Przewlekłe zakażenia helminthami przenoszonymi przez glebę (STHs) powodują zaburzenia wchłaniania, zahamowanie wzrostu oraz wyniszczenie organizmu u dzieci w fazie wzrostu. Z tego względu prawdopodobne jest, że zakażenia te obniżają również sprawność fizyczną dzieci. W niniejszym materiale prezentujemy dwie techniki diagnostyki STHs oraz test biegowy wahadłowy na dystansie 20 metrów, służący do oceny sprawności fizycznej dzieci.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Określanie statusu zakażenia helmintozami przenoszonymi przez glebę oraz sprawności fizycznej dzieci w wieku szkolnym
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Zakażenia nicieniami przenoszonymi przez glebę (STH) są powszechne. W rzeczywistości dotykają one ponad miliarda ludzi, głównie w krajach rozwijających się, gdzie dominuje ubóstwo, a zachowania higieniczne, dostęp do wody i warunki sanitarne są często niewystarczające1,2. Ascaris lumbricoides, Trichuris trichiura oraz dwa gatunki nicieni haczykowatych, Ancylostoma duodenale i Necator americanus, są najczęściej występującymi STH3. Szacowane globalne obciążenie z powodu haczykowatości, askariozy i trichurozy wynosi odpowiednio 22,1, 10,5 i 6,4 miliona lat życia skorygowanych o niepełnosprawność (DALY)4. Ponadto szacuje się, że od 30 do 100 milionów ludzi jest zakażonych Strongyloides stercoralis, najbardziej zaniedbanym gatunkiem STH o znaczeniu globalnym, który prawdopodobnie wywołuje również znaczny wpływ na zdrowie publiczne5,6. Zakażenia wielogatunkowe (tzn. obecność różnych STH u jednego osobnika) są powszechne, a zakażenia te powiązano z obniżoną produktywnością, a w konsekwencji z perspektywami gospodarczymi krajów rozwijających się1,3.
W celu diagnostyki powszechnych STH Światowa Organizacja Zdrowia (WHO) zaleca technikę Kato-Katz7,8, która jest stosunkowo prostą metodą określania rozpowszechnienia i intensywności takich zakażeń. Umożliwia ona wykrycie jaj pasożytów wydalanych z kałem przez zakażone osobniki.
W odniesieniu do diagnostyki S.stercoralis, obecnie nie dysponujemy prostym i dokładnym narzędziem. Metoda Baermanna jest najszerzej stosowaną metodą diagnostyczną. Zasada działania metody Baermanna opiera się na fakcie, że aktywne larwy S.stercoralis migrują z oświetlonej świeżej próbki kału, ponieważ larwy te wykazują fototaksję9. Wymaga ona mniej zaawansowanych materiałów laboratoryjnych i jest mniej czasochłonna niż metody hodowlane i immunologiczne5.
Schorzenia związane z infekcjami STH obejmują zarówno ostre, lecz powszechne objawy, takie jak ból brzucha, biegunka i świąd, jak i objawy przewlekłe, takie jak anemia, niedożywienie oraz zaburzenia poznawcze10. Ponieważ objawy te są zazwyczaj niespecyficzne i dyskretne, często pozostają niezauważone, są uznawane przez osoby chorych za stan normalny lub traktowane jako symptomy innych chorób, które mogą być częściej występujące w danym środowisku. W związku z tym można przypuszczać, że rzeczywista skala infekcji STH jest niedoszacowana przez narzędzia oceny opierające się na deklarowanych przez pacjentów objawach, co ma zazwyczaj miejsce w badaniach populacyjnych.
Pod koniec lat 80. i na początku lat 90. Stephenson i współpracownicy zwrócili uwagę na możliwość obniżenia sprawności fizycznej chłopców w wieku 6-12 lat przez zakażenia STH11,12. Ten kierunek badań naukowych zyskał ostatnio nowy impet13,14,15. Test biegowy wahadłowy na dystansie 20 metrów (m) został opracowany i zwalidowany przez Légera et al.16 i jest stosowany na całym świecie do pomiaru wydolności tlenowej dzieci17. Test jest łatwy do standaryzacji i może być przeprowadzony wszędzie tam, gdzie dostępny jest płaski tor biegowy o długości 20 m oraz źródło dźwięku, co czyni go atrakcyjnym w warunkach ograniczonych zasobów13. Aby ułatwić i ujednolicić próby oceny wpływu zakażeń STH na sprawność fizyczną dzieci w wieku szkolnym, przedstawiamy metodologie diagnostyki zakażeń STH oraz pomiaru sprawności fizycznej, które są proste w wykonaniu, a jednocześnie zapewniają dokładne i powtarzalne wyniki. Pomoże to w zgromadzeniu nowych dowodów dotyczących wpływu zakażeń STH na zdrowie.
Protokół
1. Metoda Kato-Katz
- Na szkiełku przedmiotowym umieść standardowy szablon Kato-Katz z otworem mieszczącym 41,7 miligrama (mg) kału.
- Nabierz 2-3 gramy (g) świeżej próbki kału na kawałek gazety lub folii aluminiowej, a następnie dociśnij z wierzchu kawałek siatki drucianej lub plastikowej w celu przesiania materiału.
- Za pomocą małej plastikowej szpatułki zeskrob przesiany materiał z siatki i całkowicie wypełnij nim otwór w szablonie Kato-Katz. Aby usunąć nadmiar materiału kałowego, wyrównaj zawartość otworu szpatułką.
- Ostrożnie podnieś szablon pionowo do góry, nie naruszając materiału kałowego przylegającego do szkiełka przedmiotowego. Szablon i szpatułkę można umyć w wodzie z detergentem i użyć ponownie.
- Na próbkę kału na szkiełku przedmiotowym nałóż kawałek celofanu, uprzednio namaczanego w roztworze gliceryny i zieleni malachitowej przez co najmniej 24 godziny (hr).
- Aby rozprowadzić materiał kałowy w formie grubego rozmazu, delikatnie dociśnij czyste szkiełko przedmiotowe do szkiełka z próbką, równomiernie rozdzielając materiał w obrębie koła o średnicy nieco mniejszej niż szerokość szkiełka przedmiotowego.
- Pozostaw szkiełko do przejaśnienia na 30-60 minut (min), podczas których szkiełka muszą być chronione przed bezpośrednim światłem słonecznym. Następnie systematycznie zbadaj gruby rozmaz pod mikroskopem świetlnym (powiększenie 40-100x). Policz liczbę jaj STH i podziel je według gatunków (tj. A.lumbricoides, T.trichiura oraz nicienie haczykowate). Należy odnotować, że tą metodą można wykryć również jaja innych helmintów (np. Schistosoma mansoni), które należy policzyć i zapisać oddzielnie.
- Aby uzyskać znormalizowaną ocenę intensywności zakażenia, tradycyjnie wyrażaną jako liczba jaj na gram kału (EPG), pomnóż liczbę jaj przez 24 (24 x 41,7 mg ≈ 1 g).
2. Metoda Baermanna
- Przygotować statyw, który może utrzymać lejek szklany, i przymocować do dna lejka gumową rurkę zamkniętą zaciskiem.
- Włożyć do lejka sito lub kawałek siatki drucianej w kształcie stożka i wyłożyć go warstwą gazy medycznej.
- Napełnić lejek wodą z kranu i upewnić się, że cały układ jest szczelny.
- Nałożyć 20-30 g świeżych kał na środek gazy medycznej i upewnić się, że próbka jest całkowicie zanurzona w wodzie. W razie potrzeby dolać wody. Złożyć gazę medyczną tak, aby przykryła próbkę.
- Naświetlać lejek sztucznym światłem od dołu przez 2 hr.
- Zlać 50 ml wody z dolnej części lejka do probówki wirówkowej, delikatnie zwalniając zacisk na gumowej rurce.
- Wirować zebraną wodę przy 600 x g (względna siła odśrodkowa) przez 5 min i ostrożnie odlać nadsącz, nie naruszając osadu. Pozostawić w probówce ostatnie kilka kropel.
- Resuspendować osad, nanieść 2 krople roztworu na szkiełko przedmiotowe i zbadać preparat pod mikroskopem świetlnym (powiększenie 40x w celu detekcji oraz 100-400x w celu potwierdzenia gatunku). Larwy pierwszego stadium (L1) S. stercoralis są żywe i aktywnie poruszają się pod mikroskopem.
3. Test biegowy wahadłowy na dystansie 20 m
- Wyznacz płaski i prosty tor biegowy o długości 20 m i oznacz go pachołkami.
- Pomóż uczestnikowi testu założyć monitor tętna na nadgarstek oraz odpowiadający mu nadajnik wokół klatki piersiowej18. Sprzęt ten pozwala na pomiar tętna uczestnika przed i po teście, co umożliwia monitorowanie, czy uczestnik włożył w ćwiczenie maksymalny wysiłek.
- Poleć uczestnikowi bieg w przód i w tył na torze, zgodnie z tempem wcześniej nagranych sygnałów dźwiękowych wyznaczających pętle 20-m. Zaczynając od prędkości biegu 8,5 kilometrów na godzinę (km/hr), częstotliwość sygnałów wskazujących interwały 20-m zwiększa się o równowartość 0,5 km/hr każdej min.
- Upewnij się, że uczestnik rozpoczyna nowy interwał 20-m za każdym razem, gdy wybrzmi sygnał, i kończy go przed pojawieniem się kolejnego sygnału.
- Zatrzymaj uczestnika, jeśli nie zdoła on utrzymać tempa przez dwa kolejne interwały 20-m.
- Zapisz najwyższą prędkość biegu wskazaną dla ostatniego interwału, który uczestnik ukończył w pełni, a także wiek i płeć uczestnika.
- Zweryfikuj, czy tętno osiągnięte na koniec testu jest maksymalnym tętnem dziecka19. Jeśli tętno to nie zostało osiągnięte, dziecko mogło nie włożyć maksymalnego wysiłku, w związku z czym test należy powtórzyć.
- Oszacuj maksymalną wydolność tlenową (VO2 max) uczestnika, korzystając z równania zaproponowanego przez Légera i współpracowników: VO2 max = 31,025 + 3,238 * speed (in km/hr) - 3,248 * age (in years) + 0,1536 * speed (in km/hr) * age (in years).
4. Reprezentatywne wyniki
W zakresie diagnostyki STH metodą Kato-Katz, unikalne cechy jaj różnych helminthów umożliwiają identyfikację większości gatunków20. Jaja A.lumbricoides (o długości około 45-75 μm i szerokości 35-50 μm, Rycina 1) mają grubsze ściany skorupki niż jaja T.trichiura (Rycina 2) i haczykówców (Rycina 3). Zapłodnione jajo A.lumbricoides (Rycina 1) posiada zewnętrzną otoczkę albuminową, która nadaje mu złocistobrązowy kolor, natomiast jajo niezapłodnione nie posiada tej otoczki, jest nieco bardziej wydłużone i ogólnie większe. Jaja T.trichiura (o długości około 50 μm i szerokości 22 μm, Rycina 2) są wydłużone i posiadają wyraźne korki polarne. Jaja haczykówców (o długości około 64-76 μm i szerokości 36-40 μm, Rycina 3) z kolei mają bardzo cienką ściankę, za którą znajduje się przejrzysty pierścień otaczający gęsty skup komórek w centrum jaja.
S.stercoralis larwy L1 (Rysunek 4) mają długość około 180-380 μm i bardzo krótką jamę gębową. Można zaobserwować wyraźny zrąb narządów płciowych (zaznaczony niebieską strzałką na Rysunku 4), a ogon larw (zaznaczony czerwoną strzałką na Rysunku 4) ma ostry koniec.
Ponieważ rzeczywisty wpływ infekcji STH na sprawność fizyczną dzieci jest wciąż przedmiotem dyskusji13,14,15, obecnie nie ma reprezentatywnych wyników w tej kwestii. Interpretację wyników testu biegu wahadłowego na dystansie 20 m można przeprowadzić na różne sposoby. Sprawność fizyczną dzieci można porównać między osobnikami zainfekowanymi i niezinfekowanymi, podobnymi pod względem wieku i płci, innych potencjalnie istotnych stanów zdrowia, statusu socjoekonomicznego oraz nawyków kulturowych. Można to zrobić w badaniu przekrojowym13,14,15, w którym status infekcji STH oraz sprawność fizyczną dzieci zainfekowanych i niezinfekowanych ocenia się w konkretnym punkcie czasowym. Dowody będą silniejsze w przypadku zastosowania projektu randomizowanego badania kontrolowanego, w którym sprawność fizyczna dzieci w wieku szkolnym jest oceniana przed i po leczeniu anthelmintycznym/placebo, co pozwala na ocenę zarówno krótkoterminową, jak i długoterminową. Można ponadto próbować zidentyfikować ewentualną zależność dawka-odpowiedź między intensywnością infekcji STH a sprawnością fizyczną oraz porównać różne poziomy multiparazytyzmu1 ze sprawnością fizyczną. W pracy przedstawionej przez Yapa i współpracowników15 stwierdzono, że sprawność fizyczna, opisana przez VO2 max, była znacząco obniżona u dzieci zainfekowanych T.trichiura w porównaniu z dziećmi, które nie były zainfekowane T.trichiura (Rycina 5).
Rycina 1. Obrazy mikroskopowe jaj A.lumbricoides : zapłodnionych (A) i niezapłodnionych (B) przy powiększeniu 500x. Pasek skali = 50 μm.
Rycina 2. Obraz mikroskopowy jaja T.trichiura przy powiększeniu 500x. Pasek skali = 50 μm.
Rycina 3. Obraz mikroskopowy jaja nicienia przy powiększeniu 500x. Pasek skali = 50 μm.
Rycina 4. Obraz mikroskopowy larwy L1 S.stercoralis przy powiększeniu 250x. Strzałki wskazują ogon (czerwona) i prymordium narządów płciowych (niebieska). Pasek skali = 100 μm.
Rycina 5. Wykres przedstawiający poziom sprawności fizycznej dzieci zakażonych T.trichiura w porównaniu do poziomu sprawności fizycznej dzieci niezakażonych T. trichiura.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Trzy protokoły opisane w niniejszej pracy zostały przetestowane i przeprowadzone w południowo-zachodniej części prowincji Junnan w Chińskiej Republice Ludowej wśród członków mniejszości etnicznej Bulang21 oraz w różnych częściach Afryki6,13,14.
Dostępnych jest kilka szablonów do techniki Kato-Katz. Każdy otwór o odmiennym rozmiarze pozwala na pobranie różnej ilości materiału kałowego. W celu obliczenia liczby jaj na gram kału (EPG) konieczna jest zatem znajomość jednostki...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Autorzy są wdzięczni społecznościom w prowincji Junnan w Chińskiej Republice Ludowej oraz w Agboville w Wybrzeżu Kości Słoniowej za udział w opisanych powyżej badaniach. Jesteśmy zobowiązani wobec lokalnych zespołów terenowych, które pomogły w testowaniu i wdrażaniu protokołów. Szczególne podziękowania kierujemy do następujących współpracowników ze Szwajcarskiego Instytutu Zdrowia Tropikalnego i Publicznego: Yvette Endriss za udostępnienie obrazów mikroskopowych, Hanspeterowi Martiemu i jego zespołowi za wsparcie laboratoryjne oraz Stefanie Krauth za pomoc podczas nagrywania wideo. Na koniec dziękujemy dwóm anonimowym recenzentom za szereg cennych uwag.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
Uwaga: Materiały w tej liście są ogólne i mogą być pozyskiwane z różnych źródeł. | |||
| Zestaw Kato-Katz [400 plastikowych szablonów z otworem o średnicy 6 milimetrów (mm) w szablonie o grubości 1,5 mm; 400 plastikowych szpatułek; 20-m rolka nylonowej siatki o oczkach 80; 20-m rolka celofanu hydrofilowego o grubości 34 μm.] | Vestergaard Frandsen | Należy pamiętać, że roztwór gliceryny i zieleni malachitowej nie wchodzi w skład tego zestawu, ale można go zakupić u każdego dostawcy chemikaliów. | |
| Lejek szklany [o szerokości ok. 8 centymetrów (cm) i głębokości 6 cm] | Lejek szklany do metody Baermanna powinien pomieścić około 60 mL wody. Rozmiar węża gumowego i gazy zależy od rodzaju użytego lejka szklanego. | ||
| Mikroskop biologiczny | Olympus | CX21LED/CX21 | |
| Wirówka | Shanghai Medical Instruments Group | 80 - 2T | |
| Nagrane sygnały | Bitworks Design | Team Bleep Test Version 1.3.1 | Aplikacja na iPhone |
| Monitor tętna | POLAR | FT1 | Zegarek i nadajnik |
Bibliografia
- Steinmann, P., Utzinger, J., Du, Z. W., Zhou, X. N. Multiparasitism: a neglected reality on global, regional and local scale. Advances in Parasitology. 73, 21-50 (2010).
- Bethony, J., Brooker, S., Albonico, M., Geiger, S., Loukas, A., Diemert, D., Hotez, P. J. The soil-transmitted helminth infections: ascariasis, trichuriasis, and hookworm. Lancet. 367, 1521-1532 (2006).
- Hotez, P. J., Molyneux, D. H., Fenwick, A., Kumaresan, J., Ehrlich Sachs, S., Sachs, J. D., Savioli, L. Control of neglected tropical diseases. New England Journal of Medicine. 357, 1018-1027 (2007).
- Chan, M. S. The global burden of intestinal nematode infections-fifty years on. Parasitology Today. 13, 438-443 (1997).
- Olsen, A., van Lieshout, L., Marti, H., Polderman, T., Polman, K., Steinmann, P., Stothard, R., Thybo, S., Verweij, J. J., Magnussen, P. Strongyloidiases - the most neglected of the neglected tropical diseases. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 103, 967-972 (2009).
- Becker, S. L., Sieto, B., Silue, K. D., Adjossan, L., Kone, S., Hatz, C., Kern, W. V., N'Goran, E. K., Utzinger, J. Diagnosis, clinical features, and self-reported morbidity of Strongyloides stercoralis and hookworm infection in a co-endemic setting. PLoS Neglected Tropical Diseases. 5, e1292(2011).
- World Health Organization. Action against worms. WHO Newsletter. (11), Geneva. (2008).
- Montresor, A., Crompton, D. W. T., Hall, A., Bundy, D. A. P., Savioli, L. Guidelines for the evaluation of soil-transmitted helminthiasis and schistosomiasis at community level. World Health Organization. , (1998).
- García, L. S., Bruckner, D. A. Diagnostic medical parasitology. , American Society for Microbiology. Washington D.C. (2001).
- Brooker, S. Estimating the global distribution and disease burden of intestinal nematode infection: adding up the numbers - a review. International Journal for Parasitology. 40, 1137-1144 (2010).
- Stephenson, L. S., Latham, M. C., Kinoti, S. N., Kurz, K. M., Brigham, H. Improvements in physical fitness of Kenyan schoolboys infected with hookworm, Trichuris trichiura and Ascaris lumbricoides following a single dose of albendazole. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 84, 277-282 (1990).
- Stephenson, L. S., Latham, M. C., Adams, E. J., Kinoti, S. N., Pertet, A. Physical fitness, growth and appetite of Kenyan school boys with hookworm, Trichuris trichiura and Ascaris lumbricoides infections are improved four months after a single dose of albendazole. Journal of Nutrition. 123, 1036-1046 (1993).
- Bustinduy, A. L., Thomas, C. L., Fiutem, J. J., Parraga, I. M., Mungai, P. L., Muchiri, E. M., Mutuku, F., Kitron, U., King, C. H. Measuring fitness of Kenyan children with polyparasitic infections using the 20-meter shuttle run test as a morbidity metric. PLoS Neglected Tropical Diseases. 5, e1213(2011).
- Müller, I., Coulibaly, J. T., Fürst, T., Knopp, S., Hattendorf, J., Krauth, S. J., Stete, K., Righetti, A. A., Glinz, D., Yao, A. K., Pühse, U., N'Goran, E. K., Utzinger, J. Effect of schistosomiasis and soil-transmitted helminth infections on physical fitness of school children in Côte d'Ivoire. PLoS Neglected Tropical Diseases. 5, e1239(2011).
- Yap, P., Du, Z. W., Chen, R., Zhang, L. P., Wu, F. W., Wang, J., Wang, X. Z., Zhou, H., Zhou, X. N., Utzinger, J., Steinmann, P. Soil-transmitted helminth infections and physical fitness in school-aged Bulang children of southwest China: results from a cross-sectional survey. Parasites and Vectors. 5, 50(2012).
- Léger, L. A., Mercier, D., Gadoury, C., Lambert, J. The multistage 20 metre shuttle run test for aerobic fitness. Journal of Sports Sciences. 6, 93-101 (1988).
- Tomkinson, G. R., Léger, L. A., Olds, T. S., Cazorla, G. Secular trends in the performance of children and adolescents (1980-2000): an analysis of 55 studies of the 20 m shuttle run test in 11 countries. Sports Medicine. 33, 285-300 (2003).
- POLAR Electro, User Manual for POLAR FT1/FT2 in English. , Available from: http://www.polar.fi/en/support/manuals/User_Manual_for_Polar_FT1_FT2_in_English?product_id=26180&category=manuals (2011).
- Mahon, A. D., Marjerrison, A. D., Lee, J. D., Woodruff, M. E., Hanna, L. E. Evaluating the prediction of maximal heart rate in children and adolescents. Research Quarterly for Exercise and Sport. 81, 466-471 (2010).
- Bogitsh, B. J., Carter, C. E., Oeltmann, T. N. Human Parasitology. , third edition, Elsevier Academic Press. (2011).
- Steinmann, P., Zhou, X. N., Du, Z. W., Jiang, J. Y., Wang, L. B., Wang, X. Z., Li, L. H., Marti, H., Utzinger, J. Occurence of Strongyloides stercoralis in Yunnan province, China, and comparison of diagnostic methods. PLoS Neglected Tropical Diseases. 1, e75(2007).
- Martin, L. K., Beaver, P. C. Evaluation of Kato thick-smear technique for quantitative diagnosis of helminth infections. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 17, 382-391 (1968).
- Dacombe, R. J., Crampin, A. C., Floyd, S., Randall, A., Ndhlovu, R., Bickle, Q., Fine, P. E. Time delays between patient and laboratory selectively affect accuracy of helminth diagnosis. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 101, 140-145 (2007).
- Knopp, S., Mgeni, A. F., Khamis, I. S., Steinmann, P., Stothard, J. R., Rollinson, D., Marti, H., Utzinger, J. Diagnosis of soil-transmitted helminths in the era of preventive chemotherapy: effect of multiple stool sampling and use of different diagnostic techniques. PloS Neglected Tropical Diseases. 2, e331(2008).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
