Test wychwytywania powinowactwa do fazy ciekłej przy użyciu kulek magnetycznych do badania interakcji białko-białko: przykład wirusa polio-nanoma

Podsumowanie

W tym artykule przedstawiono prosty, ilościowy test wychwytywania powinowactwa do fazy ciekłej. Jest to niezawodna technika oparta z jednej strony na interakcji między kulkami magnetycznymi a znakowanymi białkami (np. nanociałami) oraz powinowactwem między znakowanym białkiem a drugim, znakowanym białkiem (np. wirusem polio) z drugiej.

Streszczenie

W tym artykule przedstawiono prosty, ilościowy test wychwytywania powinowactwa do fazy ciekłej. Pod warunkiem, że jedno białko może być znakowane, a inne znakowane, metoda ta może być stosowana do badania interakcji białko-białko. Opiera się ona z jednej strony na rozpoznawaniu znakowanego białka przez kulki magnetyczne pokryte kobaltem, a z drugiej strony na interakcji między znakowanym białkiem a drugim specyficznym białkiem, które jest znakowane. Najpierw znakowane i znakowane białka miesza się i inkubuje w temperaturze pokojowej. Kulki magnetyczne, które rozpoznają znacznik, są dodawane, a związana frakcja znakowanego białka jest oddzielana od frakcji niezwiązanej za pomocą magnesów. Ilość znakowanego białka, które jest wychwytywane, można określić w sposób pośredni, mierząc sygnał znakowanego białka pozostałego we frakcji niezwiązanej. Opisany test powinowactwa do fazy ciekłej jest niezwykle przydatny, gdy testowane są białka wrażliwe na konwersję konformacyjną. Wykazano opracowanie i zastosowanie testu w odniesieniu do interakcji między wirusem polio a wirusem polio rozpoznającym nanociała¹. Ponieważ wirus polio jest wrażliwy na konwersję^{konformacyjną 2} po przyczepieniu do stałej powierzchni (wyniki niepublikowane), stosowanie testu ELISA jest ograniczone i dlatego należy preferować system oparty na fazie ciekłej. Przykładem systemu opartego na fazie ciekłej, często stosowanego w badaniach nad polio^3,4,^{jest test} immunoprecypitacyjny mikrobiałka A5. Mimo że test ten dowiódł swojej przydatności, wymaga struktury Fc, której nie ma w nanociałach^6,7. Jednak jako kolejną okazję, te interesujące i stabilne przeciwciała jednodomenowe⁸ można łatwo zaprojektować z różnymi znacznikami. Szeroko stosowany znacznik (His)₆ wykazuje powinowactwo do jonów dwuwartościowych, takich jak nikiel lub kobalt, które z kolei można łatwo pokryć kulkami magnetycznymi. W związku z tym opracowaliśmy ten prosty ilościowy test wychwytywania powinowactwa oparty na kulkach magnetycznych pokrytych kobaltem. Wirus polio został oznaczony symbolem ³⁵S, aby umożliwić niezakłóconą interakcję z nanociałami i umożliwić ilościowe wykrywanie. Metoda jest łatwa do wykonania i może być ustalona przy niskich kosztach, co jest dodatkowo wspierane przez możliwość skutecznej regeneracji kulek magnetycznych.

Protokół

Zasada (A) i przegląd metody (B) są przedstawione na rysunku 1.

1. Przygotowanie bufora

1. Przygotować bufor wiążący/przemywać, rozpuszczając diwodorofosforan sodu (50 mM) i chlorek sodu (300 mM) w wodzie i dostosować pH do 8,0. Dodatkowo dodać Tween 20 (stężenie końcowe 0,01% (m/v)), metioninę (stężenie końcowe 2% (m/v)) i albuminę (stężenie końcowe 0,1% (m/v)) i dostosować do wymaganej objętości.

2. Przygotowanie koralików magnetycznych

Przygotuj koraliki magnetyczne zgodnie z instrukcją obsługi. Krótko:

1. Zawieś ponownie kulki magnetyczne za pomocą wiru.
2. Dla każdej próbki przenieść 10 μl zawieszonych kulek magnetycznych (40 mg/ml) do probówki.
3. Zbierz kulki magnetyczne za pomocą magnesu, aż supernatant będzie czysty (+/- 30 sekund) i ostrożnie usuń supernatant.
4. Umyj kulki magnetyczne dwa razy: zawieś je ponownie w 150 μl buforu do wiązania/mycia. Przenieś kulki magnetyczne na jedną stronę rurki za pomocą magnesu, aż supernatant będzie czysty i ostrożnie usuń supernatant.
5. Użyć 40 μl buforu wiążącego/płuczącego dla każdej próbki, aby ponownie zawiesić kulki (10 mg/ml).

3. Test wychwytywania powinowactwa

Uwaga: Aby zmierzyć radioaktywność (kosmiczną) tła (0% radioaktywności), do próbki kontrolnej 1 nie dodaje się radioaktywnego wirusa. Zamiast tego dodawany jest ten sam bufor wiązania/mycia woluminu.

Uwaga: 100% radioaktywność jest definiowana przez próbkę kontrolną 2, do której dodawane są wszystkie składniki z wyjątkiem nanociała. Zamiast tego dodawany jest ten sam bufor wiązania/mycia woluminu.

1. Wprowadzić 2000 cpm wirusa polio typu 1⁹ znakowanego ³⁵S (promieniowanie β) szczepu Sabin, rozcieńczonego buforem wiążącym/płuczącym do 80 μl, do 96-dołkowej płytki do mikromiareczkowania.
2. Dodać 10 μl rozcieńczenia nanocząsteczki do studzienek.
3. Mieszaj przez około 10 sekund za pomocą shakera.
4. Pozostawić próbki do inkubacji przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
5. Dodać 40 μl przemytej zawiesiny kulek magnetycznych i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej, ciągle wstrząsając.
6. Oddzielić kulki i supernatant za pomocą magnesu i przenieść oczyszczony supernatant do probówki.

4. Pomiar radioaktywności

1. Przenieść 50 μl supernatantu z etapu 3.6 do kolby liczącej.
2. Dodać 3 ml płynu scyntylacyjnego i wymieszać. Zmierz radioaktywność w liczniku β-scyntylacyjnym.

5. Recykling koralików

1. Zebrać zużyte kulki magnetyczne do probówki i odwirować przy 500 x g przez 2 minuty lub do uzyskania klarownego supernatantu.
2. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić kulki w 6 ml 0,5 M NaOH.
3. Przenieść zawiesinę do wielu probówek i inkubować w łaźni ultradźwiękowej przez 5 minut.
4. Użyj magnesów, aby zebrać kulki magnetyczne i usunąć supernatant.
5. Dodać 1 ml 2% roztworu SDS do każdej probówki i ponownie zawiesić za pomocą wiru. Gotować przez 5 minut.
6. Zebrać kulki i usunąć supernatant. Zawiesić kulki w 1 ml 0,2 M EDTA (pH = 7).
7. Inkubować probówki w łaźni ultradźwiękowej przez 5 minut i ponownie usunąć supernatant.
8. Dodaj 1 ml wody do każdej probówki i ponownie zawieś kulki. Zebrać kulki i usunąć supernatant. Powtórz ten krok prania dwukrotnie.
9. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić kulki w 1 ml 10 mM roztworu CoCl₂. Umieść na shakerze na 10 minut.
10. Usunąć supernatant za pomocą magnesu w celu zebrania kulek i ponownie zawiesić w 1 ml buforu wiążącego/płuczącego.
11. Usunąć supernatant i umyć kulki dwa razy przy użyciu 1 ml 20% (v/v) etanolu
12. Zawiesić kulki w ich pierwotnej objętości 20% (v/v) etanolu, aby uzyskać zregenerowane kulki w stężeniu 40 mg/ml.

6. Interpretacja wyników

1. Próbka kontrolna 1, do której nie dodano wirusa znakowanego radioizotopem, zostanie wykorzystana do skorygowania radioaktywności tła i ustalenia wartości promieniotwórczości 0%. Próbkę kontrolną 2, która nie zawiera nanocząsteczki i w związku z tym cały wirus znakowany radioaktywnie pozostaje w supernatancie, ustala się jako wartość promieniotwórczości 100%.
2. Procentowa zawartość promieniotwórczości w supernatance (= %) jest miarą całkowitego wytrącenia (= 100 - %) wirusa znakowanego radioaktywnie przez nanociało.

7. Reprezentatywne wyniki

Reprezentatywne wyniki dla tego testu przechwytywania powinowactwa są pokazane na rysunkach 2, 3 i 4. Na rycinie 2 pokazano powinowactwo PVSS38C, gatunku nanobody specyficznego dla wirusa polio. Powinowactwo PVSS38C badano dla trzech różnych antygenów wirusa polio: antygenu natywnego (antygen N), antygenu cheateda (antygenu H) i podjednostek 14S. Antygen N to nienaruszony wirus, który jest zakaźny. Gdy wirus jest podgrzewany (20 minut w temperaturze 56 °C) lub przyczepiany do stałej powierzchni (wyniki niepublikowane), konformacja kapsydu zmienia się, powodując (częściową) utratę wirusowego RNA i białka kapsydu VP4, i powstają puste kapsydy, które są następnie nazywane antygenami H. Podjednostki 14S są półproduktami montażowymi. Antygeny te są rozpoznawane przez różne zestawy przeciwciał po szczepieniu¹⁰ i dlatego mają różne epitopy i miejsca antygenowe. Na rysunku procent promieniotwórczości stwierdzonej w supernatancie jest przedstawiony jako funkcja stężenia nanociała. Można zauważyć, że promieniotwórczość w supernatancie próbek zawierających znakowane radioizotopowo podjednostki 14S zmniejsza się wraz ze wzrostem stężeń PVSS38C nanocząsteczkowej. Można to przetłumaczyć jako wzrost ilości podjednostek 14S wirusa polio połączonych z PVSS38C nanobody i pośrednio z kulkami magnetycznymi. Miano wychwytywania (= stężenie nanocząsteczki niezbędne do wychwycenia 50% wirusa znakowanego radioaktywnie) można obliczyć graficznie jako 0,099 nM. Nie obserwuje się powinowactwa PVSS38C do N-antygenowej i H-antygenowej postaci wirusa polio. Na podstawie tych danych interpretuje się, że PVSS38C oddziałuje z epitopem, który jest obecny wyłącznie w podjednostce 14S, a nie w dwóch innych antygenowych formach wirusa polio.

Aby wykazać, że utrata radioaktywności z supernatantu wynika tylko ze specyficznego powinowactwa nanonika do jego antygenów, ten sam test został przeprowadzony z Nb1, nanocząsteczką wygenerowaną przeciwko regulatorowi transkrypcji lrpB Sulfolobus sulfataricus i o której wiadomo, że nie ma interakcji z żadnym antygenem wirusa polio. Wynik tego testu przedstawiono na rysunku 3. Cały znakowany radioaktywnie wirus pozostaje w supernatantach, co wskazuje, że nie ma reaktywności Nb1 przeciwko trzem formom antygenowym wirusa polio.

Powtarzalność wyników została przetestowana poprzez powtórzenie eksperymentu w sumie osiem razy dla jednego danego nanobody (tj. PVSP29F) w różnych dniach i przez różne osoby. Wyniki przedstawiono na rysunku 4. Średnia wartość procentowej promieniotwórczości w supernatantze została obliczona dla każdego stężenia nanonika i jest przedstawiona zgodnie z jego odchyleniem standardowym.

Rysunek 1. Przegląd zasady (A) i metody (B) testu. A. Znakowane przez Hisa nanociała, które specyficznie rozpoznają określony antygen wirusa polio, będą w stanie wchodzić w interakcje z pokrytymi kobaltem kulkami magnetycznymi i wytrącać radioaktywnie znakowanego wirusa. B. Znakowane przez niego nanociała dodaje się do znakowanego radioaktywnie wirusa polio i inkubuje. Dodaje się kulki magnetyczne pokryte kobaltem i przeprowadza się separację magnetyczną antygenu związanego/niezwiązanego. Mierzy się radioaktywność supernatantu i można określić ilość wychwyconego antygenu.

Rysunek 2. Wychwytywanie powinowactwa kulek magnetycznych różnych antygenów wirusa polio przez nanobody PVSS38C. Procent promieniotwórczości stwierdzony w supernatantze jest przedstawiany jako funkcja stężenia PVSS38C. Dla 14S można znaleźć zależność stężenie-odpowiedź, pokazującą oddziaływanie PVSS38C z epitopem występującym wyłącznie na 14S. Nie można wykryć istotnej interakcji z antygenem N- ani H, chociaż zauważa się znikome nieswoiste wychwytywanie w bardzo wysokich stężeniach.

Rysunek 3. Wychwytywanie powinowactwa kulek magnetycznych różnych antygenów wirusa polio przez nanobody Nb1. Procent radioaktywności stwierdzony w supernatancie jest reprezentowany jako funkcja stężenia Nb1. Wiadomo, że Nb1 nie wchodzi w interakcje z żadnym antygenem lub podjednostką wirusa polio. Ponieważ 100 % promieniotwórczości znajduje się w supernatancie, żaden wirus nie był niespecyficznie związany z Nb1. Utrata radioaktywności na rysunku 2 wynika zatem wyłącznie ze specyficznego powinowactwa nanocząsteczki do swoich antygenów.

Rysunek 4. Odtwarzalność testu. Średnia wartość procentowej promieniotwórczości w supernatancie jest przedstawiana jako funkcja stężenia nanociała. Eksperyment został powtórzony osiem razy w różnych dniach i przez różne osoby. Odchylenie standardowe jest reprezentowane przez pionowe słupki.

Dyskusja

W protokole radioaktywność antygenu oddziałującego z nanocząsteczką jest zdefiniowana jako utrata znakowanego radioaktywnie wirusa z supernatantu. W związku z tym ilość promieniotwórczości wytrąconej (=100 - a %) (związanej z kulkami magnetycznymi) może być oszacowana w sposób pośredni na podstawie promieniotwórczości w supernatancie (= a %). Z drugiej strony możliwy jest również pomiar radioaktywności wytrąconej frakcji związanej antygenu w sposób bezpośredni poprzez elucję immunokompleksów z kulek magnetycznych za pomo...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Dynabeads His-Tag Izolacja i ściąganie	Invitrogen	101.03D	Koraliki magnetyczne
Optiphase ' HiSafe" 2	PerkinElmer, Inc.	1200 - 436	Płyn scyntylacyjny