Zoptymalizowana analiza metylacji DNA i ekspresji genów z małych, anatomicznie zdefiniowanych obszarów mózgu

Podsumowanie

Przedstawiono usprawniony schemat badania metylacji DNA oraz zmian w ekspresji genów pod wpływem stresu we wczesnym okresie życia. Począwszy od separacji matczynej noworodków myszy i izolacji poszczególnych tkanek mózgowych, prezentujemy protokół jednoczesnej izolacji DNA i RNA z wycinków tkanki mózgowej w celu przeprowadzenia następującej po niej sekwencjonowania z konwersją bisulfitową oraz analizy RT-PCR.

Streszczenie

Ekspozycja na dietę, leki i niekorzystne doświadczenia we wczesnym dzieciństwie podczas wrażliwych okien rozwojowych ^1,2 może prowadzić do trwałych zmian w ekspresji genów, które przyczyniają się do wystąpienia określonych fenotypów fizjologicznych i behawioralnych. Takie programowanie środowiskowe prawdopodobnie zwiększa podatność na choroby metaboliczne, sercowo-naczyniowe i psychiczne ^3,4.

Metylacja DNA i modyfikacje histonów są uważane za kluczowe procesy w mediacji dialogu między genami a środowiskiem i wydają się również leżeć u podstaw programowania środowiskowego ⁵. U ssaków metylacja DNA zazwyczaj polega na kowalencyjnym przyłączeniu grupy metylowej w pozycji 5 cytozyny w obrębie dinukleotydów CpG.

Metylacja CpG zachodzi w sposób ściśle specyficzny dla tkanki i komórek, co stanowi wyzwanie w badaniu odrębnych, niewielkich obszarów mózgu, w których heterogeniczność komórkowa jest wysoka, a ilość tkanki ograniczona. Ponadto, ponieważ ekspresja genów i metylacja są zdarzeniami ściśle powiązanymi, większą wartość informacyjną można uzyskać poprzez porównanie obu tych parametrów w tej samej próbce.

W niniejszym opracowaniu przedstawiono protokół krok po kroku (Rycina 1) do badania programowania epigenetycznego w mózgu, wykorzystując w celach ilustracyjnych paradygmat „separacji matczynej” jako model wczesnodziecięcej przeciwności losu. Protokół opisuje przygotowanie mikropróbek (tzw. micropunches) z mózgów myszy w różnym wieku, z których można jednocześnie wyizolować DNA i RNA, co umożliwia analizę metylacji DNA oraz ekspresji genów w tej samej próbce.

Protokół

1. Programowanie przez wczesnodziecięce przeciwności losu

Separację matczyną (MS) przeprowadza się w celu wywołania stresu we wczesnym stadium życia (ELS) u szczeniąt urodzonych z myszy C57BL/6N w określonym czasie ciąży (0. dzień postnatalny (P0) w dniu urodzenia).

1. Poszczególne mioty umieszcza się w czystych klatkach (z matą grzewczą) na 3 h dziennie od P1 do P10.
2. Szczęta kontrolne (bez ELS) pozostają niezakłócone w gnieździe matki przez cały ten czas.
3. Szczętę utrzymuje się z matkami do czasu odsadzenia (P21), po czym są one kwaterowane w grupach tej samej płci (3-5 myszy na klatkę) w standardowych warunkach utrzymania zwierząt laboratoryjnych.

2. Izolacja i sekcja tkanki mózgowej

1. Myszy są uśmiercane w pożądanym wieku poprzez zwichnięcie stawów szyjnych. Uwaga: ponieważ protokół ten obejmuje paradygmat stresowy, przed zwichnięciem stawów szyjnych nie podaje się znieczulenia, aby uniknąć zakłócenia normalnej regulacji fizjologicznej hormonów stresu. Czaszki są otwierane, a mózgi ostrożnie usuwane i natychmiast zamrażane szokowo poprzez zanurzenie w mieszaninie izopentanu i suchego lodu, a następnie przechowywane w temperaturze -80 °C.
2. Mózgi są poddawane kriosekcjonowaniu (grubość 10 μm); skrawki są montowane na szkiełkach Superfrost i przechowywane w temperaturze -20 °C. W celu weryfikacji precyzji anatomicznej i zapewnienia uwzględnienia obszaru zainteresowania (np. dla neuronów w jądrze przykomorowym - PVN - pobiera się skrawki zaczynając od poziomu rostralnego PVN, bregma -0.75 do -0.85) stosuje się odniesienie do standardowego atlasu stereotaksycznego myszy (np. Paxinos ⁶).
3. Skrawki są barwione fioletem krezylowym w celu ułatwienia identyfikacji różnych struktur mózgu. Wycinki (0,8 mm) z obszarów zainteresowania (np. PVN) są pobierane metodą mikrodysekcji in loco.

3. Izolacja kwasów nukleinowych z wycinków tkanki mózgowej

Opisano zoptymalizowany protokół jednoczesnej ekstrakcji DNA i RNA z niewielkich, zdefiniowanych neuroanatomicznie obszarów mózgu do analizy konwersji bisulfitowej oraz ekspresji genów ⁷.

Uwaga: Biorąc pod uwagę, że RNA jest mniej stabilne niż DNA w buforze GTC, zaleca się w pierwszej kolejności przetwarzanie RNA. Homogenat wykorzystywany do oczyszczania DNA może w tym czasie być przechowywany w temperaturze pokojowej (RT).

1. Homogenizować wycinki za pomocą pipety i vortexera w 400 μl buforu z tiocyjanianem guanidyny (GTC) (4,5 M tiocyjanianu guanidyny, 2% N-lauroylosarkozyny, 50 mM EDTA pH 8,25, mM Tris-HCl pH 7,5, 0,1 M beta-merkaptoetanolu, 0,2% przeciwpieniacza A) w temperaturze pokojowej (RT), przepuszczając zawiesinę kilka razy przez strzykawkę hipodermiczną (29G) (Rysunek 2).
2. Podzielić lizat na równe części; RNA i DNA można ekstrahować jednocześnie lub osobno, w zależności od konkretnych potrzeb eksperymentalnych.
3. W celu oczyszczania RNA dodać do lizatu 1/10 objętości NaOAc, 1 objętość AquaPhenol (Appligene) (pH 4) oraz 1/2 objętości chloroformu:izoamylu (24:1). Po każdym etapie intensywnie mieszać na vortexerze i inkubować na lodzie przez 10 min, a następnie wirować (20 min przy 10 000 g w 4 °C); do fazy wodnej dodać równą objętość 70% EtOH.
4. Przenieść mieszaninę do kolumny spinowej do RNA (np. Nucleospin RNA II firmy Macherey-Nagel) i przeprowadzić trawienie DNazą w kolumnie oraz etapy płukania (zgodnie z protokołem producenta); eluiować RNA w 25 μl H₂O.
5. Do oczyszczania DNA stosuje się zoptymalizowany protokół zestawu Qiagen DNeasy Blood and Tissue Kit. Zrównoważyć lizat równymi objętościami Buforu AL i 100% EtOH, nanieść na kolumnę spinową i wirować (1 min przy 10 000 g w RT), a następnie odrzucić filtrat.
6. Dodać do kolumny 500 μl Buforu AW1 zawierającego 5 μl RNAzy (1 mg/ml) i inkubować przez 10 min w RT. Wirować (1 min przy 10 000 g w RT) i odrzucić filtrat.
7. Przepłukać kolumnę 500 μl Buforu AW2, odrzucić filtrat i osuszyć pustą kolumnę przez wirowanie (1 min przy 15 000 g).
8. Dodać uprzednio ogrzany (70 °C) Bufor AE i inkubować kolumny przez 10 min w 70 °C. Eluiować poprzez wirowanie (1 min przy 10 000 g), ponownie nanieść filtrat i powtórzyć etap wirowania.

Do oznaczenia stężeń DNA i RNA należy użyć spektrofotometru. Typowy wycinek PVN dostarcza ~600 ng DNA i ~400 ng RNA. Do analizy ekspresji genów za pomocą ilościowej PCR (qPCR) zazwyczaj wykorzystujemy ~100 ng RNA w reakcji odwrotnej transkrypcji.

4. Konwersja bisulfitowa

Pirosiarczyn sodu jest używany do konwersji niezmetylowanych cytozyn w uracyle. Z kolei cytozyny zmetylowane są chronione przed tą konwersją. W związku z tym wszystkie cytozyny wykryte w końcowym sekwencjonowaniu amplikonu PCR po konwersji pirosiarczynowej reprezentują cytozyny zmetylowane.

Konwersja pirosiarczynowa powoduje znaczną degradację DNA, co może być czynnikiem ograniczającym w analizie PCR. Zoptymalizowane warunki reakcji, które maksymalizują konwersję cytozyny, ograniczają fragmentację DNA i utrzymują jednoniciowy charakter DNA nawet w niższych temperaturach, można osiągnąć przy użyciu zestawu EpiTect Bisulfite Kit firmy Qiagen. W naszych badaniach ok. 200 ng DNA oczyszczonego z mikrowykrojów zapewnia wystarczającą ilość materiału wyjściowego do reakcji pirosiarczynowej.

Aby zapobiec różnicom w wydajności reakcji konwersji, ilość matrycowego DNA powinna pozostać stała we wszystkich próbkach przetwarzanych podczas eksperymentu. Ponadto odczyty sekwencji należy poddać kontroli pod kątem wydajności konwersji, badając odsetek niekonwertowanych pozycji non-CpG. Wartość ta powinna przekraczać 98%. Niższe wartości wskazują na niepełną lub niewydajną konwersję pirosiarczynową, a odpowiadające im sekwencje powinny zostać wykluczone z analizy.

5. PCR z konwersją bisulfitową

1. Zaprojektuj primery do sekwencjonowania pirosulfitowego, które są specyficzne dla DNA poddanego konwersji pirosulfitowej (patrz dyskusja); oprogramowanie Methyl Primer Express (https://products.appliedbiosystems.com/ab/en/US/adirect/ab?cmd=catNavigate2&catID=602121) ułatwi ten proces i pomoże określić optymalne temperatury przyłączania w eksperymentach pilotażowych.
2. Przygotuj PCR-Master-Mix (na jedną reakcję) w następujący sposób:
   2,5 μl buforu PCR 10x
   0,5 μl 10 mM dNTPs
   1 μl 10 μM primera forward
   1 μl 10 μM primera reverse
   0,125 μl Qiagen Hotstart Taq Plus
   uzupełnij H₂O do objętości 23 μl
   
3. Dodaj 2 μl DNA poddanego działaniu pirosulfitu do reakcji.
4. Przeprowadź amplifikację w następujących warunkach:
   1 cykl 6 min 95 °C
   45-50 cykli: 1 min 95 °C, 1 min w optymalnej temperaturze przyłączania, 1 min 72 °C
   1 cykl 5 min 72 °C
   

Przeanalizuj 7 μl produktu PCR za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym, aby zweryfikować wielkość amplikonu, a następnie oczyść pozostałą reakcję PCR do późniejszej ligacji, korzystając z dostępnego komercyjnie zestawu do oczyszczania PCR (np. Macherey-Nagel Nucleospin Extract). W przypadku otrzymania dodatkowych, niepożądanych produktów PCR, zaleca się oczyszczanie z żelu.

6. Sekwencjonowanie z konwersją bisulfitową

Profile metylacji DNA o wysokiej rozdzielczości, uzyskane z odczytów pojedynczych klonów, pozwalają na wykrycie niewielkich zmian w metylacji DNA oraz identyfikację regionów regulacyjnych reagujących na leczenie (programowanie środowiskowe). Proces sekwencjonowania z użyciem bisulfitu obejmuje trzy następujące po sobie etapy robocze. Po pierwsze, produkty PCR uzyskane w poprzednim etapie PCR z bisulfitem są ligowane do wektora i transformowane do bakterii. Po drugie, w celu określenia prawidłowej wielkości insertu stosuje się PCR kolonii z pojedynczych klonów. Po trzecie, pozytywne produkty PCR kolonii są oczyszczane i poddawane reakcji sekwencjonowania Big-Dye. Po etapie oczyszczania produkty są poddawane elektroforezie w sekwencjonatorze kapilarnym.

6.1 Ligacja i transformacja

Uwaga: Rutynowo stosujemy zestaw do klonowania wektora pGEM-T (Promega). W naszym doświadczeniu wydajność klonowania zależy w sposób krytyczny od wstawki podlegającej ligacji. W przypadku powtarzającego się uzyskiwania niskiej liczby klonów rekombinowanych należy przetestować różne wektory.

1. Przygotowanie reakcji ligacji:
   5 μl buforu do ligacji 2x
   1 μl wektora pGEM-T
   1 μl T4-ligazy
   3 μl oczyszczonego produktu PCR
   
2. Wymieszanie reakcji poprzez pipetowanie i inkubacja przez noc w temperaturze 4 °C.
   Uwaga: Ligację można przeprowadzić również przez 1 h w temperaturze pokojowej. Aby zwiększyć liczbę klonów rekombinacyjnych, zaleca się ligację przez noc w 4 °C.
   
3. Oczyszczanie produktów ligacji poprzez wytrącanie etanolem:
   1. Do reakcji ligacji dodać 1 μl glikogenu, 1 μl 3M NaAc oraz 25 μl 100% EtOH i wytrącać przez 1 min w ciekłym azocie.
   2. Wirować (15,000 g przez 30 min w 4 °C) i odlać nadsącz.
   3. Przemyć 300 μl 70% EtOH i wirować (15,000 g przez 20 min w 4 °C), odlać nadsącz i osuszyć osad w temperaturze pokojowej (10 min).
   4. Resuspendować osad w 10 μl H₂O.

6.2 Transformacja produktów ligacji w bakteriach elektrokompetentnych

1. Schłodzić kuwety do elektroporacji (szerokość 1 mm) na lodzie i rozmrozić na lodzie alikwot bakterii DH5α kompetentnych do elektroporacji.
2. Dodać 45 μl bakterii DH5α do 10 μl oczyszczonego produktu ligacji (patrz wyżej) i przenieść do kuwety.
3. Przeprowadzić transformację bakterii przy parametrach 1,5 kV, 200 Ω, 15 μF i dodać 1 ml uprzednio ogrzanego podłoża SOB bezpośrednio po podaniu impulsu.
4. Inkubować bakterie w celu regeneracji przez 1 h w 37 °C, a następnie wysiać 100 μl zawiesiny na płytki LB/ampicylina pokryte IPTG/X-Gal.
5. Inkubować płytki przez noc w 37 °C.

6.3 PCR kolonii

Uwaga: PCR kolonii z pojedynczych klonów przeprowadza się w celu upewnienia się, że inserty mają przewidywaną wielkość. Opóźniony rozwój barwy podczas selekcji niebiesko-białej, niepożądane zdarzenia rekombinacji podczas ligacji, włączenie oligomerycznych par starterów lub skrócone produkty PCR mogą w przeciwnym razie prowadzić do błędnych wyników sekwencjonowania. Rutynowo stosujemy startery T7 i SP6 do amplifikacji sklonowanych insertów; podejście to skutkuje obecnością dodatkowych sekwencji wektora o długości około 150 bp. Starter T7 jest wykorzystywany w reakcji sekwencjonowania w późniejszym etapie.

1. Przygotować reakcję colony PCR na płytce 96-dołkowej. Na jedną reakcję należy użyć:
   3 μl 2.5 mM MgCl₂
   2.5 μl 10x buforu Taq
   1.5 μl 10 mM dNTP
   2 μl 2.5 mM startera T7
   2 μl 2.5 mM startera SP6
   1 μl polimerazy Taq Fermentas
   uzupełnić do 25 μl wodą H₂O
   
2. Rozdzielić po 25 μl master mixu do każdego dołka płytki 96-dołkowej.
3. Wybrać z płytki pozytywny (biały) klon za pomocą końcówki pipety i zanurzyć go w reakcji PCR.
4. Przeprowadzić amplifikację według następujących warunków:
   1 cykl 4 min w 95 °C
   10 cykli 30 s w 94 °C, 30 s w 56 °C i 30 s w 72 °C
   30 cykli 30 s w 94 °C, 30 s w 48 °C i 30 s w 72 °C
   1 cykl 5 min w 72 °C
   
5. Naniesć 5 μl produktu colony PCR na żel agarozowy i wyznaczyć reakcje zawierające insert o prawidłowej wielkości.
6. Produkty colony PCR zawierające pożądane amplikony należy oczyścić za pomocą dostępnego komercyjnie zestawu (Machery Nagel Nucleofast).

6.4 Reakcja terminacyjna Big-Dye i sekwencjonowanie

1. Przygotować mieszaninę Master mix do reakcji Big-Dye. Na jedną reakcję należy użyć:
   1 μl H₂O
   0.5 μl odczynnika Big-Dye
   1.5 μl buforu do sekwencjonowania
   
2. Do każdej studni płytki 96-dołkowej nanieść 3 μl mieszaniny, a następnie dodać 2 μl oczyszczonego produktu PCR kolonii i przeprowadzić reakcję w termocyklerze z następującymi parametrami:
   1 cykl: 1 min w 96 °C
   35 cykli: 10 s w 96 °C, 5 s w 50 °C oraz 4 min w 60 °C
   
3. Produkty reakcji Big-Dye oczyścić za pomocą komercyjnego zestawu (Millipore Montage 96 Sequencing Clean-Up Kit) i poddać analizie w sekwenatorze kapilarnym (np. ABI 3100 DNA).
4. Sekwencje analizować przy użyciu programu Biq Analyzer (http://biq-analyzer.bioinf.mpi-sb.mpg.de/) lub narzędzia online BISMA (http://biochem.jacobs-university.de/BDPC/BISMA/) w celu określenia wzoru metylacji badanego regionu DNA (Rycina 4).

7. Reprezentatywne wyniki

Aby uzyskać wgląd w wpływ ELS na ekspresję i stan metylacji genu Avp, myszy C57BL/6N poddano procedurom zgodnie z opisanym powyżej schematem postępowania. W skrócie, grupa myszy C57BL/6N została poddana ELS, natomiast grupa kontrolna nie była niepokojona. Wycięto próbki z jądra przykomorowego (PVN) oraz jądra nadwzrokowego (SON), a następnie z pojedynczych wycinków jednocześnie wyizolowano DNA i RNA. RNA poddano odwrotnej transkrypcji, a poziomy transkryptów Avp zmierzono za pomocą analizy qPCR i znormalizowano względem ekspresji genów referencyjnych Hprt oraz Gapdh. DNA poddano konwersji bisulfitowej, amplifikowano za pomocą starterów specyficznych dla enhancera Avp (Rysunek 4a), a produkty PCR sklonowano i zsekwencjonowano. Przeanalizowano co najmniej 20 klonów rekombinowanych z każdej myszy/reakcji PCR, aby określić częstotliwość metylacji dla CpG zawartych w amplikonie PCR (Rysunek 4b). W porównaniu z grupą kontrolną, ELS wywołała istotną hipometylację w obrębie CpG10, CpG12, CpG13 i Cpg14 enhancera Avp (p < 0,05, n = 6-8 zwierząt), co sugeruje epigenetyczne znakowanie tego regionu regulacyjnego poprzez doświadczenia z wczesnego etapu życia. W przeciwieństwie do PVN, metylacja enhancera Avp w SON nie była zmieniona przez ELS, co ilustruje tkankową specyficzność znakowania epigenetycznego (Rysunek 4c). Analiza stanu metylacji DNA w CpG10 i ekspresji genu Avp u zwierząt kontrolnych (n = 6) wykazała ujemną korelację, co wskazuje na rolę metylacji DNA w precyzyjnej regulacji ekspresji genu AVP (Rysunek 4d).

Rysunek 1. Mikropuncje pobrane z mózgów myszy z grupy kontrolnej oraz myszy poddanych stresowi we wczesnym okresie życia. Po izolacji DNA i RNA ekspresję genów określono za pomocą qRT-PCR, natomiast DNA poddane działaniu bisulfitu poddano amplifikacji, a oczyszczone produkty sklonowano w odpowiednim wektorze, co umożliwiło identyfikację klonów rekombinowanych za pomocą selekcji niebiesko-białej. Prawidłowe rozmiary wstawek zweryfikowano metodą colony PCR przed przeprowadzeniem reakcji Big-Dye i analizą na sekwenatorze kapilarnym. Wzory metylacji zwizualizowano za pomocą odpowiedniego oprogramowania. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony rysunek.

Rysunek 2. Oś czasu od ekstrakcji DNA/RNA do sekwencjonowania bisulfitowego.

Rysunek 3. Schemat jednoczesnej ekstrakcji DNA i RNA. Wybiórczy fragment (punch) jądra przykomorowego podwzgórza, niewielkiego obszaru mózgu wykazującego ekspresję genu Avp, umieszcza się w 400 μl buforu GTA, miesza na wirówce do rozpadu tkanki, a następnie homogenizuje, przepuszczając przez strzykawkę (29G). Homogenizat jest następnie dzielony w celu oczyszczania RNA i DNA. Podział może wynosić 1:1 lub być w innych proporcjach, w zależności od konkretnego pytania badawczego. Homogenizaty należy przetworzyć w ciągu kilku godzin.

Rycina 4. Metylacja CpG w locus Avp u 6-tygodniowych zwierząt kontrolnych i zwierząt z ELS. (A) Schemat genów Avp i oxytocin zorientowanych ogon-do-ogona i oddzielonych regionem międzygenowym (IGR). Egzony przedstawiono jako otwarte (numerowane) prostokąty. Wskazano rozkład pozostałości CpG, a rozmiar i położenie odpowiedniego amplikonu PCR zawierającego CpG 10 do CpG14 zaznaczono pogrubioną linią. (B) Metylacja enhancera Avp w PVN u zwierząt kontrolnych i zwierząt z ELS (n = 6-8). (C) Metylacja enhancera Avp w SON u zwierząt kontrolnych i zwierząt z ELS (n = 8-10). (D) Ekspresja genu Avp została skorelowana z metylacją w CpG10 (n = 6). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną rycinę.

Dyskusja

Programowanie epigenetyczne jest coraz częściej uznawane za ważny mechanizm leżący u podstaw zdrowia i chorób. Przedstawiamy tutaj udoskonaloną metodę jednoczesnej izolacji DNA i RNA z mikropróbek (micropunches) oraz kolejne kroki prowadzące do uzyskania profili metylacji DNA za pomocą sekwencjonowania z konwersją pirosulfitem. Zoptymalizowany schemat pracy umożliwia wygodną analizę programowania epigenetycznego w mózgu w odpowiedzi na bodźce środowiskowe. Ponadto podejście to ułatwia badanie funkcjonalnej zależności między metylacją DNA a ekspresją genów, ponieważ oba te parametry są analizowane z tej samej próbki. W konsekwencji liczba zwierząt potrzebnych do przeprowadzenia eksperymentu może zostać znacznie zredukowana.

Podczas realizacji przedstawionego schematu postępowania należy przestrzegać określonych środków ostrożności i wytycznych. Biorąc pod uwagę nadzwyczajną złożoność i heterogeniczność mózgu oraz fakt, że wzorce metylacji i ekspresji mogą różnić się w zależności od komórki i tkanki, najwyższej wagi ma przeprowadzenie mikropunchingu w sposób standaryzowany. Jako przykład można podać programowanie epigenetyczne Avp, które wykrywa się w jądrze przykomorowym, ale nie w jądrze nadwzrokowym (Rysunek 4b-d), czyli dwóch obszarach podwzgórza wykazujących ekspresję Avp ⁴. W związku z tym korzystna jest dostępność DNA i RNA z tego samego wycięcia tkanki, ponieważ ekspresja RNA niektórych markerowych genów specyficznych dla danej tkanki może w niektórych przypadkach służyć do potwierdzenia, że pobrano próbkę z prawidłowego obszaru. Chociaż mikropunching może ograniczyć heterogeniczność komórkową, należy pamiętać, że podejście to nie prowadzi do izolacji pojedynczych typów lub populacji komórek. W celu rozwiązania tego problemu można rozważyć dodatkowe etapy oczyszczania.

W przypadku sekwencjonowania z użyciem siarczanów kluczowe jest optymalne zaprojektowanie starterów do amplifikacji PCR po obróbce pirosiarczynowej. Produkty PCR przekraczające 400 bp mogą być problematyczne ze względu na degradację DNA podczas obróbki pirosiarczynowej. Należy również zauważyć, że nested PCR może dawać obciążone wyniki, jeśli w proces amplifikacji włączy się tylko kilka nienaruszonych matryc. Należy zaprojektować pary starterów specyficzne dla zmodyfikowanego amplikonu; ich sekwencje nie powinny zawierać dinukleotydów CpG, aby uniknąć amplifikacji zależnej od metylacji. Dodatkowo startery powinny zawierać cytozyny niebędące w kontekście CpG, aby zapobiec amplifikacji DNA niezmodyfikowanego lub niecałkowicie konwertowanego. Amplifikacja niektórych matryc może przebiegać pomyślniej przy zastosowaniu Hot-start PCR. W każdym przypadku przydatność par starterów powinna zostać zweryfikowana w eksperymentach pilotażowych, aby zapobiec zmarnowaniu cennych próbek doświadczalnych.

Sekwencjonowanie bisulfitowe stanowi standardową metodę analizy metylacji w konkretnych miejscach, ponieważ pozwala na wiarygodne i precyzyjne wykrycie metylacji pojedynczych reszt CpG w sposób specyficzny dla allelu ⁸. Bezpośrednie sekwencjonowanie produktu PCR nie jest zalecane, ponieważ mieszana metylacja reszty CpG objawi się jako podwójny pik C/T na elektroferogramie, co może uniemożliwić ilościowe określenie stopnia metylacji w analizowanym miejscu. Z tego powodu przeprowadza się etap pośredniego klonowania i sekwencjonuje kilka klonów (~20-30), aby ustalić zakres metylacji. Pirosekwencjonowanie jest alternatywną metodą ilościowego oznaczania metylacji DNA. Wykorzystuje ono również konwersję bisulfitową oraz PCR po konwersji bisulfitowej, jednak zamiast klonowania i sekwencjonowania, amplikon poddawany jest bezpośredniej reakcji pirosekwencjonowania, w której stan metylacji reszty CpG jest odczytywany jako polimorfizm pojedynczego nukleotydu C/T, który można łatwo skwantyfikować. Obie metody wykrywają podobne poziomy metylacji ⁹, lecz dzięki możliwości pominięcia etapu klonowania, pirosekwencjonowanie jest bardziej efektywne czasowo. Jednak w zależności od matrycy, jednorazowo można zsekwencjonować jedynie od 40 do 100 nukleotydów, co sprawia, że konieczne jest przeprowadzenie kilku rund pirosekwencjonowania z użyciem różnych starterów sekwencyjnych. Jest to krytyczne ograniczenie, biorąc pod uwagę, że wymagane są większe ilości DNA (około 1 μg na reakcję), co prawdopodobnie przekracza ilości dostępne z niewielkich wycinków tkanki mózgowej. W związku z tym wstępne skanowanie obszarów o wielkości kilku kilobaz za pomocą pirosekwencjonowania wydaje się mniej odpowiednie niż odczyt pojedynczych klonów. Niemniej jednak, po zidentyfikowaniu niewielkiego obszaru zainteresowania, należy rozważyć zastosowanie pirosekwencjonowania.

Opisany powyżej protokół stanowi w swojej całości dokładne, wydajne i usprawnione podejście do szybkiej i kosztowo efektywnej analizy zmian epigenetycznych w mikropróbkach tkanki mózgowej. W jednym przebiegu można przetworzyć wiele próbek, a zastosowane metody są odpowiednie do analizy materiału pochodzącego z eksperymentów o średniej skali.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Zestaw DNeasy Blood & Tissue Kit	Qiagen	69506
Nucleospin RNA II	Macherey-Nagel	740955.50
Zestaw Epitect Bisulfite Kit	Qiagen	59104
Nucleospin Extract	Macherey-Nagel	740609.50
Zestaw do klonowania pGEM-T Vector Cloning Kit	Promega	A3600
Nucleofast 96	Macherey-Nagel	743100.50
Montage 96 Sequencing Clean-Up	Millipore	LSK09624
Polimeraza Hotstar Taq	Qiagen	203203
Polimeraza Taq	Fermentas	EP0401