Kontrolowanie wielkości, kształtu i stabilności polimerów supramolekularnych w wodzie

Summary

Celem tego eksperymentu jest określenie i kontrola rozmiaru, kształtu i stabilności samodzielnie składających się dyskotycznych amfifilów w wodzie. W przypadku wodnych polimerów supramolekularnych taki poziom kontroli jest bardzo trudny. Stosujemy strategię wykorzystującą zarówno odpychające, jak i atrakcyjne interakcje. Techniki eksperymentalne zastosowane do scharakteryzowania tego systemu mają szerokie zastosowanie.

Abstract

Dla wodnych polimerów supramolekularnych, jednoczesna kontrola nad kształtem, rozmiarem i stabilnością jest bardzo trudna¹. Jednocześnie zdolność do tego jest bardzo ważna ze względu na szereg zastosowań w funkcjonalnej miękkiej materii, w tym w elektronice, inżynierii biomedycznej i czujnikach. W przeszłości skuteczne strategie kontrolowania rozmiaru i kształtu polimerów supramolekularnych zazwyczaj koncentrowały się na wykorzystaniu matryc^2,3, zakręcaczy końcowych⁴ lub technik selektywnego rozpuszczalnika⁵.

Tutaj ujawniamy strategię opartą na samoorganizujących się dyskotycznych amfifilach, która prowadzi do kontroli nad długością stosu i kształtem uporządkowanych, chiralnych agregatów kolumnowych. Równoważąc elektrostatyczne oddziaływania odpychające na hydrofilowym brzegu i przyciągające siły niekowalencyjne w hydrofobowym rdzeniu polimeryzującego bloku budulcowego, udaje nam się stworzyć małe i dyskretne obiekty sferyczne^6,7. Zwiększenie stężenia soli w celu przesiewania ładunków indukuje przejście od kuli do pręta. Co ciekawe, przejście to wyraża się we wzroście kooperatywności w zależnym od temperatury mechanizmie samoorganizacji i uzyskuje się bardziej stabilne agregaty.

Do naszego badania wybieramy rdzeń benzeno-1,3,5-trikarboksyamidu (BTA) połączony z hydrofilowym chelatem metalu za pomocą hydrofobowego, fluorowanego przekładki na bazie L-fenyloalaniny (Schemat 1). Wybrany chelat metalu to kompleks Gd(III)-DTPA, który zawiera dwa całkowite pozostałe ładunki na kompleks i koniecznie dwa przeciwjony. Jednowymiarowy wzrost agregatu jest kierowany przez układanie w stosy π-π i międzycząsteczkowe wiązania wodorowe. Jednak elektrostatyczne, odpychające siły, które powstają z ładunków w kompleksie Gd(III)-DTPA, zaczynają ograniczać jednowymiarowy wzrost dyskotyki opartej na BTA po osiągnięciu pewnego rozmiaru. Przy stężeniach milimolowych utworzony agregat ma kulisty kształt i średnicę około 5 nm, jak wywnioskowano ze spektroskopii ¹H-NMR, rozpraszania promieniowania rentgenowskiego pod małym kątem i kriogenicznej transmisyjnej mikroskopii elektronowej (cryo-TEM). Siła elektrostatycznych oddziaływań odpychających między cząsteczkami może być zmniejszona poprzez zwiększenie stężenia soli w buforowanych roztworach. Owo przesiewanie ładunków indukuje przejście od sferycznych agregatów do wydłużonych prętów o długości > 25 nm. Cryo-TEM pozwala na wizualizację zmian kształtu i rozmiaru. Ponadto spektroskopia CD pozwala na uzyskanie mechanistycznych szczegółów procesów samoorganizacji przed i po dodaniu soli. Co ważne, kooperatywność – kluczowa cecha, która decyduje o właściwościach fizycznych wytwarzanych polimerów supramolekularnych – znacznie wzrasta po przesiewaniu oddziaływań elektrostatycznych. Ten wzrost kooperatywności powoduje znaczny wzrost masy cząsteczkowej powstających polimerów supramolekularnych w wodzie.

Protocol

Schemat 1. Samoorganizacja dyskotyków na bazie BTA w buforze cytrynianowym w sferyczne agregaty o średnicy około 5 nm, przy milimolowych stężeniach bloku budulcowego. Zwiększenie siły jonowej poprzez dodanie NaCl powoduje powstawanie wydłużonych prętów o średnicy około 3 nm i długości > 25 nm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą postać.

1. Przygotowanie roztworów BTA-Gd(III)DTPA do spektroskopii CD i pomiar widm CD zależnych od temperatury w funkcji stężenia NaCl

1. Przygotować 100 mM bufor cytrynianu (pH 6,0).
2. Przygotować 100 mM bufor cytrynianowy (pH 6,0) z 2 M NaCl.
3. Rozpuścić 0,254 mg BTA-Gd(III)DTPA (MW = 3184 g•^mol-1) w 10 ml 100 mM buforu cytrynianowego, stężenie docelowe 8•10-3 mM BTA-Gd(III)DTPA.
4. Sonikować roztwór przez 5 minut.
5. Napełnić roztworem 1 cm kuwetę UV i zmierzyć widmo CD w zakresie od 230 do 350 nm oraz krzywą chłodzenia CD w paśmie CD o najwyższym natężeniu (np. λ = 269 nm) w zakresie 363 - 283 K z szybkością 1 K ^min-1.
6. Dodać tę samą objętość 2 M roztworu buforowego NaCl do buforowanego roztworu cytrynianowego BTA-Gd(III)DTPA w celu zwiększenia siły jonowej do 1 M NaCl, rozcieńczając dyskotyki do połowy stężenia, docelowe stężenie 4•^10-3 mM BTA-Gd(III)DTPA.
7. Wirować roztwór o zwiększonej sile jonowej przez 5 minut.
8. Ponownie zmierz widmo CD od 230 do 350 nm i krzywą chłodzenia CD w paśmie CD o najwyższym natężeniu od 363 do 283 K z szybkością 1 K ^min-1.

2. Dopasowywanie danych CD zależnych od T do modelu do samodzielnego montażu zależnego od T

1. Nieprzetworzone dane z płyty CD zostały wyeksportowane do Origin 8.5 i znormalizowane. Osiągnięto to poprzez zdefiniowanie efektu CD w najwyższej zmierzonej temperaturze jako równego 0, a efektu CD w najniższej zmierzonej temperaturze jako równego 1. Ponieważ wielkość efektu CD jest proporcjonalna do stopnia agregacji⁸, znormalizowane krzywe CD są proporcjonalne do stopnia agregacji.
2. Znormalizowane dane zostały dopasowane przy użyciu opcji dopasowania krzywej nieliniowej w OriginPro 8.5 przy użyciu modelu samomontażu zależnego od T uzyskanego przez van der Schoota^8,9. W tym modelu wyróżnia się reżim zarodkowania i wydłużenia. Najpierw dopasowano stopień agregacji w reżimie wydłużenia (T < T_e), stosując następujące równanie:

Powyższe równanie zawiera (obok zmiennej temperatury, T i stopnia skupienia, Φ_n) trzy parametry; tj. entalpia wydłużenia h_e, temperatura wydłużenia T_e (temperatura, w której rozpoczyna się samoorganizacja) oraz parametr Φ_SAT, który wprowadza się w celu zapewnienia, że Φ_n/Φ_SAT nie przekracza jedności, co wynika z ograniczenia, że stopień agregacji nie może przekraczać jedności.

Dopasowanie renderuje entalpię wydłużenia h_e (J/mol) i temperaturę wydłużenia T_e (K), które charakteryzują samoorganizację cząsteczek dla danego stężenia. Podczas montażu należy przestrzegać jednego utwierdzenia, zgodnie z którym należy zamontować tylko stopień agregacji w temperaturach poniżej _{Te e}, ponieważ równanie 2.1 obowiązuje tylko w reżimie wydłużenia.

Następnie, eksperymentalnie znaleziony stopień agregacji w reżimie zarodkowania może być dopasowany, używając następującego równania:

Powyższe równanie zawiera (obok zmiennych T i Φ_n) cztery parametry, z których już trzy zostały wyznaczone równaniem 2.1; tj. entalpia wydłużenia h_e, temperatura wydłużenia T_e i parametr Φ_SAT. Jedynym nieznanym parametrem jest wartość K_a - opisująca kooperatywność fazy zarodkowania - którą można znaleźć poprzez dopasowanie eksperymentalnie znalezionego stopnia agregacji dla temperatur powyżej T_e.

3. Przygotowanie roztworów BTA-Gd(III)DTPA do transmisyjnej mikroskopii elektronowej i wizualizacji polimerów supramolekularnych za pomocą kriogenicznego TEM

1. Przygotować dwa: 100 mM bufor cytrynianowy (pH 6,0) i 100 mM bufor cytrynianowy (pH 6,0) z 5 M NaCl.
2. Rozpuścić 0,318 mg BTA-Gd(III)DTPA (MW = 3184 g•^mol-1) w 0,1 ml każdego z przygotowanych, docelowe stężenie 1 mM BTA-Gd(III)DTPA.
3. Witryfikacja próbki do kriogenicznego TEM odbywa się za pomocą zautomatyzowanego robota do witryfikacji (FEI Vitrobot Mark III). Siatki CryoTEM (kratki R2/2 Quantifoil Jena firmy Quantifoil Micro Tools GmbH) są poddawane obróbce plazmowej powierzchni przed zabiegiem witryfikacji za pomocą powlekarki węglowej Cressington 208 pracującej pod ciśnieniem 5 mA przez 40 s. Roztwór wodny jest następnie nakładany na siatkę podczas witryfikacji na zautomatyzowanym robotze FEI Vitrobot. Polega to na nałożeniu próbki na siatkę, osuszeniu nadmiaru cieczy w celu wytworzenia cienkiej warstwy roztworu wodnego na siatce, a następnie witryfikacji poprzez bardzo szybkie zanurzenie siatki w ciekłym etanie. Po zeszkleniu próbka jest utrzymywana w ciekłym azocie i przenoszona ręcznie na kasetę automatycznego podajnika, również chłodzoną ciekłym azotem. Kaseta jest następnie wkładana do automatycznego podajnika TEM. Wszystko to odbywa się ręcznie.
4. Eksperymenty cryoTEM są przeprowadzane na TU/e cryoTITAN (FEI), (www.cryotem.nl). TU/e cryoTITAN jest wyposażony w polowy pistolet emisyjny (FEG) pracujący pod napięciem 300 kV. Obrazy zostały zarejestrowane za pomocą kamery CCD 2k x 2k Gatan wyposażonej w kolumnowy filtr energii Gatan Energy Filter (GIF).

4. ¹H-DOSY NMR Pomiary sferycznych samoorganizujących się BTA-Gd(III)DTPA przy niskiej sile jonowej

1. Przygotować 50 mM d 6-bursztynianowy bufor w D₂O ("pH 6,0"); bufor przygotowuje się przez rozpuszczenie kwasu _d 6-bursztynowego w D₂O, a następnie dostosowanie pH do 6,0 przy użyciu 1 M ND₄OD w D 2 O. Końcowe stężenie bursztynianu 50 mM dostosowano za pomocą dodatkowego_D2O.
2. Ponieważ Gd(III) jest wysoce paramagnetyczny i sygnały ¹H zostałyby w związku z tym znacznie rozszerzone, Gd(III) został zastąpiony przez Y(III).
3. Rozpuścić 2,98 mg BTA-Y(III)DTPA (MW = 2979 g•^mol-1) w 1 ml 50 mM buforu 6-bursztynianowego w D₂O ("pH 6,0"), stężenie docelowe 1 mM BTA-Y(III)DTPA.
4. Pomiary ¹H-DOSY NMR wykonywane są na spektrometrze Varian Unity Inova 500 wyposażonym w sondę ID-PFG 5 mm firmy Varian. Eksperymenty DOSY przeprowadzono przy użyciu jednostrzałowej sekwencji impulsowej DOSY (Doneshot, Varian). Czasy pulsacji i mieszania 90 stopni zostały odpowiednio dostosowane. Przesunięcia chemiczne odniesiono za pomocą przesunięcia chemicznego soli sodowej kwasu 3-(trimetylosililo)propiono-2,2,3,3-[D₄] kwaśnej soli sodowej (TMSP).
5. Do kalibracji pomiarów wykorzystano samodyfuzję HDO; z piśmiennictwa wiadomo, że samodyfuzja HDO w D₂O w temperaturze 298 K wynosi 19,0 × 10-9 m²•^s-1. Jako odniesienie, samodyfuzję HDO w D₂O zmierzono w próbce wzorcowej VARIAN 2 Hz D₂O i skalibrowano do jej wartości wzorcowej. Modelem używanym do obliczania promieni hydrodynamicznych R_H agregatów jest zależność Stokesa-Einsteina dla dyfuzji cząstki sferycznej.

5. Reprezentatywne wyniki

¹Pomiary H-DOSY NMR i SAXS na BTA-M(III)-DTPA: obiekty sferyczne w buforze cytrynianowym

Jonowy charakter obwodowych kompleksów Gd(III) wprowadza frustrację w jednowymiarowym wzroście dyskotycznych monomerów, których rdzeń jest przeznaczony do polimeryzacji w wydłużone agregaty przypominające pręciki. Równowaga pomiędzy oddziaływaniami przyciągającymi i odpychającymi steruje wielkością i kształtem agregatów (Schemat 2).

Schemat 2.

Potężną techniką określania wielkości i kształtu cząstek w roztworze jest rozpraszanie promieniowania rentgenowskiego o małym kącie nachylenia ze źródła synchrotronowego (SAXS). BTA-Gd(III)-DTPA rozpuszczono w roztworze buforowym cytrynianu, a profile SAXS zarejestrowano i dopasowano w zakresie 0,01 < q < 0,1 ^A-1. Nachylenie zbliżające się do zera w obszarze low-q (q < 0,06 ^A-1) wskazuje na brak anizotropii kształtu w agregacie, co sugeruje obecność obiektów sferycznych (Rysunek 1). Dane mierzone przy różnych stężeniach zostały dopasowane przy użyciu jednorodnego monodyspersyjnego współczynnika sferycznego, co doprowadziło do obliczonego promienia R wynoszącego 3,2 nm. Obliczony promień geometryczny monomerycznej dyskotyki BTA-Gd(III)-DTPA wynosi 3,0 nm, co sugeruje obecność agregatów o współczynniku kształtu bliskim 1.

Rysunek 1. Profile SAXS dla BTA-Gd(III)-DTPA w buforze cytrynianowym (100 mM, pH 6) przy 0,5 i 1,0 mM (u góry). DOSY NMR BTA-Y(III)-DTPA w 50 mM d buforze 6-bursztynianowym przy 1,0 mM (na dole). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą postać.

Aby dostarczyć dalszych dowodów na sferyczny kształt i nanometrowy rozmiar samoskładających się obiektów, przeprowadziliśmy spektroskopię NMR z dyfuzją ¹H (¹H-DOSY NMR) (rysunek 1). DOSY-NMR pozwala na wyznaczenie współczynników dyfuzji kruszyw, na podstawie których można obliczyć promień hydrodynamiczny (R_H). Ponieważ Gd(III) jest wysoce paramagnetyczny i w związku z tym sygnały ¹H zostałyby znacznie poszerzone, zmieniliśmy Gd(III) na diamagnetyczne Y(III). Określono współczynniki dyfuzji zagregowanego diamagnetycznego amfifilu dyskotycznego w deuterowanym buforze bursztynianowym (50 mM, pH 6, c = 1 mM) na 0,69x10-10^{m2 s-1}. Za pomocą relacji Stokesa-Einsteina obliczamy promień hydrodynamiczny R_H wynoszący 2,9 nm dla dyskretnych obiektów o rozmiarach sferycznych (tabela 1). Wielkość ta jest doskonale zgodna z wartością uzyskaną z danych SAXS dla BTA-Gd(III)-DTPA.

BTA-M(III)-DTPA
[mM] D ^{t a}
[^10-10 m^{2 s-1}] R_H ^a
[nm] R ^b
[nm] 1 0,69 pkt. 2.9 3.2

^a z DOSY; ^b z SAXS

Tabela 1. Wyniki pomiarów SAXS i DOSY dla BTA-M(III)-DTPA.

Cryo-TEM na BTA-Gd(III)-DTPA: od obiektów sferycznych do wydłużonych nanoprętów

Dalsze dowody na skuteczną kontrolę nad jednowymiarową długością stosu uzyskano z mikrofotografii cryo-TEM. Ze względu na witryfikację roztworów wodnych, kriogeniczny TEM zachowuje morfologię strukturalną samoorganizujących się agregatów i pozwala uniknąć skutków wysuszenia związanych z konwencjonalnym przygotowaniem próbek TEM. Rysunek 2 (po lewej) pokazuje, że BTA-Gd(III)-DTPA wytwarza oczekiwane obiekty sferyczne o średnicach bliskich 6 nm przy stężeniu 1 mM, co potwierdza wyniki pomiarów SAXS i DOSY. Zgodnie z tymi odkryciami udało nam się uzyskać samoorganizujące się dyskretne obiekty, które można uznać za supramolekularne odpowiedniki makrocząsteczek dendrytycznych¹⁰.

Rysunek 2. Obrazy Cryo-TEM dla BTA-Gd(III)-DTPA (po lewej) 1 mM zeszklony w 298 K w buforze cytrynianowym (100 mM, pH 6), podziałka odpowiada 50 nm; (po prawej) 1 mM zeszklony w 298 K w buforze cytrynianowym (100 mM, pH 6) i ogólne stężenie NaCl 5 M, podziałka reprezentuje 50 nm.

Do tej pory pracowaliśmy tylko w roztworach buforowych o niskiej sile jonowej. Jeśli jednak elektrostatyczne siły odpychające obwodowo naładowanych kompleksów M(III)-DTPA na BTA-Gd(III)-DTPA są przyczyną sfrustrowanego jednowymiarowego wzrostu, spodziewaliśmy się, że zwiększenie siły jonowej buforowanego środowiska, przy użyciu obojętnej soli 1:1 z wysoce uwodnionymi przeciwjonami, powinno zmniejszyć oddziaływania elektrostatyczne, a zatem powinien powstać inny typ samoorganizującego się obiektu. W buforze cytrynianowym zawierającym 5 M NaCl efekt ten rzeczywiście zaobserwowano (ryc. 2, po prawej). Tworzenie się pręcikowatych polimerów supramolekularnych o wysokim współczynniku kształtu jest wyraźnie obserwowane na mikrofotografiach cryo-TEM przy wysokiej sile jonowej. Badania elektrostatyczne są najbardziej prawdopodobnym wyjaśnieniem tego odkrycia. Kształt zmienia się z kulistego agregatu o średnicy około 6 nm na wydłużone pręty o średnicy 6 nm i długości do kilkuset nanometrów.

Pomiary CD TTA-GD(III)-DTPA: włączenie kooperatywnego samomontażu poprzez zwiększenie siły jonowej

Spektroskopia dichroizmu kołowego (CD) mierzy różnicę w absorpcji między lewoskrętnym i prawoskrętnym światłem spolaryzowanym kołowo. Gdy obiekt spiralny ma preferowany zmysł spiralny, lewoskrętne i prawoskrętne światło spolaryzowane kołowo będzie pochłaniane w różnym stopniu, powodując w ten sposób efekt CD. Ponieważ międzycząsteczkowe wiązania wodorowe utworzone między kolejnymi BTA-Gd(III)-DTPA w agregatach są ustawione w sposób spiralny, a stereogeniczne centrum w ugrupowaniu L-fenyloalaniny faworyzuje jeden spiralny sens nad drugim, spodziewamy się wyraźnego widma CD z agregatów opartych na BTA-Gd(III)-DTPA^11,12. Ponadto spektroskopia CD zależna od temperatury jest potężnym narzędziem do oceny mechanizmu samoorganizacji polimeryzacji BTA-Gd(III)-DTPA i pozwala na wyciągnięcie wniosków na temat stabilności formowanych agregatów¹³.

Na przykład, widma CD w temperaturze pokojowej BTA-Gd(III)-DTPA (8x10-3 mM lub 4x10-3 mM w buforze cytrynianowym 100 mM) wraz ze wzrostem stężenia soli (0 M NaCl do 1,0 M NaCl) są podane na rysunku 3A. Chociaż do pomiarów CD stosuje się znacznie niższe stężenie, wyraźny efekt bawełny wskazuje na obecność nienaruszonych agregatów, nawet przy stężeniach mikromolowych. Kształt widma CD zmienia się wraz ze wzrostem stężenia soli, co jest dobrym wskaźnikiem dla zmniejszenia oddziaływań na obrzeżach stosów i lepszego upakowania dyskotyki. Ponadto krzywe chłodzenia CD tych samych roztworów (363 - 283 K, mierzone przy λ = 269 lub 278 nm) wykazują wyraźne różnice w kształcie (rysunek 3B). Pozorna T_e - temperatura, w której rozpoczyna się agregacja - przesuwa się do wyższych temperatur przy wyższym stężeniu soli i staje się widoczny coraz bardziej kooperatywny mechanizm, charakteryzujący się bardziej gwałtownym wzrostem efektu CD. Podczas gdy krzywa chłodzenia przy 0 M NaCl jest najlepiej opisana przez izodesmiczny proces samoorganizacji, krzywa chłodzenia przy 1,0 M NaCl jest typowa dla kooperatywnego procesu samoorganizacji ¹⁴. W pierwszym przypadku zakłada się, że wszystkie stałe asocjacyjne są równe, podczas gdy w drugim przypadku samoorganizacja zachodzi w co najmniej dwóch odrębnych etapach. W pierwszym kroku musi powstać "jądro", które jest energetycznie wysoce niekorzystne. Po schłodzeniu poniżej krytycznej temperatury polimeryzacji następuje wydłużenie i wykładniczy wzrost do polimerów supramolekularnych o dużej masie cząsteczkowej. Kwantyfikacja parametrów termodynamicznych samoorganizacji BTA-Gd(III)-DTPA przy 0 i 1 M NaCl przy użyciu modelu kooperatywnego wyraźnie ujawnia spadek _Kña, która jest bezwymiarową stałą aktywacji⁸. Niższe wartości _Ka wskazują na wyższy stopień kooperatywności w procesie samoorganizacji, który wyraża się w tworzeniu wysoce wydłużonych polimerów supramolekularnych, co obserwuje się w cryo-TEM.

BTA-Gd(III)-DTPA C_NaCl K_a 8 x ^10-3 mM 0 mln 5 ^10-2 4 x ^10-3 mM 1 mln 1 ^10-4

Tabela 2. Stopień kooperatywności wyrażony przez K_a w zależnej od temperatury samoorganizacji BTA-Gd(III)-DTPA w funkcji stężenia NaCl (C_NaCl).

Rysunek 3. BTA-Gd(III)-DTPA w buforze cytrynianu o stężeniu 100 mM (c = 8 ^x10-3 mM przy niskiej sile jonowej i 4 x10-3 mM przy wysokiej sile jonowej) A] widma CD zarejestrowane w temperaturze 293 K w funkcji siły jonowej, c_NaCl = 0 M - 1,0 M, eliptyczność molową Δε oblicza się w następujący sposób: Δε = efekt CD/(cxl), w którym c jest stężeniem BTA w molu ^L-1, a l jest długością drogi optycznej w cm; B] Odpowiednie krzywe chłodzenia CD mierzone przy λ = 269 nm dla 0 M NaCl i 278 nm dla 1 M roztworów NaCl wyrażone jako stopień agregacji Φ_n w funkcji stężenia_{NaCl c NaCl} = 0 M - 1,0 M, Φ_n oblicza się, dzieląc zmierzony efekt CD przez maksymalny efekt CD.

Discussion

Samoorganizujące się amfifile dyskotyczne omówione w tym artykule, zawierające kompleks Gd(III)-DTPA, są obecnie badane jako nowe środki do obrazowania metodą rezonansu magnetycznego (MRI), które łączą wysoki kontrast z regulowanym czasem wydalania. ¹⁵ A zatem decydujące znaczenie mają szczegóły dotyczące ich samoskładania się i stabilności w różnych warunkach. Połączenie technik spektroskopowych (CD i NMR), rozpraszania (SAXS) i mikroskopowych (cryo-TEM) pozwala na wizualizację formowanych struktur i ilościowe określenie ich parametrów termodynamicznych. Ta kombinacja technik jest ogólnie stosowana do samoorganizujących się cząsteczek, o ile preferencyjny zmysł spiralny w badanym układzie pozwala na różnicę w absorpcji lewo- i prawoskrętnego światła spolaryzowanego kołowo.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
BTA-Gd(III)-DTPA			Wykonane we własnym zakresie
BTA-Y(III)-DTPA			Wykonane we własnym zakresie
spektroskopia CD	Jasco	Jasco J-815 spektropolarymetr
NMR	Varian	Varian Unity Spektrometr Inova 500	5-mm ID-PFG Sonda Varian
cryo-TEM	FEI	cryoTITAN TEM
SAXS	Holendersko-belgijska linia badawcza (BM26B) w Europejskim Ośrodku Promieniowania Synchotronowego (ESRF) w Grenoble, Francja