Ocena biomateriałów do augmentacji pęcherza moczowego z wykorzystaniem analiz cystometrycznych w różnych modelach gryzoni

Podsumowanie

Etapy chirurgiczne powiększenia pęcherza moczowego opisano z wykorzystaniem rusztowań 3-D w modelach mysich i szczurzych. W celu przetestowania skuteczności konfiguracji biomateriałów do zastosowania w powiększeniu pęcherza przedstawiono techniki cystometrii przeprowadzanej zarówno u zwierząt w stanie czuwania, jak i znieczulonych.

Streszczenie

Funkcja nerek oraz zdolność do kontrolowania oddawania moczu są krytycznie zależne od prawidłowego funkcjonowania pęcherza moczowego, który gromadzi mocz pod niskim ciśnieniem i wydala go poprzez precyzyjnie zorganizowany skurcz. Liczne wrodzone i nabyte anomalie urologiczne, w tym zastawki cewki moczowej, łagodny przerost prostaty oraz pęcherz neurogenny wtórny do rozszczepu kręgosłupa lub urazu rdzenia kręgowego, mogą prowadzić do patologicznej przebudowy tkanek, skutkującą upośledzeniem podatności i zmniejszeniem pojemności pęcherza¹. Funkcjonalna lub anatomiczna niedrożność dróg moczowych często towarzyszy tym schorzeniom i może prowadzić do nietrzymania moczu oraz uszkodzenia nerek w wyniku zwiększonego ciśnienia podczas gromadzenia i wydalania moczu². Chirurgiczna implantacja segmentów przewodu pokarmowego w celu zwiększenia pojemności narządu i obniżenia ciśnienia wewnątrz pęcherza stanowi główną opcję leczenia chirurgicznego tych zaburzeń w przypadku niepowodzenia leczenia zachowawczego³. Podejście to jest jednak ograniczane przez niewielką dostępność tkanek donora i wiąże się z poważnymi powikłaniami, takimi jak chroniczne infekcje dróg moczowych, zaburzenia metaboliczne, kamica moczowa oraz wtórne zmiany nowotworowe^4,5.

Obecne badania w dziedzinie inżynierii tkankowej pęcherza moczowego koncentrują się głównie na identyfikacji konfiguracji biomateriałów, które mogą wspierać regenerację tkanek w miejscach uszkodzeń. Konwencjonalne rusztowania 3-D pochodzące z polimerów naturalnych i syntetycznych, takich jak błona podśluzowa jelita cienkiego oraz kwas poliglikolowy, wykazały pewne krótkoterminowe sukcesy w wspieraniu regeneracji urothelium i mięśni gładkich, a także w zwiększaniu pojemności magazynowej narządu zarówno w modelach zwierzęcych, jak i w praktyce klinicznej^6,7. Jednakże niedostatki w zakresie integralności mechanicznej i biokompatybilności rusztowań często prowadzą do szkodliwej włóknicy⁸, kurczenia się przeszczepu⁹ oraz zwapnień¹⁰, co zwiększa ryzyko niepowodzenia implantu i konieczność przeprowadzenia wtórnych procedur chirurgicznych. Ponadto, przy użyciu standardowych konstruktów biomateriałowych do augmentacyjnej cystoplastyki nie udało się jeszcze przywrócić prawidłowych cech mikcji, dlatego niezbędne są badania i rozwój nowych macierzy, które mogłyby spełnić tę rolę.

Aby skutecznie opracować i ocenić optymalne biomateriały do klinicznej augmentacji pęcherza moczowego, w pierwszej kolejności należy przeprowadzić badania skuteczności w standaryzowanych modelach zwierzęcych, stosując szczegółowe metody chirurgiczne oraz oceny wyników funkcjonalnych. Wcześniej zgłaszaliśmy zastosowanie modelu augmentacji pęcherza u myszy w celu określenia potencjału rusztowań opartych na fibroinie jedwabiu w pośredniczeniu w regeneracji tkanek oraz funkcjonalnych charakterystyk oddawania moczu.^11,12 Analizy cystometryczne tego modelu wykazały, że różnice w strukturalnych i mechanicznych właściwościach implantów mogą wpływać na wynikowe cechy urodynamiczne pęcherzy wytworzonych metodami inżynierii tkankowej^11,12. W modelu tym wykazano dodatnią korelację między stopniem regeneracji tkanek indukowanej przez macierz, określonym histologicznie, a funkcjonalną podatnością i pojemnością ocenianą za pomocą cystometrii^11,12. Wyniki te sugerują zatem, że oceny funkcjonalne konfiguracji biomateriałów w systemach augmentacji pęcherza u gryzoni mogą być użytecznym formatem oceny właściwości rusztowań i ustalenia wykonalności in vivo przed badaniami na dużych zwierzętach i wdrożeniem klinicznym. W niniejszym badaniu przedstawimy poszczególne etapy chirurgiczne augmentacji pęcherza u myszy i szczurów z wykorzystaniem rusztowań jedwabnych oraz zaprezentujemy techniki cystometrii u zwierząt w stanie czuwania i znieczulonych.

Protokół

Metody chirurgiczne

1. Przygotowanie chirurgiczne i znieczulenie

1. Przygotuj sterylne pole operacyjne z niezbędnymi instrumentami chirurgicznymi: maszynką do strzyżenia, pęsetą ząbkowaną, pęsetą atraumatyczną precyzyjną, precyzyjnym uchwytem do igieł, gazą, nożyczkami Metzenbauma, nożyczkami do tenotomii, ostrzem skalpela, igłą hipodermiczną 30 G, strzykawką 1 mL wypełnioną solą fizjologiczną, czterema szwami polipropylenowymi 6-0 oraz szwami z poliglaktyny 7-0 i 4-0.
2. Zpodaj zwierzęciu znieczulenie izofluranem drogą wziewną w komorze indukcyjnej. Przed przeniesieniem na pole operacyjne potwierdź pełną indukcję u zwierzęcia. Upewnij się, że rurka do znieczulenia wziewnego znajduje się w odpowiedniej pozycji, aby zapewnić ciągłość znieczulenia.
3. Ułóż zwierzę na plecach na sterylnej podkładce.
   [W przypadku analizy cystometrycznej zapoznaj się z poniższą sekcją dotyczącą tunelizacji cewnika cystostomijnego.]
4. Użyj maszynki do strzyżenia, aby usunąć sierść z dolnej części brzucha.
5. Oczyść brzuch betadyną i 70% etanolem.
6. Przed nacięciem w celu okołoperacyjnego kontrolowania bólu można podać podskórnie środek przeciwbólowy, taki jak buprenorfina (0,05-0,1 mg/kg).

2. Nacięcie i odsłonięcie pęcherza moczowego

1. Za pomocą skalpela wykonaj nacięcie skóry wzdłuż linii środkowej w dolnej części o długości 1-2 cm (zależnie od wielkości zwierzęcia oraz tego, czy jest to szczur czy mysz). Pogłęb nacięcie w jego dolnej części, przecinając mięsień prosty, uważając, aby nie uszkodzić leżących poniżej jelit lub pęcherza moczowego.
2. Używając pęsety z ząbkami, unieś mięsień prosty i wypreparuj jego powierzchnię tylną za pomocą cienkich nożyc Metzenbauma.
3. Rozetnij pozostałą część mięśnia w linii środkowej na całej długości nacięcia skóry.
4. Wyprowadź pęcherz moczowy przez ranę po nacięciu (Rysunek 1). Pęcherz moczowy jest zazwyczaj organem położonym najniżej w miednicy. (U samców stutka prostaty znajduje się jeszcze niżej i jest większa od zdekompresowanego pęcherza).
5. Za pomocą szwu polipropylenowego 6-0 umieść jeden szew stabilizujący w tylnej ścianie pęcherza, a następnie kolejny w przedniej ścianie pęcherza. Umieść dodatkowe szwy bocznie. Nie zawiązuj tych szwów. Po naprężeniu szwów pęcherz przyjmie kwadratowy kształt o powierzchni około 1 cm² (Rysunek 2). Należy uważać, aby nie przyłożyć zbyt dużego napięcia do szwów, ponieważ mogą one łatwo przerwać tkankę pęcherza.
6. Rozetnij pęcherz moczowy wzdłuż przedniej ściany (tuż poniżej kopuły pęcherza) w linii środkowej na długości około 1 cm (1,5-2 cm w przypadku pęcherza szczura).

3. Anastomoza rusztowania

1. Za pomocą precyzyjnych nożyczek przytnąć rusztowanie jedwabne do przybliżonego rozmiaru ubytku w pęcherzu.
2. Używając nici z poliglaktynu 7-0, rozpocząć od jednego rogu rusztowania i przyszyć je do pęcherza szwem ciągłym, aby stworzyć wodoszczelne uszczelnienie wokół całego ubytku (Rycina 3).
3. Sprawdzić szczelność anastomozy, napełniając pęcherz sterylnym roztworem soli fizjologicznej, wstrzykując go przez ścianę pęcherza za pomocą igły hipodermicznej o rozmiarze 30 G. W przypadku stwierdzenia nieszczelności można ją zamknąć dodatkowym szwem przerywanym z poliglaktynu 7-0 w celu zlikwidowania szczeliny.
4. Wprowadzić zrekonstruowany pęcherz z powrotem do jamy brzusznej.

4. Zamknięcie rany

1. Przed zamknięciem ściany brzucha wstrzyknąć do mięśnia prostego i tkanki podskórnej bupiwakainę w celu znieczulenia miejscowego (< 3 mg/kg 0,25%).
2. Zeszyć mięsień prosty szwem ciągłym z użyciem nici z poliglaktynu 4-0.
3. Zamknąć skórę szwem ciągłym z użyciem nici z poliglaktynu 4-0.
4. Oczyścić i osuszyć miejsce nacięcia (Rycina 4).
5. Przenieść zwierzę do ciepiej, czystej klatki w celu wybudzenia z narkozy.

Kolejne kroki wprowadzania cewnika do cystostomii w celu przeprowadzenia analizy cystometrycznej są następujące:

5. Tunelizacja cewnika cystostomijnego

1. Przygotować sterylną pole operacyjne z niezbędnymi instrumentami chirurgicznymi: nożyczkami do strzyżenia, pęsetą z ząbkami, precyzyjną pęsetą atraumatyczną, precyzyjnym porta-igłowym, gazą, nożyczkami Metzenbauma, nożyczkami do tenotomii, małym zakrzywionym zaciskiem, ostrzem skalpela, nicią polipropylenową 6-0, nicią poliglaktynową 4-0, nicią jedwabną 3-0 (nicią jedwabną 4-0 dla myszy), igłą 18G, igłą stępioną 22G, igłą 25G, strzykawką 1 mL wypełnioną solą fizjologiczną oraz rurką polietylenową 50 (PE-50) odciętą na długość ~10 cm.
2. Rozszerzyć koniec rurki PE-50, delikatnie wystawiając go na działanie płomienia. Należy uważać, aby nie stopić końca ani nie zablokować światła rurki (można to zweryfikować, wstrzykując sól fizjologiczną przez igłę 25G podłączoną do „nierozszerzonego” końca i sprawdzając przepływ). Służy to jako kotwica utrzymująca rurkę w pęcherzu (Rysunek 5).
3. Zznieczulić zwierzę zgodnie z opisem w kroku 1.2.
4. Za pomocą nożyczek do strzyżenia usunąć sierść z grzbietu zwierzęcia pomiędzy łopatkami oraz z dolnej części brzucha na stronie brzusznej.
5. Przygotować te obszary betadyną i 70% etanolem. Umieścić zwierzę w pozycji brzusznej na polu operacyjnym.
6. Wykonać nacięcie o długości 1 cm na grzbiecie pomiędzy łopatkami. Używając nożyczek Metzenbauma, wypracować płaszczyznę między skórą a leżącym pod nią mięśniem, wprowadzając końcówki nożyczek w tę płaszczyznę i rozszerzając je w celu utworzenia tunelu prowadzącego do brzusznej strony brzucha.
7. Przemieścić zwierzę do pozycji grzbietnej. Wykonać nacięcie brzuszne i odsłonić pęcherz zgodnie z opisem w krokach 2.1-2.4. Wprowadzić pęcherz z powrotem do jamy brzusznej.
8. Wprowadzić mały zacisk do utworzonego w kroku 5.6 tunelu podskórnego, zaczynając od nacięcia skóry na grzbiecie. Chroniąc palcami zawartość jamy brzusznej, przebić ścianę brzuszną końcówkami zacisku do wnętrza jamy brzusznej.
9. Chwycić gładki koniec rurki PE-50 zaciskiem i wyciągnąć go przez nacięcie grzbietowe. Upewnić się, że rozszerzony koniec nie został wyciągnięty poza ścianę brzuszną (Rysunek 6).

6. Wprowadzanie rurki cystostomijnej

1. Wyprowadź pęcherz moczowy przez nacięcie. Od tego momentu pęcherz należy manipulować za pomocą delikatnej pincety, aby zapobiec urazom, które mogłyby spowodować uszkodzenie lub stan zapalny, co z kolei mogłoby zafałszować wyniki cystometrii lub spowodować dodatkowy dyskomfort zwierzęcia po operacji.
2. Wyznacz planowane miejsce wprowadzenia rurki cystostomijnej. Powinna ona zostać umieszczona w kopule pęcherza (powyżej segmentu augmentacyjnego). Zapobiegnie to załamaniu lub niedrożności rurki.
3. Używając nici polipropylenowej 6-0, wykonaj szew purse-string (szew woreczkowy) w kopule pęcherza w następujący sposób: wykonaj pierwszy prześcieg przez ścianę pęcherza wzdłużnie, bocznie od planowanego miejsca wprowadzenia rurki cystostomijnej. Zostaw mały zacisk na wolnym końcu, aby szew nie został przypadkowo całkowicie wyciągnięty. Wykonaj kolejny prześcieg w kierunku poprzecznym, zaczynając od wprowadzenia igły do ściany pęcherza nieco bocznie od miejsca wyjścia pierwszego prześciegu.
4. Nie naciągaj mocno nici. Wykonaj kolejny prześcieg równolegle do pierwszego (wzdłużnie), wprowadzając go do pęcherza tuż głowy od miejsca wyjścia ostatniego szwu poprzecznego. Czwarty prześcieg należy zacząć bocznie od miejsca wyjścia ostatniego szwu i zakończyć obok miejsca wejścia pierwszego prześciegu. Prawidłowo wykonany zabieg tworzy okrężny kwadrat wokół planowanego miejsca wprowadzenia cewnika (Rycina 7).
5. Za pomocą igły 18G przebij ścianę pęcherza w centrum szwu purse-string. Należy uważać, aby nie przebić jej zbyt głęboko (tylko do światła pęcherza). Wprowadź końcówki delikatnej pincety do otworu i ostrożnie rozszerz go.
6. Wprowadź balonowy koniec cewnika w otwór w pęcherzu, aż znajdzie się on w jego świetle. Zaciśnij szew purse-string wokół cewnika i zawiąż go. Powinno to ściągnąć ścianę pęcherza wokół cewnika, stabilizując go w miejscu (Rycina 8).
7. Weź jeden koniec nici, owiń go raz wokół cewnika i zawiąż, aby dodatkowo go zabezpieczyć.

7. Testowanie cewnika i zamknięcie nacięcia w obrębie jamy brzusznej

1. Za pomocą strzykawki 1 mL i igły 25G wprowadzić igłę do cewnika i powoli wstrzyknąć sól fizjologiczną, aby rozszerzyć pęcherz. Obserwować, czy nie występuje wyciek wokół cewnika. Po zauważeniu wycieku z cewki moczowej odessać sól fizjologiczną, aby ponownie odbarczyć pęcherz.
2. Zamknąć nacięcie brzuszne zgodnie z powyższymi krokami 4.1-4.4.

8. Zamknięcie nacięcia grzbietowego i zabezpieczenie cewnika (dla szczurów)

1. Ułóż zwierzę w pozycji brzusznej.
2. Odetnij rurkę cewnika na wysokości skóry za pomocą nożyczek. Wprowadź do rurki igłę tępą 22G.
3. Zaszyj skórę nad rurką, stosując szew ciągły z nici polyglactin 4-0. Pozostaw nasadę igły wystającą ponad skórę.
4. Załóż korek do linii dożylnej na tępą igłę. Za pomocą nici jedwabnej 3-0 przymocuj końcówkę cewnika do skóry (Rysunek 9).
5. Oczyść miejsce nacięcia. Przenieś szczura do ciepiej, czystej klatki w celu wybudzenia z narkozy.

8.* Zamknięcie nacięcia grzbietowego i zabezpieczenie cewnika (dla myszy lub szczurów)

1. *Zamknij dystalny koniec cewnika, zaginając go lub używając płomienia do stopienia końca.
2. *Zwiń koniec rurki i pozostaw go w podskórnej kiesonce na grzbiecie zwierzęcia (NIE przycinaj rurki w celu jej skrócenia) (Rysunek 10).
3. *Zamknij skórę nad rurką, używając szwu ciągłego z nici polyglactin 4-0 (Rysunek 11).
4. *W dniu cystometrii przygotuj nacięcie na grzbiecie, używając betadyny i 70% etanolu. Otwórz nacięcie na grzbiecie pod narkozą i wyjmij zwiniętą rurkę z podskórnej kieszonki. Zamknij nacięcie. Wybudź zwierzę z narkozy i przeprowadź cystometrię, gdy będzie ono w pełni rozbudzone.

9. Reprezentatywne wyniki - metody chirurgiczne

Zrekonstruowany pęcherz powinien być jak najszczelniejszy, aby uniknąć powikłań związanych z istotnym wyciekiem moczu (Rycina 3). Ból lub dyskomfort objawiają się zazwyczaj dreszczami lub drapaniem i gryzieniem w okolicy cięcia brzusznego. Można temu przeciwdziałać poprzez codzienne podskórne wstrzyknięcia niesteroidowego leku przeciwzapalnego, takiego jak meloksykam (0,5-1,0 mg/kg podskórnie). Zazwyczaj zwierzęta wymagają tych zastrzyków jedynie przez pierwsze 3 dni po operacji. W razie potrzeby można zastosować suplementację opioidem, np. buprenorfiną (0,05-0,1 mg/kg podskórnie co 8-12 h). Zwierzęta powinny być monitorowane 3 razy dziennie przez pierwsze 3 dni po operacji, 2 razy dziennie w dniach 3-5 po operacji, a następnie codziennie, aby ocenić poziom bólu, oznaki infekcji, prawidłowe gojenie rany, aktywność, pielęgnację i turgor skóry. Antybiotyki (Baytril, 5 mg/kg podskórnie co 24 h w objętości nieprzekraczającej 0,1 mL) podawane są przez pierwsze 72 h po zabiegu jako profilaktyka chirurgiczna przeciwko infekcjom. Oznakami prawidłowej rekonwalescencji są: normalna lokomocja i poziom aktywności, odpowiednie żywienie i picie, brak bólu lub stresu (brak wokalizacji) oraz normalna socjalizacja ze współlokatorami z klatki. Przed analizą cystometryczną należy zapewnić czas rekonwalescencji wynoszący co najmniej 5-7 dni, aby umożliwić zagojenie pęcherza i zmniejszenie stanu zapalnego, który mógłby potencjalnie wpłynąć na wyniki.

Analizy cystometryczne

10. Cystometria w stanie czuwania

1. Układ opisano z wykorzystaniem MLT844 ADInstruments wraz z systemem przechwytywania i analizy danych LabChart v6 (ADInstruments) oraz pompy strzykawkowej Harvard 22 (Harvard Apparatus, Holliston, MA), choć dostępne są inne porównywalne systemy (Rysunek 12).
2. Zkalibrować objętość oraz ciśnienie zgodnie ze specyfikacją użytego systemu cystometrycznego.
3. Umieścić zwierzęta w klatkach metabolicznych (klatkach z drucianą siatką na dnie), które są zawieszone nad wagą. Waga jest podłączona do przetwornika.
4. Usunąć z układu pęcherzyki powietrza i zapewnić ciągły przepływ z pompy infuzyjnej.
5. Podłączyć system przechwytywania danych do komputera i obserwować zapisy danych. Odpowiednio dostosować skalę. Ciśnienie w pęcherzu i objętość moczu będą rejestrowane w sposób ciągły.
6. Uzyskać dostęp do cewników nadłonowych za pomocą igły 27G połączonej za pomocą rurki T z przetwornikiem ciśnienia i pompą infuzyjną. Rozpocząć infuzję soli fizjologicznej z prędkością 12,5 μL/min dla myszy i 100 μL/min dla szczura.
7. Odczekać do ustabilizowania się zapisu wzorca mikcji (wzrost ciśnienia w pęcherzu, a następnie opróżnienie). Zazwyczaj zajmuje to około 10-20 minut. Rejestrować cykle mikcji przez 45-120 minut lub przez co najmniej 3-4 cykle opróżniania.
8. Obserwować całą procedurę w czasie rzeczywistym, aby rozwiązywać problemy z komplikacjami, które mogą prowadzić do powstania artefaktów (np. zagięcie cewnika, niedrożność itp.; patrz dyskusja poniżej).
9. Zatrzymać infuzję, odłączyć cewnik od układu i zwrócić zwierzę do klatki.

11. Nieświadoma analiza cystometryczna (bez cewnika nadłonowego)

1. Zanurz zwierzę w anestezji za pomocą wtryśnięcia uretanu (1-2 g/kg) drogą dosytnieniową (IP).
2. Obnaż pęcherz zgodnie z opisem w krokach 1.3-2.4.
3. Kalibruj system zgodnie z krokiem 9.2. Przygotuj system zgodnie z krokami 9.4-9.5.
4. Wprowadź igłę 27G, połączoną za pomocą rurki w kształcie litery T z przetwornikiem ciśnienia i pompą infuzyjną, w boczny aspekt pęcherza.
5. Rejestruj cykle mikcji przez 45-90 minut.
6. Zatrzymaj infuzję, usuń igłę z pęcherza i poddaj zwierzę eutanazji.

12. Reprezentatywne wyniki - analizy cystometryczne

Następnie można przeanalizować zapisy urodynamiczne w celu wyznaczenia parametrów takich jak objętość oddanego moczu, podatność, szczytowe ciśnienia oddawania moczu, odstęp między skurczami, czas cyklu mikcji oraz objętość moczu resztkowego.

Cystometrogram można podzielić na fazę napełniania i fazę opróżniania. Prawidłowa faza napełniania to część cyklu mikcyjnego, w której pęcherz napełnia się przy bardzo niewielkich zmianach ciśnienia wewnątrz pęcherza. Prawidłowa faza opróżniania na zapisie charakteryzuje się stałym wzrostem ciśnienia wewnątrz pęcherza odpowiadającym skurczowi detrusora. Najwyższe ciśnienie osiągnięte podczas fazy opróżniania na zapisie określa się mianem szczytowego ciśnienia opróżniania. Wysokie szczytowe ciśnienie opróżniania może sugerować obturacyjny wzorzec opróżniania, pęcherz hiperkurczliwy lub zagięcie cewnika nadłonowego. Podatność można obliczyć, wyznaczając stosunek objętości wprowadzonej podczas fazy napełniania do zmiany ciśnienia (podatność = ΔV/ΔP). Pęcherz o niskiej podatności to taki, który nie jest w stanie pomieścić odpowiednich objętości moczu przy niskim ciśnieniu. Odstęp między skurczami można obliczyć, analizując czas między dwoma skurczami widocznymi na cystometrogramie. Krótki odstęp między skurczami sugeruje podrażnienie pęcherza. Czas cyklu mikcyjnego odnosi się do czasu potrzebnego na zakończenie pełnej fazy napełniania i opróżniania i można go łatwo ustalić poprzez analizę zapisu. Po zakończeniu cystometrii można wyznaczyć resztkową objętość moczu po mikcji (PVR). Odbywa się to poprzez aspirację z cewnika nadłonowego po zakończeniu skurczu detrusora. Parametry te pomagają badaczowi obiektywnie analizować dynamikę pęcherza podczas jego napełniania i opróżniania.

Rysunek 1. Fotografia nacięcia brzusznego i wyprowadzenia pęcherza moczowego.

Rysunek 2. Nacięcie pęcherza z odsłonięciem światła pęcherza.

Rysunek 3. Integracja implantu ze ścianą pęcherza moczowego.

Rycina 4. Fotografia zamkniętego nacięcia.

Rysunek 5. Rozszerzony koniec rurki PE-50.

Rycina 6. Przewód PE-50 (cewnik) wprowadzony przez nacięcie grzbietowe.

Rysunek 7. Szew purse-string (szew kaletniczy).

Rycina 8. Mocowanie cewnika do pęcherza.

Rysunek 9. Zabezpieczony łącznik cewnika.

Rycina 10. Zwinięta rurka w kieszeni podskórnej.

Rysunek 11. Zamknięcie nacięcia grzbietowego.

Rysunek 12. Przykład zestawu do cystometrii.

Rycina 13. Reprezentatywny zapis cystometrii.

Dyskusja

Oceny cystometryczne konfiguracji biomateriałów po implantacji i powiększeniu pęcherza w modelach małych zwierząt stanowią ważny etap walidacji w celu zidentyfikowania optymalnych charakterystyk strukturalnych i mechanicznych projektów macierzy do zastosowania w sytuacjach klinicznych. W niniejszym badaniu opisujemy metody chirurgiczne przeprowadzania powiększenia pęcherza u myszy i szczurów, a także techniki cystometryczne służące do wyznaczania właściwości urodynamicznych zaprojektowanych organów w celu oceny funkcjonalnej. Wykorzystaliśmy te techniki w wielu eksperymentach z udziałem zarówno myszy, jak i szczurów, z czego każdy eksperyment obejmował ponad 30 gryzoni i nie napotkaliśmy istotnych problemów. Nasze laboratorium badawcze jest zróżnicowaną grupą naukowców podstawowych i lekarzy chirurgów, a aspekty proceduralne tych eksperymentów były wykonywane przez chirurgów z co najmniej 5-6 letnim stażem szkolenia chirurgicznego po studiach.

Niezależnie od rodzaju użytego biomateriału, główną różnicą między augmentacją pęcherza u szczurów a myszy jest wielkość pęcherza. Ze względu na mniejszy rozmiar pęcherza, dyssekcja i inkorporacja biomateriału u myszy są trudniejsze pod względem technicznym. W celu ułatwienia wizualizacji można zastosować mikroskop chirurgiczny. Ponieważ pęcherz szczura jest większy, jest on bardziej odpowiedni w sytuacjach, gdy w obrębie pęcherza należy przeprowadzić więcej niż jedną procedurę (np. augmentację i wprowadzenie cewnika cystostomijnego). Dodatkowo powyższy protokół opisuje zastosowanie rurek PE-50 u szczura ¹³, jednak stosowano również cewniki o większej średnicy, aż do PE-100, szczególnie w badaniach długoterminowych ¹⁴. U myszy można wykorzystać rurki o mniejszym kalibrze, takie jak PE-10 ^15,16, należy jednak pamiętać, że mniejsze, bardziej giętkie rurki mogą nie przenosić zmian ciśnienia do przetwornika w sposób dokładny. Ponadto alternatywna metoda mocowania cewnika na grzbiecie (krok 8* powyżej) jest stosowana u myszy ze względu na ich niewielkie rozmiary ciała, przez co igła z tępym końcem i kapturek do wkłuć dożylnych są zbyt nieporęczne. Wadą tego rozwiązania jest konieczność zastosowania znieczulenia w celu wyciągnięcia końca cewnika z kieszonki podskórnej przed cystometrią.

Badania wykazały, że w pierwszych dniach (0-4 dni) po wprowadzeniu cewników cystometria wykazywała wysokie ciśnienie w pęcherzu oraz nadreaktywność przy niskich objętościach mikcji. Wyniki te zdawały się stabilizować około szóstego do siódmego dnia^14,17, co prawdopodobnie stanowi idealny czas na przeprowadzenie oceny cystometrycznej. Jednak większość doniesień w literaturze opisuje wykonywanie cystometrii w ciągu pierwszych 3 dni od cewnikowania ¹⁸, co wyjaśnia szerokie zróżnicowanie powyższych parametrów w zależności od czasu. Pozostawienie cewnika nadłonowego na okres dłuższy niż 3 dni wiąże się z powikłaniami, takimi jak ryzyko powstania kamieni, przemieszczenia cewnika, infekcji, krwiomoczu oraz niedrożności cewnika z powodu obecności złogów.

W literaturze opisano różne prędkości infuzji podczas cystometrii, od 1-3 mL/hr dla myszy^15,16 do 10-11 mL/hr dla szczurów ^13,19,20. Nadfizjologiczne prędkości infuzji mogą powodować fałszywie podwyższone ciśnienie ¹⁴. W naszej konfiguracji stosujemy prędkość infuzji 12,5 μL/min (0,75 mL/hr) dla myszy i 100 μL/min (6 mL/hr) dla szczurów, jednak można wykorzystać również niższe prędkości. Temperatura soli fizjologicznej powinna wynosić co najmniej temperaturę pokojową, choć optymalniejsza jest sól fizjologiczna w temperaturze 37°, aby uniknąć nadreaktywności pęcherza wywołanej podawaniem zimnego roztworu. W cystometrii u zwierząt w stanie czuwania kluczowe jest zapewnienie stabilizacji wzorca mikcji w miarę adaptacji zwierzęcia do klatki, co w naszym doświadczeniu wymaga okresu ~10-20 minut. Następnie regularne cykle mikcji mogą być rejestrowane przez 45-120 minut lub przez co najmniej 3-4 cykle voidingu. Zwierzę powinno być obserwowane w czasie rzeczywistym, ponieważ porusza się swobodnie, a komplikacje takie jak skręcenie lub zagięcie cewnika mogą zaburzyć analizę cystometryczną. W celu zmniejszenia ruchliwości zwierzęcia i wynikających z niej artefaktów zaleca się ograniczenie hałasu w otoczeniu podczas badania. Cystometria u zwierząt w narkozie nie wiąże się z problemami występującymi w badaniach w stanie czuwania, jednak wykazano, że wiele środków anestetycznych hamuje spontaniczne skurcze pęcherza. Hamowanie to odpowiada bezpośrednio oczekiwanemu czasowi działania leków anestetycznych, tzn. gdy efekt znieczulenia ustępuje, wznawiają się spontaniczne skurcze ¹⁴. Co więcej, ciśnienia mierzone podczas przepełnienia pęcherza były statystycznie wyższe u znieczulonych szczurów, zarówno żywych, jak i post-mortem, co wskazuje na wpływ na pasywne właściwości podatności ściany pęcherza. Efekt ten obserwuje się przy stosowaniu pentobarbitalu²¹, ketaminy i chloralozonu IM/IP, a także wziewnego halotanu i dokanałowego nesakainy ¹⁴. Bardziej szczegółowe badanie różnych środków anestetycznych potwierdza ten wynik poprzez supresję odruchu mikcyjnego zarówno w przypadku anestetyków inhalacyjnych (izofluran i metoksyfluran), jak i barbituranów (pentobarbital i tiobutabarbital) przy umiarkowanych poziomach znieczulenia¹⁷. Efekt ten zaobserwowano nawet przy lekkim poziomie znieczulenia lub sedacji przy użyciu takich leków jak fentanyl-droperidol i ketamina-diazepam; podobnie jak w poprzednim badaniu, wraz z ustępowaniem efektu znieczulenia znikało również hamowanie¹⁷. W tej procedurze można stosować dostrytonalne iniekcje uretanu, ponieważ wykazano, że odruchowa mikcja zostaje zachowana, przy jednoczesnym zapewnieniu odpowiedniego znieczulenia^17,22. Co więcej, nie stwierdzono wpływu na ciśnienie mikcji²³. W niniejszym opisie przedstawiono umieszczenie cewnika nadłonowego do cystometrii, ponieważ wykazano, że cewnikowanie przezcewkowe skutkuje wyższymi krzywymi ciśnienia w pęcherzu i niższymi prędkościami przepływu, co jest zgodne z względną obstrukcją ujścia pęcherza ²⁴. Ponadto cewnikowanie przezcewkowe jest wykonalne tylko u zwierząt znieczulonych, a nawet wtedy może być trudne, szczególnie u samców gryzoni i myszy.

Podsumowując, wybór modelu do augmentacji pęcherza i/lub analizy cystometrycznej zależy od celów konkretnego badania. Z punktu widzenia technicznego model szczura wykazuje wyraźną przewagę z przyczyn omówionych powyżej. Jednakże model mysi może być stosowany w badaniach oceniających rolę specyficznych produktów końcowych kodowanych genetycznie w chorobach dróg moczowych, ze względu na podatność tych zwierząt na manipulacje genetyczne. W przypadku szczura nie jest to zazwyczaj możliwe do zrealizowania.

Cystometria u zwierząt budzących się najdokładniej odwzorowuje normalny stan fizjologiczny, w którym zwierzęta te przechodzą cykle mikcji, a zatem pozwala prawdopodobnie na bardziej wiarygodne fizjologiczne określenie funkcji pęcherza. Ponadto pozwala to uniknąć zmiennej zakłócającej w postaci bezpośredniego wpływu środków znieczulających na funkcję pęcherza.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Nożyce do strzyżenia	Przygotowanie szczura/myszy do zabiegu chirurgicznego
Sterylne obłożenia, betadyna, 70% etanol, sterylna gaza	Przygotowanie sterylnego pola operacyjnego
Instrumenty:
Ostrze skalpela	Nacięcie skóry
pinceta z ząbkami	Manipulacja skórą
Pinceta precyzyjna	Atraumatyczny (bez zębów), bez ząbkowania lub z drobnym ząbkowaniem do manipulacji
Mały igłotrzymacz	Ostre preparowanie tkanek
nożyczki Metzenbauma	Nacięcie pęcherza moczowego
Nożyczki do tenotomii	Do szwów odciągających oraz do utworzenia tunelu podskórnego (cewnik cystostomijny)
Małe kleszczyki zakrzywione	Tunel podskórny (cewnik cystostomijny)
Szwy:
szwy polipropylenowe 6-0	Szwy stabilizujące pęcherz moczowy i szew marszerski
szew z poliglaktyny 7-0	Anastomoza rusztowania z pęcherzem moczowym
szew z polyglaktyny 4-0	Zamknięcie mięśni/skóry
Szew jedwabny 3-0 lub 4-0	Mocowanie końcówki cewnika do skóry
Igły i strzykawki:
igła 18 G	Punkcja pęcherza w celu wprowadzenia cewnika cystostomijnego
Igły o rozmiarze 25 G i 30 G	Testowanie szczelności pęcherza moczowego
strzykawka wypełniona 1 ml soli fizjologicznej
igła tępokątna 22 G
Cewnik cystostomijny:
przewód PE-50
Zapalniczka	Rozwieranie rurek PE-50
Mały zacisk zakrzywiony	Tworzenie tunelu podskórnego
Cystometria:
System akwizycji danych ADInstruments MLT844 i oprogramowanie LabChart	Akwizycja danych o ciśnieniu
pompa strzykawkowa Harvard 22 (Harvard Apparatus, Holliston, MA)	Pompa infuzyjna do płynów
Środki znieczulające (cystometria w stanie nieprzytomności):
Izofluran	Indukcja/podtrzymywanie znieczulenia ogólnego
Uretan	Cystometria nieświadoma
Bupiwakaina lub zamiennik	Znieczulenie miejscowe
Meloksykam	Analgezja pooperacyjna
Buprenorfina	Analgezja pooperacyjna