W niniejszym artykule przedstawiono prosty ilościowy test wychwytu powinowactwa w fazie ciekłej. Jest to niezawodna technika oparta na oddziaływaniu między kulkami magnetycznymi a białkami z markerem (np. nanociałami) z jednej strony oraz na powinowactwie między białkiem z markerem a drugim, znakowanym białkiem (np. poliovirus) z drugiej strony.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Analiza wychwytu powinowactwa w fazie ciekłej z użyciem kulek magnetycznych do badania oddziaływań białko-białko: przykład poliwirusa i nanoprzeciwciała
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
W niniejszym artykule przedstawiono prosty, ilościowy test powinowactwa w fazie ciekłej. Pod warunkiem, że jedno białko może zostać oznakowane tagiem, a drugie białko znacznikiem, metodę tę można zastosować do badania oddziaływań białko-białko. Opiera się ona z jednej strony na rozpoznawaniu białka z tagiem przez magnetyczne kulki powlekane kobaltem, a z drugiej na oddziaływaniu między białkiem z tagiem a drugim, specyficznym białkiem znakowanym. W pierwszej kolejności białka znakowane i z tagiem są mieszane i inkubowane w temperaturze pokojowej. Następnie dodaje się kulki magnetyczne rozpoznające tag, a związaną frakcję białka znakowanego oddziela się od frakcji niezwiązanej za pomocą magnesów. Ilość wychwyconego białka znakowanego można określić pośrednio, mierząc sygnał białka znakowanego pozostałego w frakcji niezwiązanej. Opisany test powinowactwa w fazie ciekłej jest niezwykle użyteczny podczas analizy białek wrażliwych na zmiany konformacyjne. Opracowanie i zastosowanie testu zademonstrowano na przykładzie oddziaływania między poliovirusem a nanobody rozpoznającymi poliovirusa1. Ponieważ poliovirus jest wrażliwy na zmiany konformacyjne2 po przytwierdzeniu do powierzchni stałej (wyniki nieopublikowane), zastosowanie metody ELISA jest ograniczone, w związku z czym preferowany powinien być system oparty na fazie ciekłej. Przykładem systemu opartego na fazie ciekłej, często stosowanego w badaniach nad polio3,4, jest test mikroimmunoprecypitacji białkiem A5. Mimo że test ten potwierdził swoją przydatność, wymaga on obecności struktury Fc, której brakuje w nanobody6,7. Jednakże te interesujące i stabilne przeciwciała jednodomenowe8 mogą zostać łatwo zmodyfikowane w celu wprowadzenia różnych tagów. Powszechnie stosowany tag (His)6 wykazuje powinowactwo do jonów bidentatnych, takich jak nikiel lub kobalt, które z kolei mogą być łatwo naniesione na kulki magnetyczne. Opracowaliśmy zatem ten prosty, ilościowy test powinowactwa oparty na magnetycznych kulkach powlekanych kobaltem. Poliovirus został znakowany 35S, aby umożliwić niezakłócone oddziaływanie z nanobody oraz umożliwić detekcję ilościową. Metoda ta jest łatwa w wykonaniu i może zostać wdrożona niskim kosztem, co dodatkowo wspiera możliwość efektywnej regeneracji kulek magnetycznych.
Protokół
Zasada (A) oraz ogólny opis metody (B) przedstawione są na Rysunku 1.
1. Przygotowanie buforu
- Przygotować bufor wiążący/płuczący, rozpuszczając w wodzie wodorofosforan sodu (50 mM) oraz chlorek sodu (300 mM), a następnie dostosować pH do wartości 8,0. Dodatkowo dodać Tween 20 (stężenie końcowe 0,01% (m/v)), metioninę (stężenie końcowe 2% (m/v)) oraz albuminę (stężenie końcowe 0,1% (m/v)) i doprowadzić do wymaganej objętości.
2. Przygotowanie kulek magnetycznych
Przygotować kulki magnetyczne zgodnie z instrukcją obsługi. W skrócie:
- Resuspenduj kulki magnetyczne za pomocą wortexa.
- Przenieś dla każdej próbki 10 μl resuspendowanych kulek magnetycznych (40 mg/ml) do probówki.
- Zgromadź kulki magnetyczne za pomocą magnesu, aż naddatek stanie się przejrzysty (+/- 30 sec), a następnie ostrożnie usuń naddatek.
- Umyj kulki magnetyczne dwukrotnie: resuspenduj kulki w 150 μl buforu Binding/Wash. Przesuń kulki magnetyczne na jedną stronę probówki za pomocą magnesu, aż naddatek stanie się przejrzysty, i ostrożnie usuń naddatek.
- Użyj 40 μl buforu Binding/Wash dla każdej próbki, aby resuspendować kulki (10 mg/ml).
3. Analiza wychwytu powinowactwem
Uwaga: Aby zmierzyć (kosmiczną) radioaktywność tła (0% radioaktywności), do próbki kontrolnej 1 nie dodaje się wirusa znakowanego radioaktywnie. Zamiast tego dodaje się taką samą objętość buforu do wiązania/płukania (Binding/Wash buffer).
Uwaga: 100% radioaktywności jest definiowane przez próbkę kontrolną 2, do której dodano wszystkie składniki z wyjątkiem nanociała. Zamiast niego dodano taką samą objętość buforu do wiązania/płukania (Binding/Wash buffer).
- Nanieś 2000 cpm poliwirusa szczepu Sabina typu 19 znakowanego 35S (promieniowanie β), rozcieńczonego buforem do wiązania i płukania (Binding/Wash buffer) do objętości 80 μl, do płytki mikrotitracyjnej z 96 dołkami.
- Dodaj 10 μl rozcieńczenia nanociała do poszczególnych dołków.
- Mieszaj przez około 10 sekund za pomocą wytrząsarki.
- Inkubuj próbki przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
- Dodaj 40 μl zawiesiny przemytych kulek magnetycznych i inkubuj przez 10 minut w temperaturze pokojowej przy ciągłym mieszaniu.
- Oddziel kulki od nadfiltratu za pomocą magnesu i przelej oczyszczony nadfiltr do probówki.
4. Pomiar promieniotwórczości
- Przenieś 50 μl supernatantu z kroku 3.6 do kolby do liczenia.
- Dodaj 3 ml płynu scyntylacyjnego i wymieszaj. Zmierz radioaktywność w liczniku scyntylacyjnym β.
5. Regeneracja kulek
- Zebrać zużyte kuleczki magnetyczne do probówki i odwirować przy 500 x g przez 2 minuty lub do momentu uzyskania klarownego supernatantu.
- Usunąć supernatant i resuspender kuleczki w 6 ml 0.5 M NaOH.
- Przenieść zawiesinę do kilku probówek i inkubować w kąpieli ultradźwiękowej przez 5 minut.
- Użyć magnesów do zebrania kuleczek magnetycznych i usunąć supernatant.
- Dodać 1 ml 2% roztworu SDS do każdej probówki i resuspender za pomocą wortexa. Gotować przez 5 minut.
- Zebrać kuleczki i usunąć supernatant. Resuspender kuleczki w 1 ml 0.2 M EDTA (pH=7).
- Inkubować probówki w kąpieli ultradźwiękowej przez 5 minut, a następnie ponownie usunąć supernatant.
- Dodać 1 ml wody do każdej probówki i resuspender kuleczki. Zebrać kuleczki i usunąć supernatant. Powtórzyć ten etap płukania dwukrotnie.
- Usunąć supernatant i resuspender kuleczki w 1 ml roztworu 10 mM CoCl2. Inkubować na wytrząsarce przez 10 minut.
- Usunąć supernatant, używając magnesu do zebrania kuleczek, i resuspender w 1 ml buforu wiążącego/płuczącego (Binding/Wash buffer).
- Usunąć supernatant i przemyć kuleczki dwukrotnie, używając 1 ml 20% (v/v) etanolu.
- Resuspender kuleczki w ich pierwotnej objętości 20% (v/v) etanolu, aby uzyskać zregenerowane kuleczki o stężeniu 40 mg/ml.
6. Interpretacja wyników
- Próbka kontrolna 1, do której nie dodano wirusa znakowanego izotopowo, służy do korekty tła radioaktywnego oraz wyznaczenia wartości 0% radioaktywności. Próbka kontrolna 2, która nie zawiera nanociała i w której konsekwentnie cały znakowany izotopowo wirus pozostaje w supernatancie, jest przyjęta jako wartość 100% radioaktywności.
- Procent radioaktywności w supernatancie (= a %) jest miarą całkowitego wytrącenia (= 100 - a %) wirusa znakowanego izotopowo przez nanociało.
7. Reprezentatywne wyniki
Reprezentatywne wyniki dla tego testu wychwytu powinowactwa przedstawiono na Rysunkach 2, 3 i 4. Na Rysunku 2 pokazano powinowactwo PVSS38C, nanoprzeciwciała specyficznego dla poliovirusa. Powinowactwo PVSS38C badano dla trzech różnych antygenów poliovirusa: antygenu natywnego (antygen N), antygenu podgrzanego (antygen H) oraz podjednostek 14S. Antygen N to nienaruszony, zakaźny wirus. Podczas podgrzewania wirusa (20 minut w 56 °C) lub jego przytwierdzenia do stałej powierzchni (wyniki nieopublikowane) zmienia się konformacja kapsydu, co prowadzi do (częściowej) utraty wirusowego RNA oraz białka kapsydu VP4, w wyniku czego powstają puste kapsydy nazywane antygenami H. Podjednostki 14S są produktami pośrednimi składania. Antygeny te są rozpoznawane przez różne zestawy przeciwciał po immunizacji10 i posiadają zatem różne epitopy oraz miejsca antygenowe. Na rysunku procent radioaktywności w supernatancie przedstawiono jako funkcję stężenia nanoprzeciwciała. Widać, że radioaktywność w supernatancie próbek zawierających znakowane radioaktywnie podjednostki 14S maleje wraz ze wzrostem stężenia nanoprzeciwciała PVSS38C. Można to interpretować jako zwiększenie ilości podjednostek 14S poliovirusa związanych z nanoprzeciwciałem PVSS38C, a pośrednio z kulkami magnetycznymi. Miano wychwytu (= stężenie nanoprzeciwciała niezbędne do wychwycenia 50% znakowanego radioaktywnie wirusa) można obliczyć graficznie jako 0,099 nM. Nie zaobserwowano powinowactwa PVSS38C do formy antygenu N i antygenu H poliovirusa. Na podstawie tych danych wyinterpretowano, że PVSS38C oddziałuje z epitopem, który występuje wyłącznie na podjednostce 14S, a nie na dwóch pozostałych formach antygenowych poliovirusa.
Aby wykazać, że utrata radioaktywności z supernatantu wynika wyłącznie ze specyficznego powinowactwa nanobody do jego antygenów, ten sam test przeprowadzono z użyciem Nb1 – nanobody wytworzonego przeciwko regulatorowi transkrypcyjnemu lrpB z *Sulfolobus sulfataricus*, o którym wiadomo, że nie wykazuje on żadnych interakcji z żadnym antygenem poliwirusa. Wynik tego testu przedstawiono na Rysunku 3. Cały znakowany radioaktywnie wirus pozostał w supernatantach, co dowodzi braku reaktywności Nb1 wobec trzech form antygenowych poliwirusa.
Powtarzalność wyników sprawdzono poprzez powtórzenie eksperymentu łącznie osiem razy dla jednego nanociała (tzn. PVSP29F), w różne dni i przez różne osoby. Wyniki przedstawiono na Ryc. 4. Średnią wartość procentową radioaktywności w supernatnacie obliczono dla każdego stężenia nanociała i przedstawiono wraz z odchyleniem standardowym.
Rysunek 1. Przegląd zasady (A) oraz metody (B) analizy. A. Nanoprzeciwciała z tagiem His, które specyficznie rozpoznają określony antygen poliovirusa, będą w stanie oddziaływać z kulkami magnetycznymi powlekanymi kobaltem i spowodują wytrącenie radioaktywnie znakowanego wirusa. B. Do radioaktywnie znakowanego poliovirusa dodaje się nanoprzeciwciała z tagiem His i inkubuje. Następnie dodaje się kulki magnetyczne powlekane kobaltem i przeprowadza separację magnetyczną antygenu związanego i niezwiązanego. Mierzy się radioaktywność nadkładu, na podstawie której można wyznaczyć ilość wychwyconego antygenu.
Rycina 2. Wychwyt powinowactwa różnych antygenów poliwirusa przez nanociało PVSS38C za pomocą kulek magnetycznych. Procent radioaktywności w nadfiltrze przedstawiono jako funkcję stężenia PVSS38C. W przypadku 14S stwierdzono zależność stężenie-odpowiedź, co wskazuje na oddziaływanie PVSS38C z epitopem obecnym wyłącznie na 14S. Nie wykryto istotnego oddziaływania z antygenem N ani antygenem H, choć przy bardzo wysokich stężeniach zauważono pomijalny wychwyt niespecyficzny.
Rysunek 3. Magnetyczne wychwytywanie powinowactwa różnych antygenów poliwirusa przez nanociało Nb1. Procent radioaktywności obecnej w supernatancie przedstawiono jako funkcję stężenia Nb1. Wiadomo, że Nb1 nie wchodzi w interakcje z żadnym antygenem ani podjednostką poliwirusa. Ponieważ 100 % radioaktywności znajduje się w supernatancie, żaden wirus nie został związany niespecyficznie z Nb1. Utrata radioaktywności na rysunku 2 wynika zatem wyłącznie ze specyficznego powinowactwa nanociała do jego antygenów.
Rycina 4. Powtarzalność testu. Średnią wartość procentową radioaktywności w supernatancie przedstawiono w funkcji stężenia nanoprzeciwciała. Eksperyment powtórzono ośmiokrotnie w różne dni i przez różne osoby. Odchylenie standardowe przedstawiono w postaci pionowych słupków.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W protokole radioaktywność antygenu oddziałującego z nanociałem definiuje się jako utratę radioznaczonego wirusa z supernatantu. Zatem ilość wytrąconej radioaktywności (=100 - a %) (związanej z koralikami magnetycznymi) może być oszacowana w sposób pośredni na podstawie radioaktywności w supernatancie (= a %). Z drugiej strony możliwe jest również bezpośrednie pomiar radioaktywności wytrąconej frakcji związanej antygenu poprzez elucję immunokompleksów z koralików magnetycznych za pomocą 500 mM imidazolu. Wcześniej wykaza...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie mamy nic do ujawnienia.
Podziękowania
Autorzy dziękują pracownikom wydziału Biotechnologii Farmaceutycznej i Biologii Molekularnej, a w szczególności Monique De Pelsmacker za przygotowanie wirusa znakowanego radioaktywnie. Jesteśmy wdzięczni Ellen Merckx i Hadewych Halewyck za interesujące uwagi i dyskusje oraz Gerrit De Bleeser za pomoc w laboratorium. Praca ta była wspierana finansowo z grantu OZR Vrije Universiteit Brussel (OZR1807), Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek Vlaanderen (G.0168.10N) oraz Światowej Organizacji Zdrowia (TSA 200410791). Lise Schotte jest stypendystką przeddoktorancką Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek Vlaanderen (FWO).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Izolacja i pulldown białek z tagiem His za pomocą Dynabeads | Invitrogen | 101.03D | Kuleczki magnetyczne |
| Optiphase ’HiSafe’ 2 | PerkinElmer, Inc. | 1200 - 436 | Płyn scyntylacyjny |
Bibliografia
- Thys, B., Schotte, L., Muyldermans, S., Wernery, U., Hassanzadeh-Ghassabeh, G., Rombaut, B. In vitro antiviral activity of single domain antibody fragments against poliovirus. Antiviral Res. 87, 257-264 (2010).
- Meloen, R. H., Briaire, J. A study of the cross-reacting antigens on the intact foot-and-mouth disease virus and its 12S subunits with antisera against the structural proteins. J. Gen. Virol. 51, 107-116 (1980).
- Vrijsen, R., Rombaut, B., Boeye, A. A simple quantitative protein A micro-immunoprecipitation method: assay of antibodies to the N and H antigens of poliovirus. J. Immunol. Methods. 59, 217-220 (1983).
- Rombaut, B., Jore, J., Boeye, A. A competition immunoprecipitation assay of unlabeled poliovirus antigens. J. Virol. Methods. 48, 73-80 (1994).
- Kessler, S. W. Rapid isolation of antigens from cells with a staphylococcal protein A-antibody adsorbent: parameters of the interaction of antibody-antigen complexes with protein A. J. Immunol. 115, 1617-1624 (1975).
- Hamers-Casterman, C., Atarhouch, T., Muyldermans, S., Robinson, G., Hamers, C., Songa, B. ajyana, Bendahman, E., N,, Hamers, R. Naturally occurring antibodies devoid of light chains. Nature. 363, 446-448 (1993).
- Arbabi Ghahroudi, M., Desmyter, A., Wyns, L., Hamers, R., Muyldermans, S. Selection and identification of single domain antibody fragments from camel heavy-chain antibodies. FEBS Lett. 414, 521-526 (1997).
- Muyldermans, S. Single domain camel antibodies: current status. Rev. Mol. Biotechnol. 74, 277-302 (2001).
- Rombaut, B., Vrijsen, R., Boeye, A. Epitope evolution in poliovirus maturation. Arch. Virol. 76, 289-298 (1983).
- Brioen, P., Sijens, R. J., Vrijsen, R., Rombaut, B., Thomas, A. A., Jackers, A., Boeye, A. Hybridoma antibodies to poliovirus N and H antigen. Arch. Virol. 74, 325-330 (1982).
- Thys, B., Saerens, D., Schotte, L., De Bleeser, G., Muyldermans, S., Hassanzadeh-Ghassabeh, G., Rombaut, B. A simple quantitative affinity capturing assay of poliovirus antigens and subviral particles by single-domain antibodies using magnetic beads. J. Virol. Methods. 173, 300-305 (2011).
- Wild, D. The Immunoassay Handbook. , Third edition, Elsevier. (2005).
- Kremser, L., Konecsni, T., Blaas, D., Kenndler, E. Fluorescence labeling of human rhinovirus capsid and analysis by capillary electrophoresis. Anal. Chem. 76, 4175-4181 (2004).
- Pelkmans, L., Kartenbeck, J., Helenius, A. Caveolar endocytosis of simian virus 40 reveals a new two-step vesicular-transport pathway to the ER. Nat. Cell Biol. 3, 473-483 (2001).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
