Artykuł metodologiczny

Wizualizacja organizacji i dynamiki kory mikroorganizmów z wykorzystaniem mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem

11.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/3982

⸱

1 maja 2012

 ,  ,  , 
1AG Cellular Dynamics and Cell Patterning, Max Planck Institute of Biochemistry, 2Helmholtz Zentrum München

W tym artykule

Podsumowanie

Mikroskopia fluorescencyjna z całkowitym wewnętrznym odbiciem (TIRF) to potężna metoda obserwacji struktur znajdujących się blisko powierzchni komórki przy wysokim kontraście i rozdzielczości czasowej. Demonstrujemy, w jaki sposób TIRF może być wykorzystany do badania dynamiki białek w korze bakterii i grzybów otoczonych ścianą komórkową.

Streszczenie

Mikroskopia TIRF stała się potężną technologią obrazowania służącą do badania dynamiki czasowo-przestrzennej cząsteczek fluorescencyjnych in vitro oraz w żywych komórkach1. Zjawisko optyczne całkowitego wewnętrznego odbicia występuje, gdy światło przechodzi z ośrodka o wysokim współczynniku załamania do ośrodka o niskim współczynniku załamania pod kątem większym niż charakterystyczny kąt krytyczny (tzn. bardziej równolegle do granicy ośrodków). Chociaż w takich warunkach całe światło ulega odbiciu, powstaje fala ewanescentna, która rozprzestrzenia się w poprzek i wzdłuż granicy, zanikając wykładniczo wraz z odległością i przenikając jedynie obszary próbki znajdujące się w odległości 100-200 nm od interfejsu2. Oprócz zapewnienia doskonałej rozdzielczości osiowej, ograniczone wzbudzanie fluoroforów znajdujących się poza ogniskową pozwala na uzyskanie bardzo wysokiego stosunku sygnału do szumu oraz minimalizuje szkodliwe efekty fotoblaknięcia2,3. Jako technika szerokopolowa, TIRF umożliwia również szybszą akwizycję obrazów niż większość konfokalnych układów opartych na skanowaniu.

Na pierwszy rzut oka niewielka głębokość penetracji TIRF wydaje się być niekompatybilna z obrazowaniem komórek bakteryjnych i grzybów, które często są otoczone grubymi ścianami komórkowymi. Wręcz przeciwnie, odkryliśmy, że ściany komórkowe drożdży i bakterii w rzeczywistości poprawiają użyteczność TIRF i zwiększają zakres obserwowalnych struktur4-8. Wiele procesów komórkowych może zatem być bezpośrednio badanych za pomocą TIRF w małych, jednokomórkowych mikroorganizmach, które często oferują potężne techniki manipulacji genetycznej. Pozwala to na przeprowadzanie eksperymentów z zakresu biochemia in vivo, w których kinetykę oddziaływań i aktywności białek można bezpośrednio oceniać w żywych komórkach.

Opisujemy tutaj poszczególne etapy niezbędne do uzyskania wysokiej jakości obrazów TIRF dla komórek Saccharomyces cerevisiae lub Bacillus subtilis. Wskazujemy na różne problemy, które mogą wpływać na wizualizację sond fluorescencyjnych w komórkach przy użyciu TIRF, i ilustrujemy tę procedurę za pomocą kilku przykładów zastosowań. Na koniec demonstrujemy, w jaki sposób obrazy TIRF można dodatkowo ulepszyć, stosując uznane techniki rekonstrukcji obrazu.

Protokół

1. Przygotowanie próbek

  1. Przygotowanie szkiełek nakrywkowych
    Szkiełka nakrywkowe należy oczyścić z cząsteczek kurzu, ponieważ technika TIRF jest wrażliwa na sygnały tła pochodzące od szkiełka (Fig. 1A, Movie 1).
    1. Za pomocą pęsety umieścić szkiełka nakrywkowe w ceramicznym uchwycie z pokrywką.
    2. Wypełnić szklany pojemnik 1 M NaOH (można go używać wielokrotnie).
    3. Inkubować przez 2 h w powolnym, ciągłym obrocie (mieszalnik orbitalny). Nadmierna inkubacja (> 8 h) spowoduje powstanie nieprzezroczystych szkiełek.
    4. Przemyć dwukrotnie wodą destylowaną przez 5 min w powolnym, ciągłym obrocie.
    5. Przechowywać w ceramicznym uchwycie zalanym 100% etanolem.
  2. Przygotowanie komórek Bacillus subtilis
    1. Rozcieńczyć do OD600 na poziomie 0,01-0,05 w 5 ml odpowiedniej pożywki wzrostowej i hodować do fazy wykładniczej (OD600 0,3-0,7).
    2. Przygotować 1,25% agarozę w wodzie lub pożywce. W celu zmniejszenia fluorescencji tła należy użyć pożywki syntetycznej. Rozpuścić proszek w plastikowej probówce 1,5 ml w temperaturze 95°C i przechowywać w bloku grzewczym w temperaturze 72°C.
    3. Nanieść małą kroplę agarozy na środek szkiełka i docisnąć drugim szkiełkiem, tworząc płaski pad. Ostrożnie rozdzielić szkiełka po co najmniej 2 min lub bezpośrednio przed użyciem.
    4. Odwirować 500 μl komórek w mikrocentryfudze przy 12 000 rpm przez 1 min.
    5. Usunąć supernatant i resuspender osad w 50 μl pożywki.
    6. Nanieść 2-4 μl komórek na środek pada agarowego.
    7. Wyjąć oczyszczone szkiełko nakrywkowe z pojemnika z etanolem za pomocą pęsety, osuszyć sprężonym powietrzem i ostrożnie położyć na próbce.
    8. Pozostawić komórki do osiadania przez co najmniej 2 min przed rozpoczęciem mikroskopii.
    9. W przypadku długotrwałego obrazowania uszczelnić krawędzie szkiełka nakrywkowego VALAPem (mieszanka wazeliny, lanoliny i parafiny w równych proporcjach wagowych, zmieszana pod wpływem ciepła, nakładana małym pędzelkiem lub szpatułką).
  3. Przygotowanie komórek Saccharomyces cerevisiae
    1. Rozcieńczyć prekulturę i hodować w odpowiedniej pożywce przez co najmniej 5 h do fazy wykładniczej (OD600 0,2-0,8).
    2. Wyjąć szkiełko nakrywkowe z pojemnika pęsetą i osuszyć sprężonym powietrzem.
    3. Rozprowadzić pipetą 5 μl roztworu konkawanaglucyny A (ConA, 2 μg/ml w wodzie destylowanej) na szkiełku nakrywkowym i osuszyć sprężonym powietrzem. ConA wiąże się z węglowodanami ściany komórkowej drożdży i unieruchamia komórki.
    4. Przenieść 4,5 μl zawiesiny komórek drożdży na jedną stronę pokrytego ConA szkiełka nakrywkowego. Ostrożnie położyć szkiełko nakrywkowe na szkiełku przedmiotowym. Zacząć od jednej krawędzi i powoli opuszczać szkiełko, aby uniknąć powstania pęcherzyków powietrza.
    5. Pozostawić komórki do osiadania przez co najmniej 2 min przed rozpoczęciem mikroskopii.
    6. W przypadku długotrwałego obrazowania uszczelnić krawędzie szkiełka nakrywkowego VALAPem (patrz wyżej).

2. Akwizycja obrazów

  1. Konfiguracja mikroskopu
    Wszystkie eksperymenty przeprowadzono na dostosowanym układzie TIRF opartym na w pełni zautomatyzowanym statywie iMIC (Till Photonics) z obiektywem Olympus 100x 1.45 NA. Jako źródła światła wykorzystano lasery DPSS o mocy 75 mW o długości fali 488 nm (Coherent Sapphire) i 561 nm (Cobolt Jive). Lasery były wybierane za pomocą AOTF i kierowane przez światłowód szerokopasmowy do iMIC. Do regulacji kątów padania lub pozycji odzyskiwania fluorescencji po fotowybielaniu (FRAP) zastosowano dwuosiową głowicę skanującą sterowaną galwanometrem. Dodatkowy galwanometr służył do przełączania między epifluorescencją, FRAP a TIRF. Obrazy gromadzono za pomocą kamery Andor iXON DU-897 EMCCD z soczewką powiększającą 2x umieszczoną przed kamerą. Akwizycję kontrolowano za pomocą pakietu oprogramowania Live Acquisition (Till Photonics).
    Należy wziąć pod uwagę następujące kwestie:
    1. Programowalne sterowanie źródłem oświetlenia (linią laserową) i kątem TIRF jest niezbędne dla powtarzalnych wyników, a zwłaszcza w przypadku wielokolorowego TIRF, gdzie kąty padania muszą być dostosowane do każdej długości fali wzbudzenia, aby zapewnić równą penetrację fal ewanescentnych. W naszym układzie kąt TIRF można dostosować natychmiastowo za pomocą dwóch galwanometrów, które są sterowane bezpośrednio z pakietu oprogramowania Live Acquisition.
    2. Nasz dostosowany układ dodatkowo umożliwia szybkie przełączanie między epifluorescencją, TIRF a FRAP za pomocą trzeciego galwanometru, co pozwala na prosty pomiar kinetyki lokalizacji obiektów śledzonych w TIRF.
    3. TIRF typu obiektywowego wymaga wysokich apertur numerycznych NA>1.4. Użyliśmy obiektywu Olympus 100x NA 1.45.
    4. Kamery EMCCD sprawdzają się bardzo dobrze w TIRF ze względu na wysoki stosunek sygnału do szumu. Aby umożliwić obrazowanie z optymalną czułością, użyliśmy kamery EMCCD z podświetleniem tylnym o rozdzielczości 512x512 pikseli i rozmiarze piksela 16 μm. Aby zachować maksymalną rozdzielczość, przed kamerą umieściliśmy soczewkę powiększającą 2x.
    5. Ponieważ TIRF jest techniką szerokopolową, intensywność wiązek laserowych ulega rozproszeniu. Dlatego silne lasery często poprawiają obrazowanie. Użyliśmy laserów diodowo-pompowanych w stanie stałym (DPSS) o mocy 75 mW o długości fali 488 nm i 561 nm.
    6. Aby utrzymać komórki w optymalnych warunkach wzrostu podczas obrazowania, należy zastosować odpowiednie systemy kontroli środowiskowej. Do badania temperaturowrażliwych mutantów drożdży użyliśmy specjalnie wykonanej komory grzewczej (Rys. 1B). Do wymiany medium podczas akwizycji stosowaliśmy proste komory przepływowe lub szalki hodowlane z dna szklanego, do których można łatwo uzyskać dostęp od góry w mikroskopie odwróconym.
  2. Dostrajanie parametrów
    1. Zidentyfikuj pozycję komórek, używając oświetlenia w polu jasnym. Czerwone diody LED są szczególnie polecane, ponieważ nie wywołują znaczących uszkodzeń fotochemicznych.
    2. Przełącz na oświetlenie laserowe i wybierz odpowiednie lasery oraz kombinacje filtrów, aby wzbudzić wybrane fluorofory. Upewnij się, że kąt TIRF jest podkrytyczny, w przeciwnym razie nie będziesz w stanie wykryć żadnego sygnału pochodzącego z białek fuzyjnych GFP. W razie wątpliwości ustaw kąt TIRF na 0°, aby uzyskać prostopadłą wiązkę laserową. Znajdź górną część komórki (stronę skierowaną w stronę szkiełka nakrywnego). Zmieniaj kąt padania wiązki laserowej, aż sygnały znikną, a następnie powoli zwiększaj kąt, aż do momentu ponownego pojawienia się fluorescencji na powierzchni komórki (Film 2). Ponownie dostosuj ostrość w osi z dla optymalnej pozycji na powierzchni. Właściwe kąty TIRF nie tworzą rozmytego halo na krawędzi komórki (Rys. 1C). Jeśli podczas konfiguracji wystąpi znaczące fotowybielanie, zapisz kąt TIRF i przenieś się do niewybielonej pozycji preparatu przed rozpoczęciem akwizycji.
    3. Dostosuj intensywność laserów i wzmocnienie kamery, aby zmaksymalizować zakres dynamiczny (wysoki stosunek sygnału do szumu bez nasycenia pikseli). Zazwyczaj kamery EMCCD są optymalne do wykrywania bardzo niskich sygnałów przy wysokim stosunku sygnału do szumu. Przy silniejszych sygnałach zwykłe kamery CCD generują mniej szumów i oferują szerszy zakres dynamiczny.
    4. Mikroskopia TIRF jest bardzo wrażliwa na niewielkie różnice w wysokości szkiełka nakrywnego, co skutkuje tym, że jednocześnie można obrazować tylko kilka komórek (Rys. 1D). W przypadku małych komórek obszar akwizycji (region zainteresowania, ROI) często można ograniczyć do podregionu zawierającego wybrany obiekt. Zmniejsza to również czas potrzebny na transfer danych z chipa na dysk twardy, co często jest etapem ograniczającym szybkość przy wysokich częstotliwościach klatek.
    5. W przypadku eksperymentów TIRF dwukolorowych należy zminimalizować przenikanie sygnałów (bleed-through) fluoroforów. Dla par RFP/GFP stosuj oddzielne filtry emisyjne, ponieważ RFP jest słabo wzbudzany światłem 488 nm (Rys. 2A). Większość filtrów nie jest ze sobą idealnie zsynchronizowana. Przesunięcie filtra można skorygować, używając kulek fluorescencyjnych zmieszanych z komórkami. Aby uzyskać porównywalną głębokość penetracji, dostosuj kąty TIRF oddzielnie dla każdej linii laserowej. Typowy przebieg pracy przedstawiono na Rys. 2B.
    6. Krytycznym parametrem wpływającym na jakość obrazu jest centrowanie lasera oraz czystość obiektywu. Aby wycentrować laser, najpierw ustaw ostrość na pozycji z używanej do obrazowania TIRF. Następnie usuń próbkę i oczyść obiektyw z całego oleju (pozostałości oleju spowodują dyfrakcję światła laserowego i powstawanie plamek w profilu wiązki). Rzutuj laser na sufit w trybie TIRF i skalibruj pozycję 0° tak, aby laser znajdował się w linii prostej z obiektywem (użyj punktu odniesienia, zawsze noś okulary ochronne do laserów i unikaj wszelkich odbić na drodze wiązki). Skup punkt laserowy do minimalnego rozmiaru. Nasz układ posiada ruchomą soczewkę umieszczoną między galwanometrami a mikroskopem, co ułatwia szybką kalibrację. Po optymalnej regulacji profil lasera powinien tworzyć dobrze zdefiniowany punkt o kształcie zbliżonym do koła. Przeprowadzaj kalibrację przed każdą sesją, aby uzyskać optymalną jakość obrazu.

3. Reprezentatywne wyniki

  1. Rozmieszczenie homologów aktyny i enzymów ściany komórkowej w Bacillus subtilis. Wykonaliśmy obrazowanie komórek wykazujących fuzje GFP homologu aktyny Mbl lub transpeptydazy PbpH za pomocą TIRF oraz zwykłej epifluorescencji. Głębokość penetracji w TIRF jest wyraźnie zredukowana i ograniczona do powierzchni przylegającej do szkiełka przedmiotowego (Ryc. 3A, B). Słabo wyrażona transpeptydaza PbpH lokalizuje się w plamkach kortykalnych, które są ledwie widoczne w epifluorescencji, ale można je wyraźnie rozpoznać w TIRF (Ryc. 3B). Zredukowaną penetrację najlepiej widać dla sygnału PbpHGFP w przegrodach, które w epifluorescencji pojawiają się jako linie, a w TIRF jako kropki (Ryc. 3B, strzałka).

  2. Domeny białkowe w błonie plazmatycznej drożdży. Przykłady wzorów przypominających sieć, tworzonych przez białka błony plazmatycznej w drożdżach, przedstawiono już na Ryc. 1C i 2. Poza poprawionym kontrastem w TIRF, który pozwala na wyraźne rozróżnienie tych sieciowych wzorów, czasami można wykryć słabe sygnały wyłącznie za pomocą mikroskopii TIRF. Jako przykład obrazowaliśmy fuzję GFP komponentu kompleksu TORC2 Bit61 z Saccharomyces cerevisiae. Białko to jest słabo wyrażone i tworzy małe plamki kortykalne zawierające tylko kilka kopii białka na plamkę9. W epifluorescencji nad silnym tłem widocznych jest tylko kilka plamek, natomiast w TIRF plamki można obrazować z bardzo dobrym stosunkiem sygnału do szumu (Ryc. 3C). Dlatego TIRF jest szczególnie odpowiedni do badania słabo fluorescencyjnych struktur i białek na powierzchni komórki.

    Wysoka rozdzielczość osiowa zapewniana przez TIRF już teraz redukuje fluorescencję tła. Dodatkowej poprawy kontrastu obrazu można dokonać poprzez różne etapy przetwarzania obrazu. Prostą standardową techniką jest lokalna wyrównanie tła, w której obraz rozmyty jest odejmowany od oryginalnego. Rozmywanie można przeprowadzać za pomocą różnych filtrów dolnoprzepustowych, w tym filtrów medianowych lub Gaussa (Ryc. 3D). Lokalna subtrakcja tła usuwa szum i wyostrza struktury o wysokiej intensywności. Często odbywa się to jednak kosztem utraty drobnych struktur i przesadnego wzmocnienia obszarów o wysokiej intensywności (Ryc. 3D, strzałka). Lepszą procedurą jest dekonwolucja 2D, którą można przeprowadzić za pomocą darmowych lub komercyjnych pakietów oprogramowania, takich jak ImageJ, Matlab lub Huygens (Scientific Volume Imaging b.v.). Obrazy TIRF zapewniają bardzo dobrą rozdzielczość osiową, a zatem niemal dwuwymiarową funkcję rozproszenia punktu (PSF). Wyznaczyliśmy tę PSF eksperymentalnie, wykonując obrazy fluorescencyjnych kulek o rozmiarze 40 nm przy tych samych ustawieniach, które zastosowano do właściwego obrazowania (obiektyw, kamera, długość fali wzbudzenia i emisji). Eksperymentalna PSF została następnie wykorzystana do dekonwolucji z klasycznym algorytmem największej wiarygodności w programie Huygens. Filmy poklatkowe GFPRas2 lub Fet3GFP i Pma1RFP (Filmy 3 i 4) demonstrują wzrost kontrastu po dekonwolucji. W obrazach dwukolorowych kluczowe jest maksymalne zwiększenie kontrastu, aby móc ilościowo określić wartości kolokalizacji (Film 4).

  3. Analiza obrotu białek w korteksie komórkowym. TIRF i FRAP oferują potężną kombinację do badania dynamiki białek kortykalnych. Jednakże, aby umożliwić efektywne wykorzystanie tych technik, wymagana jest szybka kontrola kątów i pozycji laserów. W TIRF, technice szerokiego pola, laser musi być skupiony na tylnej płaszczyźnie ogniskowej i musi zachowywać płytki kąt padania, aby uzyskać pożądane odbicie. W przeciwieństwie do tego, FRAP wymaga, aby laser był skupiony bezpośrednio na próbce i ustawiony z wysoką dokładnością przestrzenną, aby umożliwić wybielanie określonych struktur lub obszarów. Układ od Till photonics, którego użyliśmy w naszych eksperymentach, zapewnia bardzo szybką i intuicyjną kontrolę nad tymi parametrami. Dwa lustra sterowane galwanometrem służą do regulacji pozycji FRAP w osiach x,y lub do ustawienia kąta padania w TIRF. Trzecie lustro służy do przełączania między oddzielnymi ścieżkami wiązki dla oświetlenia TIRF i FRAP (wiązka lasera w ścieżce TIRF jest rozszerzana przez dodatkowe soczewki). Wszystkie ustawienia są kontrolowane przez oprogramowanie LA (live acquisition), a kalibracje mogą być szybko przeprowadzane dla każdego eksperymentu w celu osiągnięcia optymalnych warunków. Oprogramowanie to pozwala również na definiowanie pozycji wybielania podczas akwizycji obrazu, co jest niezbędne dla eksperymentów FRAP na strukturach ruchomych.
    Wykorzystując tę funkcję, mogliśmy wykluczyć proces treadmilling filamentów Mbl jako źródło obserwowanej ruchliwości plamek zawierających Mbl (Ryc. 3E). Obserwacja ta zmotywowała nas do poszukiwania alternatywnych mechanizmów ruchliwości i ostatecznie doprowadziła do zidentyfikowania całkowicie nieoczekiwanego typu ruchliwości, w którym wewnątrzkomórkowe kompleksy białkowe (w tym Mbl) są przemieszczane poprzez aktywność enzymów syntetyzujących ścianę komórkową znajdujących się na zewnątrz komórki4. W podobny sposób byliśmy w stanie zaobserwować powolne reorganizacje białek błony plazmatycznej drożdży, które rozkładają się w domeny przypominające sieć pokrywające całą powierzchnię komórki (Ryc. 3F).
    Przykłady te ilustrują, w jaki sposób dynamika i wzorce białek kortykalnych mogą być bezpośrednio oceniane poprzez połączenie technik TIRF i FRAP.

4. Reprezentatywne wyniki

Obrazy mikroskopowe analizujące cząstki brudu i lateksu, układ spektroskopowy do procedur optycznych.
Rysunek 1. Dopasowanie parametrów. A. Zanieczyszczone i oczyszczone szkiełko nakrywkowe. Sygnał tła wynikający z obecności kurzu na szkiełku nakrywkowym zakłóca potencjalny sygnał GFP/RFP; oczyszczone szkiełko nakrywkowe wykazuje mniejsze tło. B. Specjalnie wykonany sterownik ogrzewania elektrycznego pokazujący temperaturę zadaną (a), temperaturę w sondzie (b) oraz w uchwycie próbki (c). C. Białko drożdżowe Pma1GFP obrazowane przy zmniejszających się kątach padania (od lewego górnego do prawego dolnego rogu). Obrazy wykazują nagłą utratę sygnału w kącie krytycznym oraz stopniowy spadek informacji strukturalnych i stosunku sygnału do szumu. D. Nierównomierne pole widzenia. Obraz gęstej zawiesiny fluorescencyjnych kulek wykazuje, że tylko część pola widzenia znajduje się w ogniskowej. Paski skali w A, B: 2 μm, w C: 10 μm.

Obrazowanie komórek z wyrównaniem kanałów laserowych czerwonego/zielonego; schemat przedstawia dekonwolucję i detekcję komórek.
Rycina 2. Obrazowanie dwukolorowe. A. Przeciek sygnału Pil1RFP. Pil1RFP jest wzbudzany laserem 488 nm i 561 nm, a fluorescencję rejestruje filtr przepustowy pasmowy. Sygnał Pil1RFP jest słabo widoczny w kanale GFP. Pasek skali 2 μm B. Typowe kroki w celu uniknięcia przecieku sygnału w obrazowaniu dwukolorowym. Po obrazowaniu komórek z osobno zastosowanymi zestawami filtrów, są one poddawane dekonwolucji i wyrównaniu (przy użyciu kulek fluorescencyjnych) przed połączeniem w celu analizy.

Mikroskopia fluorescencyjna z użyciem TIRFM, Epi, DIC; lokalizacja białka fuzyjnego GFP; rozmycie Gaussa, mediana, dekonwolucja.
Rycina 3. Reprezentatywne wyniki. A. Porównanie rozkładu GFPMbl w B. subtilis z użyciem mikroskopii TIRF lub standardowej epifluorescencji (Epi). Kolor niebieski: granica komórki z obrazu w świetle przechodzącym. Obrazy przedstawiają średnie projekcje serii czasowej, wskazujące obszar pokryty przez ruchome fragmenty MreB monitorowane w różnych trybach obrazowania. B. Poprawiona rozdzielczość osiowa i kontrast obrazów TIRF transpeptydazy PbpHGFP w B. subtilis. Strzałki wskazują barwienie przegrody, które w epifluorescencji pojawia się jako pierścień, a w TIRF jako fragmenty. Czas naświetlania: 100 ms. C. Porównanie oświetlenia epifluorescencyjnego i TIRF dla komponentu kompleksu TOR, Bit61, w S. cerevisiae. Bit61 wykazuje bardzo słabą ekspresję9. Czas naświetlania: 250 ms. D. Porównanie różnych metod przetwarzania obrazu. Seria pokazująca surowy obraz TIRF Pma1GFP, odejmowanie obrazów z rozmyciem Gaussa lub medianowym, a także dekonwolucję z użyciem algorytmu maksymalnej wiarygodności w programie Huygens. E. TIRF-FRAP pojedynczego fragmentu GFPMbl (nad gwiazdką) przemieszczającego się przez komórkę B. subtilis. Kymograf fragmentu, który nie uległ regeneracji, oraz profil intensywności wzdłuż kymografu (linia przerywana) wykluczają mechanizm treadmilling jako źródło ruchu. F. TIRF-FRAP komórki drożdżowej wykazującej ekspresję Pma1GFP. Zwróć uwagę na dyfuzyjne zamykanie się luki w korowym wzorze barwienia. Paski skali: 2 μm. Czas w sekundach.

Film 1. Film przedstawiający komórki B. subtilis wykazujące ekspresję białka fuzyjnego RFP na zanieczyszczonej lamellce. Należy zauważyć, że sygnał RFP jest prawie nieodróżnialny od szumu tła. Czas cyklu 100 ms. Kliknij tutaj, aby obejrzeć film.

Film 2. Film przedstawiający Pma1GFP pod różnymi kątami padania. Kąt jest zmieniany od kąta podkrytycznego do krytycznego, aż do utraty sygnału. Należy zauważyć, że przy kącie podkrytycznym widoczny jest sygnał wewnętrzny, co powoduje szum na obrazach; dopiero przy kącie krytycznym widoczne jest wyłącznie białko w błonie plazmatycznej (PM). Czas cyklu 200 ms. Pasek skali: 2 μm. Kliknij tutaj, aby obejrzeć film.

Film 3. Film przedstawiający drożdże GFPRas2, ukazujący naprzemienne obrazy RAW i odkonwolucjonowane obrazy TIRF. GFPRas2 jest białkiem szybko przemieszczającym się (T1/2 wynoszący 2 s, dane niepublikowane), dlatego krótkie czasy akwizycji są kluczowe dla rozdzielenia zachowań dynamicznych. Czas cyklu 150 ms. Pasek skali: 2 μm. Kliknij tutaj, aby obejrzeć film.

Film 4. Film dwukolorowy białek drożdżowych Fet3GFP i Pma1RFP. Pierwsze 10 klatek przedstawia obrazy surowe (RAW), a ostatnie klatki są odkonwolwowane. Film ten pokazuje znaczenie przetwarzania obrazu dla analizy kolokalizacji. Rozmyte obrazy surowe zostają wyostrzone, co umożliwia przeprowadzenie analizy. Czas cyklu 5 s. Pasek skali: 2 μm. Kliknij tutaj, aby obejrzeć film.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Mikroskopia TIRF jest preferowaną techniką obrazowania białek peryferyjnych. Mała głębokość penetracji pola ewanescentnego minimalizuje ilość światła poza ogniskiem, co prowadzi do bardzo dobrego stosunku sygnału do szumu i umożliwia akwizycję danych z wysoką częstotliwością klatek lub obrazowanie białek o bardzo słabej ekspresji. Połączenie wysokiego kontrastu i wysokiej częstotliwości klatek sprawia, że mikroskopia TIRF jest idealnym narzędziem do obrazowania dynamiki czasowo-przestrzennej białek zlokalizowanych w korz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie zadeklarowano konfliktów interesów.

Podziękowania

Niniejsza praca została sfinansowana przez Towarzystwo Maxa Plancka.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Inkubator orbitalnyUniEquipUNITWIST 3-D ROCKER SHAKER
Mikroskop TIRFUkład niestandardowy
Szklany pojemnikVitlab340-232880353
Ceramiczny statyw do barwieniaThomas Scientific8542E40
Konkanawalina ASigma-AldrichL7647
Kryszalki nr 1 (18 x 18 mm)Menzel-GlaserBB018018A1
Przedmiotu mikroskopoweMenzel-GlaserAA00000102E
Olejek imersyjnyCarl Zeiss, Inc.Immersol 518F
AgarozaInvitrogen16500-500
FluoSpheresInvitrogenF8795

Bibliografia

  1. Axelrod, D., Thompson, N. L., Burghardt, T. P. Total internal inflection fluorescent microscopy. J. Microsc. 129, 19-28 (1983).
  2. Axelrod, D., Omann, G. M. Combinatorial microscopy. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 944-952 (2006).
  3. Axelrod, D. Selective imaging of surface fluorescence with very high aperture microscope objectives. J. Biomed. Opt. 6, 6-13 (2001).
  4. Dominguez-Escobar, J. Processive movement of MreB-associated cell wall biosynthetic complexes in bacteria. Science. 333, 225-228 (2011).
  5. Sparkes, I. A. Bleach it, switch it, bounce it, pull it: using lasers to reveal plant cell dynamics. J. Exp. Bot. 62, 1-7 (2011).
  6. Uchida, M. Total synthesis and absolute configuration of avenolide, extracellular factor in Streptomyces avermitilis. J. Antibiot. (Tokyo). , (2011).
  7. Yu, H., Wedlich-Soldner, R. Cortical actin dynamics: Generating randomness by formin(g) and moving. Bioarchitecture. 1, 165-168 (2011).
  8. Yu, J. H., Crevenna, A. H., Bettenbuhl, M., Freisinger, T., Wedlich-Soldner, R. Cortical actin dynamics driven by formins and myosin V. J. Cell. Sci. 124, 1533-1541 (2011).
  9. Berchtold, D., Walther, T. C. TORC2 plasma membrane localization is essential for cell viability and restricted to a distinct domain. Mol. Biol. Cell. 20, 1565-1575 (2009).
  10. Vizcay-Barrena, G., Webb, S. E., Martin-Fernandez, M. L., Wilson, Z. A. Subcellular and single-molecule imaging of plant fluorescent proteins using total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM). J. Exp. Bot. 62, 5419-5428 (2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Mikroskopia TIRFobrazowanie mikroorganizm wdynamika kory kom rkowejlokalizacja bia ekfluorescencyjne odzyskiwanie po fotoblakni ciutechniki rekonstrukcji obrazuSaccharomyces cerevisiaeBacillus subtilisustawianie lasera

Powiązane artykuły