Określanie statusu zakażenia helmintozami przenoszonymi przez glebę oraz sprawności fizycznej dzieci w wieku szkolnym

Podsumowanie

Przewlekłe zakażenia helminthami przenoszonymi przez glebę (STHs) powodują zaburzenia wchłaniania, zahamowanie wzrostu oraz wyniszczenie organizmu u dzieci w fazie wzrostu. Z tego względu prawdopodobne jest, że zakażenia te obniżają również sprawność fizyczną dzieci. W niniejszym materiale prezentujemy dwie techniki diagnostyki STHs oraz test biegowy wahadłowy na dystansie 20 metrów, służący do oceny sprawności fizycznej dzieci.

Streszczenie

Zakażenia nicieniami przenoszonymi przez glebę (STH) są powszechne. W rzeczywistości dotykają one ponad miliarda ludzi, głównie w krajach rozwijających się, gdzie dominuje ubóstwo, a zachowania higieniczne, dostęp do wody i warunki sanitarne są często niewystarczające^1,2. Ascaris lumbricoides, Trichuris trichiura oraz dwa gatunki nicieni haczykowatych, Ancylostoma duodenale i Necator americanus, są najczęściej występującymi STH³. Szacowane globalne obciążenie z powodu haczykowatości, askariozy i trichurozy wynosi odpowiednio 22,1, 10,5 i 6,4 miliona lat życia skorygowanych o niepełnosprawność (DALY)⁴. Ponadto szacuje się, że od 30 do 100 milionów ludzi jest zakażonych Strongyloides stercoralis, najbardziej zaniedbanym gatunkiem STH o znaczeniu globalnym, który prawdopodobnie wywołuje również znaczny wpływ na zdrowie publiczne^5,6. Zakażenia wielogatunkowe (tzn. obecność różnych STH u jednego osobnika) są powszechne, a zakażenia te powiązano z obniżoną produktywnością, a w konsekwencji z perspektywami gospodarczymi krajów rozwijających się^1,3.

W celu diagnostyki powszechnych STH Światowa Organizacja Zdrowia (WHO) zaleca technikę Kato-Katz^7,8, która jest stosunkowo prostą metodą określania rozpowszechnienia i intensywności takich zakażeń. Umożliwia ona wykrycie jaj pasożytów wydalanych z kałem przez zakażone osobniki.

W odniesieniu do diagnostyki S.stercoralis, obecnie nie dysponujemy prostym i dokładnym narzędziem. Metoda Baermanna jest najszerzej stosowaną metodą diagnostyczną. Zasada działania metody Baermanna opiera się na fakcie, że aktywne larwy S.stercoralis migrują z oświetlonej świeżej próbki kału, ponieważ larwy te wykazują fototaksję⁹. Wymaga ona mniej zaawansowanych materiałów laboratoryjnych i jest mniej czasochłonna niż metody hodowlane i immunologiczne⁵.

Schorzenia związane z infekcjami STH obejmują zarówno ostre, lecz powszechne objawy, takie jak ból brzucha, biegunka i świąd, jak i objawy przewlekłe, takie jak anemia, niedożywienie oraz zaburzenia poznawcze¹⁰. Ponieważ objawy te są zazwyczaj niespecyficzne i dyskretne, często pozostają niezauważone, są uznawane przez osoby chorych za stan normalny lub traktowane jako symptomy innych chorób, które mogą być częściej występujące w danym środowisku. W związku z tym można przypuszczać, że rzeczywista skala infekcji STH jest niedoszacowana przez narzędzia oceny opierające się na deklarowanych przez pacjentów objawach, co ma zazwyczaj miejsce w badaniach populacyjnych.

Pod koniec lat 80. i na początku lat 90. Stephenson i współpracownicy zwrócili uwagę na możliwość obniżenia sprawności fizycznej chłopców w wieku 6-12 lat przez zakażenia STH^11,12. Ten kierunek badań naukowych zyskał ostatnio nowy impet^13,14,15. Test biegowy wahadłowy na dystansie 20 metrów (m) został opracowany i zwalidowany przez Légera et al.¹⁶ i jest stosowany na całym świecie do pomiaru wydolności tlenowej dzieci¹⁷. Test jest łatwy do standaryzacji i może być przeprowadzony wszędzie tam, gdzie dostępny jest płaski tor biegowy o długości 20 m oraz źródło dźwięku, co czyni go atrakcyjnym w warunkach ograniczonych zasobów¹³. Aby ułatwić i ujednolicić próby oceny wpływu zakażeń STH na sprawność fizyczną dzieci w wieku szkolnym, przedstawiamy metodologie diagnostyki zakażeń STH oraz pomiaru sprawności fizycznej, które są proste w wykonaniu, a jednocześnie zapewniają dokładne i powtarzalne wyniki. Pomoże to w zgromadzeniu nowych dowodów dotyczących wpływu zakażeń STH na zdrowie.

Protokół

1. Metoda Kato-Katz

1. Umieść na szkiełku mikroskopowym standardowy szablon Kato-Katz z otworem przeznaczonym na 41,7 miligramów (mg) kału.
2. Nanieś 2-3 gramy (g) świeżej próbki kału na kawałek gazety lub folii aluminiowej, a następnie dociśnij do niej kawałek drucianej lub plastikowej siatki, aby przesiać materiał.
3. Za pomocą małej plastikowej szpatułki zeskrob przesiany materiał z siatki i całkowicie wypełnij nim otwór w szablonie Kato-Katz. Aby usunąć nadmiar materiału kałowego, wyrównaj zawartość otworu szpatułką.
4. Pionowo zdejmij szablon, nie naruszając materiału kałowego przylegającego do szkiełka mikroskopowego. Szablon i szpatułkę można myć w wodzie z detergentem i używać ponownie.
5. Na próbkę kału na szkiełku mikroskopowym połóż kawałek celofanu, namoczony wcześniej w roztworze gliceryny i zieleni malachitowej przez co najmniej 24 godziny (hr).
6. Aby rozprzestrzenić materiał kałowy w postaci grubego preparatu, delikatnie dociśnij czyste szkiełko mikroskopowe do szkiełka z próbką, równomiernie rozdzielając materiał w obrębie koła o średnicy nieco mniejszej niż szerokość szkiełka mikroskopowego.
7. Pozostaw preparat do przejaśnienia na 30-60 minut (min), pamiętając, że w tym czasie szkiełka muszą być przechowywane z dala od bezpośredniego światła słonecznego. Następnie systematycznie zbadaj gruby preparat pod mikroskopem świetlnym (powiększenie 40-100x). Policz liczbę jaj STH i podziel je według gatunków (tj. A.lumbricoides, T.trichiura oraz nicieni haczykowatych). Należy odnotować, że metodą tą można wykryć również jaja innych helmintów (np. Schistosoma mansoni), które należy policzyć i zapisać oddzielnie.
8. Aby uzyskać ustandaryzowany szacunek natężenia infekcji, konwencjonalnie wyrażany jako liczba jaj na gram kału (EPG), pomnóż liczbę jaj przez 24 (24 x 41,7 mg ≈ 1 g).

2. Metoda Baermanna

1. Przygotować statyw, który może utrzymać szklany lejek, i przymocować do dna lejka gumową rurkę zamkniętą zaciskiem.
2. Włożyć do lejka sito lub kawałek siatki drucianej w kształcie stożka i wyłożyć go gazą medyczną.
3. Napełnić lejek wodą z kranu i upewnić się, że cały układ jest szczelny.
4. Nałożyć 20-30 g świeżego kału na środek gazy medycznej i upewnić się, że próbka jest całkowicie zanurzona w wodzie. W razie potrzeby dodać więcej wody. Złożyć gazę medyczną nad próbką.
5. Naświetlać lejek od dołu światłem sztucznym przez 2 hr.
6. Zlać 50 mililitrów (ml) wody z dolnej części lejka do probówki do wirowania, delikatnie otwierając zacisk na gumowej rurce.
7. Wirować zebraną wodę przy 600 x g (względna siła odśrodkowa) przez 5 min i ostrożnie odlać nadsącz, nie naruszając osadu. Pozostawić w probówce ostatnie kilka kropel.
8. Resuspender osad, nanieść 2 krople roztworu na szkiełko przedmiotowe i zbadać preparat pod mikroskopem świetlnym (powiększenie 40x dla detekcji i 100-400x dla potwierdzenia gatunku). Larwy pierwszego stadium (L1) S. stercoralis są żywe i aktywnie poruszają się pod mikroskopem.

3. Test biegowy wahadłowy na dystansie 20 m

1. Wymierz płaski i prosty odcinek biegowy o długości 20 m i wyznacz go za pomocą pachołków.
2. Pomóż uczestnikowi badania założyć pulsometr na nadgarstek oraz odpowiadający mu nadajnik wokół klatki piersiowej¹⁸. Sprzęt ten umożliwia pomiar tętna uczestnika przed i po teście, co pozwala monitorować, czy uczestnik włożył w wysiłek maksymalne zaangażowanie.
3. Poleć uczestnikowi bieg w przód i w tył na wyznaczonym odcinku, dostosowując tempo do wcześniej nagranych sygnałów dźwiękowych wyznaczających pętle o długości 20 m. Początkowa prędkość biegu wynosi 8,5 kilometrów na godzinę (km/h), a częstotliwość sygnałów wskazujących interwały 20 m zwiększa się o równowartość 0,5 km/h w każdej minucie.
4. Upewnij się, że uczestnik rozpoczyna nowy interwał 20 m przy każdym sygnale dźwiękowym i kończy go przed pojawieniem się kolejnego sygnału.
5. Zatrzymaj uczestnika, jeśli nie zdoła on dotrzymać tempa przez dwa kolejne interwały 20 m.
6. Zapisz najwyższą prędkość biegu wskazaną dla ostatniego interwału, który uczestnik ukończył w pełni, wraz z wiekiem i płcią uczestnika.
7. Zweryfikuj, czy tętno osiągnięte na koniec testu odpowiada maksymalnemu tętnu dziecka¹⁹. Jeśli tętno to nie zostało osiągnięte, dziecko mogło nie włożyć maksymalnego wysiłku, w związku z czym test należy powtórzyć.
8. Oszacuj maksymalną zdolnośćt tlenową (VO₂ max) uczestnika, korzystając z równania opracowanego przez Légera i współpracowników: VO₂ max = 31,025 + 3,238 * prędkość (w km/h) - 3,248 * wiek (w latach) + 0,1536 * prędkość (w km/h) * wiek (w latach).

4. Reprezentatywne wyniki

W kontekście diagnostyki STH z wykorzystaniem techniki Kato-Katz, unikalne cechy jaj różnych helminthów umożliwiają identyfikację większości gatunków²⁰. Jaja A.lumbricoides (o długości około 45-75 μm i szerokości 35-50 μm, Rycina 1) mają grubsze ściany skorupki niż jaja T.trichiura (Rycina 2) oraz nicieni haczykowatych (Rycina 3). Zapłodnione jajo A.lumbricoides (Rycina 1) posiada zewnętrzną otoczkę albuminową, która nadaje mu złocisto-brązowy kolor, podczas gdy jajo niezapłodnione nie posiada tej zewnętrznej otoczki, jest nieco bardziej wydłużone i ogólnie większe. Jaja T.trichiura (o długości około 50 μm i szerokości 22 μm, Rycina 2) są wydłużone i posiadają wyraźne czopy polarne. Z kolei jaja nicieni haczykowatych (o długości około 64-76 μm i szerokości 36-40 μm, Rycina 3) mają bardzo cienką ścianę, za którą następuje przejrzysty pierścień otaczający gęsty skup komórek w centrum jaja.

S.stercoralis L₁ (larwy) (Rycina 4) mają długość około 180-380 μm i bardzo krótką jamę gębową. Można zaobserwować wyraźny zrąbek płciowy (oznaczony niebieską strzałką na Rycynie 4), a ogon larw (oznaczony czerwoną strzałką na Rycynie 4) ma ostry koniec.

Ponieważ rzeczywisty wpływ infekcji STH na sprawność fizyczną dzieci jest wciąż przedmiotem dyskusji^13,14,15, obecnie nie ma reprezentatywnych wyników dotyczących tego oddziaływania. Interpretacja wyników testu biegowego wahadłowego na dystansie 20 m może być przeprowadzona na różne sposoby. Sprawność fizyczną dzieci można porównywać między osobnikami zakażonymi i niezakażonymi, którzy są podobni pod względem wieku i płci, innych potencjalnie istotnych stanów zdrowia, statusu socjoekonomicznego oraz nawyków kulturowych. Można to zrobić w badaniu przekrojowym^13,14,15, w którym w konkretnym punkcie czasowym ocenia się status infekcji STH oraz sprawność fizyczną dzieci zakażonych i niezakażonych. Siła dowodów będzie większa w przypadku zastosowania schematu randomizowanego badania kontrolowanego, w którym sprawność fizyczna dzieci w wieku szkolnym jest oceniana przed i po leczeniu anthelmintycznym lub placebo, co pozwala na ewaluację zarówno krótkoterminową, jak i długoterminową. Można ponadto podjąć próbę zidentyfikowania potencjalnej zależności dawka-odpowiedź między intensywnością infekcji STH a sprawnością fizyczną oraz porównać różne poziomy multiparazytizmu¹ ze sprawnością fizyczną. W pracy przedstawionej przez Yap i współpracowników¹⁵ stwierdzono, że sprawność fizyczna, opisana przez VO₂ max, była znacznie niższa u dzieci zakażonych T.trichiura w porównaniu z dziećmi, które nie były zakażone T.trichiura (Rysunek 5).

Rycina 1. Obrazy mikroskopowe jaj A.lumbricoides: zapłodnionych (A) i niezapłodnionych (B) przy powiększeniu 500x. Pasek skali = 50 μm.

Rycina 2. Obraz mikroskopowy jaja T.trichiura przy powiększeniu 500x. Pasek skali = 50 μm.

Rysunek 3. Obraz mikroskopowy jaja nicienia krwozakowego przy powiększeniu 500x. Pasek skali = 50 μm.

Rycina 4. Obraz mikroskopowy larwy L₁ S.stercoralis przy powiększeniu 250x. Strzałki wskazują ogon (czerwona) i primordium narządów płciowych (niebieska). Pasek skali = 100 μm.

Rysunek 5. Wykres przedstawiający poziom sprawności fizycznej dzieci zakażonych T.trichiura w porównaniu do poziomu sprawności fizycznej dzieci niezakażonych T. trichiura.

Dyskusja

Trzy protokoły opisane w niniejszej pracy zostały przetestowane i przeprowadzone w południowo-zachodniej części prowincji Junnan w Chińskiej Republice Ludowej wśród członków mniejszości etnicznej Bulang²¹ oraz w różnych częściach Afryki^6,13,14.

Dostępnych jest kilka szablonów do techniki Kato-Katz. Każdy otwór o odmiennym rozmiarze pozwala na pobranie różnej ilości materiału kałowego. W celu obliczenia liczby jaj na gram kału (EPG) konieczna jest zatem znajomość jednostki...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Uwaga: Materiały w tej liście są ogólne i mogą być pozyskiwane z różnych źródeł.
Zestaw Kato-Katz [400 plastikowych szablonów z otworem o średnicy 6 milimetrów (mm) w szablonie o grubości 1,5 mm; 400 plastikowych szpatułek; 20-m rolka nylonowej siatki o oczkach 80; 20-m rolka celofanu hydrofilowego o grubości 34 μm.]	Vestergaard Frandsen		Należy pamiętać, że roztwór gliceryny i zieleni malachitowej nie wchodzi w skład tego zestawu, ale można go zakupić u każdego dostawcy chemikaliów.
Lejek szklany [o szerokości ok. 8 centymetrów (cm) i głębokości 6 cm]			Lejek szklany do metody Baermanna powinien pomieścić około 60 mL wody. Rozmiar węża gumowego i gazy zależy od rodzaju użytego lejka szklanego.
Mikroskop biologiczny	Olympus	CX21LED/CX21
Wirówka	Shanghai Medical Instruments Group	80 - 2T
Nagrane sygnały	Bitworks Design	Team Bleep Test Version 1.3.1	Aplikacja na iPhone
Monitor tętna	POLAR	FT1	Zegarek i nadajnik