Bioassay elektroantenograficzny jako narzędzie przesiewowe dla lotnych substancji rośliny żywicielskiej

Podsumowanie

Przedstawiono metodę szybkiego przesiewania substancji lotnych roślin żywicielskich poprzez pomiar odpowiedzi elektrofizjologicznej czułków dorosłych osobników omacnicy brzoskwiniowej (Amyelois transitella) na pojedyncze składniki oraz mieszaniny za pomocą analizy elektroantenograficznej.

Streszczenie

Lotne związki roślinne odgrywają istotną rolę w interakcjach między roślinami a owadami. Owady roślinożerne wykorzystują lotne związki roślinne, znane jako kairomony, do lokalizacji rośliny żywicielskiej.^1,2 Gdy roślina żywicielska jest ważnym produktem rolnym, uszkodzenia spowodowane żerowaniem szkodników mogą przynieść producentom poważne straty ekonomiczne. W związku z tym kairomony mogą być stosowane jako atraktanty do wabiących lub dezorientujących tych owadów, oferując tym samym przyjazną dla środowiska alternatywę dla pestycydów w zwalczaniu owadów.³ Niestety rośliny mogą emitować ogromną liczbę substancji lotnych o zmiennym składzie i proporcjach emisji, zależnych od fenologii uprawy lub pory dnia. Sprawia to, że identyfikacja biologicznie aktywnych komponentów lub mieszanin składników lotnych jest procesem żmudnym. Aby pomóc w identyfikacji bioaktywnych komponentów lotnych emisji rośliny żywicielskiej, stosujemy laboratoryjny bioassay przesiewowy – elektroantenografię (EAG). EAG jest skutecznym narzędziem do oceny i zapisu elektrofizjologicznego odpowiedzi węchowych owada za pośrednictwem jego receptorów antenalnych. Proces przesiewowy EAG może pomóc w ograniczeniu liczby testowanych substancji lotnych w celu zidentyfikowania obiecujących komponentów bioaktywnych. Jednakże bioassay EAG dostarcza informacji jedynie o aktywacji receptorów. Nie dostarcza on informacji o rodzaju zachowania owada, jakie wywołuje dany związek; może to być działanie atraktanta, repelenta lub inny rodzaj reakcji behawioralnej. Substancje lotne wywołujące istotną odpowiedź w EAG, w odniesieniu do odpowiedniej kontroli pozytywnej, są zazwyczaj przekazywane do dalszych testów odpowiedzi behawioralnych szkodnika. Przedstawiony projekt eksperymentalny szczegółowo opisze metodologię zastosowaną do przesiewania lotnych związków rośliny żywicielskiej migdałowca^4,5 poprzez pomiar elektrofizjologicznych odpowiedzi antenalnych dorosłego owada szkodnika, mącznika migdałowca (Amyelois transitella), na pojedyncze komponenty i proste mieszaniny składników za pomocą bioassay EAG. Metoda ta wykorzystuje dwie wycięte anteny umieszczone w uchwycie elektrody w kształcie „widełek”. Protokół zaprezentowany tutaj przedstawia szybką, wysokoprzepustową, zestandaryzowaną metodę przesiewania substancji lotnych. Każda substancja lotna występuje w określonej, stałej ilości, aby zestandaryzować poziom bodźca, a tym samym pozwolić, by odpowiedzi antenalne były wskaźnikiem względnej chemireceptywności. Kontrola negatywna pomaga wyeliminować odpowiedź elektrofizjologiczną zarówno na pozostałości rozpuszczalnika, jak i na mechaniczną siłę podmuchu. Kontrola pozytywna (w tym przypadku acetofenon) to pojedynczy związek, który wywołuje spójną odpowiedź u samców i samic ćmy mącznika migdałowca (NOW). Dodatkowym standardem semiochemicznym, który zapewnia spójną odpowiedź i jest stosowany w badaniach bioassay z samcami ćmy NOW, jest (Z,Z)-11,13-heksadekadienal, komponent aldehydowy feromonu płciowego produkowanego przez samice.^6-8

Protokół

1. Przygotowanie substancji lotnych wykrytych z rośliny żywiciela do przesiewu EAG

1. Po odpowiedniej identyfikacji i uwierzytelnieniu wszystkich substancji lotnych za pomocą GC-MS, przeprowadź analizę EAG metodą podmuchów (puff analysis) dla każdej dostępnej substancji lotnej. Wstępny screening może polegać na niskiej liczbie powtórzeń odpowiedzi antenalnych (N=3-5) dla każdej płci, aby w krótkim czasie uzyskać wskazanie względnej chemoreceptywności (Tabela 1).
2. Przygotuj roztwór każdej substancji lotnej o stężeniu 5 mg/mL w pentanie. Szczelnie zamknij i przechowuj próbkę w lodówce do momentu bezpośredniego użycia (np. acetofenon, gęstość = 1,03 g/mL, objętość = (0,005 g/1,03 g/mL) × 1 000 = 4,85 μL acetofenonu do kolby miarowej o pojemności 1,0 mL i dopełnij pentanem do 1,0 mL).
3. Tuż przed analizą EAG wyjmij fiolki zawierające substancje lotne do przetestowania o stężeniu 5 mg/mL i pozostaw je do ogrzania do temperatury pokojowej. W międzyczasie oznakuj odpowiednią liczbę pipet Pasteura, aby odpowiadały każdej testowanej substancji lotnej, i owiń końcówkę pipety małym kawałkiem parafilmu (ok. 15 × 15 mm). Do wstępnego screeningu przygotowuje się 10 pipet ze stymulantem (N=4 dla każdego samca i samicy) na wypadek błędnego przygotowania lub innych nieprzewidzianych przeszkód.
4. Za pomocą pęsety delikatnie złóż dysk do bioanalizy na pół, aby ułatwić jego umieszczenie w pipecie, a następnie częściowo włóż złożony dysk do szerokiego końca pipety tak, aby wystawało ok. 2-3 mm dysku. Ułóż oznakowane i przygotowane pipety w statywie.
5. Używając pipety automatycznej lub strzykawki, nanieś 10 μL (50 μg) roztworu substancji lotnej na każdy dysk i odczekaj 2 minuty przed całkowitym wsunięciem dysków do pipety. Po załadowaniu natychmiast zamknij koniec pipety parafilmem (ok. 15 × 30 mm). Ilość załadowanego i podanego w podmuchu stymulanta lotnego będzie prawdopodobnie różnić się w zależności od gatunku owada.
6. Postępując zgodnie z opisanym powyżej protokołem, przygotuj kontrole do uwzględnienia w każdej analizie. W przypadku kontroli negatywnej nanieś 10 μL samego pentanu na każdy dysk, odczekaj 2 minuty, włóż do oznakowanej pipety i zamknij. W przypadku kontroli pozytywnej nanieś 10 μL (50 μg) na dysk, odczekaj 2 minuty, włóż do oznakowanej pipety i zamknij parafilmem.
7. Żywotność preparatu antenalnego owada będzie prawdopodobnie różnić się w zależności od gatunku, jednak stwierdziliśmy, że anteny Amyelois transitella zazwyczaj pozostają aktywne i stabilne przez > 30 minut po wycięciu przy zastosowaniu opisanego protokołu. Taki czas pozwoli zazwyczaj na ocenę od 4 do 10 próbek substancji lotnych. Tabela 2 przedstawia przykład czasów i sekwencji.

2. Przygotowanie czułków owadów do bioanalizy EAG

1. Celem niniejszego eksperymentu jest analiza EAG; przyjmuje się zatem, że każdy badacz będzie miał dostęp do odpowiednio hodowanych owadów.
2. W tym eksperymencie będziemy badać sparowane ćmy płci męskiej i żeńskiej w wieku 3-4 dni. W dniu analizy poszczególne ćmy przenosi się do małego, plastikowego pojemnika z pokrywką. Bezpośrednio przed bioanalizą badaną ćmę przenosi się głową do przodu do urządzenia stabilizującego (np. wykonanego z różnych plastikowych końcówek do pipet) i zabezpiecza od tyłu. Manipulację owadem można obserwować pod niskopowiększającym stereomikroskopem, aby ułatwić wycięcie.
3. Czułki są oddzielane za pomocą narzędzia z drutowym końcem. Uchwyt widelcowy, z cienką warstwą żelu elektrodowego, jest umieszczany w bliskiej odległości w celu szybkiego przeniesienia czułków. Pierwszy czułek jest wycinany za pomocą mikronoareczek i umieszczany na widelcu, dbając o to, aby podstawa czułka znajdowała się na nieczerwonej części widelca (obojętnej elektrodzie uziemiającej). Uruchamia się minutnik ustawiony na 10 minut, a następnie wycina się drugi czułek i umieszcza go obok pierwszego, tak aby obie podstawy znajdowały się po tej samej stronie widelca.
4. Alternatywnie czułki można pozostawić zabezpieczone w rurce stabilizującej, wyciąć, a następnie delikatnie usunąć z przestrzeni między rurką a owadem za pomocą narzędzia z drutowym końcem z odrobiną żelu na końcówce.
5. Sprawdza się, czy podstawa i wierzchołek czułków są zanurzone w żelu elektrodowym i czy w żelu nie ma pęcherzyków powietrza. Końcówki/wierzchołki można przyciąć, aby zagwarantować pełną ekspozycję na żel elektrodowy. Należy zachować ostrożność, aby reszta każdego czułka nie była pokryta żelem, zapewniając tym samym maksymalną powierzchnię czułka wystawioną na działanie podmuchu.
6. Przygotowany widelec jest następnie wkładany do przedwzmacniacza sondy i utrzymywany w stałym strumieniu nawilżonego powietrza o przepływie 200 mL/min przez pozostały czas 10-minutowego okresu oczekiwania. Odnotowuje się czas wycięcia i czasy rozpoczęcia EAG (Tabela 2), a na 30 sekund przed pierwszym podmuchem bodźca, pipetę zawierającą kontrolę pozytywną odprzepieczętowuje się i umieszcza w uchwycie, który jest ustawiony tak, aby kierować przepływ powietrza/podmuch 2-3 mm od przygotowanych czułków.
7. Po każdym eksperymencie badane ćmy są uśmiercane w środowisku suchego lodu i odpowiednio utylizowane.
8. Ćmy żeńskie są sekcjowane w celu sprawdzenia statusu kopulacji. Przyjmuje się, że samce przebywające wspólnie z samicami kopulowały.

3. Protokół EAG dla poszczególnych komponentów

1. Reakcje antenalne są rejestrowane za pomocą oprogramowania AutoSpike dołączonego do urządzenia Syntech EAG. W karcie AutoSpike Properties dla kanału z sondą EAG ustawiono częstotliwość próbkowania 106.7, opcję NO dla prostowania (rectify) oraz filtr 0-42 Hz. W karcie Filter filtr EAG jest włączony (ON), a dolna częstotliwość odcięcia ustawiona na 0.1 Hz.
2. Podmuchy bodźca trwają od 1 do 2 sekund. Po każdym podmuchu uruchamiany jest timer ustawiony na 1 minutę.
3. Kolejna pipeta z lotną substancją testową zostaje odszczelniona i umieszczona w uchwycie. Następnie postępuje się zgodnie z kolejnością lotnych substancji testowych (np. Tabela 2), które są randomizowane pomiędzy seriami pomiarowymi, aby zapewnić, że związki testowe nie następują po sobie w stałej kolejności, zachowując dokładnie 1 minutę przerwy między podmuchami.
4. Aby ułatwić odczyt reakcji EAG, na ekranie komputera umieszcza się fragmenty linijek, a odległość od poziomu bazowego do szczytu sygnału odchylenia w dół mierzy się w mm i zapisuje w arkuszu danych (np. dla ustawienia 5 mV, 33 mm = 2.5 mV). Oprogramowanie umożliwia odtwarzanie zapisanych pomiarów w celu późniejszej analizy. Przeliczenie mm na amplitudę w mV lub μV wykonuje się na etapie późniejszej analizy danych.
5. Po podaniu ostatniego podmuchu kontroli dodatniej (np. pomiar nr 12), anteny są usuwane, a widelec czyszczony ściereczką nasączoną etanolem i pozostawiany do wyschnięcia przed kolejnym użyciem.
6. Aby zwiększyć przepustowość analiz, drugi pracownik laboratorium może rozpocząć wycinanie kolejnego zestawu anten około 10 minut przed zakończeniem bieżącego eksperymentu – po czwartym podmuchu; drugą lotną substancją testową bieżącego eksperymentu, zgodnie z Tabelą 2. Pozwoli to na rozpoczęcie kolejnego eksperymentu bezpośrednio po zakończeniu obecnego.
7. W przypadku związków budzących szczególne zainteresowanie można przeprowadzić większą liczbę powtórzeń (na różnych antenach), aby zapewnić dalszą walidację statystyczną.

4. Przykład analizy EAG mieszanin lub innych matryc (Tabela 3)

1. Następnie oblicza się stosunki i objętości dla dwóch mieszanin trzeciorzędowych (mieszanin 3-składnikowych), aby przedstawić przykład łączenia substancji lotnych wywołujących silne odpowiedzi EAG (Tabela 4). Obliczenia dotyczą podstawowych proporcji: molowego stosunku 1:1:1 dla α-humulene : 2-undecanone : 2-phenylethanol, a następnie porównania z drugim stosunkiem mieszaniny wynoszącym 1:2:4.
2. Zgodnie z podobnymi protokołami opisanymi wcześniej, przygotowuje się mieszaniny, a oznakowane pipety Pasteura napełnia wraz z niezbędnymi kontrolami pozytywnymi i negatywnymi.
3. Próbki substancji lotnych podaje się w formie podmuchów na czułki samców i samic, a odpowiedzi mierzy się i zapisuje w arkuszu danych (Tabela 3).

5. Reprezentatywne wyniki

W przypadku samic omacnicy pępekowej stosuje się następujące ustawienia: 2-sekundowe podmuchy, 10-sekundowy czas rejestracji, 10-sekundowe okno oraz skalę 5 mV. Typową odpowiedzią jest odchylenie ujemne, jednak rejestrowana jest wartość bezwzględna (np. odchylenie -3,400 μV rejestrowane jest jako 3,400 μV). Relatywnie słaba odpowiedź preparatu na kontrolę dodatnią jest odrzucana. Rysunek 1 przedstawia graficznie słabą odpowiedź omacnicy pępekowej na kontrolę dodatnią.

Przykładem słabego wyniku kontrolnego jest średnia odpowiedź antenalna samic na acetofenon, która wynosi zazwyczaj ok. 2 600 μV (Ryc. 2); jeśli preparat wykazał odpowiedź na poziomie ok. 1 300 μV, był on odrzucany, a następnie przygotowywano kolejną parę anten. Podobnie średnia odpowiedź samców na (Z,Z)-11,13-heksadekadienal wynosiła zazwyczaj 3 000 μV; w związku z tym każda odpowiedź poniżej 1 500 μV była zazwyczaj odrzucana.

Kontrola dodatnia na początku i na końcu każdego eksperymentu dostarcza również informacji na temat stanu czułków. Przyjmujemy następującą zasadę kciuka w ramach szybkiego przesiewu: jeżeli odpowiedź czułków na podmuch kontroli dodatniej (pomiar nr 12, Tabela 2) wynosi mniej niż 75% wartości 1^st wydech kontrolny (pomiar nr 1, Tabela 2) lub mniej niż 2^nd wydech kontrolny (pomiar nr 2, Tabela 2) w takim przypadku eksperyment nie jest wykorzystywany w analizie danych ze względu na możliwą degradację preparatu (Rycina 3). Przykładem pierwszej ogólnej zasady byłby zapis nr 1 = 2,730 μV i zarejestruj #12 = 1,680 μV; a druga zasada kciuka brzmi: jeżeli rekord nr 2 = 2,350 μV oraz zapis nr 12 = 1,680 μVW każdym z tych przypadków preparat oraz wyniki eksperymentu zostałyby odrzucone.

Reprezentatywny przykład korygowania wartości odpowiedzi EAG względem pomiaru kontroli pozytywnej przedstawia się następująco.

Pomiar nr	EAG (μV)	Pomiar nr 2	EAG (μV)	Pomiar nr 3	EAG (μV)
(+) Ctrl	2800	(+) Ctrl	2420	(+) Ctrl	3030
Związek A	3000	Związek A	2500	Związek A	3440
(-) Ctrl	530	(-) Ctrl	755	(-) Ctrl	910
Związek B	2400	Związek B	2000	Związek B	2560
(+) Ctrl	2770	(+) Ctrl	2400	(+) Ctrl	3020

Przy zastosowaniu powyższych wartości dla eksperymentu N=3, odpowiedź kontroli negatywnej jest odejmowana od każdej wartości w obrębie każdego eksperymentu, przy założeniu, że kontrola negatywna stanowi bazową odpowiedź antenną na mechaniczny podmuch i pozostałości rozpuszczalnika.

Pomiar nr 1	EAG (μV)	Pomiar nr 2	EAG (μV)	Pomiar nr 3	EAG (μV)
Ktrl (+)	2270	Ktrl (+)	1665	Ktrl (+)	2120
Związek A	2470	Związek A	1745	Związek A	2530
Ktrl (-)	0	Ktrl (-)	0	Ktrl (-)	0
Związek B	1870	Związek B	1245	Związek B	1650
Ktrl (+)	2240	Ktrl (+)	1645	Ktrl (+)	2110

Wartości kontroli pozytywnych dla każdego eksperymentu należy następnie uśrednić i znormalizować do poziomu 1 000 μV, odnotowując stosunek użyty do korekty do 1 000 μV. Arkusz danych (np. Excel) pozwala na łatwe przekształcenie odpowiedzi w dane przydatne do analizy.

Pomiar nr 1	Śr (μV)	Pomiar nr 2	Śr (μV)	Pomiar nr 3	Śr (μV)
(+) Kontrola	2255	(+) Kontrola	1655	(+) Kontrola	2115
(+) Kontrola skoryg.	1000 (0.443)	(+) Kontrola skoryg.	1000 (0.604)	(+) Kontrola skoryg.	1000 (0.473)

Po pomnożeniu przez współczynnik korekcyjny w obrębie każdego eksperymentu, wartości dla związku A i związku B zostają skorygowane.

Pomiar nr 1	Skorygowane EAG(μV)	Pomiar nr 2	Skorygowane EAG(μV)	Pomiar nr 3	Skorygowane EAG(μV)
Cmpnd A	1094	Cmpnd A	1054	Cmpnd A	1197
Cmpnd B	828	Cmpnd B	752	Cmpnd B	780

Następnie wyznaczane są średnie dla każdego związku wraz z innymi istotnymi danymi statystycznymi, co pozwala na ocenę odpowiedzi EAG dla badanych związków pod kątem ich przydatności do dalszych analiz.

Związek	EAG (μV)	Liczba pomiarów, N=
A	1115	3
B	787	3

Rycina 1. Reprezentatywny EAG dla odpowiedzi czułków samca (1 180 μV) na próbę wstępną (1^sz podmuch kontroli pozytywnej), która zostałaby odrzucona ze względu na słabą odpowiedź czułków po upewnieniu się, że czułki mają dobry kontakt z żelem. Niebieskie słupki w dolnych oknach reprezentują drugi dwusekundowy podmuch substancji lotnej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą rycinię.

Rycina 2. Reprezentatywna odpowiedź EAG czułków samicy (3,400 μV) na 1.^szą dawkę przed kontrolną, która byłaby uznana za odpowiednią. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną rycinę.

Rysunek 3. Reprezentatywny zapis EAG dla odpowiedzi antenalnej samic (1,680 μV) do kontroli końcowej (ostatniej kontroli pozytywnej dla każdego eksperymentu), co byłoby uznane za wynik słaby i sugerujące degradację czułków (<75% z 1^{Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.} przed kontrolą lub < 2^nd wartość puff próby kontrolnej przed badaniem). W tym przykładzie 1^Wprowadzenie zaciągnięcie kontrolne przed testem było 2,730 μV oraz 2^nd puff przed kontrolny był 2,350 μV. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony rysunek.

Rysunek 4. Reprezentatywny zapis EAG dla odpowiedzi czułków samicy (3,800 μV) na podmuch kandydowanej mieszaniny lotnych związków oraz późniejsze pomiary maksymalnego wychylenia początkowego (3,800 μV), nachylenia początkowego podczas czasu trwania podmuchu (0.3 s/1.2 mV = 0.25 s/mV) oraz nachylenia dla pozostałego czasu trwania podmuchu (1.6 s/1.9 mV = 0.84 s/mV). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony rysunek.

Rysunek 5. Małe zmodyfikowane naczynie zawierające macierz próbki oraz powiązane substancje lotne, które mają zostać skierowane strumieniem powietrza na czułki A. transitella .

Tabela 1. In situ emisja lotnych związków migdałów Nonpareil (2007) oraz odpowiedzi EAG określone przy użyciu innej, mniej czułej konfiguracji w programie Autospike.

Tabela 2. Przykład formularza do rejestrowania odpowiedzi antenalnych samców i samic na poszczególne komponenty lotne.

Tabela 3. Przykład formularza do rejestrowania reakcji antenalnych samców i samic na mieszaniny i/lub bukiety lotne.

Tabela 4. Przykłady przygotowania 10 mL roztworu o stężeniu 5 mg/mL dla dwóch różnych stosunków mieszanin.

Tabela 5. Przykład formularza do rejestracji dwóch następujących po sobie podań pojedynczych lotnych składników na czułki samców i samic.

Dyskusja

Wykorzystanie zapisów elektroantenogramów jako bioanalizy do określania odpowiedzi chemorecepcyjnych docelowego owada jest dość powszechne, a w literaturze można znaleźć liczne badania wykorzystujące EAG jako detektor dla effluentu z chromatografu gazowego (GC-EAD).^9,10 Przedstawiona metoda zapewni szybki screening równoważnych ilości komponentów lotnych z dużą liczbą powtórzeń, co pozwoli na wiarygodne przypisanie względnej responsywności. Program AutoSpike w oprogramowaniu Syntech jest odpowiednim narzędziem...