną w plasterki na około godzinę przed krojeniem.
2. Do 300 μl kolagenu typu 1 dodać 100 μl 0,1% roztworu kwasu octowego i 100 μl 5 x L15 podłoża. Dokładnie wymieszaj po każdym dodaniu. Roztwór powinien zmienić kolor na żółty.
3. Teraz dodaj 15-20 μl 7,5% wodorowęglanu sodu i dokładnie zwiruj. Roztwór powinien stać się lekko różowy, a wymagana do tego objętość wodorowęglanu sodu może się różnić. Trzymać na lodzie i za każdym razem uzupełniać na świeżo.
4. Do 10 ml pożywki neurobazalnej dodać suplement B-27 i Glutamax, do 1 x końcowe stężenie i 10 μl roztworu gentamycyny.
5. Umieścić pożywkę w inkubatorze o temperaturze 37 °C zbuforowaną 5% CO_{2 .} Pozostawić górną część pojemnika luźną, aby umożliwić jej zrównoważenie z CO₂ .

4. Kultura Slice

1. Usunąć zarodki z jaja i umyć w pożywce L15.
2. Umieścić w naczyniu do hodowli tkankowej z warstwą sylgardu na dnie i wyciąć je przez otaczające błony pozazarodkowe, tak aby były napięte.
3. Za pomocą mikronoża pokrój zarodek tak prosto, jak to możliwe, przez obszar zainteresowania. W przypadku rdzenia kręgowego plastry powinny mieć grubość od 1 do 2 somitów. Pozostaw plastry przyczepione do zarodka, podczas gdy kroisz inne zarodki, aby ich nie stracić.
4. Przygotuj końcówkę do mikropipety o pojemności 200 μl, odcinając ~1 mm końcówki i podłączając ją do końcówki p2 lub p10. Ta końcówka zostanie użyta do przeniesienia plasterków rdzenia kręgowego do naczynia ze szklanym dnem. Końcówka o pojemności 10 μl nie jest wystarczająco szeroka, aby zbierać plastry.
5. Pokryj wnętrze końcówki kolagenem, pipetując 1 μl przygotowanej wcześniej mieszanki kolagenowej. Pozostaw na 1-2 minuty, a następnie spłucz pożywką L15. Zapobiegnie to przywieraniu tkanki do wnętrza końcówki.
6. Oderwij plasterek od zarodka za pomocą mikronoża i wyjmij z naczynia za pomocą p2 lub p10 wyposażonego w końcówkę o pojemności 200 μl i ustawionego na 1 μl. Staraj się pobierać jak najmniej podłoża.
7. Zmieszaj mieszankę kolagenu i upuść 5-8 μl tego na naczynie pokryte poli-l-lizyną.
8. Natychmiast umieść plasterek zarodka w kolagenie i umieść na miejscu za pomocą cienkich kleszczy. Plasterki powinny być ułożone w taki sposób, aby strona, która ma być zobrazowana, znajdowała się równo z szkiełkiem nakrywkowym. Tkanka powinna przylegać do powłoki poli-l-lizynowej na szkiełku nakrywkowym.
9. Powtarzaj to, aż na szkiełku nakrywkowym pojawi się kilka plasterków. Na jednym naczyniu możemy zazwyczaj ułożyć 6-9 kromek.
10. Gdy wszystkie plastry znajdą się na swoim miejscu, przykryj naczynie i pozwól kolagenowi zastygnąć przez 20 minut. Niektóre z najwcześniej umieszczonego kolagenu mogły już zacząć wysychać. Aby temu zapobiec, dodaj do nich niewielką ilość L15 przed przykryciem.
11. Po związaniu ostrożnie dodać 2 ml pożywki w plastrach, która była zrównoważona w 5% CO₂ w temperaturze 37 °C przez co najmniej godzinę. Należy uważać, aby kolagen nie wysunął się ze szkiełka nakrywkowego.
12. Umieścić w inkubatorze o stężeniu 37 ° / 5% CO₂ i pozostawić plastry do odzyskania przez co najmniej 3 godziny przed obrazowaniem. Jeśli nie ma wilgoci, umieść naczynie w pudełku z pleksiglasu z odrobiną wilgotnej bibuły w jednym rogu.

5. Obrazowanie wycinków zarodków

1. Do obrazowania wycinków używamy mikroskopu szerokokątnego DeltaVision Core wyposażonego w komorę środowiskową WeatherStation. Komora jest stale utrzymywana w temperaturze 37 °C, za pomocą aparatu perfuzyjnego_CO2 w celu utrzymania stolika mikroskopu na poziomie 5% CO₂ / 95% powietrza.
2. Obrazowanie odbywa się zwykle przy użyciu obiektywu olejowego 40 x / 1,30 NA, a obrazy są rejestrowane za pomocą chłodzonej kamery CCD CoolSnap HQ2.
3. Wycinki Z są wychwytywane co 1,5 μm przez tkankę 45 μm. Czas ekspozycji powinien być utrzymywany na jak najkrótszym poziomie. Zwykle naświetlamy na 5-50 ms dla każdego przekroju Z. Obrazy są rejestrowane co 7 minut, a za pomocą funkcji precyzyjnego odwiedzania punktów systemu DeltaVision można odwiedzić do 9 wycinków.

6. Reprezentatywne wyniki

Przykładowa sekwencja poklatkowa komórki progenitorowej rdzenia kręgowego jest pokazana na Rys. 2a i odpowiadającym jej filmie 1. Obrazowanie rozpoczęto na wycinku rdzenia kręgowego z dwudniowego zarodka (HH stadium 12). Komórka ta została transfekowana konstruktem eksprymującym GFP-αtubulinę. Na tym wczesnym etapie nerwowe komórki progenitorowe przechodzą głównie podziały w trybie progenitor-progenitor, podczas których komórki dzielą się, aby wytworzyć dwie kolejne cykliczne komórki progenitorowe. Ryc. 2b i odpowiadający mu film 2 pokazują komórkę transfekowaną GFP-GPI (GFP zakotwiczoną w GPI), oznaczającą błonę komórkową. Komórka ta ulega podziałowi, podczas którego wyrostek podstawowy dzieli się na dwie części i jest w równym stopniu dziedziczony przez komórki potomne.

Rysunek 1. Protokół hodowli Slice do obrazowania poklatkowego.

Rysunek 2. Zachowanie komórek podczas normalnego rozwoju rdzenia kręgowego. (a) Wybrane klatki z filmu 1. Komórka wykazująca ekspresję tubuliny GFP dzieli się płaszczyzną rozszczepienia prostopadłą do powierzchni wierzchołkowej (2 h 20 min), tworząc dwie komórki potomne, które dzielą się ponownie (24 h 23 min i 25 h 54 min). (b) Wybrane klatki z filmu 2. Komórka transfekowana GFP-GPI ulega podziałowi komórkowemu, podczas którego proces podstawowy jest dzielony (białe strzałki) i w równym stopniu dziedziczony przez komórki potomne.

Film 1. Kliknij tutaj, aby wyświetlić film.

Film 2. Kliknij tutaj, aby wyświetlić film.

Discussion

Przedstawiamy tutaj nowatorski test obrazowania poklatkowego do monitorowania zachowania komórek w hodowli zarodków kurczaków. Test ten umożliwia obrazowanie żywej tkanki w wysokiej rozdzielczości przez okres do 70 godzin, chociaż ramy czasowe od 24 do 48 godzin są łatwiejsze do uchwycenia. Zastosowanie obiektywu o wysokim stopniu nabycia azotu i stosunkowo krótkich odstępów czasu między punktami czasowymi umożliwia uzyskanie obrazu w wysokiej rozdzielczości, a także pozwala na monitorowanie zachowania komórek, które często zachodzi szybko i może być łatwo przeoczone podczas konwencjonalnego obrazowania poklatkowego przy użyciu mikroskopii konfokalnej.

Główną zaletą tego testu jest możliwość obrazowania komórek przez długi czas. Zastosowanie mikroskopii szerokokątnej⁶ zamiast konfokalnej mikroskopii skaningowej⁷ ma w tym celu kluczowe znaczenie. Mikroskopia konfokalna tradycyjnie oferuje kilka zalet w porównaniu z mikroskopią szerokokątną, w tym możliwość pobierania przekrojów optycznych i bezpośredniego eliminowania informacji nieostrych⁷, ale użycie otworka prowadzi do utraty światła do detektora⁸, wykluczając znaczną ilość informacji i wymagając dłuższych czasów naświetlania. Z kolei mikroskopia szerokokątna wykorzystuje pełne oświetlenie pola, a całe światło przechodzące przez obiektyw jest wysyłane do detektora. W połączeniu z kamerą CCD (Cooled Coupled Device) o wysokiej wydajności kwantowej zapewnia obrazowanie z wysokim stosunkiem sygnału do szumu w porównaniu z mikroskopią konfokalną⁹, z bardzo krótkimi czasami naświetlania. W naszej aplikacji musimy obrazować przez długi czas, rejestrować stosy 3D i ostatecznie rozwiązywać małe struktury o ograniczonych możliwościach dyfrakcji. Chociaż mikroskopia konfokalna zapobiega przedostawaniu się nieostrego światła do detektora, a tym samym znacznie zmniejsza tło w grubych, gęsto znakowanych próbkach^{7, 8}, osiąga ona użyteczny stosunek sygnału do szumu tylko przy znacznie większym dopływie światła niż mikroskopia szerokokątna¹⁰. W przypadku bardzo wrażliwych, słabo znakowanych próbek, takich jak nasze elektroporowane wycinki rdzenia kręgowego, mikroskopia szerokokątna działa lepiej niż mikroskopia konfokalna. W połączeniu z przywracaniem obrazu przez dekonwolucję, która usuwa nieostre informacje i poprawia kontrast, szerokie pole widzenia jest szczególnie dobre do wykrywania małych, ciemnych obiektów¹¹. Chociaż nie jest to odpowiednie dla każdego eksperymentu z obrazowaniem tkanek, to podejście okazało się bardzo skuteczne w naszej aplikacji do obrazowania żywych komórek.

Wybór białka fluorescencyjnego jest ważnym czynnikiem, który może wpływać na przeżycie komórek. Odkryliśmy, że najlepsze wyniki uzyskuje się z konstruktów, które wykorzystują białko zielonej fluorescencji (GFP)¹² jako marker. Obecnie oceniamy szereg białek czerwonej fluorescencji, które mogą być skutecznie stosowane w połączeniu z GFP do dwukanałowych filmów poklatkowych. Dostępnych jest wiele takich białek¹³. Chociaż wiele białek jest stabilnych w wyniku fuzji z białkiem fluorescencyjnym, niektóre białka mogą stać się niestabilne w wyniku fuzji, co skutkuje zmniejszoną żywotnością komórek. W takich przypadkach zastosowanie konstruktów zawierających wewnętrzne miejsce wejścia rybosomu (IRES) jest przydatne do oddzielenia białka będącego przedmiotem zainteresowania od białka fluorescencyjnego.

Podczas obrazowania wycinków rdzenia kręgowego należy zachować ostrożność, aby zminimalizować narażenie na światło fluorescencyjne. Okulary mikroskopowe mogą być używane wyłącznie przy świetle przechodzącym (jasne pole) do lokalizowania i pozycjonowania wycinków. Obrazy fluorescencyjne należy zawsze uzyskiwać za pomocą oprogramowania mikroskopowego przy minimalnym czasie naświetlania. Powinny one być utrzymywane w zakresie 5-50 ms i należy eksperymentować z użyciem filtrów o neutralnej gęstości. Chociaż dłuższe czasy naświetlania mogą początkowo dawać wyraźniejsze obrazy, fototoksyczne skutki ekspozycji na światło fluorescencyjne mogą prowadzić do śmierci komórek. Pierwsze 5-10 μm tkanki, która znajduje się najbliżej szkiełka nakrywkowego, nie powinna być obrazowana, ponieważ obszar ten zawiera tkankę, która mogła zostać uszkodzona podczas krojenia.

Chociaż przedstawione tutaj przykłady dotyczą zarodków elektroporowanych w stadium HH 10 i zobrazowanych 6-7 godzin później, metoda ta może być stosowana w przypadku zarodków do stadium HH 18. W późniejszych stadiach tkanka rdzenia kręgowego jest znacznie większa, dlatego trudno ją przeciąć ręcznie. W takich przypadkach osadzenie zarodków w agarozie o niskiej temperaturze topnienia i cięcie za pomocą wibratomu może przynieść lepsze wyniki. Mimo że przedstawiamy ten test jako metodę obrazowania komórek w rozwijającym się rdzeniu kręgowym, podejście to zostało również zmodyfikowane w celu obrazowania innych tkanek embrionalnych, w tym plakodów czuciowych³.