Izolacja komórek odpornościowych z guzów pierwotnych

Podsumowanie

W niniejszym raporcie opisujemy protokół izolacji wysoko oczyszczonych populacji leukocytów infiltrujących guzy. Protokół ten został opracowany na podstawie metody firmy Miltenyi Biotech w celu zwiększenia wydajności i czystości izolacji komórek z złożonej tkanki nowotworowej.

Streszczenie

Guzy nowotworowe tworzą unikalne immunosupresyjne mikrośrodowisko (mikrośrodowisko guza, TME), w którym leukocyty są rekrutowane do guza przez różne chemokiny i czynniki wzrostu ^1,2. Jednak po dostaniu się do TME komórki te tracą zdolność do promowania odporności przeciwnowotworowej i zaczynają wspierać wzrost guza oraz hamować przeciwnowotworowe odpowiedzi immunologiczne ^3-4. Badania nad leukocytami związanymi z guzem koncentrowały się głównie na komórkach izolowanych z węzłów chłonnych drenujących guz lub z śledziony ze względu na trudności w uzyskaniu wystarczającej liczby i czystości komórek z guza pierwotnego. Choć identyfikacja mechanizmów aktywacji i transportu komórek przez układ limfatyczny u myszy z nowotworem jest istotna i może dostarczyć informacji na temat kinetyki odpowiedzi immunologicznej na raka, w naszym doświadczeniu wiele leukocytów, w tym komórki dendrytyczne (DCs), w węzłach chłonnych drenujących guz wykazuje inny fenotyp niż komórki infiltrujące guzy ^5,6. Ponadto wykazaliśmy wcześniej, że adoptywnie przeniesione limfocyty T izolowane z węzłów chłonnych drenujących guz nie są tolerystyczne i są zdolne do odpowiedzi na wtórną stymulację in vitro, w przeciwieństwie do limfocytów T izolowanych z TME, które są tolerystyczne i niezdolne do proliferacji lub produkcji cytokin ^7,8. Co ciekawe, wykazaliśmy, że zmiana mikrośrodowiska guza, np. poprzez dostarczenie pomocniczych limfocytów T CD4⁺ w drodze transferu adoptywnego, sprzyja utrzymaniu pro zapalnych funkcji efektorowych przez limfocyty T CD8^{+ 5}. Wyniki każdego z wcześniej wspomnianych badań demonstrują znaczenie pomiaru odpowiedzi komórkowych z komórek immunologicznych infiltrujących TME, a nie z komórek pozostających w obwodzie. Aby zbadać funkcję komórek immunologicznych infiltrujących guzy przy użyciu systemu izolacji Miltenyi Biotech⁹, zmodyfikowaliśmy i zoptymalizowaliśmy tę procedurę izolacji opartą na przeciwciałach, aby uzyskać silnie wzbogacone populacje komórek prezentujących antygen oraz cytotoksycznych limfocytów T specyficznych dla antygenu nowotworowego. Protokół obejmuje szczegółową sekcję tkanki prostaty mysiej z modelu spontanicznego nowotworu prostaty (TRansgenic Adenocarcinoma of the Mouse Prostate – TRAMP) ¹⁰ oraz modelu podskórnego czerniaka (B16), a następnie oczyszczanie różnych populacji leukocytów.

Protokół

1. Izolacja komórek mieloidalnych z guzów prostaty TRAMP

1. Wszystkie procedury zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi komisji ds. etyki badań na zwierzętach. Myszy TRAMP spontanicznie rozwijają autochtoniczne guzy prostaty w wyniku obecności transgenu (SV40) kontrolowanego przez promotor probazyny ¹⁰. Do tej procedury można użyć dowolnej myszy samca. Choć guzy TRAMP można pobierać w każdym wieku, należy zauważyć, że guzy prostaty TRAMP zazwyczaj pozostają małe, dopóki myszy nie osiągną wieku powyżej 20 tygodni. Eutanazję myszy przeprowadza się poprzez uduszenie CO₂. Usunąć układ moczowo-płciowy (UGT), rozcinając jamę otrzewną i odsuwając tkankę tłuszczową. Tkanka tłuszczowa ma piankowaty, lśniący wygląd.
2. Zlokalizować pęcherz moczowy; znajduje się on bezpośrednio między dwiema dużymi, białymi pęcherzykami nasiennymi. Przytrzymać pęcherz pęsetą. Trzymając nożyczki zamknięte, delikatnie odsunąć tkankę tłuszczową i zlokalizować cewkę moczową. Przeciąć cewkę moczową jak najbliżej obręczy miednicy i przeciąć przewody nasienne. Podczas przecinania jednocześnie pociągać pęcherz do góry. Uwolni to cały UGT, który można następnie poddać mikrodysekcji w celu uzyskania poszczególnych płatów prostaty.
3. Umieścić UGT w PBS w temperaturze pokojowej. Użyć mikroskopu sekcyjnego, aby zwizualizować UGT i usunąć nadmiar tkanki tłuszczowej. Za pomocą pęsety przytrzymać cewkę moczową i pobrać płaty brzuszny, boczny oraz przedni prostaty. Umieścić tkankę w PBS podczas pobierania pozostałych płatów.
4. Usunąć pęcherzyki nasienne i je odrzucić.
5. Obrócić pozostałą tkankę o 180°. Pobrać gruczoł ampularny i grzbietowe płaty prostaty.
6. Za pomocą pęsety rozdzielić tkankę prostaty i umieścić ją w buforze do trawienia (dysocjacji).
7. Umieścić tkankę guza w 1 ml buforu do dysocjacji (100 U/ml kolagenazy typu IV i 100 μg/ml DNazy w RPMI + 10% FBS). Każdy guz może wymagać specyficznych warunków dysocjacji; dla guzów prostaty TRAMP należy użyć 1 ml, a dla guzów B16 5 ml (patrz poniżej). Uwaga: stopień kolagenazy (I-IV) zależy od populacji komórek przeznaczonych do izolacji; izolacja komórek mieloidalnych przebiega najlepiej przy użyciu typu IV, natomiast wydajność limfocytów jest wyższa przy użyciu typu I.
8. Umieścić probówkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 30 min.
9. Pipetować zawiesinę w górę i w dół za pomocą pipety 1 ml, aby uzyskać łatwo płynną zawiesinę pojedynczych komórek.
10. Przefiltrować zawiesinę przez filtr 70 mikronów i przemyć 3x buforem separacyjnym MACs uzupełnionym o 10% FBS w przypadku izolacji komórek mieloidalnych.
11. Wirować zawiesinę komórek przy 400 xg przez 10 min. Następnie wypłukać osad 10 ml buforu MACs i ponownie wirować przy tych samych parametrach.
12. Resuspendować osad komórkowy w 100 μl buforu MACs. Następnie dodać 1 μg przeciwciała (Ab) anty-CD16/32 na 10⁸ komórek (200 μl supernatantu z hodowli hybrydomy 2.4.G2) i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 min. Uwaga: ilość dodawanego przeciwciała blokującego FcR-γ (Ab) może się różnić w zależności od częstości/liczby komórek FcR-γ⁺ w tkance oraz objętości zawiesiny komórkowej; dlatego ten krok może wymagać optymalizacji.
13. Dodać 100 μl MicroBeads „Pan-DC” lub 10 μl MicroBeads anty-CD11b, anty-CD11c lub anty-PDCA-1 na 10⁸ całkowitej liczby komórek, w zależności od pożądanej populacji komórek. Uwaga: wymagana ilość MicroBeads może się różnić w zależności od częstości/liczby komórek pożądanej populacji w tkance; dlatego ten krok może wymagać optymalizacji.
14. Wymieszać dokładnie, delikatnie potrząsając probówką (nie używać wortexa) i inkubować przez 15 min w temperaturze 4-8 °C, osłaniając przed światłem. Nie inkubować na lodzie.
15. Przemyć komórki, dodając 10 ml buforu MACs. Wirować przy 400 xg przez 10 min.
16. Całkowicie odlać nadsącz i resuspendować komórki w 500 μl buforu MACs. Zawiesiny komórek nowotworowych lepiej przepływają przez kolumny LC (inne opcje: MS, LS, LD).
17. Założyć nową kolumnę na separator magnetyczny. Przygotować kolumnę, płucząc ją odpowiednią ilością buforu MACs dla wybranej kolumny: dla kolumn LC i MS użyć 500 μl, dla kolumn LS lub LD 1 ml. Po przygotowaniu kolumny nanieść zawiesinę komórkową na górę kolumny. Używać jednej kolumny na każdą 1 x 10⁸ komórek.
18. Zebrać nieoznaczone komórki (frakcja przepływowa) i przemyć kolumnę minimum trzy (do pięciu) razy objętością 500 μl, co daje łącznie 1,5-2,5 ml płynu do przemywania. Krok przemywania 1 wykonać poprzez dodanie buforu MACs do kolumny; ważne jest utrzymanie przepływu w kolumnie. Gdy tylko z kolumny spadnie ostatnia kropla, dodać więcej buforu. Nie można dopuścić do zatrzymania przepływu ani do wyschnięcia kolumny (jest to niezwykle ważne, ponieważ wyschnięcie kolumny może zniszczyć czystość i prowadzić do znacznej utraty żywotności komórek). W kroku przemywania 2 przepłukać kolumnę mieszaniną buforu do dysocjacji (zawierającą kolagenazę + DNazę, jak opisano w kroku 1.7); służy to jako „silniejszy” etap przemywania w celu usunięcia lepkich zanieczyszczeń z martwych lub obumierających komórek nowotworowych. Krok przemywania 3 wykonać buforem MACs; jeśli po trzecim przemyciu ciecz przepływowa nie jest całkowicie klarowna, kontynuować przemywanie przez kolejne dwa etapy buforem MACs (łącznie 5 przemyć). W przypadku dużych guzów podskórnych (np. czerniaka B16), podczas ostatniego etapu przemywania, delikatnie nacisnąć opuszkiem palca w rękawiczce górną część kolumny; uwalnia to dodatkowe zanieczyszczenia, co pozwala uzyskać czystszą, oczyszczoną populację komórek. Krok ten nie jest wymagany dla guzów z tkanki litej, takich jak prostata; zamiast tego należy zastosować dodatkowe etapy przemywania, płucząc łącznie co najmniej 5-6 razy.
19. Zdjąć kolumnę z separatora magnetycznego i umieścić ją nad odpowiednią probówką zbiorczą. Pipetować 2 ml buforu na kolumnę. Zebrać magnetycznie oznakowane komórki, mocno naciskając tłok dołączony do kolumny.
20. Policzyć liczbę komórek i potwierdzić czystość wybranej populacji komórek za pomocą analizy cytometrycznej. Do identyfikacji populacji DC sugerowane markery to CD45, CD11c, PDCA-1, B220 i CD11b. Sugerowane markery makrofagów to CD45, CD11b, F4-80 i Ly6C.

2. Izolacja adoptywnie przeniesionych limfocytów T z podskórnych guzów czerniaka B16

Protokół ten sprawdza się najlepiej w przypadku guzów o powierzchni 250 mm² lub mniejszej (szacowanej poprzez pomiar średnic przecinających guz).

1. Komórki guza B16 wstrzyknięto podskórnie myszom C57BL/6, a pomiary guza rejestrowano co 2 dni 8. Myszy z guzami o powierzchni 250 mm² poddawano eutanazji poprzez uduszenie CO₂. Używając autoklawowanych instrumentów chirurgicznych płukanych 70% ETOH, pocięto guz na małe (< 3mm) fragmenty i inkubowano w 5 ml roztworu do dysocjacji (pożywka RPMI uzupełniona o 5% FBS, kolagenaza typu I (200 U/ml) i DNaza I (100 μg/ml)) przez 30 min w 37 °C, pipetując (używając końcówki do pipety 1 000 μl) i mieszając w wirówce laboratoryjnej (vortex) co 10 minut podczas inkubacji. Jeśli komórki mieloidalne mają być następnie wyizolowane, 5% FBS oraz kolagenazę typu I zastąpiono odpowiednio 10% FBS i kolagenazą typu IV (200 U/ml).
2. Po inkubacji zawiesinę komórkową przepuszczono przez sitko komórkowe 70 μm i przemyto dwukrotnie 10 ml buforu MACs (przygotowanego zgodnie z instrukcją producenta, Miltenyi Biotech). Opcjonalnie – w przypadku bardzo dużych guzów (>300 mm²), komórki zapalne można wstępnie wzbogacić za pomocą wirowania w gradiencie gęstości (Percoll lub Ficoll).
3. Odsessano nadsącz z płukania i dodano 1 μg przeciwciała anty-CD16/32 na 10⁸ komórek (200 μl nadsączu z hodowli klonu 2.4.G2), a następnie inkubowano w temperaturze pokojowej przez 10 min.
4. Bez płukania dodano 1 μg przeciwciała anty-Thy1.1 PE na 10⁸ komórek, wymieszano poprzez delikatne potrząsanie probówką i inkubowano przez 30 minut na lodzie, chroniąc przed światłem.
5. Komórki przemyto w celu usunięcia niezwiązanego przeciwciała pierwszorzędowego, dodając 10 ml buforu MACs i wirując przy 400 xg przez 5 minut.
6. Odsessano nadsącz i dodano 20 μl mikrokulek anty-PE (Miltenyi Biotech) na 10⁷ wszystkich komórek, zgodnie z instrukcjami producenta.
7. Wymieszano poprzez delikatne potrząsanie probówką (nie używać vortexa) i inkubowano w 4 °C (nie używać lodu) przez 15 minut, chroniąc przed światłem. Uwaga: mieszanie w vortexie może naruszyć integralność kulek.
8. Komórki przemyto, dodając 10 ml buforu MACs i wirując przy 400 xg przez 5 minut.
9. Odsessano nadsącz i zawieszono komórki w 500 μl buforu MACs. W przypadku guzów o większym rozmiarze (>300 mm²), należy użyć 1 ml buforu.
10. Umieszczono jedną kolumnę LC (Large Cell) w separatorze magnetycznym. Zawiesiny komórek guza najlepiej przepływają przez te kolumny. Przepłukano kolumnę 500 μl buforu MACs w celu jej przygotowania. Większość guzów przepłynie również przez kolumny LS i LD, ale wymagają one dalszego trawienia i mechanicznego rozbicia, aby uzyskać odpowiedni poziom zawiesiny pojedynczych komórek. Przemyto kolumnę 1 ml buforu MACs w celu jej przygotowania.
11. Nanośnięto zawiesinę komórkową na kolumnę i pozwolono jej całkowicie przepłynąć (nie pozwalając na całkowite wyschnięcie kolumny). Następnie przemyto 500 μl buforu MACs i powtórzono płukanie 3 razy. Nowy bufor należy dodawać dopiero, gdy zbiornik kolumny będzie pusty, ale nie wolno pozostawiać kolumny bez przepływu. Spowoduje to zapchanie i zmniejszenie czystości.
12. Jest to krytyczny krok dla dużych guzów podskórnych: po ostatnim etapie płukania, opuszkiem palca w rękawiczce, wywierono delikatny nacisk na górę kolumny, gdy ta wciąż znajdowała się w separatorze magnetycznym. Uwalnia to dodatkowe zanieczyszczenia, co pozwala na uzyskanie czystszej populacji wzbogaconej. Następnie kolumnę przemyto jeszcze raz 500 μl buforu MACs.
13. Wyjęto kolumnę z separatora i umieszczono ją w czystej stożkowej probówce 15 ml, dodając na kolumnę 2 ml buforu MACs. Wypłukano komórki znakowane magnetycznie, mocno wciskając tłok do kolumny.
14. Frakcję eluantu wirowano przy 400 xg przez 5 min. Czystość na tym etapie wynosi zazwyczaj od 75% do 80%. Aby osiągnąć czystość >90%, powtórzono procedurę separacji magnetycznej opisaną w krokach 1.10-1.12, używając nowej kolumny MS. Kolumna MS jest mniejsza i bardziej zwarta, więc zawiesina przepływa przez nią wolniej, ale pozwala uzyskać większą liczbę i czystość interesujących komórek.
15. Policzono liczbę komórek do dalszych eksperymentów i sprawdzono czystość za pomocą analizy cytometrycznej. W przypadku izolacji adoptywnie przeniesionych limfocytów T, takich jak te opisane w niniejszym protokole, markerami allelicznymi służącymi do identyfikacji są CD45 i Thy1.1 (komórki przeniesione) oraz Thy1.2 (limfocyty T gospodarza).

3. Reprezentatywne wyniki

Wydajność uzyskiwania konkretnej populacji komórek (np. makrofagów, komórek DC, limfocytów T itp.) będzie różnić się w zależności od wielkości guza oraz zastosowanych terapii podczas jego wzrostu. Prostata nieleczonej myszy TRAMP w wieku 14-16 tygodni powinna dostarczyć od 8x10⁵ do 1x10⁶ komórek CD11c⁺/PDCA-1⁺ (DC) przy czystości 90-95% lub od 1x10⁶ do 1,5x10⁶ komórek F4/80⁺/CD11b⁺ (makrofagów) przy czystości 80-90% z 300 mg tkanki, zgodnie z powyższym protokołem izolacji przedstawionym na Rysunku 1. Liczba każdej z tych komórek nieznacznie wzrasta po adoptywnym transferze limfocytów T swoistych dla antygenu nowotworowego. Niska czystość jest zazwyczaj wynikiem niewystarczającego przemywania, dopuszczenia do wyschnięcia kolumny (co może prowadzić do zatrzymania w niej resztek guza) lub niewystarczającego blokowania receptorów Fc.

Podobnie, całkowita liczba komórek wyizolowanych z guzów B16 będzie również zależeć od wielkości guza w momencie pobrania tkanki oraz od adaptacyjnego transferu limfocytów T (transfer 5x10⁶) z zastosowaniem lub bez zastosowania szczepionki DC (transfer 1x10⁵). Bardzo niewielka liczba antygenowo swoistych limfocytów T infiltruje guz, chyba że jeden dzień po transferze limfocytów T podano również szczepionkę DC pulsującą antygenem. W przypadku podania szczepionki DC myszy z małym, wyczuwalnym guzem (< 50 mm²), uzyskanie około 3x10⁵ limfocytów T Thy1.1⁺ o czystości 80-85% można uznać za „dobry” wynik pobrania, co przedstawiono na Rysunku 2A. Jednakże w przypadku pobrania większych guzów, całkowita wydajność i czystość będą niższe.

Makrofagi (F4/80⁺/CD11b⁺) stanowią zazwyczaj niewielki procent całkowitej liczby komórek w guzach B16. Rysunek 2B pokazuje, że wykorzystanie CD11b w przypadku guza o powierzchni 250 mm² pozwala uzyskać około 1x10⁶ makrofagów o czystości 90-95%. Ponadto Rysunek 2B wykazuje, że populacja komórek DC w guzach B16 jest heterogeniczna. W przeciwieństwie do guzów prostaty, z guzów czerniaka B16 można uzyskać dwie subpopulacje: CD11c⁺/PDCA-1⁺ (pDC) oraz CD11c⁺/PDCA-1^- (cDC). Szacuje się, że z guza B16 o powierzchni 250 mm² można uzyskać 2x10⁶ pDC i 4x10⁶ cDC przy czystości 80-90%. Obniżona czystość jest zazwyczaj wynikiem niecałkowitego usunięcia komórek nowotworowych z kolumny. Krok 2.12 jest kluczowy dla usunięcia małej grudki komórek czerniaka, która pozostaje u podstawy kolumny. Przeprowadzenie tego kroku zwiększa skuteczność etapów płukania i pozwala uzyskać lepszą czystość.

Rycina 1. Komórki dendrytyczne (CD11c⁺/PDCA-1⁺) oraz makrofagi (F4/80⁺/CD11b⁺) zostały wyizolowane z guza prostaty myszy TRAMP. Wartości na wykresach kropkowych przedstawiają procent komórek docelowych przed lub po oczyszczaniu.

Rysunek 2. (A) Adoptywnie przeniesione limfocyty T Thy1.1⁺/CD8⁺ oraz (B) komórki mieloidalne, w tym plazmacytoidalne komórki dendrytyczne CD11c⁺/PDCA-1⁺, konwencjonalne komórki dendrytyczne CD11c⁺/PDCA-1^- oraz makrofagi F4/80⁺/CD11b⁺, zostały wyizolowane z podskórnego czerniaka B16 od myszy Thy1.2⁺. Wartości na wykresach kropkowych przedstawiają procent interesujących komórek przed lub po oczyszczaniu.

Dyskusja

Niniejszy protokół można modyfikować w zależności od wielkości i pochodzenia guza (podskórnego, spontanicznego lub ortotopowego). W przypadku większych guzów zaleca się zwiększenie ilości buforu do dysocjacji i buforu MACs oraz liczby etapów płukania. Kondycja wyizolowanych komórek może zależeć od mikrośrodowiska guza (TME), z którego są one wzbogacane. Na przykład w naszym doświadczeniu komórki izolowane ze spontanicznych guzów prostaty wymagają łagodniejszej dysocjacji niż komórki izolowane z podskórnych guzów czerniaka B16. Podczas wycinania guza należy usunąć jak najwięcej tkanki tłuszczowej, skóry lub innych zanieczyszczeń, które mogą utrudnić skuteczną dysocjację enzymatyczną. Kluczowe jest całkowite strawienie masy guza i uzyskanie zawiesiny pojedynczych komórek, aby zapewnić prawidłowe znakowanie przeciwciałami (Ab) i zapobiec zapychaniu się kolumn. W celu izolacji komórek mieloidalnych zwiększono zalecaną ilość płodowej surowicy bydlęcej w buforze izolacyjnym MACs z 2% do 10%, aby poprawić żywotność komórek. Niezbędne jest również utrzymywanie wszystkich buforów i komórek w niskiej temperaturze przez cały czas trwania protokołu, aby zapobiec nieswoistemu wiązaniu przeciwciał i zapychaniu kolumny. Podsumowując, aby uzyskać silnie wzbogacone populacje komórek prezentujących antygen oraz cytotoksycznych limfocytów T specyficznych dla antygenu nowotworowego, zmodyfikowaliśmy i zoptymalizowaliśmy procedurę izolacji opartą na przeciwciałach z wykorzystaniem technologii Miltenyi Biotech. Stosując ten protokół, można wzbogacić zarówno adoptywnie przeniesione, jak i endogenne populacje leukocytów, używając przeciwciał skierowanych przeciwko markerom powierzchniowym specyficznymi dla danego typu komórek. Jedną z zalet opisanych procedur jest ograniczenie przenoszenia zanieczyszczeń z guza dzięki rozbudowanemu i rygorystycznemu płukaniu. Obejmuje to zastosowanie kolagenazy w buforze do płukania, a także określenie momentu, w którym zwiększenie ciśnienia w kolumnie może usunąć zatory spowodowane komórkami nowotworowymi. Uzyskanie wystarczającej liczby komórek odpornościowych z tkanek, zwłaszcza o czystości odpowiedniej do analizy funkcjonalnej, może być trudnym zadaniem. Jednak w naszym doświadczeniu opisany tutaj protokół pozwala uzyskać największą liczbę komórek, przy najwyższej czystości i największej powtarzalności.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Kolagenaza I	GIBCO, by Life Technologies	17100-017	Stosować podczas selekcji limfocytów T
Kolagenaza IV	GIBCO, by Life Technologies	17104-019	Stosować do selekcji komórek mieloidalnych
DNaza	Calbiochem	260913
RPMI	GIBCO, by Life Technologies	21870
PBS Dulbecco’s	Lonza Inc.	17-5158
Płodowa surowica bydlęca	Lonza Inc.	14-501F
Bufor MACs			2% FBS dla limfocytów T 10% FBS dla komórek mieloidalnych
Thy1.1 PE	eBioscience	551401
Mikrokuleczki anty-PE	Miltenyi Biotec	120-000-294
Mikrokuleczki anty-Pan DC	Miltenyi Biotec	120-003-183
Mikrokuleczki anty-CD11b	Miltenyi Biotec	120-000-300
Kolumna LC	Miltenyi Biotec	130-042-202
Kolumna MS	Miltenyi Biotec	130-042-201