Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Kierunkowe różnicowanie indukowanych pluripotentnych komórek macierzystych w kierunku limfocytów T

18.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/3986

⸱

14 maja 2012

 ,  ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology, Pennsylvania State University College of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Generowanie limfocytów T z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPS) stanowi alternatywne podejście do wykorzystania embrionalnych komórek macierzystych w immunoterapii opartej na limfocytach T. Metoda ta wykazuje, że dzięki zastosowaniu systemu indukcji in vitro lub in vivo, komórki iPS są zdolne do różnicowania się zarówno w konwencjonalne, jak i antygenowo swoiste limfocyty T.

Streszczenie

Adoptywne przeniesienie komórek (ACT) antygenowo swoistych cytotoksycznych limfocytów T (CTL) CD8+ stanowi obiecującą metodę leczenia wielu rodzajów nowotworów złośliwych 1. CTL mogą rozpoznawać komórki nowotworowe poprzez oddziaływanie antygenów guza z receptorami komórek T (TCR), a następnie uwalniać cytotoksyny oraz cytokiny w celu zniszczenia komórek nowotworowych. Wiadomo, że słabo zróżnicowane CTL o fenotypie podobnym do komórek pamięci centralnej (określane jako wysoce reaktywne) stanowią optymalną populację dla immunoterapii opartej na ACT, ponieważ posiadają one wysoki potencjał proliferacyjny, są mniej podatne na apoptozę niż komórki bardziej zróżnicowane i wykazują większą zdolność do odpowiedzi na cytokiny homeostatyczne 2-7. Jednak ze względu na trudności w uzyskaniu od pacjentów dużej liczby takich CTL, istnieje pilna potrzeba znalezienia nowego podejścia do generowania wysoce reaktywnych, Ag-swoistych CTL dla skutecznych terapii opartych na ACT.

Transdukcja TCR samoodnawiających się komórek macierzystych w celu rekonstrukcji immunologicznej wykazuje potencjał terapeutyczny w leczeniu chorób 8-10. Jednakże podejście polegające na pozyskiwaniu embrionalnych komórek macierzystych (ESCs) od pacjentów nie jest wykonalne. Choć wykorzystanie hematopoetycznych komórek macierzystych (HSCs) do celów terapeutycznych znajduje szerokie zastosowanie w klinice 11-13, HSCs charakteryzują się ograniczoną zdolnością do różnicowania i proliferacji, a ich namnażanie w hodowlach komórkowych in vitro jest utrudnione 14-16. Niedawno opracowana technologia komórek iPS oraz rozwój systemów in vitro do dostarczania genów umożliwiają generowanie komórek iPS od pacjentów bez konieczności stosowania metod chirurgicznych. Ponadto, podobnie jak ESCs, komórki iPS posiadają nieograniczoną zdolność do proliferacji in vitro oraz wykazują zdolność do różnicowania w komórki krwiotwórcze. W związku z tym komórki iPS mają większy potencjał do wykorzystania w immunoterapii opartej na ACT w porównaniu do ESCs lub HSCs.

W niniejszej pracy przedstawiamy metody generowania limfocytów T z komórek iPS in vitro oraz programowania in vivo swoistych dla antygenu CTL z komórek iPS w celu promowania immunologicznego nadzoru nad nowotworami. Stymulacja in vitro ligandem Notch indukuje różnicowanie komórek iPS w komórki T, a transdukcja genu TCR skutkuje różnicowaniem się komórek iPS w swoiste dla antygenu komórki T in vivo, co zapobiega wzrostowi guza. W ten sposób demonstrujemy swoiste dla antygenu różnicowanie komórek T z komórek iPS. Nasze badania zapewniają potencjalnie bardziej wydajne podejście do generowania swoistych dla antygenu CTL dla terapii opartych na ACT i ułatwiają opracowanie strategii terapeutycznych w leczeniu chorób.

Protokół

1. Hodowla komórek

  1. Przygotowanie napromieniowanych komórek zasilających SNL76/7 (irSNL76/7) do hodowli.
    Komórki SNL76/7 są zazwyczaj hodowane w pożywce Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) z dodatkiem 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS).
    1. Naczynie hodowlane lub kolba zostaną pokryte 0,1% roztworem żelatyny w inkubatorze o temperaturze 37 °C przez 30 minut przed wybudzeniem komórek SNL76/7 z ciekłego azotu.
    2. Po osiągnięciu konfluencji komórki SNL76/7 zostaną odklejone za pomocą trypsyny, odwirowane przy 400 g przez 5 min i resuspenderowane w świeżej pożywce.
    3. Resuspenderowane komórki SNL76/7 zostaną napromieniowane w irradiatorze 60Co dawką 5000 Rads.
      Alternatywnie komórki SNL76/7 można zastąpić embrionalnymi fibroblastami mysimi (MEF), a napromieniowanie zastąpić inaktywacją mitomycyną.
    4. Po napromieniowaniu komórki zostaną odwirowane przy 400 g przez 5 min, resuspenderowane w buforze do mrożenia składającym się z FBS i 10% dimetylosulfoksydu (DMSO), podzielone na alykwooty do krioprobówek i przechowywane w ciekłym azocie do przyszłego użycia.
  2. Przygotowanie komórek OP9-DL1 do dyferencjacji in vitro.
    Komórki OP9-DL1 są zazwyczaj hodowane w pożywce α-minimum essential medium (α-MEM) z dodatkiem 20% FBS. Po osiągnięciu konfluencji komórki zostaną przesiane w rozcieńczeniu 1:5.
  3. Przygotowanie komórek grasiczaka E.G7.
    Komórki grasiczaka E.G7 są zazwyczaj hodowane w pożywce Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI)-1640 z dodatkiem 10% FBS. Po osiągnięciu konfluencji komórki zostaną przesiane w rozcieńczeniu 1:10.
  4. Ogólna hodowla i utrzymanie komórek iPS oraz komórek iPS z transdukcją TCR.
    1. Naczynie hodowlane zostanie pokryte 0,1% roztworem żelatyny w temperaturze 37 °C przez 30 minut przed wysianiem komórek zasilających irSNL76/7 na jeden dzień przed wybudzeniem lub przesianiem komórek iPS.
    2. W przypadku przesiewania komórek iPS, zostaną one odklejone trypsyną, odwirowane przy 400 g przez 5 min i resuspenderowane w pożywce DMEM z 15% FBS.
    3. Trypsynizowane komórki iPS będą inkubowane w nowym naczyniu hodowlanym przez 30 minut w inkubatorze o temperaturze 37 °C przed wysianiem na świeże, powlekane naczynie z komórkami zasilającymi irSNL76/7, aby wyeliminować komórki zróżnicowane i pozostałości komórek zasilających.
    4. Po inkubacji 4×106 komórek zostanie wysianych do naczynia hodowlanego o średnicy 100 mm.

2. Programowanie in vitro

  1. System kokultury in vitro.
    1. W dniu 0. zostanie wysianych 5x104 komórek iPS na szalkę hodowlaną o średnicy 100mm zawierającą konfluentną monowarstwę komórek OP9-DL1 w pożywce α-MEM z 20% FBS.
    2. W dniu 3. pożywka hodowlana zostanie wymieniona na świeżą.
      1. W dniu 5. komórki zostaną odklejone trypsyną i odwirowane przy 400 g przez 5 min, a następnie inkubowane na świeżej szalce hodowlanej o średnicy 100mm przez 30 minut w inkubatorze w temperaturze 37 °C.
      2. Komórki pływające zostaną zebrane i przeliczone, a 5x105 komórek zostanie przeniesionych na świeżą szalkę hodowlaną zawierającą konfluentną monowarstwę komórek OP9-DL1 w pożywce α-MEM z 20% FBS. Do hodowli zostanie dodana cytokina mFlt-3L (stężenie końcowe: 5 ng/mL).
      1. W dniu 8. słabo przylegające komórki zostaną delikatnie pobrane pipetą.
      2. Warstwę odżywczą OP9-DL1 należy przemyć 10 mL PBS jeszcze raz, aby uzyskać maksymalny odzysk częściowo zróżnicowanych komórek iPS.
      3. Po zbiorze komórek z kokultury, zostaną one odwirowane przy 400 g przez 5 min i resuspendowane w pożywce α-MEM z 20% FBS uzupełnionej o mFlt-3L (5 ng/mL) i mIL-7 (1 ng/mL).
      4. Komórki zostaną przeniesione do płytki hodowlanej z 6 dołkami pokrytej konfluentnymi komórkami OP9-DL1. Zazwyczaj komórki iPS odzyskane z jednej szalki hodowlanej 100 mm są przenoszone do jednego dołka płytki 6-dołkowej.
      1. Od 10. dnia pożywka hodowlana będzie wymieniana co drugi dzień (pożywka α-MEM z 20% FBS uzupełniona o mFlt-3L (5 ng/mL) i mIL-7 (1 ng/mL)).
      2. Płytki hodowlane pokryte komórkami odżywczymi OP9-DL1 będą wymieniane co 4-6 dni, w zależności od wzrostu komórek odżywczych.
  2. Dojrzewanie częściowo zróżnicowanych komórek iPS in vivo.
    1. W 22. dniu kokultury komórki iPS zostaną odklejone trypsyną, odwirowane przy 400 g przez 5 min i inkubowane na świeżej szalce hodowlanej w 37 °C przez 30 minut.
    2. Komórki pływające zostaną zebrane, przepuszczone przez nylonowe sito 70 μm w celu wyeliminowania skupisk komórkowych, które mogłyby spowodować zator zatorowość płucną u myszy, i przemyte trzykrotnie w zimnym PBS.
    3. Komórki zostaną resuspendowane w PBS do stężenia 1,5x107 komórek/mL.
    4. Komórki będą przechowywane na lodzie przed wstrzyknięciem.
    5. Przed wstrzyknięciem i.v. do żyły ogonowej myszy zostaną umieszczone pod lampą podczerwien owną w celu rozszerzenia żyły ogonowej.
    6. Po rozszerzeniu żyły, 200 μl zawiesiny komórkowej lub 3x106 komórek zostanie przeniesionych adoptywnie do 4-tygodniowej myszy B6.129S7-Rag1tm1Mom/J przez żyłę ogonową. Przez trzy tygodnie zapewnione zostanie dojrzewanie częściowo zróżnicowanych komórek iPS in vivo.
  3. Ocena.
    1. Zmiany morfologiczne zróżnicowanych komórek i wskaźniki odzysku komórek. Rysunek 1.
      1. W różnych dniach kokultury z komórkami OP9-DL1 zostaną wykonane zdjęcia żywych komórek pod zwykłym mikroskopem.
      2. Wskaźniki odzysku komórek zostaną obliczone na podstawie liczby komórek zebranych z hodowli.
    2. Analiza cytometryczna zmian markerów powierzchniowych. Rysunek 2a.
      1. W różnych dniach kokultury komórki zostaną usunięte z hodowli poprzez trypsynizację i przemyte zimnym PBS przed przystąpieniem do barwienia powierzchni komórek.
      2. Przed barwieniem różnymi przeciwciałami sprzężonymi z fluorochromami komórki zostaną zablokowane za pomocą blokera Fc 24G2 w 4 °C przez 20 minut.
      3. Po 20-minutowym barwieniu w 4 °C komórki zostaną przemyte trzykrotnie w zimnym PBS przed analizą cytometryczną.
    3. Aktywacja komórek iPS zróżnicowanych in vitro. Rysunek 2b.
      1. Na dzień przed testem aktywacyjnym należy pokryć płytkę 24-dołkową przeciwciałami anty-CD3 (stężenie końcowe: 4 μg/mL, w PBS) w 4 °C przez noc.
      2. W 22. dniu kokultury komórki T pochodzące z komórek iPS zostaną zebrane z hodowli i przemyte zimnym PBS przed stymulacją przeciwciałami anty-CD3 pokrywającymi płytkę oraz rozpuszczalnymi przeciwciałami anty-CD28 (stężenie końcowe: 4 μg/mL).
      3. Inkubacja będzie prowadzona w inkubatorze w 37 °C, 5% CO2 przez 40 godzin, a następnie do hodowli zostanie dodany Befeldin A na kolejne 4 godziny.
      4. Po zakończeniu kokultury komórki zostaną zebrane, przemyte i zablokowane blokerem Fc zgodnie z powyższym opisem. Zablokowane komórki zostaną zabarwione na markery powierzchniowe, takie jak CD8 i łańcuch Vβ TCR, przy użyciu przeciwciał sprzężonych z fluorochromami.
      5. Po barwieniu powierzchni komórek, zostaną one utrwalone przy użyciu 4% formaldehydy i przepuszczczone za pomocą zestawu Permeabilizing firmy Biolegend.
      6. Po przepuszczaniu cząsteczki wewnątrzkomórkowe, takie jak IL-2 i IFN-γ, zostaną zabarwione przy użyciu przeciwciał sprzężonych z fluorochromami.
      7. Przed końcową analizą cytometryczną komórki zostaną przemyte trzykrotnie w zimnym PBS, aby usunąć nadmiar przeciwciał.
    4. Dojrzewanie u myszy Rag-/-.
      1. Po trzech tygodniach rozwoju in vivo myszy Rag-/- zostaną uśmiercone, a z myszy usunięte zostaną śledziona i węzły chłonne.
      2. Pojedyncze komórki zostaną poddane obróbce poprzez rozbicie mechaniczne. Erytrocyty zostaną zlizowane przy użyciu buforu lizującego ACK, a mononukleocyty zostaną zebrane i przemyte dwukrotnie w zimnym PBS.
      3. Po przemyciu komórki zostaną zablokowane blokerem Fc 24G2 w 4 °C przez 20 minut, a po zakończeniu blokowania komórki zostaną zabarwione różnymi przeciwciałami anty-CD3, anty-CD4, anty-CD8 i anty-TCRβ sprzężonymi z fluorochromami w 4 °C przez 20 minut.
      4. Po zakończeniu barwienia komórki zostaną przemyte trzykrotnie w zimnym PBS przed analizą cytometryczną.

3. Programowanie in vivo

  1. Generowanie konstruktu retrowirusowego.
    1. Wektor MSCV-IRES-DsRED (MiDR) został skonstruowany na podstawie wektora MSCV-IRES-GFP poprzez zastąpienie genu GFP genem DsRED.
    2. Gen receptora limfocytów T OT-I zostaje podklonowany do wektora MiDR w celu stworzenia konstruktu OT-I/MiDR.
  2. Transdukcja retrowirusowa i sortowanie komórek.
    1. Komórki pakujące Plat-E są wykorzystywane do generowania pseudowirusów, które zostaną użyte w dalszej transdukcji.
      1. 3x106 Komórki Plat-E wysiewa się na szalkę hodowlaną o średnicy 100 mm na jeden dzień przed transfekcją.
    2. W dniu 0 komórki Plat-E zostaną transfekowane plazmidem OT-I MiDR przy użyciu odczynnika do transfekcji GeneJamma.
    3. W dniu 1., 1x106 Komórki iPS zostaną wysiane do jednego dołka płytki 24-dołkowej, uprzednio pokrytej 0,1% żelatyną.
      1. W drugim dniu supernatant zawierający pseudowirusy z hodowli Plat-E zostanie zebrany i przepuszczony przez 0.4 μm filtr w celu usunięcia potencjalnych zanieczyszczeń.
      2. Transdukcję przeprowadzono w warunkach 32 °C wirować przy 1400 obr./min przez 1 godzinę w obecności 5 μg/ml polybrene
      3. Po transdukcji z wykorzystaniem wirowania komórki zostaną umieszczone w 32 °C, 5% CO₂2 inkubować przez noc.
    5. W dniu 3. powtórz procedurę transdukcji z dnia 2., zgodnie z powyższym opisem. Płytka 6-dołkowa zostanie uprzednio pokryta komórkami feeder irSNL76/7 do późniejszego użycia.
    6. W 4. dniu transdukowane komórki iPS zostaną odczepione trypsyną, odwir ਕੀowane z prędkością 400 g przez 5 min i wysiane na uprzednio pokryte komórki zasilające irSNL76/7.
    7. Po osiągnięciu konfluencji komórki zostaną odklejone za pomocą trypsyny, odwirowane przy 400 g przez 5 min, a następnie poddane sortowaniu. Komórki podwójnie dodatnie dla GFP i DsRED zostaną posortowane za pomocą sortera komórkowego MoFlo. Posortowane komórki zostaną wyhodowane na komórkach feederowych irSNL76/7 do późniejszego wykorzystania.
  3. Transfer adopcyjny i indukowanie guza.
    Komórki iPS przetransdukowane TCR OT-I (OT-I/iPS) są zazwyczaj hodowane na komórkach feederowych irSNL76/7 zgodnie z powyższym opisem.
    1. W dniu transferu adopcyjnego komórki OT-I/iPS zostają odklejone za pomocą trypsyny, odwirowane przy 400 g przez 5 min i resuspenderowane w świeżej pożywce.
    2. 30-minutowa inkubacja w nowej płytce hodowlanej w 37 °C Wymagany jest inkubator w celu wyeliminowania zróżnicowanych komórek oraz pozostałości komórek pokarmowych.
    3. Po zakończeniu inkubacji należy zebrać pływające komórki i odwirować je z prędkością 400 g przez 5 min.
    4. Osad komórkowy zostanie trzykrotnie przemyty zimnym PBS, a następnie komórki zostaną przepuszczone przez 70 μm Sito nylonowe pomiędzy dwoma praniami w celu usunięcia agregatów komórkowych (podwójna filtracja).
    5. Po przemyciu komórki zostaną policzone i resuspendowane w zimnym PBS do stężenia 1,5x10^6/ml.7 komórek/ml.
    6. Komórki będą przechowywane w lodzie przed wstrzyknięciem.
    7. Do transferu adopcyjnego wykorzystane zostaną samice myszy C57BL/6J w wieku od 4 do 6 tygodni. Przed dożylnie podczas wstrzykiwania do żyły ogonowej myszy zostaną umieszczone pod lampą podczerwienną w celu rozszerzenia żył ogonowych.
    8. Po rozszerzeniu żyły, 200 μl zawiesina komórkowa lub 3x106 komórki zostaną przeniesione adoptywnie poprzez żyłę ogonową. Pozostawiono sześć tygodni na in vivo dojrzewanie iPS-komórek przetransdukowanych TCR OT-I.
      1. Po sześciu tygodniach doż. wtryskiwanie, 4x106 Komórki grasiczaka E.G7 zostaną zaszczepione wewnątrzbrzusznie.
      2. Komórki grasiczniaka E.G7 zostaną zebrane z hodowli i trzykrotnie przemyte w PBS.
      3. Po zakończeniu etapu płukania komórki zostaną zawieszone w zimnym PBS w stężeniu 8x107 komórek/ml.
      4. 50 μl zawiesina komórkowa lub 4x106 komórki zostaną wstrzyknięte do jamy otrzewnej.
  4. Ocena.
    1. In vitro charakterystyka komórek iPS przetransdukowanych TCR OT-I.
      1. Badanie mikroskopowe fluorescencyjne komórek podwójnie dodatnich dla DsRED i GFP zostanie przeprowadzone przy użyciu konwencjonalnego mikroskopu fluorescencyjnego na nieutrwalonych żywych komórkach.
      2. Integrację i ekspresję genu przeanalizowano za pomocą metod PCR oraz RT-PCR.
        1. Komórkowe DNA lub RNA zostanie wyizolowane oddzielnie z próbek przy użyciu zestawu do izolacji DNA lub RNA firmy Qiagen.
        2. Reakcję PCR oraz RT-PCR przeprowadzono z wykorzystaniem starterów specyficznie rozpoznających rekombinowany region VDJ łańcucha TCR Vβ5.
    2. Rozwój i dojrzewanie limfocytów T. Rycina 3a.
      1. W 2., 4. i 6. tygodniu po transferze komórek zwierzęta zostaną uśpione, a następnie pobrane zostaną śledziona oraz węzły chłonne.
      2. Jednokomórkowa zawiesina zostanie przygotowana poprzez rozdrabnianie mechaniczne. Erytrocyty zostaną poddane lizie przy użyciu buforu lizującego ACK, a następnie mononukleocyty zostaną zebrane i dwukrotnie przemyte zimnym buforem PBS.
      3. Po przemyciu komórki zostaną zablokowane za pomocą blokera Fc 24G2 w 4 °C przez 20 minut, a po zakończeniu blokowania komórki zostaną podzielone na aalikwoty i barwione różnymi przeciwciałami koniugowanymi z fluorochromami w 4 °C przez 20 minut.
      4. Po zakończeniu barwienia komórki należy trzykrotnie przemyć zimnym PBS przed nałożeniem na cytometr przepływowy.
    3. Stymulacja peptydowa. Rysunek 3b.
      1. W 50. dniu po indukowaniu guza zwierzęta zostaną uśpione, a następnie pobrana zostanie śledziona oraz węzły chłonne.
      2. Jednosączkowa zawiesina komórek zostanie przygotowana poprzez rozdrabnianie mechaniczne. Erytrocyty zostaną poddane lizie z użyciem buforu lizującego ACK, a mononukleocyty zostaną zebrane i dwukrotnie przemyte zimnym buforem PBS.
      3. CD8+ Komórki T zostaną wyizolowane przy użyciu zestawu CD8 firmy Miltenyi Biotec.+ Zestaw do izolacji limfocytów T. Izolowane limfocyty T CD8+ zostaną zmieszane z napromieniowanymi splenocytami izolowanymi z naiwnych myszy C57BL/6J w stosunku 1:10, a następnie poddane pulsacji z 0.5 μmol/ml OVA257-264 peptyd przez 40 godzin. Następnie do hodowli doda się brefeldynę A na kolejne 4 godziny.
      4. Po zakończeniu kokultury komórki zostaną zebrane, przemyte i zablokowane za pomocą blokera Fc zgodnie z powyższym opisem.
      5. Zablokowane komórki zostaną barwione pod kątem markerów powierzchniowych, takich jak CD8 i łańcuch TCR Vβ5, z wykorzystaniem przeciwciał koniugowanych z fluorochromami.
      6. Po barwieniu powierzchni komórek, komórki zostaną utrwalone przy użyciu 4% formaldehydu i permeabilizowane z zastosowaniem zestawu do permeabilizacji komórek.
      7. Po permeabilizacji cząsteczki wewnątrzkomórkowe, takie jak IL-2 i IFN-γ, zostaną zabarwione przy użyciu przeciwciał koniugowanych z fluorochromem.
      8. Przed końcową analizą cytometryczną komórki należy przemyć trzykrotnie zimnym PBS w celu usunięcia nadmiaru przeciwciał.
    4. In vivo test aktywności bakteriobójczej Rysunek 3C.
      1. Splenocyty z naiwnych myszy C57BL/6J zostaną wyizolowane i znakowane estrem karboksyfluoresceiny i sukcynimidylu (CFSE) w celu uzyskania komórek docelowych.
      2. Komórki znakowane za pomocą 5 μmol/ml CFSE (CFSECześć komórki) zostaną poddane impulsom 10 μg/ml OVA257-264 peptyd i komórki znakowane za pomocą 0.5 μmol/ml CFSE (CFSElo komórki) nie zostaną poddane impulsowaniu.
      3. Mieszanina 2,5x106 CFSEWitaj komórki plus 2,5x106 CFSElo komórki zostaną przeniesione adopcyjnie poprzez wstrzyknięcie dożylne do wskazanego biorcy.
      4. Po 16 godzinach izolowane będą splenocyty z tych myszy, a komórki CFSE+ zostaną poddane analizie za pomocą cytometrii przepływowej.
    5. Liczba komórek nowotworowych w jamie otrzewnej. Rysunek 4.
      W 20. dniu po wywołaniu nowotworu myszy zostaną uśpione, a następnie wykonano płukanie jamy otrzewnej przy użyciu zimnego PBS. Policzone zostaną komórki nowotworowe odzyskane podczas płukania otrzewnej.
    6. Identyfikacja limfocytów T naciekających nowotwór. Rysunek 5.
      1. W późnej fazie wywoływania nowotworu myszy zostaną uśpione, a guzy zostaną usunięte z jamy otrzewnej zwierząt z poszczególnych grup.
      2. Guz zostanie pocięty na fragmenty; jeden fragment zostanie umieszczony w krioszczelnej probówce i natychmiast przeniesiony na suchy lód, druga połowa zostanie utrwalona w formaldehydzie, a trzeci fragment zostanie zachowany w kondycjonowanym medium RPMI-1640 do późniejszego wykorzystania.
      3. H&Barwienie E zostanie wykonane zgodnie z ogólnym protokołem na próbkach utrwalonych formaldehydem i zatopionych w parafinie.
      4. Barwienie immunofluorescencyjne zostanie wykonane na próbkach kriozachachowanych.
        1. Tkanka zostanie pocięta i zakonserwowana w -20 °C przed użyciem.
        2. Przetniaki tkanek należy suszyć na powietrzu przez 15 minut, a następnie poddać 15-minutowej fiksacji w zimnym acetonie.
        3. Po utrwaleniu przekroje będą suszone na powietrzu przez kolejne 15 minut, a następnie płukane w PBS przez 5 minut.
        4. Po przemyciu umieścić preparaty w komorze wilgotnościowej i pokryć skrawki tkanek 30 μl 3% BSA w PBS przez 30 minut w celu zablokowania niespecyficznego wiązania.
        5. Po zakończeniu blokowania należy osuszyć preparaty z buforu blokującego i pokryć skrawki tkanki 50 μl mieszanina przeciwciał PE-anty-TCR Vα2 oraz przeciwciał FITC-anty-OVA rozcieńczona w 3% BSA w PBS.
        6. Inkubować w komorze wilgotnej przez 2 godziny, a po zakończeniu inkubacji preparaty wypłukać trzykrotnie w zimnym PBS i zamontować za pomocą wodnego medium montażowego przed badaniem w mikroskopie fluorescencyjnym.
      5. Analiza cytometryczna limfocytów T naciekających guz.
        1. Guz zostanie rozdrobniony do postaci zawiesiny pojedynczych komórek, a erytrocyty zostaną poddane lizie przy użyciu buforu lizującego ACK.
        2. Po przemyciu i blokowaniu komórki zostaną znakowane różnymi przeciwciałami sprzężonymi z fluorochromami, które specyficznie rozpoznają cząsteczki CD8, TCR Vα2 oraz TCR Vβ5 wykazujące ekspresję na powierzchni komórek.
    7. Przeżywalność myszy. Rysunek 6.
      Po indukowaniu guza przeżywalność myszy będzie starannie monitorowana.

4. Reprezentatywne wyniki

CD3 i TCRβ są wykorzystywane jako markery limfocytów T. Aby ustalić, czy stymulacja komórek iPS ligandem Notch DL1 może przyczyniać się do różnicowania limfocytów T, oceniono ekspresję CD3 i TCRβ+ w komórkach pochodzących z komórek iPS, a następnie przeanalizowano ekspresję CD4 i CD8, stosując bramkowanie dla populacji CD3+ i TCRβ+. Jak pokazano tutaj, w 22. dniu z komórek iPS in vitro wygenerowano pojedynczo dodatnie (SP) limfocyty T CD3+ TCRβ+ CD4- CD8+. Ponadto komórki SP pochodzące z komórek iPS były zdolne do produkcji IL-2 i IFN-γ po stymulacji in vitro za pomocą przeciwciał anty-CD3 naniesionych na płytkę oraz rozpuszczalnych przeciwciał anty-CD28 (Ryc. 2), co sugeruje, że limfocyty T pochodzące z komórek iPS są funkcjonalne.

Po adoptywnym transferze do myszy biorców, większość iPS komórek z transdukcją genu TCR uległa różnicowaniu w CTL CD8+, które reagowały in vitro na stymulację peptydową poprzez wydzielanie IL-2 i IFN-γ (Ryc. 3). Co najważniejsze, adoptywny transfer iPS komórek z transdukcją TCR wywołał naciekanie reaktywnych na OVA CTL do tkanek nowotworowych i chronił zwierzęta przed wyzwaniem nowotworowym (Ryc. 5-6). Zatem iPS komórki z transdukcją genu TCR mogą różnicować się in vivo w funkcjonalne, swoiste dla antygenu CTL.

Różnicowanie komórek, obrazy mikroskopowe, time-lapse, hodowle komórkowe, od Dnia 0 do Dnia 22, etapy wzrostu.
Rycina 1. Morfologia różnicowania komórek iPS. W różnych dniach mysie komórki iPS były współhodowane z komórkami OP9-DL1 w pożywce α-MEM uzupełnionej o 20% FCS i 2,2 g/L wodorowęglanu sodu w obecności 5 ng/ml mFlt3L i 1 ng/ml mIL-7.

Cytometria przepływowa markerów TCRβ, CD3, CD4, CD8; analiza histogramów IL-2, IFN-γ; dane dotyczące komórek odpornościowych.
Rycina 2. Różnicowanie limfocytów T z komórek iPS. Mysie komórki iPS współhodowano z komórkami OP9-DL1 zgodnie z opisem na Rycinie 1. W 22. dniu wyizolowano i przeanalizowano komórki pochodzące z komórek iPS. A) Komórki CD4+ CD8- lub CD4- CD8+ po bramkowaniu populacji CD3+ i TCRβ+. B) Komórki stymulowano przeciwciałami anty-CD3 naniesionymi na płytkę oraz rozpuszczalnymi przeciwciałami anty-CD28 przez 5 godzin w 37 °C przy 5% CO2. Poziomy IL-2 i IFN-γ analizowano za pomocą barwienia wewnątrzkomórkowego po bramkowaniu żywych limfocytów T CD4- CD8+.

Flow cytometry analysis, CD8 and Vβ5 markers, cell comparison, graph for research studies.
Rysunek 3. CD8 specyficzne dla antygenu+ Różnicowanie limfocytów T z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPS) in vivoWstrzyknięto komórki iPS z przetransdukowanym genem TCR OT-I dożylnie do myszy C57BL/6. Po sześciu do dziesięciu tygodniach CD8 specyficzne dla OVA+ Vβ5+ Określono stopień rozwoju limfocytów T. A) CD8+ Vβ5+ Limfocyty T z połączonych węzłów chłonnych i śledziony analizowano metodą cytometrii przepływowej po wyznaczeniu bramki dla CD8.+ populacje. B) Produkcja IL-2 i IFN-γ (ciemne linie; obszary zacieniowane oznaczają kontrole izotypowe) została określona za pomocą wewnątrzkomórkowego barwienia cytokin po bramkowaniu populacji CD8+ Vβ5+ populacje. C) In vivo test proliferacji/cytotoksyczności. CFSEWitaj (prawe piki) i CFSElo (lewe piki) komórki docelowe zostały poddane elektroporacji OVA257-264 peptyd i kontrolę odpowiednio, a następnie wstrzyknięto je myszom dziesięć tygodni po transferze komórek iPS lub jeden dzień po transferze limfocytów CTL OT-I.

Wykres słupkowy przedstawiający liczbę komórek nowotworowych; eksperyment MiDR-TCR z komórkami iPS; porównanie metod leczenia.
Rysunek 4. Adoptywny transfer komórek iPS przetransdukowanych genem OT-I TCR hamuje wzrost nowotworu. Komórki iPS przetransdukowane genem OT-I TCR zostały przeniesione adoptywnie do myszy C57BL/6. Jednej grupie myszy wstrzyknięto reaktywne względem OVA limfocyty T CD8+ pochodzące z transgenicznych myszy OT-I TCR, a w drugiej grupie nie wykonano transferu komórek. Po sześciu tygodniach lub w dniu następującym po transferze komórek, myszy poddano wyzwaniu z komórkami nowotworowymi E. G7. W 20. dniu policzono komórki nowotworowe w jamie otrzewnowej.

Eksperyment z immunoterapii komórkowej; wyniki mikroskopii i cytometrii przepływowej, komórki iPS, analiza TCR.
Rycina 5. Antygenowo swoiste CTL pochodzące z komórek iPS infiltrują tkanki nowotworowe. W dniach od 30. do 35. po wywołaniu nowotworu badano tkanki nowotworowe pod kątem infiltracji reaktywnych przeciwko nowotworowi limfocytów T. A) Barwienie H&E. Komórki zapalne infiltrujące tkanki nowotworowe (↓). B) Barwienie immunohistochemiczne. Swoiste dla OVA CTL Vα2+ (czerwone) infiltrujące nowotwory wykazujące ekspresję OVA (zielone). C) Zawiesiny pojedynczych komórek z tkanek nowotworowych analizowano pod kątem ekspresji Vα2+ i Vβ5+ za pomocą cytometrii przepływowej, po wyselekcjonowaniu populacji CD8+.

Wykres analizy przeżywalności; terapia komórkami iPS; efekty transferu komórek; analiza przeżywalności w zależności od liczby dni.
Rysunek 6. Adoptywny transfer komórek iPS transdukowanych genem TCR OT-I podtrzymuje przeżywalność myszy. Komórki iPS transdukowane genem TCR OVA zostały podane adoptywnie myszom C57BL/6, które poddano wyzwaniu komórkami nowotworowymi E. G7, zgodnie z opisem na Rys. 4. Przeżywalność myszy w 50. dniu przedstawiono za pomocą krzywych przeżywalności Kaplana-Meiera (n=6).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W przypadku terapii opartych na ACT, optymalnym podejściem jest generowanie in vitro dużej liczby wysoce reaktywnych limfocytów T swoistych dla Ag w celu ponownego wprowadzenia ich in vivo. Chociaż nasza metoda in vitro pozwala na uzyskanie funkcjonalnych limfocytów T z komórek iPS, znaczna liczba komórek pochodzących z iPS obumiera w ciągu czterech tygodni, szczególnie w czwartym tygodniu. Wnioskujemy, że sygnały przeżycia z szlaku Notch pośredniczone przez DL1, a także IL-7 i FLt3L, są niewys...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Dziękujemy dr. Shinyę Yamanakę (Kyoto University) za udostępnienie linii komórkowej iPS-MEF-Ng-20D-17, dr. Dario Vignaliemu (St. Jude Children's Research Hospital) za wsparcie w zakresie konstruktu OT1-2A•pMig II, dr. Juan Carlosowi Zuniga-Pfluckerowi (Department of Immunology, University of Toronto) za udostępnienie linii komórkowej OP9-DL1 oraz dr. Kentowi E. Vrannie (Department of Pharmacology, Penn State University College of Medicine) za pomoc w zaprojektowaniu niniejszego badania. Projekt ten jest finansowany z grantów o numerach K18CA151798 z National Cancer Institute, Barsumian Trust oraz Melanoma Research Foundation (J. Song).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Myszy C57BL/6JJackson Laboratory000664
B6.129S7-Rag1tm1Mom/JJackson Laboratory002216
Przeciwciało anty-CD3 (2C11)BD Biosciences553058
Przeciwciało anty-CD28 (37.51)BD Biosciences553295
Przeciwciało anty-CD3 (17A2)BioLegend100202
Przeciwciało anty-CD4 (GK1.5)BioLegend100417
Przeciwciało anty-CD8 (53-6.7)BioLegend100714
Przeciwciało anty-CD25 (3C7)BioLegend101912
Przeciwciało anty-CD44 (1M7)BioLegend103012
Przeciwciało anty-CD117 (2B8)BioLegend105812
Przeciwciało anty-TCR-β (H57597)BioLegend109220
Przeciwciało anty-IL-2 (JES6-5H4)BioLegend503810
Przeciwciało anty-IFN-γ (XMG1.2)BioLegend505822
DMEMInvitrogenABCD1234
α-MEMInvitrogenA10490-01
FBSHycloneSH3007.01
Brefeldyna ASigma-AldrichB7651
PolybreneSigma-Aldrich107689
GeneJammerIntegrated Sciences204130
Zestaw do izolacji RNAQiagen74104
Zestaw do izolacji DNAQiagen69504
Zestaw do izolacji CD8Miltenyi Biotec130-095-236
Bufor lizujący ACKLonza Inc.10-548E
mFlt-3LPeproTech Inc250-31L
mIL-7PeproTech Inc217-17
ŻelatynaSigma-AldrichG9391
Przeciwciało FITC-anty-OVARockland Immunochemicals200-4233
Bufor do permeabilizacjiBiolegend421002
BSASigma-AldrichA7906
FormaldehydSigma-AldrichF8775
Filtr 0,4 μmEMD Millipore
Sorter komórkowy MofloDako
Cytometr przepływowy CaliburBD Biosciences
Cytometr przepływowy LSR IIBD Biosciences
Restryktor dla myszyBraintree Scientific, Inc.

Bibliografia

  1. Brenner, M. K., Heslop, H. E. Adoptive T cell therapy of cancer. Curr. Opin. Immunol. 22, 251-257 (2010).
  2. Hataye, J., Moon, J. J., Khoruts, A., Reilly, C., Jenkins, M. K. Naive and memory CD4+ T cell survival controlled by clonal abundance. Science. 312, 114-116 (2006).
  3. Seki, Y. IL-7/STAT5 cytokine signaling pathway is essential but insufficient for maintenance of naive CD4 T cell survival in peripheral lymphoid organs. J. Immunol. 178, 262-270 (2007).
  4. Stemberger, C. A single naive CD8+ T cell precursor can develop into diverse effector and memory subsets. Immunity. 27, 985-997 (2007).
  5. Siewert, C. Experience-driven development: effector/memory-like alphaE+Foxp3+ regulatory T cells originate from both naive T cells and naturally occurring naive-like regulatory T cells. J. Immunol. 180, 146-155 (2008).
  6. Wang, L. X., Plautz, G. E. Tumor-primed, in vitro-activated CD4+ effector T cells establish long-term memory without exogenous cytokine support or ongoing antigen exposure. J. Immunol. 184, 5612-5618 (2010).
  7. Hinrichs, C. S. Human effector CD8+ T cells derived from naive rather than memory subsets possess superior traits for adoptive immunotherapy. Blood. 117, 808-814 (2011).
  8. Alajez, N. M., Schmielau, J., Alter, M. D., Cascio, M., Finn, O. J. Therapeutic potential of a tumor-specific, MHC-unrestricted T-cell receptor expressed on effector cells of the innate and the adaptive immune system through bone marrow transduction and immune reconstitution. Blood. 105, 4583-4589 (2005).
  9. Yang, L., Baltimore, D. Long-term in vivo provision of antigen-specific T cell immunity by programming hematopoietic stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 4518-4523 (2005).
  10. Zhao, Y. Extrathymic generation of tumor-specific T cells from genetically engineered human hematopoietic stem cells via Notch signaling. Cancer Res. 67, 2425-2429 (2007).
  11. Boztug, K. Stem-cell gene therapy for the Wiskott-Aldrich syndrome. N. Engl. J. Med. Med, N. .E. ngl.J. . 363, 1918-1927 (2010).
  12. Peerani, R., Zandstra, P. W. Enabling stem cell therapies through synthetic stem cell-niche engineering. J. Clin. Invest. 120, 60-70 (2010).
  13. Mendez-Ferrer, S. Mesenchymal and haematopoietic stem cells form a unique bone marrow niche. Nature. 466, 829-834 (2010).
  14. Daley, G. Q. Towards the generation of patient-specific pluripotent stem cells for combined gene and cell therapy of hematologic disorders. Hematology Am. Soc. Hematol. Educ. Program. , 17-22 (2007).
  15. Boitano, A. E. Aryl hydrocarbon receptor antagonists promote the expansion of human hematopoietic stem cells. Science. 329, 1345-1348 (2010).
  16. Himburg, H. A. Pleiotrophin regulates the expansion and regeneration of hematopoietic stem cells. Nat. Med. 16, 475-482 (2010).
  17. Tanigaki, K., Honjo, T. Regulation of lymphocyte development by Notch signaling. Nature immunology. 8, 451-456 (2007).
  18. Zhao, T., Zhang, Z. N., Rong, Z., Xu, Y. Immunogenicity of induced pluripotent stem cells. Nature. 474, 212-215 (2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Różnicowanie limfocytów Tstymulacja ligandem Notchtransdukcja genu TCRanaliza cytometrycznasystem hodowli OP9 DL1model myszy z niedoborem Ragantygenowo specyficzne limfocyty CTLtest wyzwania nowotworowegowewnątrzkomórkowe barwienie cytokin
Kierunkowe różnicowanie indukowanych pluripotentnych komórek macierzystych w kierunku limfocytów T
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.