Ocena biomateriałów do augmentacji pęcherza moczowego z wykorzystaniem analiz cystometrycznych w różnych modelach gryzoni

Summary

Etapy chirurgiczne powiększania pęcherza są opisane za pomocą rusztowań 3D w modelach mysich i szczurzych. Aby przetestować skuteczność konfiguracji biomateriałów do stosowania w augmentacji pęcherza moczowego, przedstawiono techniki cystometrii zarówno w stanie czuwania, jak i w znieczuleniu.

Abstract

Funkcja nerek i nietrzymanie moczu są krytycznie zależne od prawidłowego funkcjonowania pęcherza moczowego, który przechowuje mocz pod niskim ciśnieniem i wydala go z precyzyjnie zaplanowanym skurczem. Szereg wrodzonych i nabytych anomalii urologicznych, w tym zastawki tylnej cewki moczowej, łagodny przerost gruczołu krokowego i pęcherz neurogenny wtórny do rozszczepu kręgosłupa/uszkodzenia rdzenia kręgowego, może powodować patologiczną przebudowę tkanek prowadzącą do upośledzenia podatności i zmniejszenia pojemności¹. Funkcjonalna lub anatomiczna niedrożność dróg moczowych jest często związana z tymi stanami i może prowadzić do nietrzymania moczu i uszkodzenia nerek z powodu zwiększonego ciśnienia magazynowania i oddawania moczu². Chirurgiczne wszczepienie segmentów przewodu pokarmowego w celu zwiększenia pojemności narządów i zmniejszenia ciśnienia śródpęcherzowego stanowi podstawową opcję leczenia chirurgicznego tych zaburzeń, gdy zawodzi postępowanie medyczne³. Jednak takie podejście jest utrudnione przez ograniczenie dostępnej tkanki dawcy i wiąże się z poważnymi powikłaniami, w tym przewlekłym zakażeniem dróg moczowych, zaburzeniami metabolicznymi, tworzeniem się kamieni moczowych i wtórnym nowotworem złośliwym^4,5.

Obecne badania nad inżynierią tkanek pęcherza moczowego koncentrują się głównie na identyfikacji konfiguracji biomateriałów, które mogą wspierać regenerację tkanek w miejscach uszkodzonych. Konwencjonalne rusztowania 3D pochodzące z naturalnych i syntetycznych polimerów, takich jak błona podśluzówkowa jelita cienkiego i kwas poliglikolowy, wykazały pewien krótkoterminowy sukces we wspieraniu regeneracji dróg moczowych i mięśni gładkich, a także w ułatwianiu zwiększonej pojemności przechowywania narządów zarówno w modelach zwierzęcych, jak i w klinice^6,7. Jednak braki w integralności mechanicznej i biokompatybilności rusztowania często skutkują szkodliwym zwłóknieniem⁸, przykurczem przeszczepu⁹ i zwapnieniem¹⁰, zwiększając w ten sposób ryzyko niepowodzenia implantu i konieczności przeprowadzenia wtórnych zabiegów chirurgicznych. Ponadto nie osiągnięto jeszcze przywrócenia normalnych cech mikcji przy użyciu standardowych konstruktów biomateriałowych do cystopplastyki augmentacyjnej, dlatego potrzebne są badania i rozwój nowych matryc, które mogą spełnić tę rolę.

Aby pomyślnie opracować i ocenić optymalne biomateriały do klinicznego powiększania pęcherza moczowego, najpierw należy przeprowadzić badania skuteczności na standardowych modelach zwierzęcych przy użyciu szczegółowych metod chirurgicznych i oceny wyników funkcjonalnych. Wcześniej informowaliśmy o zastosowaniu modelu augmentacji pęcherza moczowego u myszy w celu określenia potencjału rusztowań na bazie fibroiny jedwabiu do pośredniczenia w regeneracji tkanek i funkcjonalnych cechach mikcji. ^11,12 Analizy cystometryczne tego modelu wykazały, że różnice we właściwościach strukturalnych i mechanicznych implantów mogą wpływać na wynikające cechy urodynamiczne pęcherzy moczowych modyfikowanych tkankowo^11,12. W modelu tym wykazano dodatnie korelacje między stopniem regeneracji tkanek za pośrednictwem macierzy, determinowanym histologicznie oraz zgodnością funkcjonalną i zdolnością ocenianą za pomocą cystometrii^11,12. Wyniki te sugerują zatem, że oceny funkcjonalne konfiguracji biomateriałów w systemach powiększania pęcherza moczowego gryzoni mogą być użytecznym formatem oceny właściwości rusztowania i ustalania wykonalności in vivo przed badaniami na dużych zwierzętach i zastosowaniem klinicznym. W niniejszym badaniu przedstawimy różne etapy chirurgicznego powiększania pęcherza moczowego zarówno u myszy, jak i szczurów przy użyciu jedwabnych rusztowań oraz zademonstrujemy techniki cystometrii w stanie czuwania i znieczulenia.

Protocol

Metody chirurgiczne

1. Przygotowanie chirurgiczne i znieczulenie

1. Ustaw sterylne pole operacyjne z niezbędnymi narzędziami chirurgicznymi: nożycami do golenia, kleszczami z zębami, cienkimi kleszczami atraumatycznymi, wkrętakiem z cienką igłą, gazą, nożyczkami Metzenbauma, nożyczkami do tenotomii, ostrzem skalpela, igłą podskórną o rozmiarze 30, strzykawką 1 ml wypełnioną solą fizjologiczną, czterema szwami polipropylenowymi 6-0, szwem poliglaktynowym 7-0, szwem poliglaktynowym 4-0.
2. Znieczulić zwierzę inhalacją izofluranu w komorze indukcyjnej. Potwierdź całkowitą indukcję zwierzęcia przed przeniesieniem na pole operacyjne. Upewnij się, że rurka do znieczulenia wziewnego znajduje się w odpowiedniej pozycji, aby zapewnić ciągłe znieczulenie.
3. Ułóż zwierzę na wznak na sterylnej serwiwie.
   [Analiza cystometryczna znajduje się w sekcji poniżej w tunelowaniu cewnika cystostomijnego.]
4. Użyj nożyc do golenia, aby usunąć sierść z dolnej części brzucha.
5. Przygotuj brzuch z betadyną i 70% etanolem.
6. Przed nacięciem można wstrzyknąć podskórnie środek przeciwbólowy, taki jak buprenorfina (0,05-0,1 mg/kg) w celu kontroli bólu okołooperacyjnego.

2. Nacięcie i odsłonięcie pęcherza moczowego

1. Wykonaj 1-2 cm (w zależności od wielkości zwierzęcia i od tego, czy jest to szczur czy mysz) dolne nacięcie linii środkowej skalpelem przez skórę. Pogłęb nacięcie w dolnej części nacięcia przez mięsień prosty mięśnia prostego, uważając, aby nie uszkodzić leżącego poniżej jelita lub pęcherza.
2. Za pomocą kleszczy zębatych podnieś mięsień prosty i wypreparuj tylną powierzchnię mięśnia cienkimi nożyczkami Metzenbauma.
3. Naciąć pozostałą część mięśnia w linii środkowej na całej długości nacięcia skóry.
4. Dostarczyć pęcherz przez ranę po nacięciu (ryc. 1). Pęcherz moczowy jest zwykle najbardziej zależnym narządem w miednicy. (U mężczyzn prostata jest w rzeczywistości bardziej zależna i jest większa niż odkompresowany pęcherz).
5. Umieść jeden szew podtrzymujący przez tylną ścianę pęcherza, a następnie drugi przez przednią ścianę pęcherza moczowego za pomocą szwu polipropylenowego 6-0. Dodatkowe szwy należy założyć z boku. Nie wiąż tych szwów. Gdy szwy są napięte, pęcherz będzie miał kwadratową konfigurację o wymiarach około 1^cm2 (ryc. 2). Uważaj, aby nie mieć zbyt dużego napięcia na tych szwach, ponieważ można je łatwo przeciągnąć przez tkankę pęcherza.
6. Naciąć pęcherz wzdłużnie przez przednią ścianę pęcherza (tuż poniżej kopuły pęcherza) w linii środkowej na około 1 cm (1,5-2 cm w pęcherzu szczura).

3. Zespolenie rusztowania

1. Za pomocą cienkich nożyczek przytnij rusztowanie jedwabne do przybliżonego obszaru ubytku pęcherza moczowego.
2. Używając szwu poliglaktynowego 7-0, zacznij od jednego rogu rusztowania i przyszyj go do pęcherza w sposób ciągły, ciągły, aby stworzyć wodoszczelne uszczelnienie na całej długości ubytku (ryc. 3).
3. Przetestuj integralność zespolenia, wypełniając pęcherz sterylną solą fizjologiczną, wkraplając ją przez ścianę pęcherza moczowego za pomocą igły podskórnej o rozmiarze 30. Jeśli zostanie stwierdzona nieszczelność, można ją zamknąć dodatkowym przerwanym szwem poliglaktynowym 7-0, aby zamknąć szczelinę.
4. Zmniejsz zrekonstruowany pęcherz z powrotem do jamy brzusznej.

4. Zamknięcie nacięcia

1. Przed zamknięciem ściany brzucha należy wstrzyknąć do mięśnia prostego i tkanki podskórnej bupiwakainę w celu znieczulenia miejscowego (< 3 mg/kg 0,25%).
2. Zreaglikemuj mięsień prosty za pomocą ciągłego, biegnącego szwu poliglaktynowego 4-0.
3. Zamknij skórę ciągłym, biegnącym szwem poliglaktynowym 4-0.
4. Oczyść i osusz nacięcie (ryc. 4).
5. Przenieś zwierzę do ciepłej, czystej klatki w celu wybudzenia się z narkozy.

Etapy zakładania cewnika cystostomijnego do analizy cystometrycznej są następujące:

5. Tunelowanie cewnika cystostomijnego

1. Ustaw sterylne pole operacyjne z niezbędnymi narzędziami chirurgicznymi: nożycami do golenia, kleszczami z zębami, cienkimi kleszczami atraumatycznymi, wkrętakiem do cienkich igieł, gazą, nożyczkami Metzenbaum, nożyczkami do tenotomii, małym zakrzywionym zaciskiem, ostrzem skalpela, 6-0 polipropylen, 4-0 szew poliglaktynowy, szew jedwabny 3-0 (szew jedwabny 4-0 dla myszy), igła 18G, igła 22G z końcówką, igła 25G, strzykawka wypełniona solą fizjologiczną 1 ml, rurka polietylenowa 50 (PE-50) cięta na długość ~10 cm.
2. Poszerz koniec rurki PE-50, delikatnie wystawiając ją na działanie płomienia. Uważaj, aby nie stopić końca ani nie zatkać światła (można to sprawdzić, wstrzykując sól fizjologiczną przez igłę 25G podłączoną do "nierozszerzonego" końca i zapewniając przepływ). Służy to jako kotwica do utrzymania rurki w pęcherzu moczowym (ryc. 5).
3. Znieczulić zwierzę jak powyżej w kroku 1.2.
4. Użyj nożyc do golenia, aby usunąć sierść zarówno z grzbietu zwierzęcia między łopatką, jak i dolnej części brzucha na brzuszku.
5. Przygotuj obszary za pomocą betadyny i 70% etanolu. Połóż zwierzę na brzuchu na zasłonie.
6. Wykonaj 1 cm nacięcie na grzbiecie między łopatką. Za pomocą nożyczek Metzenbaum rozwiń płaszczyznę między skórą a leżącym pod nią mięśniem, umieszczając końcówki nożyczek w płaszczyźnie i rozkładając je, aby utworzyć tunel wokół brzusznej części brzucha.
7. Ustaw zwierzę na wznak. Wykonaj nacięcie brzucha i odsłoń pęcherz jak powyżej w krokach 2.1-2.4. Zmniejsz pęcherz z powrotem do brzucha.
8. Umieść mały zacisk w tunelu podskórnym utworzonym w kroku 5.6, zaczynając od nacięcia skóry grzbietowej. Używając palców do ochrony zawartości wewnątrz brzucha, przebij ścianę brzucha końcami zacisku do brzucha.
9. Chwyć gładki koniec rurki PE-50 za pomocą zacisku i przeciągnij go z powrotem przez nacięcie grzbietowe. Upewnij się, że bulwiasty koniec nie jest wyciągnięty poza ścianę brzucha (Rysunek 6).

6. Zakładanie rurki do cystostomii

1. Przeprowadź pęcherz przez nacięcie. Od tego momentu z pęcherzem należy obchodzić się cienkimi kleszczami, aby zapobiec urazowi pęcherza, który mógłby spowodować uszkodzenie lub stan zapalny, który może zniekształcić wyniki cystometryczne lub spowodować dodatkowy dyskomfort dla zwierzęcia po operacji.
2. Zanotuj proponowane miejsce na rurkę cystostomijną. Powinien być umieszczony w kopule pęcherza moczowego (powyżej segmentu augment). Zapobiegnie to załamaniu lub niedrożności rurki.
3. Za pomocą szwu polipropylenowego 6-0 umieść ścieg torebkowy na kopule pęcherza w następujący sposób: umieść pierwszy rzut przez ścianę pęcherza wzdłużnie, bocznie do proponowanego miejsca rurki cystostomijnej. Pozostaw mały zacisk na luźnym końcu, aby szew nie został przypadkowo przeciągnięty do końca. Umieść następny rzut w kierunku poprzecznym, zaczynając od wchodzenia w ścianę pęcherza lekko bocznie do wyjścia pierwszego rzutu.
4. Nie naciągaj szwu. Następny szew należy założyć równolegle do pierwszego (podłużnie) wchodzącego do pęcherza moczowego, po prostu głowodowo do miejsca wyjścia ostatniego, poprzecznego szwu. Czwarty rzut rozpocznie się po bokach do wyjścia z ostatniego ściegu i zakończy się obok wejścia dla twojego pierwszego rzutu. Jeśli zostanie to wykonane prawidłowo, tworzy to kwadrat obwodowy wokół proponowanego miejsca cewnika (ryc. 7).
5. Za pomocą igły 18G przebij ścianę pęcherza moczowego na środku szwu torebkowego. Uważaj, aby nie przebić zbyt głęboko (tylko na tyle, aby uzyskać światło śródświetlne). Umieść końcówki cienkich kleszczyków w otworze i delikatnie rozprowadź, aby poszerzyć otwór.
6. Wprowadzić bulwiasty koniec cewnika do ubytku w pęcherzu moczowym, aż stanie się on wewnątrzświetlny. Mocno naciągnij szew torebkowy wokół cewnika i zawiąż go. Powinno to zacisnąć ścianę pęcherza wokół cewnika, utrzymując go na miejscu (ryc. 8).
7. Weź jeden koniec szwu i owiń go raz wokół cewnika i przywiąż go, aby jeszcze bardziej zabezpieczyć cewnik.

7. Testowanie cewnika i zamykanie nacięcia w jamie brzusznej

1. Za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml i igły 25G włóż igłę do rurki i powoli wstrzyknij sól fizjologiczną, aby rozciągnąć pęcherz. Obserwuj, czy wokół cewnika nie ma wycieków. Gdy zauważysz, że wycieka z cewki moczowej, odessaj sól fizjologiczną, aby ponownie odbarczyć pęcherz.
2. Zamknij nacięcie w jamie brzusznej, jak powyżej w krokach 4.1-4.4.

8. Zamykanie nacięcia grzbietowego i zabezpieczanie cewnika (dla szczurów)

1. Zmień pozycję zwierzęcia na brzuchu.
2. Przeciąć nożyczkami rurkę cewnika na poziomie skóry. Włóż igłę 22G z końcówką do rurki.
3. Zamknij skórę nad rurką za pomocą poliglaktyny 4-0 w sposób ciągły. Pozostawić piastę igły wystającą ze skóry.
4. Umieścić nasadkę do podawania dożylnego na igle. Za pomocą jedwabnego szwu 3-0 przymocuj końcówkę cewnika do skóry (ryc. 9).
5. Oczyść nacięcie. Przenieś szczura do ciepłej, czystej klatki w celu wybudzenia się z narkozy.

8.* Zamykanie nacięcia grzbietowego i zabezpieczanie cewnika (dla myszy lub szczurów)

1. * Zatkaj dystalny koniec cewnika, zaginając go lub używając płomienia do stopienia końca.
2. *Zwiń koniec rurki i pozostaw ją w woreczku podskórnym na grzbiecie zwierzęcia (NIE przecinaj rurki, aby ją skrócić) (Rysunek 10).
3. *Zamknij skórę nad rurką za pomocą poliglaktyny 4-0 w sposób ciągły (ryc. 11).
4. *W dniu cystometrii należy przygotować nacięcie grzbietowe za pomocą betadyny i 70% etanolu. Otwórz nacięcie grzbietowe w znieczuleniu i wyjmij zwinięty rurkę z torebki podskórnej. Zamknij nacięcie. Obudź zwierzę ze znieczulenia i wykonaj cystometrię, gdy jest w pełni wybudzone.

9. Reprezentatywne wyniki - metody chirurgiczne

Zrekonstruowany pęcherz powinien być jak najbardziej wodoszczelny, aby uniknąć komplikacji związanych ze znacznym wyciekiem moczu (Rysunek 3). Ból lub dyskomfort zwykle objawia się dreszczami lub drapaniem i gryzieniem nacięcia brzucha. Można temu zaradzić poprzez codzienne podskórne wstrzyknięcia niesteroidowego leku przeciwzapalnego, takiego jak meloksykam (0,5-1,0 mg/kg podskórnie). Zazwyczaj zwierzęta wymagają zastrzyków tylko przez pierwsze 3 dni po operacji. W razie potrzeby można go uzupełnić opioidami, takimi jak buprenorfina (0,05-0,1 mg/kg podskórnie co 8-12 godzin). Zwierzęta powinny być monitorowane 3 razy dziennie przez pierwsze 3 dni po operacji, dwa razy dziennie przez 3-5 dni po operacji, a następnie codziennie w celu oceny bólu, objawów infekcji, odpowiedniego gojenia się ran, aktywności, pielęgnacji i turgoru skóry. Antybiotyki (Baytril, 5 mg/kg podskórnie co 24 godziny w objętości nieprzekraczającej 0,1 ml) podaje się przez pierwsze 72 godziny po zabiegu, jako chirurgiczną profilaktykę infekcji. Oznaki normalnego powrotu do zdrowia to normalne poruszanie się i poziom aktywności, odpowiednie karmienie i picie, brak bólu lub dystresu (brak wokalizacji) oraz normalna socjalizacja ze współlokatorami. Przed analizą cystometryczną należy podać czas rekonwalescencji wynoszący co najmniej 5-7 dni, aby umożliwić gojenie się pęcherza moczowego i zmniejszenie stanu zapalnego, który może potencjalnie wpłynąć na wyniki.

Analizy cystometryczne

10. Analiza cystometryczna Awake

1. Konfiguracja opisana za pomocą przyrządów ADInstruments MLT844 z przechwytywaniem i analizą danych za pomocą LabChart v6 (ADInstruments) oraz infuzją za pomocą pompy strzykawkowej Harvard 22 (Harvard Apparatus, Holliston, MA), chociaż dostępne są inne porównywalne systemy (rysunek 12).
2. Skalibruj zarówno objętość, jak i ciśnienie w oparciu o specyfikacje zastosowanego systemu cystometrycznego.
3. Umieść zwierzęta w klatkach metabolicznych (klatkach z podłogą z siatki drucianej), które są zawieszone nad wagą. Skala jest podłączona do przetwornika.
4. Oczyść system z wszelkich pęcherzyków powietrza i zapewnij ciągły przepływ z pompy infuzyjnej.
5. Podłącz system przechwytywania danych do komputera i obserwuj, czy dane są śledzone. Dostosuj odpowiednio skalę. Ciśnienie w pęcherzu moczowym i objętość moczu będą rejestrowane w sposób ciągły.
6. Uzyskaj dostęp do cewników nadłonowych za pomocą igły 27G połączonej za pomocą rurki T z przetwornikiem ciśnienia i pompą infuzyjną. Rozpocząć infuzję soli fizjologicznej w dawce 12,5 μl/min dla myszy i 100 μl/min dla szczura.
7. Poczekaj, aż śledzenie wzorca mikcji ustabilizuje się (wzrost ciśnienia w pęcherzu, a następnie pustka). Zwykle zajmuje to około 10-20 minut. Rejestruj cykle mikcji przez 45-120 minut lub co najmniej 3-4 cykle mikcji.
8. Obserwuj całą procedurę w czasie rzeczywistym, aby rozwiązać problemy z powikłaniami, które doprowadzą do artefaktu (np. załamanie cewnika, niedrożność itp.; patrz poniższa dyskusja).
9. Przerwać infuzję, odłączyć cewnik od układu i umieścić zwierzę z powrotem w klatce.

11. Nieprzytomna analiza cystometryczna (bez cewnika nadłonowego)

1. Znieczulić zwierzę wstrzyknięciem dootrzewnowym (IP) z uretanu (1-2 g/kg).
2. Odsłoń pęcherz jak powyżej w krokach 1.3-2.4.
3. Skalibruj system jak w kroku 9.2. Przygotuj system jak w kroku 9.4-9.5.
4. Wprowadzić igłę 27G podłączoną za pomocą rurki T do przetwornika ciśnienia i pompy infuzyjnej do bocznej części pęcherza.
5. Nagrywaj cykle mikcji przez 45-90 minut.
6. Przerwij napar, wyjmij igłę z pęcherza i poddaj zwierzę eutanazji.

12. Reprezentatywne wyniki - analizy cystometryczne

Ślady urodynamiczne mogą być następnie analizowane w celu uzyskania takich parametrów jak objętość mimiki, podatność, szczytowe ciśnienie mikcji, interwał skurczu, czas cyklu mikcji i objętości resztkowe po mikcji.

Cystometrogram można podzielić na fazę wypełniania i mikcji. Normalna faza napełniania to część cyklu mikcji, w której pęcherz napełnia się przy bardzo niewielkiej zmianie ciśnienia dopęcherzowego. Normalna faza mikcji polega na stałym wzroście ciśnienia śródpęcherzowego odpowiadającym skurczowi wypieracza. Najwyższe ciśnienie osiągnięte podczas fazy mikcji śledzenia nazywane jest szczytowym ciśnieniem mikcji. Wysokie szczytowe ciśnienie mikcji może sugerować obturacyjny wzorzec mikcji, hiperkurczliwy pęcherz lub załamanie cewnika SP. Zgodność można obliczyć, uzyskując stosunek objętości wkroplonej podczas fazy napełniania do zmiany ciśnienia (zgodność = ΔV/ΔP). Pęcherz niezgodny z wymaganiami to taki, który nie jest w stanie pomieścić odpowiedniej objętości moczu przy niskim ciśnieniu. Interwał między skurczami można obliczyć, analizując czas między dwoma skurczami, jak widać na cystometrogramie. Krótki odstęp między skurczami sugeruje drażliwy pęcherz. Czas cyklu mikcji odnosi się do czasu potrzebnego na zakończenie całej fazy napełniania i oddawania moczu i można go łatwo ustalić, analizując śledzenie. Na zakończenie cystometrii można uzyskać pozostałość po mikcji (PVR). Odbywa się to poprzez zasysanie cewnika nadłonowego po zakończeniu skurczu wypieracza. Parametry te pomagają badaczowi obiektywnie zbadać dynamikę pęcherza podczas napełniania i opróżniania pęcherza.

Rysunek 1. Zdjęcie nacięcia i wytłoczenia pęcherza brzusznego.

Rysunek 2. Nacięcie pęcherza moczowego z odsłonięciem światła pęcherza moczowego.

Rysunek 3. Integracja implantu ze ścianą pęcherza moczowego.

Rysunek 4. Zdjęcie zamkniętego nacięcia.

Rysunek 5. Rozszerzony koniec rurki PE-50.

Rysunek 6. Rurka PE-50 (cewnik) przez nacięcie grzbietowe.

Rysunek 7. Szew portmonetkowy.

Rysunek 8. Mocowanie cewnika do pęcherza moczowego.

Rysunek 9. Zabezpieczona piasta cewnika.

Rysunek 10. Zwinięty rurki w woreczku podskórnym.

Rysunek 11. Zamknięcie nacięcia grzbietowego.

Rysunek 12. Przykładowy układ cystometryczny.

Rysunek 13. Reprezentatywne śledzenie cystometrii.

Discussion

Cystometryczne oceny konfiguracji biomateriałów po implantacji i augmentacji pęcherza moczowego w małych modelach zwierzęcych stanowią ważny krok walidacyjny w identyfikacji optymalnych cech strukturalnych i mechanicznych projektów matryc do stosowania w sytuacjach klinicznych. W tym badaniu opisano metody chirurgiczne augmentacji pęcherza moczowego u myszy i szczurów, a także techniki cystometryczne w celu określenia właściwości urodynamicznych narządów inżynieryjnych do oceny funkcjonalnej. Wykorzystaliśmy te techniki w wielu eksperymentach z udziałem zarówno myszy, jak i szczurów, przy czym każdy eksperyment składał się z 30+ gryzoni bez znaczących problemów. Nasze laboratorium badawcze to zróżnicowany konglomerat naukowców i lekarzy chirurgów, a chirurdzy z co najmniej 5-6-letnim podyplomowym szkoleniem chirurgicznym wykonywali zabiegi proceduralne tych eksperymentów.

Niezależnie od rodzaju użytego biomateriału, główną różnicą między powiększaniem pęcherza moczowego u szczurów a myszy jest rozmiar pęcherza. Ze względu na mniejszy rozmiar pęcherza moczowego, rozwarstwienie i wprowadzenie biomateriału jest trudniejsze technicznie u myszy. Aby pomóc w wizualizacji, można użyć mikroskopu chirurgicznego. Ponieważ rozmiar pęcherza moczowego u szczurów jest większy, jest on bardziej podatny na sytuacje, w których należy wykonać więcej niż jeden zabieg na pęcherzu moczowym (np. powiększenie i umieszczenie cewnika cystostomijnego). Dodatkowo, powyższy protokół opisuje użycie rurki PE-50 dla szczura ¹³, jednak jeszcze większe cewniki, do PE-100, zostały użyte, szczególnie w badaniach długoterminowych ¹⁴. U myszy można zastosować rurki mniejszego kalibru, takie jak rurki PE-10 ^15,16, ale należy pamiętać, że mniejsze, bardziej giętkie rurki mogą nie przenosić dokładnie zmian ciśnienia na przetwornik. Również alternatywna metoda mocowania cewnika na grzbiecie (krok 8* powyżej) jest wykonywana u myszy ze względu na ich mniejszy rozmiar ciała, a igła z końcówką i nasadka dożylna są zbyt uciążliwe. Wadą tego rozwiązania jest konieczność znieczulenia w celu usunięcia końca cewnika w woreczku podskórnym przed cystometrią.

Badania wykazały, że w pierwszych dniach (0-4 dni) po założeniu cewników cystometria wykazała wysokie ciśnienie w pęcherzu moczowym i nadaktywność przy małej objętości mikcji. Wyniki te wydawały się stabilizować około szóstego do siódmego dnia^14,17 i dlatego jest to prawdopodobnie idealny czas na ocenę cystometryczną. Jednak większość doniesień w literaturze wykonuje cystometrię w ciągu pierwszych 3 dni cewnikowania ¹⁸, co tłumaczy duże zróżnicowanie powyższych parametrów w stosunku do czasu. Pozostawienie cewnika nadłonowego na czas dłuższy niż 3 dni niesie ze sobą choroby, takie jak ryzyko kamieni, przemieszczenia, infekcji, krwiomoczu i niedrożności cewnika z zanieczyszczeniami.

Opisano różne szybkości infuzji podczas cystometrii od 1-3 ml / h dla myszy^15,16 i 10-11 ml / h dla szczurów ^13,19,20. Szybkość infuzji suprafizjologicznej może powodować fałszywie podwyższone ciśnienie ¹⁴. W naszej konfiguracji używamy szybkości infuzji 12,5 μl/min (0,75 ml/godz.) dla myszy i 100 μl/min (6 ml/godz.) dla szczurów, ale można również zastosować niższe dawki. Temperatura soli fizjologicznej powinna wynosić co najmniej temperaturę pokojową, chociaż ciepła (37°) sól fizjologiczna jest bardziej optymalna, aby uniknąć nadczynności pęcherza sprowokowanej wkropleniem zimnego roztworu. W cystometrii na jawie ważne jest, aby umożliwić stabilizację wzorca mikcji, gdy zwierzę przyzwyczaja się do klatki, co z naszego doświadczenia wymaga okresu ~10-20 minut. Następnie można rejestrować regularne cykle mikcji przez 45-120 minut lub co najmniej 3-4 cykle mikcji. Zwierzę powinno być obserwowane w czasie rzeczywistym, ponieważ zwierzę porusza się swobodnie, a powikłania, takie jak skręcenie lub załamanie cewnika, mogą zmienić analizę cystometryczną. Ograniczenie hałasu otoczenia podczas cystometrii jest pożądane w celu zmniejszenia ruchu zwierząt i późniejszych artefaktów. Nieświadoma cystometria nie ma towarzyszących problemów, jak cystometria na jawie, ale wykazano, że wiele środków znieczulających hamuje spontaniczne skurcze pęcherza. Hamowanie to odpowiada bezpośrednio oczekiwanemu czasowi działania leków znieczulających, tj. gdy efekt znieczulający ustępuje, spontaniczne skurcze wznawiają ^{się 14}. Co więcej, ciśnienie mierzone, gdy pęcherz się przepełniał, było statystycznie większe u znieczulonych szczurów, zarówno żywych, jak i pośmiertnych, co wskazuje na wpływ na właściwości pasywnej podatności ściany pęcherza. Efekt ten obserwuje się w przypadku pentobarbitalu²¹, ketaminy i chloralozy IM/IP, a także wziewnego halotanu i dokanałowej nesacainy ¹⁴. Bardziej obszerne badanie różnych środków znieczulających potwierdza to odkrycie przy tłumieniu odruchu mikcji zarówno w przypadku środków wziewnych (izofluran i metoksyfluran), jak i barbituranów (pentobarbital i tiobutabarbital) przy umiarkowanych poziomach znieczulenia¹⁷. Efekt ten zaobserwowano przy równomiernym lekkim lub uspokajającym poziomie znieczulenia lekami takimi jak fentanyl-droperydol i ketamina-diazepam, i podobnie jak w poprzednim badaniu, wraz z ustąpieniem efektu znieczulenia, nastąpiło również zahamowanie¹⁷. Do tej procedury można zastosować uretanowe iniekcje dootrzewnowe, ponieważ wykazano, że odruchowa mikcja jest zachowana, a jednocześnie pozwala na odpowiednie znieczulenie^17,22. Ponadto nie obserwuje się żadnego wpływu w odniesieniu do ciśnienia mikcji²³. Umieszczenie cewnika nadłonowego do cystometrii opisano tutaj, ponieważ wykazano, że cewnikowanie wewnątrzcewkowe ma wyższe krzywe ciśnienia w pęcherzu moczowym i niższe natężenia przepływu zgodne ze względną niedrożnością ujścia pęcherza ^{moczowego 24}. Co więcej, cewnikowanie wewnątrzcewkowe jest możliwe tylko u znieczulonych zwierząt, a nawet wtedy cewnikowanie może być trudne, szczególnie u samców gryzoni i myszy.

Podsumowując, wybór modelu do wykorzystania do powiększenia pęcherza moczowego i/lub analizy cystometrycznej zależy od celów konkretnego badania. Z technicznego punktu widzenia model szczura ma wyraźną przewagę z powodów omówionych powyżej. Jednak model mysi może być wykorzystany w badaniach oceniających rolę określonych produktów końcowych kodowanych przez geny w chorobach dróg moczowych, ze względu na ich podatność na manipulacje genetyczne. Nie jest to na ogół wykonalne u szczura.

Cystometria czuwania najdokładniej naśladuje normalny stan fizjologiczny, w którym zwierzęta te przechodzą cykle mikcji, a zatem prawdopodobnie da bardziej wiarygodne fizjologiczne określenie funkcji pęcherza. Co więcej, unika się zmiennej zakłócającej, jaką jest bezpośredni wpływ środków znieczulających na czynność pęcherza moczowego.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nożyce do golenia	Przygotowanie szczura/myszy do operacji
Sterylne serwety, betadyna, 70% etanol, sterylna gaza	Przygotowanie sterylnego pola
Instrumenty:
Ostrze skalpela	Kleszcze do nacinania
z zębami	Manipulowanie skórą
Cienkie kleszcze	Atraumatyczne (bez zębów), bez ząbków lub z drobnymi ząbkami do manipulacji
Mały wkrętak igłowy	Wycinanie
Nożyczki Metzenbauma	Nacięcie
Nożyczki do tenotomii	Do zakładania szwów retrakcyjnych i do rozwoju tunelu podskórnego (cewnik cystotomijny)
Małe zakrzywione zaciski	Tunel podskórny (cewnik cystostomijny)
Szwy:
6-0 nici polipropylenowe	Szwy szpilkowe pęcherza moczowego i szew
7-0 szew poliglaktynowy	Zespolenie rusztowania z pęcherzem moczowym
4-0 szew poliglaktynowy	Zamknięcie mięśni/skóry
3-0 lub 4-0 Szew	jedwabnyMocowanie końcówki cewnika do skóry
Igły i strzykawki:
18 Igła o rozmiarze	Przebijanie pęcherza moczowego pod cystostomię cewnik
Igły o rozmiarze 25 i 30	Testowanie pęcherza pod kątem wycieku
1 ml strzykawki wypełnionej solą fizjologiczną
Igła
Cewnik cystostomijny:
PE-50 rurka
zapalniczki	Rozszerzanie
Mały zakrzywiony zacisk	Rozwijanie tunelu
Cystometria:
MLT844 ADInstruments przechwytywanie danych i oprogramowanie LabChart	Dane dotyczące ciśnienia akwizycja
Pompa strzykawkowa Harvard 22 (Harvard Apparatus, Holliston, MA)	Pompa
Znieczulenie (cystometria nieprzytomna):
Isofluran	Indukcja/utrzymanie znieczulenia
Uretan	Cystometria
Bupivicaine lub równoważna	Znieczulenie miejscowe
Meloksykam	Analgezja
Buprenorfina	Znieczulenie