In vitro elektroporacja dolnej wargi rombowej zarodków myszy w połowie okresu gestacji

Podsumowanie

Niniejsza praca opisuje opracowanie techniki elektroporacji in vitro, która umożliwia manipulację ekspresją genów w dolnej części wargi rombowej embrionów w połowie okresu gestacji.

Streszczenie

Warga rombowa (rhombic lip) to zarodkowy neuroepithelium znajdujący się w rombencephalonie, na styku rurki neuralnej i płyty dachowej czwartej komory (przegląd w ¹). Wargę rombową można podzielić na górną wargę rombową (URL), która obejmuje rombomer 1 (r1) i generuje neurony móżdżku, oraz dolną wargę rombową (LRL), z której wywodzą się różnorodne linie neuronalne pnia mózgu ^2-4. Pochodne LRL obejmują neurony słuchowe jąder ślimakowych oraz neurony jąder przedmóżdżkowych zaangażowane w regulację równowagi i kontrolę motoryczną ^5-8. Neurogeneza z LRL zachodzi w szerokim oknie czasowym obejmującym dni embrionalne (E) 9,5-16,5^{5, 9}. Różne linie neuronalne wyłaniają się z LRL jako komórki pomitotyczne (lub powstają) w odrębnych dniach rozwojowych w trakcie tego okna neurogenicznego.

Elektroporacja konstruktów ekspresji genów może być wykorzystana do manipulowania ekspresją genów w progenitorach LRL i potencjalnie zmieniać los neuronów powstających w tym obszarze ^10-12. Zmiana ekspresji genów progenitorów LRL u myszy poprzez elektroporację in utero okazała się bardzo skuteczna w manipulowaniu liniami komórkowymi powstającymi w 12,5 dniu embrionalnym (E12.5) lub później ^{10, 12-14}. Elektroporacje in utero przeprowadzone przed E12.5 były nieskuteczne głównie ze względu na śmiertelność związaną z nakłuciem dachu czwartej komory, co jest niezbędnym krokiem w dostarczaniu egzogennego DNA elektroporowanego do LRL. Jednak wiele linii pochodnych z LRL powstaje w LRL wcześniej niż w E12.5 ⁹. Te wczesne linie obejmują neurony tworzące jądra siatkowe boczne, klinowe zewnętrzne i oliwne dolne układu precerebellarnego, których funkcją jest łączenie sygnałów z rdzenia kręgowego i kory z móżdżkiem ⁵. Aby manipulować ekspresją w LRL embrionów młodszych niż E12.5, opracowaliśmy system in vitro, w którym embriony są poddawane hodowli po elektroporacji.

Niniejsze badanie przedstawia wydajną i skuteczną metodę manipulacji ekspresją genów progenitorów LRL na etapie E11.5. Embriony poddane elektroporacji zielonym białkiem fluorescencyjnym (GFP) sterowanym przez szeroko aktywny promotor CAG w sposób powtarzalny wykazywały ekspresję GFP po 24 godzinach hodowli. Krytycznym aspektem tego badania jest fakt, że ekspresja genów ulega zmianie wyłącznie z powodu ekspresji genu egzogennego, a nie w wyniku efektów wtórnych wynikających z technik elektroporacji i hodowli. Stwierdzono, że endogenne wzorce ekspresji genów pozostają niezmienione w embrionach poddanych elektroporacji i hodowli. Metodę tę można wykorzystać do zmiany losów komórek wywodzących się z LRL embrionów młodszych niż E12.5 poprzez wprowadzenie plazmidów do nadekspresji lub wyciszenia (poprzez RNAi) różnych pro-neuronalnych czynników transkrypcyjnych.

Protokół

1. Przygotowania przed elektroporacją

1. Należy namnożyć DNA do elektroporacji za pomocą metody maxi prep (Prime-It lub Qiagen). Stężenie DNA powinno wynosić co najmniej 1 mg/mL, aby zapewnić efektywny pobór.
2. Do probówki do mikrocentryfugi należy przenieść 495 μL DNA i wymieszać z 5 μl 0,01% Fast Green w 1 X PBS (buforze fosforanowym) .

2. Pobieranie zarodków

1. Przeprowadź kontrolowane kryzówki myszy CD-1 (Harlan). Sprawdź obecność czopów pochwowych i przyjmij datę zaobserwowania czopa jako dzień embrionalny (E) 0,5. Zarodki zostaną pobrane 11 dni po zauważeniu czopa (E11,5).
2. Umieść wysterylizowane narzędzia w 70% etanolu. Przed użyciem naświetlaj komorę z laminarnym przepływem powietrza światłem UV przez co najmniej jedną godzinę. Spryskaj komorę, tackę sekcyjną i mikroskop sekcyjny 70% etanolem. Podgrzej 1 X PBS do 37 °C.
3. W dniu E11,5 przeprowadź eutanazję samicy zgodnie z warunkami zatwierdzonymi przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Korzystania ze Zwierząt (ICCUA). Umieść tackę sekcyjną w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Spryskaj brzuch samicy 70% etanolem.
4. Otwórz jamę otrzewną i przypnij ściany do tacki sekcyjnej. Wyciągnij rogi macicy tak, aby spoczywały w obrębie jamy otrzewnej.
5. Ostrożnie rozetnij ścianę rogu macicy. Używając łyżeczki 20 mm (Fine Scientific Tools), delikatnie oddziel zarodek w pęcherzyku żółtkowym od łożyska. Umieść zarodki w 100 mm naczyniu do hodowli tkankowej wypełnionym wcześniej 10 mL sterylnego 1 X PBS, podgrzanego zgodnie z punktem 2.2.
6. Powtórz czynność dla wszystkich obecnych zarodków.

3. Elektroporacja zarodków w stadium E11.5 (Rycina 1)

1. Za pomocą łyżeczki 20 mm przenieś pierwszy zarodek do nowej szalki 100 mm wypełnionej wcześniej 10 mL sterylnego 1XPBS, podgrzanego do 37 °C.
2. Użyj pęsety 11 cm z końcówką 0,05 x 0,02 mm (Fine Scientific Tools), aby ostrożnie usunąć i odrzucić worek żółtkowy.
3. Ustaw zarodek tak, aby jego strona grzbietowa była skierowana do góry, zgodnie z rysunkiem w Rysunku 1A. Użyj elektrod płaskich 7 mm (Harvard Apparatus), aby delikatnie przytrzymać zarodek. Elektrody powinny zostać umieszczone po obu stronach rurki neuralnej na poziomie czwartej komory romboidalnej tylnego mózgu. Komora jest widoczna gołym okiem, jednak użycie mikroskopu operacyjnego może ułatwić precyzyjne rozmieszczenie elektrod. Pozycjonowanie elektrod ma kluczowe znaczenie dla określenia regionu, który otrzyma elektroporowany DNA. Jeśli pożądanym celem jest dolna warga romboidalna (LRL) grzbietowej części tylnego mózgu zarodka, elektrody muszą zostać umieszczone tak, aby bezpośrednio flankowały najszerszą część otworu czwartej komory.
4. Użyj strzykawki 1 cc, aby pobrać DNA plazmidowe zmieszane z 0,01% Fast Green. 500 μL mieszaniny powinno być wystarczające do elektroporacji co najmniej 8-10 zarodków (patrz 3.5).
5. Delikatnie przebij płytkę dachową nad czwartą komorą za pomocą igły tuberkulinowej 25G 5/8 przymocowanej do strzykawki 1 cc i wstrzyknij mieszaninę DNA z barwnikiem do komory. Prawidłowe wstrzyknięcia charakteryzują się wypełnieniem całego układu komorowego przez mieszaninę DNA z barwnikiem (Rysunek 1C). Ilość wstrzykiwanej mieszaniny DNA z barwnikiem wynosi zazwyczaj mniej niż 50 μL. Dokładne ilości różnią się między zarodkami, ponieważ część mieszaniny ma tendencję do wyciekania z komory do PBS otaczającego zarodek. Alternatywną metodą dostarczenia mieszaniny DNA z barwnikiem jest dostęp do układu komorowego poprzez przebicie welum nad śródmózgiem. Podobnie jak wcześniej, prawidłowe wstrzyknięcia charakteryzują się wypełnieniem całego układu komorowego przez mieszaninę DNA z barwnikiem.
6. Podaj pięć impulsów prostokątnych za pomocą generatora impulsów elektrycznych (BTX) i elektrod płaskich 7 mm. Każdy impuls ma napięcie 50 V i trwa 5 ms, z przerwą 500 ms między impulsami. Tkanka znajdująca się najbliżej elektrody naładowanej dodatnio pobierze plazmid.

4. Hodowla embrionów

1. W komorze z laminarnym przepływem powietrza należy napełnić zewnętrzne dołki płytki hodowlanej 12-dołkowej 2 mL pożywki DMEM/F12 uzupełnionej o 10% płodowej surowicy bydlęcej, 5% surowicy konnej, 1% glutaminy oraz 1% penicyliny/streptomycyny, uprzednio podgrzanej do 37 °C. Warunki hodowli zostały dostosowane na podstawie pracy de Diego i współpracowników.¹⁵
2. W komorze z laminarnym przepływem powietrza należy ucisnąć zarodki pęsetą w poprzek (poniżej serca) i usunąć tylną część zarodka. Przednią część należy umieścić w jednym z napełnionych dołków płytki 12-dołkowej.
3. Czynność należy powtórzyć dla wszystkich zarodków. Należy napełniać wyłącznie zewnętrzne dołki płytki 12-dołkowej, aby uniknąć zanieczyszczenia kultur.
4. Zarodki należy hodować w inkubatorze w temperaturze 37 °C przy 5% CO₂. Ekspresja elektroporowanego plazmidu powinna być widoczna w ciągu 24 hr.
5. W przypadku potrzeby dłuższego czasu hodowli należy napełnić zewnętrzne dołki nowej płytki 12-dołkowej 2 mL pożywki opisanej w punkcie 4.1. Za pomocą sterylnej łyżeczki należy przenieść zarodki do dołka w nowej płytce. Następnie należy umieścić je ponownie w inkubatorze w 37 °C. Możliwa jest hodowla do 48 hr.
6. Po osiągnięciu pożądanego czasu hodowli należy utrwalić zarodki do analizy (patrz poniżej).

5. Przygotowanie embrionów do analizy

1. Płukać zarodki w 1 X PBS w temperaturze 4 °C przez pięć minut. Powtórzyć czynność.
2. Utrwalić zarodki do analizy w 2% paraformaldehydzie (PFA) w 1XPBS przez 2 godziny w temperaturze 4 °C.
3. Płukać zarodki w 1 X PBS w temperaturze 4 °C przez pięć minut. Powtórzyć czynność.
4. Równoważyć zarodki w 30% sacharozie w 1 X PBS przez noc w temperaturze 4 °C.
5. Zatopić zarodki w związku Optimal Cutting Temperature (O.C.T) przy użyciu kąpieli z suchego lodu i etanolu. Zarodki można przechowywać w temperaturze -20 °C.
6. Wyciąć przekroje zarodków w kriotomie (Leica) na plastry o grubości 30 μm i zamontować na szkiełkach (VWR, Superfrost Plus). Przechowywać w temperaturze -20 °C.

6. Analiza immunohistochemiczna

1. Immunohistochemię przeprowadzono zgodnie z opisem w ¹⁶. Rozcieńczenia przeciwciał pierwszorzędowych zastosowane w tej badaniu obejmowały: królicze α-GFP (Invitrogen) 1:2500; mysie α-Mash1 (BD Biosciences) 1:100; królicze α-Ngn1 (Jane Johnson) 1:5000; królicze α-Ptf1a (Jane Johnson) 1:2500; królicze -Math1 (Jane Johnson) 1:100. Inkubować preparaty na płasko, stroną z próbką do góry, w kuwecie do barwienia w temperaturze 4 °C przez noc.
2. Preparaty analizowano przy użyciu mikroskopu złożonego (Olympus BX51).

7. Reprezentatywne wyniki

Schemat przedstawiony na Ryc. 1A obrazuje eksperyment z elektroporacji. Ryc. 1B przedstawia widok strzałkowy zarodka E11.5 przed manipulacją. Ten sam zarodek po wstrzyknięciu plazmidu zawierającego CAG::GFP w 0,01% Fast Green pokazano na Ryc. 1C, a reprezentatywny, nieutrwalony zarodek wykazujący jednostronną ekspresję GFP w grzbnej części tylnego mózgu 24 h po hodowli przedstawiono na Ryc. 1D. Zakres obszaru LRL, który został pomyślnie poddany elektroporacji, jest zmienny i wydaje się być wysoce zależny od rozmieszczenia elektrod. W naszych badaniach stwierdzono, że 52 z 65 (80%) elektroporowanych zarodków pomyślnie wyekspresowały GFP. Tkankę uznano za pomyślnie poddaną elektroporacji, jeśli wykazano obecność GFP w zlokalizowanych obszarach na kilku przekrojach po utrwaleniu i analizie immunohistochemicznej (patrz poniżej). Zarodki, które nie spełniły tego kryterium, zaklasyfikowano jako nieudane próby elektroporacji.

Dalszą ocenę wydajności elektroporacji można przeprowadzić, wykonując immunohistochemię przeciwko GFP na przekrojach poprzecznych elektroporowanych embrionów na poziomie czwartej komory. Rycina 2 przedstawia reprezentatywne seryjne przekroje embrionu wykazującego jednostronną ekspresję GFP. Rycina 2A przedstawia zidealizowany schemat ilustrujący, że lewa strona embrionu była skierowana w stronę elektrody dodatniej. Przekroje poprzeczne (na poziomach przedstawionych na środkowym rysunku na Rycynie 2A) ujawniają zlokalizowaną ekspresję GFP wyłącznie po lewej stronie tkanki tylnego mózgu (Ryciny 2C i 2D). Elektroporowany obszar LRL nie obejmował całej osi przednio-tylnej rurki nerwowej, ponieważ badanie przekrojów położonych o 300 μm lub więcej rostralnie w stosunku do przekroju pokazanego na Rycynie 2C nie wykazuje ekspresji GFP (Rycina 2B).

Użyteczność tego testu w manipulacji ekspresją genów zależy od stabilności domen ekspresji białek endogennych. Wykazano, że LRL posiada unikalne domeny progenitorowe, które charakteryzują się różnicową ekspresją proneuralnych czynników transkrypcyjnych (omówiono w ¹). Do analizy wybrano podzbiór tych czynników (Mash1, Math1, Ngn1 i Ptf1a) ze względu na ich proponowane i/lub opisane role w specyfikacji precerebellarnych podtypów neuronalnych w LRL, co stanowi przedmiot przyszłych badań ^16-18. Wszystkie cztery białka wykazują wysoce charakterystyczne domeny ekspresji w tylnej części tylnego mózgu w dniu E11.5 ^16-18. Zaobserwowano, że zarodki poddane hodowli nie zwiększały swojej wielkości, a także nie inicjowały produkcji nabłonka splotu naczyniówkowego ani ewaginacji LRL i płyty dachowej, czyli zdarzeń morfologicznych występujących między E11.5 a E12.5 ⁵. Na podstawie tych obserwacji ustalono, że prawidłowy rozwój w tych zarodkach został zatrzymany lub znacząco opóźniony, a porównywalną grupą kontrolną dla zarodków hodowlanych powinny być zarodki niepoddane hodowli w dniu E11.5.

Aby upewnić się, że hodowla i elektroporacja nie wpływają na poziomy białek endogennych, przeanalizowano za pomocą immunohistochemii (IHC) cztery różne białka w 34 różnych embrionach, które poddano elektroporacji, a następnie hodowano przez co najmniej 24 hr. Tabela I przedstawia liczbę analizowanych embrionów dla każdego markera oraz procent analizowanych embrionów, które zachowały prawidłowe poziomy białek. Rysunek 3 przedstawia reprezentatywne dane IHC dla dwóch z analizowanych białek: Mash1 (Rysunki 3A oraz 3B) i Math1 (Rysunki 3C i 3D). Zaobserwowano, że większość embrionów zachowała prawidłowe poziomy ekspresji po elektroporacji i hodowli (Rysunki 3B i 3D) w porównaniu do embrionów kontrolnych w stadium E11.5 (Rysunki 3A i 3C). Co istotne, charakterystyczne domeny ekspresji tych białek nie zostały zaburzone.

Rysunek 1. Elektroporacja zarodków w dniu E11,5. (A) Schemat eksperymentu z elektroporacją. Zarodek w dniu E11,5 zostaje wyizolowany, a plazmid ekspresyjny w 0,01% Fast Green jest wstrzykiwany do czwartej komory mózgu. Następnie zarodek zostaje umieszczony pomiędzy elektrodami i poddany impulsowi o napięciu 50 V przed przeniesieniem do hodowli. (B) Widok strzałkowy zarodka w dniu E11,5 przed wstrzyknięciem. (C) Ten sam zarodek E11,5 po wstrzyknięciu plazmidu w 0,01% Fast Green. (D) Jednostronna ekspresja GFP w rombence obserwowana w zarodku E11,5 po 24 h hodowli. mb – śródmózowie; 4v – czwarta komora mózgu.

Rysunek 2. Ekspresja GFP w tkance poddanej elektroporacji. (A) Schemat po lewej przedstawia rozmieszczenie elektrod wokół zarodka w stadium E11.5. Środkowy schemat przedstawia pobranie i ekspresję plazmidu kodującego GFP po lewej stronie zarodka. Schemat po prawej to schematyczny, idealny przekrój poprzeczny wykonany przez zarodek na poziomach zaznaczonych czarnymi liniami na środkowym schemacie. (B−D) Immunohistochemia GFP na przekrojach poprzecznych przez poddanego elektroporacji zarodka E11.5 po 24 h hodowli. Strzałki wskazują płytkę dachową (rp), która zatrzymuje przeciwciało wtórne. Obrazy wykonano przy powiększeniu 10X. Względne poziomy przedstawionych przekrojów zaznaczono poziomymi liniami na środkowym schemacie w (A). mb- śródmózgowie; 4v- czwarta komora; rp- płytka dachowa.

Rysunek 3. Ekspresja endogennych białek w dolnej wargi rombowej. Immunohistochemia dla Mash1 (A i B) lub Math1 (C i D) porównująca przekroje poprzeczne zarodków w stadium E11.5, które nie były hodowane (A, C), z zarodkami poddanymi elektroporacji CAG::GFP i hodowanymi przez 24 h (B i D). Zdjęcia wykonane przy 10-krotnym powiększeniu.

Analizowany pronuralny czynnik transkrypcyjny	Liczba analizowanych zarodków	Procent zachowania normalnych wzorców ekspresji
Math1	15	86.7%
Mash1	12	83.3%
Ngn1	7	71.4%
Ptf1a	6	100%

Tabela I. Procent zarodków poddanych elektroporacji i hodowli, które zachowały prawidłowe domeny proneuralnych czynników transkrypcyjnych w LRL.

Dyskusja

Technika elektroporacji in vitro przedstawiona w niniejszym badaniu jest nową metodologią, która może być efektywnie wykorzystana do manipulacji ekspresją genów w embrionach w wieku poniżej 12 dni gestacji. Umieszczenie embrionów w hodowli umożliwia ekspresję wprowadzonego genu i zapobiega letalności obserwowanej w przypadku pozostawienia poddanych elektroporacji embrionów in vivo. Technika ta pozwala na manipulację ekspresją genów w progenitorach embrionalnych, które wcześniej były niedostępne dla bada...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Kriotostat	Leica Microsystems	CM-1850
Biologia końcówka pęsety DUMONT traktowanej metodą Dumoxel	Fine Science Tools	11252-30
perforowana łyżeczka MORIA 20 mm	Fine Science Tools	10370-17
Generator elektroporacji prostokątnej ECM 830	BTX (VWR)	47745-928
Elektrody Tweezertrodes* 7 mm firmy Harvard Apparatus	BTX (Fisher)	BTX450165
Fisher Isotemp CO22 Inkubator	Fisher Scientific	1325525
NAPCO CO2 Regulator gazu	Fisher Scientific	15497020
Płytki do hodowli tkankowej z 12 dołkami	BD Falcon (Fisher)	877229
HyClone Pożywka płynna DMEM/F-12 (1:1); z L-glutaminą i HEPES; 500 ml	Thermo Scientific (Fisher)	SH3002301
Surowica końska od dawców HyClone*	Thermo Scientific (Fisher)	SH3007402
płódkowa surowica bydlęca, kwalifikowana, inaktywowana termicznie	Invitrogen	16140-063
cellgro* 10 000 IU penicyliny, 10 000μg/ml streptomycyny	Mediatech (Fisher)	MT-30-002-CI
HyClone* L-glutamina; 200 mM w 0,85% NaCl	Thermo Scientific (Fisher)	SH3003401
Fast-Green	Fisher Scientific	AC41053-0250	0.01%