$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Mikroskopia TIRF stała się potężną technologią obrazowania do badania czasoprzestrzennej dynamiki cząsteczek fluorescencyjnych in vitro i w żywych komórkach1. Zjawisko optyczne całkowitego odbicia wewnętrznego występuje, gdy światło przechodzi z ośrodka o wysokim współczynniku załamania światła do ośrodka o niskim współczynniku załamania światła pod kątem większym niż charakterystyczny kąt krytyczny (tj. bliżej równolegle do granicy). Chociaż w takich warunkach całe światło jest odbijane z powrotem, powstaje fala ulotna, która rozchodzi się w poprzek i wzdłuż granicy, która zanika wykładniczo wraz z odległością i przenika tylko przez obszary próbki o długości 100-200 nm w pobliżu granicy faz2. Oprócz zapewnienia doskonałej rozdzielczości osiowej, zmniejszone wzbudzenie nieostrych fluoroforów tworzy bardzo wysoki stosunek sygnału do szumu i minimalizuje szkodliwe skutki fotowybielania2,3. Będąc techniką szerokokątną, TIRF umożliwia również szybsze pozyskiwanie obrazu niż większość konfiguracji konfokalnych opartych na skanowaniu.
Na pierwszy rzut oka, niska głębokość penetracji TIRF wydaje się być niekompatybilna z obrazowaniem komórek bakteryjnych i grzybiczych, które często są otoczone grubymi ścianami komórkowymi. Wręcz przeciwnie, odkryliśmy, że ściany komórkowe komórek drożdży i bakterii faktycznie poprawiają użyteczność TIRF i zwiększają zakres obserwowalnych struktur4-8. Wiele procesów komórkowych może być zatem bezpośrednio dostępnych dla TIRF w małych, jednokomórkowych mikroorganizmach, które często oferują potężne techniki manipulacji genetycznej. Pozwala nam to na przeprowadzanie eksperymentów biochemicznych in vivo, w których kinetyka oddziaływań i aktywności białek może być bezpośrednio oceniana w żywych komórkach.
Opisujemy tutaj poszczególne kroki wymagane do uzyskania wysokiej jakości obrazów TIRF dla komórek Saccharomyces cerevisiae lub Bacillus subtilis. Zwracamy uwagę na różne problemy, które mogą mieć wpływ na wizualizację TIRF sond fluorescencyjnych w komórkach i ilustrujemy procedurę kilkoma przykładami zastosowań. Na koniec pokazujemy, w jaki sposób obrazy TIRF można jeszcze bardziej poprawić przy użyciu sprawdzonych technik przywracania obrazów.