Zoptymalizowana analiza metylacji DNA i ekspresji genów z małych, anatomicznie zdefiniowanych obszarów mózgu

Summary

Pokazano usprawniony przepływ pracy do badania metylacji DNA i zmian ekspresji genów we wczesnym okresie stresu. Począwszy od separacji nowonarodzonych myszy od matki i izolacji dyskretnych tkanek mózgowych, reprezentujemy protokół jednoczesnej izolacji DNA i RNA z wykrojników tkanki mózgowej w celu późniejszego sekwencjonowania wodorosiarczynów i analizy RT-PCR.

Abstract

Narażenie na dietę, narkotyki i przeciwności losu we wczesnym okresie życia podczas wrażliwych okien życia ^1,2 może prowadzić do trwałych zmian w ekspresji genów, które przyczyniają się do wyświetlania fizjologicznych i behawioralnych fenotypów. Takie programowanie środowiskowe prawdopodobnie zwiększy podatność na choroby metaboliczne, sercowo-naczyniowe i psychiczne ^3,4.

Metylacja DNA i modyfikacje histonów są uważane za kluczowe procesy w pośrednictwie dialogu gen-środowisko i wydają się również leżeć u podstaw programowania środowiskowego ⁵. U ssaków metylacja DNA zazwyczaj obejmuje kowalencyjne dodawanie grupy metylowej w pozycji 5 cytozyny w kontekście dinukleotydów CpG.

Metylacja CpG zachodzi w sposób wysoce specyficzny dla tkanek i komórek, co sprawia, że wyzwaniem jest badanie dyskretnych, małych obszarów mózgu, gdzie heterogeniczność komórkowa jest wysoka, a ilość tkanek ograniczona. Ponadto, ponieważ ekspresja genów i metylacja są zdarzeniami ściśle powiązanymi, można uzyskać większą wartość, porównując oba parametry w tej samej próbce.

Tutaj przedstawiono krok po kroku protokół (Rysunek 1) do badania programowania epigenetycznego w mózgu, wykorzystujący paradygmat "separacji matki" przeciwności losu we wczesnym okresie życia dla celów ilustracyjnych. Protokół opisuje przygotowanie mikrociosów z mózgów myszy w różnym wieku, z których można jednocześnie wyizolować DNA i RNA, umożliwiając w ten sposób analizę metylacji DNA i ekspresji genów w tej samej próbce.

Protocol

1. Programowanie według przeciwności losu we wczesnym okresie życia

Separacja matek (MS) jest przeprowadzana w celu wywołania stresu we wczesnym okresie życia (ELS) u szczeniąt urodzonych przez myszy C57BL/6N w ciąży w czasie (dzień po urodzeniu 0 (P0) w dniu urodzenia).

1. Poszczególne mioty umieszcza się w czystych klatkach (z poduszką grzewczą) na 3 godziny dziennie od P1-10.
2. Młode kontrolne (inne niż ELS) pozostają niezakłócone w gnieździe matki przez cały czas.
3. Młode są trzymane z matkami do momentu odsadzenia (P21), po czym są trzymane w grupach dopasowanych płciowo (3-5 myszy w klatce) w standardowych warunkach utrzymania zwierząt laboratoryjnych.

2. Izolacja i sekcja tkanki mózgowej

1. Myszy są zabijane w pożądanym wieku przez zwichnięcie szyjki macicy. Uwaga: ponieważ protokół ten obejmuje paradygmat stresu, nie podaje się znieczulenia przed zwichnięciem szyjki macicy, aby uniknąć zakłócenia normalnej fizjologicznej regulacji hormonów stresu. Czaszki są otwierane, a mózgi są ostrożnie usuwane i natychmiast zamrażane przez zanurzenie w suchym lodzie izopentanowym, przed przechowywaniem w temperaturze -80 °C.
2. Mózgi są poddawane kriosekcji (grubość 10 μm); skrawki są montowane na szkiełkach Superfrost i utrzymywane w temperaturze -20 °C. Odniesienie do standardowego atlasu stereotaktycznego myszy (np. Paxinos ⁶) stosuje się w celu sprawdzenia precyzji anatomicznej i zapewnienia włączenia obszaru zainteresowania (np. dla neuronów w jądrze przykomorowym - PVN - zebrać skrawki zaczynające się na poziomie rostralnego PVN, bregma od -0,75 do -0,85).
3. Skrawki są barwione fioletem krezylowym, aby ułatwić identyfikację różnych struktur mózgu. Stemple (0,8 mm) obszarów zainteresowania (np. PVN) uzyskuje się metodą mikrodysekcji in loco.

3. Ekstrakcja kwasów nukleinowych z ciosów mózgowych

Zoptymalizowany protokół jednoczesnej ekstrakcji DNA i RNA z maleńkich, neuroanatomicznie zdefiniowanych obszarów mózgu do analizy wodorosiarczynu i ekspresji genów jest opisany ⁷.

Uwaga: Biorąc pod uwagę, że RNA jest mniej stabilne niż DNA w buforze GTC, zalecamy najpierw przetworzenie RNA. Homogenat używany do oczyszczania DNA może być w tym czasie przechowywany w temperaturze pokojowej (RT).

1. Homogenizować stemple za pomocą pipety i wirownika w 400 μl buforu tiocyjanianu guanidyny (GTC) (4,5 M tiocyjanianu guanidyny, 2% N-lauroilosarkozyny, 50 mM EDTA pH 8,25 mM Tris-HCl pH 7,5, 0,1 M beta-merkaptoetanolu, 0,2% środka przeciwpieniącego A) w temperaturze pokojowej, przechodząc kilkakrotnie przez strzykawkę podskórną (29G) (Rysunek 2).
2. Podziel lizat na równe części; zarówno RNA, jak i DNA mogą być ekstrahowane w tym samym czasie lub osobno, w zależności od konkretnych potrzeb eksperymentalnych.
3. Do oczyszczania RNA dodać 1/10 objętości NaOAc, 1 objętość AquaPhenolu (Appligene) (pH 4) i 1/2 objętości chloroformu:izoamylu (24:1) do lizatu. Po każdym etapie energicznie wirować i inkubować na lodzie przez 10 minut, odwirować (20 minut w 10 000 g w temperaturze 4 °C); dodać równą objętość 70% EtOH do fazy jednorodnej.
4. Przenieść mieszaninę do kolumny wirowej RNA (np. nukleospinowego RNA II z Macherey-Nagela) i przeprowadzić etapy mineralizacji i płukania DNazy na kolumnie (zgodnie z protokołem producenta); wymyć RNA w 25 μl H₂O.
5. Do oczyszczania DNA stosuje się zoptymalizowany protokół zestawu Qiagen DNeasy Blood and Tissue Kit. Zrównoważyć lizat z równymi objętościami buforu AL i 100% EtOH, załadować na wirówkę z kolumną wirową (1 min przy 10 000 g przy wilgotności względnej) i odrzucić przepływ.
6. Dodać 500 μl buforu AW1, w tym 5 μl RNAzy (1 mg/ml) do kolumny i inkubować przez 10 minut w temperaturze suchej masy. Odwirować (1 min przy 10 000 g, RT) i odrzucić przepływ.
7. Przepłukać kolumnę z 500 μl buforu AW2, odrzucić przepływową i odwirować pustą kolumnę (1 min przy 15 000 g).
8. Dodać wstępnie podgrzany (70 °C) bufor AE i inkubować kolumny przez 10 minut w temperaturze 70 °C. Eluować przez odwirowanie (1 min, 10 000 g), ponownie zastosować przepływ i powtórzyć etap wirowania.

Użyj spektrofotometru, aby określić stężenie DNA i RNA. Typowy cios PVN daje ~600 ng DNA i ~400 ng RNA. Do analizy ekspresji genów metodą ilościowego PCR (qPCR) zwykle używamy ~100 ng RNA w reakcji odwrotnej transkrypcji.

4. Konwersja wodorosiarczynu

Wodorosiarczyn sodu jest używany do przekształcania niemetylowanych cytozyn w uracyle. Natomiast cytozyny metylowane są chronione przed konwersją. Dlatego wszystkie cytozyny, które są wykrywane w końcowym sekwencjonowaniu amplikonu PCR wodorosiarczynu, reprezentują cytozyny metylowane.

Konwersja wodorosiarczynu powoduje znaczną degradację DNA, co może być czynnikiem ograniczającym w analizie PCR. Zoptymalizowane warunki reakcji, które maksymalizują konwersję cytozyny, zmniejszają fragmentację DNA i utrzymują jednoniciowe DNA nawet w niższych temperaturach, można osiągnąć za pomocą zestawu EpiTect Bisulfite Kit. W naszych rękach ~200 ng DNA oczyszczonego z mikropunchów zapewnia wystarczającą ilość materiału wyjściowego do reakcji wodorosiarczynowej.

Aby zapobiec różnicom w efektywności reakcji konwersji, ilość matrycowego DNA powinna być utrzymywana na stałym poziomie wśród wszystkich próbek przetwarzanych podczas eksperymentu. Ponadto odczyty sekwencyjne powinny być analizowane pod kątem wydajności konwersji, badając współczynnik nieprzekształconych elementów niebędących CpG. Wskaźnik ten powinien przekraczać 98%. Niższe wartości wskazują na niepełną lub nieefektywną konwersję wodorosiarczynu, a leżące u jej podstaw sekwencje powinny zostać wyłączone z analizy.

5. PCR z wodorosiarczynem

1. Projektowanie starterów sekwencjonowania wodorosiarczynowego, które są specyficzne dla DNA przekształconego w wodorosiarczyn (patrz dyskusja); Oprogramowanie Methyl Primer Express (https://products.appliedbiosystems.com/ab/en/US/adirect/ab?cmd=catNavigate2&catID=602121) pomoże w tym i pomoże określić optymalne temperatury wyżarzania w eksperymentach pilotażowych.
2. Przygotować PCR-Master-Mix (dla jednej reakcji) w następujący sposób:
   2,5 μl 10x bufor PCR
   0,5 μl 10 mM dNTPs
   1 μl 10 μM starter do przodu
   1 μl 10 μM podkładu odwrotnego
   0,125 μl Qiagen Hotstart Taq Plus
   napełnić do 23 μl H₂O
   
3. Dodać 2 μl DNA poddanego działaniu wodorosiarczynu do reakcji.
4. Amplifikuj przy użyciu następujących warunków:
   1 cykl 6 min 95 °C
   45-50 cykli po 1 min 95 °C, 1 min przy optymalnej temperaturze wyżarzania, 1 min 72 °C
   1 cykl 5 min 72 °C
   

Analizuj 7 μl produktu PCR za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym, aby sprawdzić wielkość amplikonu i oczyścić pozostałą reakcję PCR do późniejszej ligacji za pomocą dostępnego na rynku zestawu do czyszczenia PCR (np. ekstraktu Machereya-Nagela z nukleospinu). W przypadku uzyskania dodatkowych niepożądanych produktów PCR zaleca się oczyszczenie żelem.

6. Sekwencjonowanie wodorosiarczynu

Profile metylacji DNA o wysokiej rozdzielczości, wydedukowane z odczytów pojedynczego klonu, mogą wykryć małe zmiany w metylacji DNA i zidentyfikować regiony regulatorowe, które reagują na leczenie (programowanie środowiskowe). Proces sekwencjonowania wodorosiarczynu składa się z trzech następujących po sobie etapów roboczych. Po pierwsze, produkty PCR uzyskane w wyniku wcześniejszego PCR wodorosiarczynowego są ligowane w wektor i przekształcane w bakterie. Po drugie, PCR kolonii z pojedynczych klonów stosuje się w celu określenia prawidłowego rozmiaru insertu. Po trzecie, dodatnie PCR kolonii są oczyszczane i poddawane reakcji sekwencjonowania Big-Dye. Po etapie oczyszczania produkty są poddawane elektroforezie na sekwencerze kapilarnym.

6.1 Podwiązanie i transformacja

Uwaga: Rutynowo używamy zestawu do klonowania wektorów pGEM-T (Promega). Z naszego doświadczenia wynika, że skuteczność klonowania zależy w decydującym stopniu od wkładki, która ma być podwiązana. W przypadku wielokrotnego uzyskiwania małej liczby rekombinowanych klonów należy badać różne wektory.

1. Ustaw reakcję na podwiązanie:
   5 μl 2x bufor ligacyjny
   1 μl pGEM-T Wektor
   1 μl T4-Ligazy
   3 μl oczyszczonego produktu PCR
   
2. Wymieszać przez pipetowanie i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.
   Uwaga: Podwiązanie można również przeprowadzić przez 1 godzinę w RT. W celu zwiększenia liczby rekombinowanych klonów preferowane jest podwiązanie w nocy w temperaturze 4 °C.
   
3. Oczyszczanie produktów ligacji przez wytrącanie etanolu:
   1. Dodać 1 μl glikogenu, 1 μl 3M NaAc i 25 μl 100% EtOH do reakcji ligacji i wytrącać przez 1 minutę w ciekłym azocie.
   2. Odwirować (15,0000 g przez 30 minut w temperaturze 4 °C) i odrzucić supernatant.
   3. Przemyć 300 μl 70% EtOH i odwirować (15 000 g przez 20 minut w temperaturze 4 °C), odlać supernatant i suchy osad w temperaturze pokojowej (10 min).
   4. Zawiesić osad w 10 μl H₂O.

6.2 Przemiana produktów ligacji w bakteriach elektrokompetentnych

1. Wstępnie schłodzić kuwety elektroporacyjne (o szerokości 1 mm) na lodzie i rozmrozić porcję elektrokompetentnych bakterii DH5α na lodzie.
2. Dodać 45 μl bakterii DH5α do 10 μl oczyszczonego produktu do ligacji (patrz wyżej) i przenieść do kuwety.
3. Przekształć bakterie przy napięciu 1,5 kV, 200 Ω, 15 μF i dodać 1 ml wstępnie podgrzanej pożywki SOB bezpośrednio po podaniu impulsu.
4. Odzysk bakterii przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C, rozprowadzenie 100 μl zawiesiny na płytkach LB/ampicyliny pokrytych IPTG/X-Gal.
5. Inkubować płytki przez noc w temperaturze 37 °C.

6.3 PCR kolonii

Uwaga: PCR kolonii z pojedynczych klonów jest przeprowadzany w celu upewnienia się, że wstawki mają przewidywaną wielkość. Opóźniony rozwój koloru w wyniku badania przesiewowego niebiesko-białego, niepożądane zdarzenia rekombinacji podczas ligacji, włączenie oligomerycznych par starterów lub skróconych produktów PCR mogą w przeciwnym razie prowadzić do błędnych wyników sekwencjonowania. Rutynowo używamy starterów T7 i SP6 do amplifikacji sklonowanych wkładek; Takie podejście skutkuje dodatkowymi sekwencjami wektorowymi o wartości około 150 pz. Starter T7 jest stosowany w reakcji sekwencjonowania w późniejszym etapie.

1. Ustaw reakcję PCR kolonii na 96-dołkowej płytce. Do jednej reakcji użyj:
   3 μl 2,5 mM MgCl₂
   2,5 μl 10x bufor Taq
   1,5 μl 10 mM dNTP
   2 μl 2,5 mM podkładu T7
   2 μl 2,5 mM SP6 podkład
   1 μl polimerazy Fermentas Taq
   napełnić do 25 μl olejem H₂O
   
2. Dozować 25 μl/basenik mieszanki wzorcowej do każdego dołka na płytce 96-dołkowej.
3. Pobrać dodatni (biały) klon z płytki z końcówką pipety i zanurzyć w reakcji PCR.
4. Amplifikuj przy użyciu następujących warunków:
   1 cykl 4 min w 95 °C
   10 cykli 30 s w 94 °C, 30 s w 56 °C i 30 s w 72 °C
   30 cykli 30 s w 94 °C, 30 s w 48 °C i 30 s w 72 °C
   1 cykl 5 min w 72 °C
   
5. Załaduj 5 μl colony PCR na żel agarozowy i określ reakcje, które zawierają odpowiedni rozmiar wkładki.
6. PCR kolonii zawierające pożądane amplikony są oczyszczane za pomocą dostępnego w handlu zestawu (Machery Nagel Nucleofast).

6.4 Reakcja terminatora Big-Dye i sekwencjonowanie

1. Przygotuj mieszankę główną do reakcji Big-Dye. Do jednej reakcji użyj:
   1 μl H₂O
   0,5 μl odczynnika Big-Dye
   1,5 μl Bufor sekwencyjny
   
2. Dozować 3 μl/basenik do każdej studzienki na 96-dołkowej płytce, do każdej studzienki dodać 2 μl oczyszczonego produktu PCR z kolonii i przeprowadzić reakcję na termocyklerze o następujących parametrach:
   1 cykl 1 min w 96 °C
   35 cykli po 10 s w 96 °C, 5 s w 50 °C i 4 min w 60 °C
   
3. Reakcja Big-Dye jest oczyszczana za pomocą komercyjnego zestawu (Millipore Montage 96 Sequencing Clean-Up Kit) i przetwarzana na sekwenatorze kapilarnym (np. ABI 3100 DNA).
4. Sekwencje są analizowane za pomocą Biq Analyzer (http://biq-analyzer.bioinf.mpi-sb.mpg.de/) lub narzędzia online BISMA (http://biochem.jacobs-university.de/BDPC/BISMA/) w celu wyprowadzenia wzorca metylacji badanego regionu DNA (Rysunek 4).

7. Reprezentatywne wyniki

Aby uzyskać wgląd w wpływ ELS na ekspresję Avp i stan metylacji, myszy C57BL/6N zostały przetworzone zgodnie z przepływem pracy opisanym powyżej. Krótko mówiąc, grupa myszy C57BL / 6N została poddana działaniu ELS, podczas gdy grupa kontrolna została pozostawiona w spokoju. PVN i jądro nadwzrokowe (SON) zostały przebite, a DNA i RNA zostały wyizolowane jednocześnie z pojedynczych ciosów. RNA poddano odwrotnej transkrypcji, a poziomy transkryptów Avp zmierzono za pomocą analizy qPCR i znormalizowano do ekspresji genów porządkowych Hprt i Gapdh. DNA poddano działaniu wodorosiarczynu, amplifikowano starterami specyficznymi dla wzmacniacza Avp (ryc. 4a), a produkty PCR sklonowano i zsekwencjonowano. Przeanalizowano co najmniej 20 rekombinowanych klonów z każdej myszy / PCR w celu określenia częstości metylacji dla CpG zawartych w amplikonie PCR (Figura 4b). W porównaniu z kontrolą, ELS wywołał znaczną hipometylację w CpG10, CpG12, CpG13 i Cpg14 wzmacniacza Avp (p < 0,05, n = 6-8 zwierząt), co sugeruje epigenetyczne oznaczanie tego regionu regulatorowego poprzez doświadczenia we wczesnym okresie życia. W przeciwieństwie do PVN, metylacja wzmacniacza Avp nie miała wpływu na ELS w SON, co ilustruje specyficzność tkankową znakowania epigenetycznego (Figura 4c). Analiza stanu metylacji DNA przy ekspresji genu CpG10 i Avp u zwierząt kontrolnych (n = 6) wykazała ujemną korelację wskazującą na rolę metylacji DNA w precyzyjnym dostrojeniu ekspresji genu AVP (ryc. 4d).

Rysunek 1. Mikropunche uzyskuje się z wypreparowanych mózgów myszy kontrolnych i zestresowanych we wczesnym okresie życia. Po izolacji DNA i RNA ekspresję genów określa się za pomocą qRT-PCR, podczas gdy DNA poddane działaniu wodorosiarczynu jest amplifikowane, a oczyszczone produkty są klonowane w odpowiednim wektorze umożliwiającym identyfikację rekombinowanych klonów przez selekcję niebiesko-białą. Prawidłowe rozmiary wkładek są weryfikowane za pomocą colony PCR przed przeprowadzeniem reakcji Big-Dye i przetwarzaniem na sekwencerze kapilarnym. Wzorzec metylacji jest wizualizowany przez odpowiednie narzędzia programowe. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą postać.

Rysunek 2. Kalendarium od ekstrakcji DNA/RNA do sekwencjonowania wodorosiarczynów.

Rysunek 3. Przepływ pracy do jednoczesnej ekstrakcji DNA i RNA. Uderzenie jądra podwzgórza przykomorowego, maleńkiego genu Avp wyrażającego obszar mózgu, umieszcza się w buforze GTA o pojemności 400 μl, wiruje aż do zakłócenia i dalej homogenizuje przez przejście przez strzykawkę (29G). Homogenat jest następnie dzielony w celu oczyszczenia RNA i DNA. Podział może być 1:1 lub mieć różne proporcje w zależności od konkretnego pytania eksperymentalnego. Homogenaty należy przetworzyć w ciągu kilku godzin.

Rysunek 4. Metylacja CpG w locus Avp u 6-tygodniowych zwierząt kontrolnych i ELS. (A) Schemat genów Avp i oksytocyny zorientowanych od ogona do ogona i oddzielonych regionem międzygenowym (IGR). Egzony są przedstawione za pomocą otwartych (ponumerowanych) pól. Rozmieszczenie reszt CpG jest wskazane, a rozmiar i położenie odpowiedniego amplikonu PCR zawierającego CpG 10 do CpG14 jest zaznaczone pogrubioną linią. (B) Metylacja wzmacniacza Avp w PVN u zwierząt kontrolnych i ELS (n = 6-8). (C) Metylacja wzmacniacza Avp u SON u zwierząt kontrolnych i ELS (n = 8-10). (D) Ekspresja genu Avp była skorelowana z metylacją w CpG10 (n = 6). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą postać.

Discussion

Programowanie epigenetyczne jest coraz częściej uznawane za ważny mechanizm leżący u podstaw zdrowia i choroby. W niniejszym artykule przedstawiamy udoskonaloną metodę jednoczesnej izolacji DNA i RNA z mikroprześladowań oraz kolejne etapy uzyskiwania profili metylacji DNA poprzez sekwencjonowanie wodorosiarczynowe. Zoptymalizowany przebieg pracy pozwala na wygodną analizę programowania epigenetycznego w mózgu w odpowiedzi na bodźce środowiskowe. Co więcej, podejście to ułatwia badanie funkcjonalnego związku między metylacją DNA a ekspresją genów, ponieważ oba są analizowane z tej samej próbki. Wreszcie, liczba zwierząt potrzebnych do eksperymentu może zostać znacznie zmniejszona.

Podczas wykonywania przedstawionego przepływu pracy należy przestrzegać pewnych środków ostrożności i wytycznych. Biorąc pod uwagę niezwykłą złożoność i heterogeniczność mózgu oraz fakt, że metylacja i wzorzec ekspresji mogą się różnić w zależności od komórki i tkanki, niezwykle ważne jest, aby mikrowykrawanie było wykonywane w sposób ustandaryzowany. Na przykład epigenetyczne programowanie Avp wykrywa się w parawaventriukularnym, ale nie w jądrze nadwzrokowym (ryc. 4b-d), dwóch regionach eksprymujących Avp w podwzgórzu ⁴. Pod tym względem dostępność DNA i RNA z tego samego stempla tkankowego jest korzystna, ponieważ ekspresja RNA niektórych genów markerowych specyficznych dla tkanki może być w niektórych przypadkach wykorzystana do potwierdzenia, że właściwa powierzchnia została wybita. Chociaż mikrodziurkowanie może zmniejszyć niejednorodność komórkową, należy pamiętać, że takie podejście nie prowadzi do izolacji pojedynczych typów komórek lub populacji. W celu rozwiązania tego tematu można rozważyć dodatkowe kroki oczyszczania.

Do sekwencjonowania wodorosiarczynów niezbędny jest optymalny projekt startera do amplifikacji PCR po obróbce wodorosiarczynem. Produkty PCR o długości przekraczającej 400 pz mogą być problematyczne ze względu na degradację DNA w wyniku obróbki wodorosiarczynem. Należy również zauważyć, że zagnieżdżony PCR może dawać stronnicze wyniki, jeśli tylko kilka nienaruszonych matryc przyczynia się do procesu amplifikacji. Należy zaprojektować pary starterów, które są specyficzne dla zmodyfikowanego amplikonu; ich sekwencje nie powinny zawierać dinukleotydów CpG, aby uniknąć amplifikacji spolaryzowanej metylacją. Ponadto startery powinny zawierać cytozyny inne niż CpG, aby zapobiec amplifikacji niezmodyfikowanego lub niecałkowicie przekształconego DNA. Amplifikacja niektórych matryc może być korzystna dzięki przeprowadzeniu PCR na gorąco. W każdym przypadku przydatność par starterów powinna być sprawdzana w doświadczeniach pilotażowych, aby zapobiec psuciu się cennych próbek doświadczalnych.

Sekwencjonowanie wodorosiarczynów stanowi standardową metodę analizy metylacji specyficznej dla danego miejsca, ponieważ jest w stanie niezawodnie i precyzyjnie wykryć metylację pojedynczych reszt CpG w sposób specyficzny dla alleli ⁸. Nie zaleca się bezpośredniego sekwencjonowania produktu PCR, ponieważ mieszana metylacja reszty CpG pojawi się jako podwójny pik C/T w elektroferogramie, co może uniemożliwić ilościowe określenie metylacji w danym miejscu. Z tego powodu przeprowadzany jest pośredni etap klonowania i sekwencjonuje się kilka klonów (~20-30) w celu określenia zakresu metylacji. Pirosekwencjonowanie stanowi alternatywną metodę ilościowego oznaczania metylacji DNA. Wykorzystuje również konwersję wodorosiarczynu i PCR wodorosiarczynu, ale zamiast klonowania i sekwencjonowania, amplikon jest poddawany bezpośredniej reakcji pirosekwencjonowania, w której stan metylacji reszty CpG jest odczytywany jako polimorfizm pojedynczego nukleotydu C / T, który można łatwo określić ilościowo. Obie metody wykrywają podobne poziomy metylacji ⁹ , ale ponieważ etap klonowania można pominąć, pirosekwencjonowanie jest bardziej efektywne czasowo. Jednak w zależności od matrycy można zsekwencjonować tylko 40-100 nukleotydów jednocześnie, tak że konieczne jest kilka rund pirosekwencjonowania z różnymi starterami sekwencjonowania. Jest to krytyczne ograniczenie, biorąc pod uwagę, że wymagane są większe ilości DNA (około 1 μg na reakcję), które zgodnie z przewidywaniami przekraczają ilości dostępne z maleńkich wybić tkanki mózgowej. W związku z tym wstępne skanowanie regionów w zakresie kilku kilozasad za pomocą pirosekwencjonowania wydaje się mniej odpowiednie jako odczyt pojedynczego klonu. Niemniej jednak, po zidentyfikowaniu niewielkiego obszaru zainteresowania, należy rozważyć sekwencjonowanie pirotechniki.

Reasumując, opisany powyżej protokół zapewnia dokładne, wydajne i usprawnione podejście do szybkiej i opłacalnej analizy mikrociosów mózgu pod kątem zmian epigenetycznych. Wiele próbek może być przetwarzanych w jednym przebiegu, a metody te są odpowiednie w przypadku próbek z eksperymentów o średniej wielkości.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
DNeasy Krew & Zestaw tkanek	Qiagen	69506
Nucleospin RNA II	Macherey-Nagel	740955.50
Zestaw wodorosiarczynu Epitect	Qiagen	59104
Ekstrakt nukleospinowy	Macherey-Nagel	740609.50
Zestaw do klonowania wektorów pGEM-T	Promega	A3600
Nucleofast 96	Macherey-Nagel	743100.50
Montage 96 Sekwencjonowanie Oczyszczanie	Millipore	LSK09624
Hotstar Taq Polymerase	Qiagen	203203
Taq Polymerase	Fermentas	EP0401