Kierunkowe różnicowanie indukowanych pluripotentnych komórek macierzystych w kierunku limfocytów T

Podsumowanie

Generowanie limfocytów T z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPS) stanowi alternatywne podejście do wykorzystania embrionalnych komórek macierzystych w immunoterapii opartej na limfocytach T. Metoda ta wykazuje, że dzięki zastosowaniu systemu indukcji in vitro lub in vivo, komórki iPS są zdolne do różnicowania się zarówno w konwencjonalne, jak i antygenowo swoiste limfocyty T.

Streszczenie

Adoptywne przeniesienie komórek (ACT) antygenowo swoistych cytotoksycznych limfocytów T (CTL) CD8⁺ stanowi obiecującą metodę leczenia wielu rodzajów nowotworów złośliwych ¹. CTL mogą rozpoznawać komórki nowotworowe poprzez oddziaływanie antygenów guza z receptorami komórek T (TCR), a następnie uwalniać cytotoksyny oraz cytokiny w celu zniszczenia komórek nowotworowych. Wiadomo, że słabo zróżnicowane CTL o fenotypie podobnym do komórek pamięci centralnej (określane jako wysoce reaktywne) stanowią optymalną populację dla immunoterapii opartej na ACT, ponieważ posiadają one wysoki potencjał proliferacyjny, są mniej podatne na apoptozę niż komórki bardziej zróżnicowane i wykazują większą zdolność do odpowiedzi na cytokiny homeostatyczne ^2-7. Jednak ze względu na trudności w uzyskaniu od pacjentów dużej liczby takich CTL, istnieje pilna potrzeba znalezienia nowego podejścia do generowania wysoce reaktywnych, Ag-swoistych CTL dla skutecznych terapii opartych na ACT.

Transdukcja TCR samoodnawiających się komórek macierzystych w celu rekonstrukcji immunologicznej wykazuje potencjał terapeutyczny w leczeniu chorób ^8-10. Jednakże podejście polegające na pozyskiwaniu embrionalnych komórek macierzystych (ESCs) od pacjentów nie jest wykonalne. Choć wykorzystanie hematopoetycznych komórek macierzystych (HSCs) do celów terapeutycznych znajduje szerokie zastosowanie w klinice ^11-13, HSCs charakteryzują się ograniczoną zdolnością do różnicowania i proliferacji, a ich namnażanie w hodowlach komórkowych in vitro jest utrudnione ^14-16. Niedawno opracowana technologia komórek iPS oraz rozwój systemów in vitro do dostarczania genów umożliwiają generowanie komórek iPS od pacjentów bez konieczności stosowania metod chirurgicznych. Ponadto, podobnie jak ESCs, komórki iPS posiadają nieograniczoną zdolność do proliferacji in vitro oraz wykazują zdolność do różnicowania w komórki krwiotwórcze. W związku z tym komórki iPS mają większy potencjał do wykorzystania w immunoterapii opartej na ACT w porównaniu do ESCs lub HSCs.

W niniejszej pracy przedstawiamy metody generowania limfocytów T z komórek iPS in vitro oraz programowania in vivo swoistych dla antygenu CTL z komórek iPS w celu promowania immunologicznego nadzoru nad nowotworami. Stymulacja in vitro ligandem Notch indukuje różnicowanie komórek iPS w komórki T, a transdukcja genu TCR skutkuje różnicowaniem się komórek iPS w swoiste dla antygenu komórki T in vivo, co zapobiega wzrostowi guza. W ten sposób demonstrujemy swoiste dla antygenu różnicowanie komórek T z komórek iPS. Nasze badania zapewniają potencjalnie bardziej wydajne podejście do generowania swoistych dla antygenu CTL dla terapii opartych na ACT i ułatwiają opracowanie strategii terapeutycznych w leczeniu chorób.

Protokół

1. Hodowla komórkowa

1. Przygotowanie napromieniowanych komórek karmionek SNL76/7 (irSNL76/7) do hodowli.
   Komórki SNL76/7 są zazwyczaj utrzymywane w pośrodku DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) z dodatkiem 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS).
   1. Płaskie naczynie hodowlane lub kolbę należy pokryć 0,1% roztworem żelatyny i inkubować w 37 °C przez 30 minut przed wybudzeniem komórek SNL76/7 z ciekłego azotu.
   2. Po osiągnięciu przez komórki SNL76/7 pełnej konfluencji, komórki należy odseparować za pomocą trypsyny, odwirować przy 400 g przez 5 min i resuspender w świeżym pośrodku.
   3. Resuspenderowane komórki SNL76/7 należy napromieniować w irradiatorze ⁶⁰Co dawką 5000 Rads.
      Metoda alternatywna: komórki SNL76/7 można zastąpić embrionalnymi fibroblastami mysimi (MEF), a napromieniowanie zastąpić inaktywacją mitomycyną.
   4. Po napromieniowaniu komórki należy odwirować przy 400 g przez 5 min i resuspender w buforze do zamrażania składającym się z FBS i 10% dimetylosulfotlenku (DMSO), rozdzielić do krioprolek i przechowywać w ciekłym azocie do późniejszego użycia.
2. Przygotowanie komórek OP9-DL1 do różnicowania in vitro.
   Komórki OP9-DL1 są zazwyczaj utrzymywane w pośrodku α-MEM (α-minimum essential medium) z dodatkiem 20% FBS. Po osiągnięciu konfluencji komórki należy pasażować w rozcieńczeniu 1:5.
3. Przygotowanie komórek grasiczaka E.G7.
   Komórki grasiczaka E.G7 są zazwyczaj utrzymywane w pośrodku RPMI-1640 (Roswell Park Memorial Institute medium) z dodatkiem 10% FBS. Po osiągnięciu konfluencji komórki należy pasażować w rozcieńczeniu 1:10.
4. Ogólna hodowla komórek iPS oraz komórek iPS z transdukcją TCR.
   1. Naczynie hodowlane należy pokryć 0,1% roztworem żelatyny w 37 °C przez 30 minut przed wysianiem komórek karmionek irSNL76/7 na dzień przed wybudzeniem lub pasażem komórek iPS.
   2. W przypadku pasażu komórek iPS, komórki należy odseparować za pomocą trypsyny, odwirować przy 400 g przez 5 min i resuspender w pośrodku DMEM z 15% FBS.
   3. Trypsynizowane komórki iPS należy inkubować w nowym naczyniu hodowlanym przez 30 minut w inkubatorze w 37 °C przed wysianiem na świeżo przygotowane naczynie z komórkami karmionkami irSNL76/7, aby wyeliminować komórki zróżnicowane oraz pozostałości komórek karmionek.
   4. Po inkubacji 4×10⁶ komórek należy wysiać do naczynia hodowlanego o średnicy 100 mm.

2. Programowanie in vitro

1. System kokultury in vitro.
   1. W dniu 0, 5x10⁴ komórek iPS zostanie wysianych na 100-mm szalkę hodowlaną zawierającą konfluentną monowarstwę komórek OP9-DL1 w pożywce α-MEM z 20% FBS.
   2. W dniu 3 pożywka hodowlana zostanie wymieniona na świeżą.
   3. 1. W dniu 5 komórki zostaną odklejone trypsyną i odwirowane przy 400 g przez 5 min, a następnie inkubowane na świeżej 100-mm szalce hodowlanej przez 30 minut w inkubatorze w 37 °C.
      2. Komórki pływające zostaną zebrane i policzone, a 5x10⁵ komórek zostanie przeniesionych na świeżą szalkę hodowlaną zawierającą konfluentną monowarstwę komórek OP9-DL1 w pożywce α-MEM z 20% FBS. Do hodowli zostanie dodana cytokina mFlt-3L (stężenie końcowe: 5 ng/mL).
   4. 1. W dniu 8 słabo przytwierdzone komórki zostaną delikatnie zespisowane pipetą.
      2. Warstwę zasilającą OP9-DL1 należy przemyć 10 mL PBS jeszcze raz, aby uzyskać maksymalną odzyskowalność częściowo zróżnicowanych komórek iPS.
      3. Po zbiorze komórek z kokultury, zostaną one odwirowane przy 400 g przez 5 min i resuspendowane w pożywce α-MEM z 20% FBS uzupełnionej o mFlt-3L (5 ng/mL) i mIL-7 (1 ng/mL).
      4. Komórki zostaną przeniesione do 6-dołkowej płytki hodowlanej pokrytej konfluentnymi komórkami OP9-DL1. Zazwyczaj komórki iPS odzyskane z jednej 100-mm szalki hodowlanej zostaną przeniesione do jednego dołka płytki 6-dołkowej.
   5. 1. Od 10 dnia pożywka hodowlana będzie wymieniana co drugi dzień (pożywka α-MEM z 20% FBS uzupełniona o mFlt-3L (5 ng/mL) i mIL-7 (1 ng/mL)).
      2. Płytki hodowlane pokryte komórkami zasilającymi OP9-DL1 będą wymieniane co 4-6 dni, w zależności od wzrostu komórek zasilających.
2. Dojrzewanie częściowo zróżnicowanych komórek iPS in vivo.
   1. W 22 dniu kokultury komórki iPS zostaną odklejone trypsyną, odwirowane przy 400 g przez 5 min i inkubowane na świeżej szalce hodowlanej w 37 °C przez 30 minut.
   2. Komórki pływające zostaną zebrane, przepuszczone przez 70 μm nylonowe sitko w celu wyeliminowania agregatów komórkowych, które mogłyby wywołać zatorowość płucną u myszy, i przemyte trzykrotnie w zimnym PBS.
   3. Komórki zostaną resuspendowane w PBS do stężenia 1,5x10⁷ komórek/mL.
   4. Komórki będą utrzymywane na lodzie przed wstrzyknięciem.
   5. Przed wstrzyknięciem i.v. do żyły ogonowej, myszy zostaną umieszczone pod lampą podczerwienną w celu rozszerzenia żyły ogonowej.
   6. Po rozszerzeniu żyły, 200 μl zawiesiny komórkowej lub 3x10⁶ komórek zostanie adoptacyjnie przeniesionych do 4-tygodniowej myszy B6.129S7-Rag1^tm1Mom/J poprzez żyłę ogonową. Przez trzy tygodnie będzie trwało dojrzewanie in vivo częściowo zróżnicowanych komórek iPS.
3. Ocena.
   1. Zmiany morfologiczne zróżnicowanych komórek i wskaźniki odzyskiwania komórek. Rysunek 1.
      1. W różnych dniach kokultury z komórkami OP9-DL1, zdjęcia żywych komórek zostaną wykonane pod mikroskopem świetlnym.
      2. Wskaźniki odzyskiwania komórek zostaną obliczone na podstawie liczby komórek zebranych z hodowli.
   2. Analiza cytometryczna zmian markerów powierzchniowych. Rysunek 2a.
      1. W różnych dniach kokultury komórki zostaną usunięte z hodowli poprzez trypsynizację i przemyte zimnym PBS przed przystąpieniem do barwienia powierzchni komórek.
      2. Przed barwieniem różnymi przeciwciałami sprzężonymi z fluorochromami, komórki zostaną zablokowane blokerem Fc 24G2 w 4 °C przez 20 minut.
      3. Po 20-minutowym barwieniu w 4 °C, komórki zostaną przemyte trzykrotnie w zimnym PBS przed badaniem cytometrycznym.
   3. Aktywacja komórek iPS zróżnicowanych in vitro. Rysunek 2b.
      1. Na jeden dzień przed testem aktywacji, płytkę 24-dołkową należy pokryć przeciwciałami anty-CD3 (stężenie końcowe: 4 μg/mL, w PBS) w 4 °C przez noc.
      2. W 22 dniu kokultury, pochodne od komórek iPS limfocyty T zostaną zebrane z hodowli i przemyte zimnym PBS przed stymulacją przeciwciałami anty-CD3 unieruchomionymi na płytce oraz rozpuszczalnymi przeciwciałami anty-CD28 (stężenie końcowe: 4 μg/mL).
      3. Inkubację przeprowadzono w inkubatorze w 37 °C, 5% CO₂ przez 40 godzin, a następnie do hodowli dodano Befeldynę A na kolejne 4 godziny.
      4. Po zakończeniu kokultury komórki zostaną zebrane, przemyte i zablokowane blokerem Fc zgodnie z powyższym opisem. Zablokowane komórki zostaną zabarwione na markery powierzchniowe, takie jak CD8 i łańcuch Vβ TCR, przy użyciu przeciwciał sprzężonych z fluorochromami.
      5. Po barwieniu powierzchni komórek, zostaną one utrwalone 4% formaldehydem i permeabilizowane za pomocą zestawu Permeabilizing kit firmy Biolegend.
      6. Po permeabilizacji cząsteczki wewnątrzkomórkowe, takie jak IL-2 i IFN-γ, zostaną zabarwione przeciwciałami sprzężonymi z fluorochromami.
      7. Przed końcowym badaniem cytometrycznym komórki zostaną przemyte trzykrotnie w zimnym PBS, aby usunąć nadmiar przeciwciał.
   4. Dojrzewanie u myszy Rag-/-.
      1. Po trzech tygodniach rozwoju in vivo, myszy Rag-/- zostaną uśmiercone, a z organizmów usunięte śledziona i węzły chłonne.
      2. Pojedyncze komórki zostaną wyizolowane poprzez rozbicie mechaniczne. Erytrocyty zostaną zlizowane przy użyciu buforu lizującego ACK, a mononukleocyty zostaną zebrane i przemyte dwukrotnie w zimnym PBS.
      3. Po przemyciu komórki zostaną zablokowane blokerem Fc 24G2 w 4 °C przez 20 minut, a po zakończeniu blokowania zostaną zabarwione różnymi przeciwciałami anty-CD3, anty-CD4, anty-CD8 i anty-TCRβ sprzężonymi z fluorochromami w 4 °C przez 20 minut.
      4. Po zakończeniu barwienia komórki zostaną przemyte trzykrotnie w zimnym PBS przed badaniem cytometrycznym.

3. Programowanie in vivo

1. Generowanie konstruktu retrowirusowego.
   1. Wektor MSCV-IRES-DsRED (MiDR) został skonstruowany na podstawie wektora MSCV-IRES-GFP poprzez zastąpienie genu GFP genem DsRED.
   2. Gen receptora komórek T OT-I został podklonowany do wektora MiDR w celu stworzenia konstruktu OT-I/MiDR.
2. Transdukcja retrowirusowa i sortowanie komórek.
   1. Komórki pakujące Plat-E są wykorzystywane do generowania pseudowirusów, które zostaną użyte w kolejnym etapie transdukcji.
      1. 3x10⁶ Komórki Plat-E wysiewa się na szalkę hodowlaną o średnicy 100 mm na jeden dzień przed transfekcją.
   2. W dniu 0 komórki Plat-E zostaną transfekowane plazmidem OT-I MiDR przy użyciu odczynnika do transfekcji GeneJamma.
   3. W dniu 1. 1x10⁶ Komórki iPS zostaną wysiane do jednego dołka płytki 24-dołkowej uprzednio pokrytej 0,1% żelatyną.
   4. 1. W dniu 2. ze hodowli Plat-E zostanie zebrany supernatant zawierający pseudowirusy, który następnie zostanie przepuszczony przez filtr 0,4 μm w celu usunięcia potencjalnych zanieczyszczeń.
      2. Transdukcję przeprowadzono w temperaturze 32 °C, wirowując próbki z prędkością 1400 obr./min przez 1 godzinę w obecności 5 μg/ml polybrene.
      3. Po transdukcji z wykorzystaniem wirowania komórki zostaną umieszczone w temperaturze 32 °C i w atmosferze 5% CO2₂ inkubator przez noc.
   5. W dniu 3. powtórzyć procedurę transdukcji z dnia 2., zgodnie z powyższym opisem. Płytka 6-dołkowa zostanie uprzednio pokryta komórkami zasilającymi irSNL76/7 do późniejszego wykorzystania.
   6. W 4. dniu transdukowane komórki iPS zostaną odklejone za pomocą trypsyny, odwirowane przy 400 g przez 5 min i wysiane na uprzednio powlekaną warstwę komórek feeder irSNL76/7.
   7. Po osiągnięciu konfluencji komórki zostaną odklejone za pomocą trypsyny, odwirowane przy 400 g przez 5 min i poddane sortowaniu. Komórki podwójnie dodatnie dla GFP i DsRED zostaną posortowane za pomocą sortera komórkowego MoFlo. Posortowane komórki będą hodowane na komórkach karmicielskich irSNL76/7 do późniejszego wykorzystania.
3. Transfer adopcyjny i indukcja nowotworu.
   Komórki iPS transdukowane TCR OT-I (komórki OT-I/iPS) są zazwyczaj hodowane na komórkach karmicielskich irSNL76/7 zgodnie z powyższym opisem.
   1. W dniu transferu adopcyjnego komórki OT-I/iPS odrywa się za pomocą trypsyny, wiruje przy 400 g przez 5 min i resuspendsuje w świeżym medium.
   2. Wymagana jest 30-minutowa inkubacja na nowej szalce hodowlanej w inkubatorze w temperaturze 37 °C w celu wyeliminowania zróżnicowanych komórek oraz pozostałości komórek dokarmiających.
   3. Po zakończeniu inkubacji należy zebrać komórki pływające i odwirować je przy 400 g przez 5 min.
   4. Osad komórkowy należy przemyć trzy razy zimnym roztworem PBS, a pomiędzy dwoma przemyciami komórki należy przepuścić przez nylonowe sito o oczkach 70 μm w celu usunięcia agregatów komórkowych (podwójna filtracja).
   5. Po przemyciu komórki zostaną policzone i zawieszone ponownie w zimnym PBS w stężeniu 1,5x10⁷ komórek/ml
   6. Komórki należy przechowywać w lodzie przed iniekcją.
   7. Do transferu adopcyjnego zostaną wykorzystane samice myszy C57BL/6J w wieku 4–6 tygodni. Przed dożylnie W przypadku iniekcji do żyły ogonowej myszy zostaną umieszczone pod lampą podczerwienną w celu rozszerzenia żył ogonowych.
   8. Po rozszerzeniu żyły, 200 μl zawiesiny komórkowej lub 3x10⁶ komórki zostaną przeniesione adoptywnie poprzez żyłę ogonową. Przez sześć tygodni będzie oczekiwano na in vivo dojrzewanie komórek iPS z transdukowanym receptorem TCR OT-I.
   9. 1. Po sześciu tygodniach dożylnie iniekcja, 4x10⁶ Komórki tymusomy E.G7 zostaną wstrzyknięte do jamy otrzewnej.
      2. Komórki grasiczaka E.G7 zostaną zebrane z hodowli i trzykrotnie przemyte w PBS.
      3. Po zakończeniu płukania komórki zostaną zawieszone w zimnym PBS w stężeniu 8x10⁷ komórek/ml
      4. 50 μl zawiesiny komórkowej lub 4x10⁶ komórki zostaną wstrzyknięte do jamy otrzewnowej.
4. Ocena.
   1. In vitro charakterystyka komórek iPS z transdukowanym TCR OT-I.
      1. Badanie mikroskopowe z wykorzystaniem fluorescencji komórek podwójnie dodatnich dla DsRED i GFP zostanie przeprowadzone za pomocą konwencjonalnego mikroskopu fluorescencyjnego na niefiksowanych, żywych komórkach.
      2. Integrację i ekspresję genów przeanalizowano za pomocą analiz PCR oraz RT-PCR.
         1. Komórkowe DNA lub RNA zostanie wyizolowane oddzielnie z próbek przy użyciu zestawu do izolacji DNA lub RNA firmy Qiagen.
         2. Reakcje PCR i RT-PCR zostaną przeprowadzone z wykorzystaniem starterów specyficznie rozpoznających rekombinowany region VDJ łańcucha TCR Vβ5.
   2. Rozwój i dojrzewanie limfocytów T. Rysunek 3a.
      1. W 2., 4. i 6. tygodniu po transferze komórek zwierzęta zostaną uśmiercone, a z ich organizmów zostaną pobrane śledziona oraz węzły chłonne.
      2. Zawiesinę pojedynczych komórek przygotuje się poprzez rozbicie mechaniczne. Erytrocyty zostaną poddane lizie z użyciem buforu lizującego ACK, a mononukleocyty zostaną zebrane i dwukrotnie przemyte zimnym PBS.
      3. Po przemyciu komórki zostaną zablokowane za pomocą blokeru Fc 24G2 w temperaturze 4 °C przez 20 minut, a po zakończeniu blokowania zostaną podzielone na alikwoty i barwione różnymi przeciwciałami sprzężonymi z fluorochromami w temperaturze 4 °C przez 20 minut.
      4. Po zakończeniu barwienia komórki należy przemyć trzykrotnie w zimnym PBS przed załadowaniem do cytometru przepływowego.
   3. Stymulacja peptydowa. Rycina 3b.
      1. W 50. dniu po indukcji guza zwierzęta zostaną uśmiercone, a następnie pobrany zostanie śledziona oraz węzły chłonne.
      2. Zawiesinę pojedynczych komórek przygotuje się poprzez rozbicie mechaniczne. Erytrocyty zostaną poddane lizie przy użyciu buforu lizującego ACK, a mononukleocyty zostaną zebrane i dwukrotnie przemyte zimnym PBS.
      3. CD8⁺ Limfocyty T zostaną wyizolowane przy użyciu zestawu CD8 firmy Miltenyi Biotec.⁺ Zestaw do izolacji limfocytów T. Izolowane limfocyty T CD8+ zostaną zmieszane z napromienionymi splenocytami izolowanymi z naiwnych myszy C57BL/6J w stosunku 1:10 i poddane pulsacji 0,5 μmol/ml OVA_257-264 peptyd przez 40 godzin. Następnie do hodowli doda się Brefeldynę A na kolejne 4 godziny.
      4. Po zakończeniu kokultywacji komórki zostaną zebrane, przemyte i zablokowane za pomocą blokerów Fc zgodnie z powyższym opisem.
      5. Zablokowane komórki zostaną zabarwione pod kątem markerów powierzchniowych, takich jak CD8 i łańcuch TCR Vβ5, przy użyciu przeciwciał sprzężonych z fluorochromami.
      6. Po barwieniu powierzchni komórek, zostaną one utrwalone za pomocą 4% formaldehydu i permeabilizowane przy użyciu zestawu do permeabilizacji komórek.
      7. Po permeabilizacji cząsteczki wewnątrzkomórkowe, takie jak IL-2 i IFN-γ, zostaną zabarwione przy użyciu przeciwciał koniugowanych z fluorochromem.
      8. Przed końcową analizą cytometryczną komórki zostaną trzykrotnie przemyte zimnym buforem PBS w celu usunięcia nadmiaru przeciwciał.
   4. In vivo test aktywności bakteriobójczej Rycina 3C.
      1. Splenocyty od naiwnych myszy C57BL/6J zostaną wyizolowane i znakowane karboksyfluoresceiną w postaci estru suksynimidylowego (CFSE) w celu uzyskania komórek docelowych.
      2. Komórki znakowane 5 μmol/ml CFSE (CFSE^Cześć komórki) zostaną poddane pulsacji z użyciem 10 μg/ml OVA_257-264 peptyd i komórki znakowane 0,5 μmol/ml CFSE (CFSE^lo komórki) nie zostaną poddane impulsom.
      3. Mieszanina 2,5x10⁶ CFSE^Cześć komórki plus 2,5x10⁶ CFSE^lo komórki zostaną przeniesione adoptywnie poprzez wstrzyknięcie dożylne do wskazanego biorcy.
      4. Po 16 godzinach zostanie wyizolowane splenocyty od tych myszy, a następnie za pomocą cytometrii przepływowej przeanalizowane zostaną komórki CFSE+.
   5. Oznaczanie liczby komórek nowotworowych w jamie otrzewnej. Rycina 4.
      W 20. dniu po wywołaniu nowotworu myszy zostaną uśmiercone, a następnie wykonane zostanie płukanie jamy otrzewnej przy użyciu zimnego PBS. Policzone zostaną komórki nowotworowe odzyskane z płuczki otrzewnowej.
   6. Identyfikacja limfocytów T naciekających guz. Rysunek 5.
      1. W późnej fazie wywoływania nowotworu myszy zostaną uśmiercone, a guzy zostaną usunięte z jamy otrzewnej u zwierząt z różnych grup.
      2. Guz zostanie pocięty na fragmenty; jeden fragment zostanie umieszczony w krioprobówce i natychmiast umieszczony na suchym lodzie, druga połowa zostanie utrwalona w formaldehydzie, a trzeci fragment zostanie zachowany w kondycjonowanym medium RPMI-1640 do późniejszego wykorzystania.
      3. H&Barwienie E zostanie wykonane zgodnie z ogólnym protokołem na próbkach utrwalonych formaldehydem i zatopionych w parafinie.
      4. Barwienie immunofluorescencyjne zostanie przeprowadzone na próbkach kriozachowanych.
         1. Tkankę należy pociąć i przechowywać w temperaturze -20 °C do momentu użycia.
         2. Przetoki tkankowe należy suszyć na powietrzu przez 15 minut, a następnie utrwalać w zimnym acetonie przez 15 minut.
         3. Po utrwaleniu preparaty należy suszyć na powietrzu przez kolejne 15 minut, a następnie płukać w PBS przez 5 minut.
         4. Po przemyciu należy umieścić preparaty w komorze wilgotnej i pokryć skrawki tkanki 30 μl 3% BSA w PBS na 30 minut w celu zablokowania nieswoistego wiązania.
         5. Po zakończeniu blokowania należy osuszyć preparaty z buforu blokującego i pokryć skrawki tkanek 50 μl mieszaniną przeciwciał PE-anty-TCR Vα2 oraz przeciwciał FITC-anty-OVA rozcieńczonych w 3% BSA w PBS.
         6. Inkubować w komorze wilgotnościowej przez 2 godziny, a po zakończeniu inkubacji preparaty wypłukać trzykrotnie w zimnym PBS i zamontować w wodnym medium montażowym przed badaniem pod mikroskopem fluorescencyjnym.
      5. Analiza cytometryczna limfocytów T naciekających guz.
         1. Guz zostanie rozdrobniony do postaci zawiesiny pojedynczych komórek, a erytrocyty zostaną poddane lizie przy użyciu buforu lizującego ACK.
         2. Po przemyciu i blokowaniu komórki zostaną znakowane różnymi przeciwciałami sprzężonymi z fluorochromami, które swoiście rozpoznają cząsteczki CD8, TCR Vα2 oraz TCR Vβ5 wykazujące ekspresję na powierzchni komórek.
   7. Przeżywalność myszy. Rysunek 6.
      Po wywołaniu nowotworu przeżywalność myszy będzie starannie monitorowana.

4. Reprezentatywne wyniki

CD3 i TCRβ są wykorzystywane jako markery limfocytów T. Aby określić, czy stymulacja komórek iPS ligandem Notch DL1 może przyczyniać się do różnicowania limfocytów T, oceniono ekspresję CD3 i TCRβ⁺ w komórkach pochodzących z iPS, a następnie przeanalizowano ekspresję CD4 i CD8, stosując bramkowanie na populacji CD3⁺ i TCRβ⁺. Jak pokazano tutaj, w 22. dniu z komórek iPS in vitro wygenerowano pojedynczo dodatnie (SP) limfocyty T CD3⁺ TCRβ⁺ CD4^- CD8⁺. Dodatkowo, pochodzące z komórek iPS komórki SP były zdolne do produkcji IL-2 i IFN-γ po stymulacji in vitro przeciwciałami anty-CD3 naniesionymi na płytkę oraz rozpuszczalnymi przeciwciałami anty-CD28 (Ryc. 2), co sugeruje, że limfocyty T pochodzące z komórek iPS są funkcjonalne.

Po transferze adoptywnym do myszy biorców większość iPS komórek z transdukcją genu TCR uległa różnicowaniu w CTL CD8⁺, które reagowały in vitro na stymulację peptydową poprzez sekrecję IL-2 i IFN-γ (Rys. 3). Co najważniejsze, transfer adoptywny iPS komórek z transdukcją TCR wywołał infiltrację tkanek nowotworowych przez CTL reaktywne na OVA i ochronił zwierzęta przed wyzwaniem nowotworowym (Rys. 5-6). Zatem iPS komórki z transdukcją genu TCR mogą różnicować się in vivo w funkcjonalne, swoiste dla antygenu CTL.

Rycina 1. Morfologia różnicowania komórek iPS. W różnych dniach komórki iPS myszy były współhodowane z komórkami OP9-DL1 w medium α-MEM uzupełnionym o 20% FCS i 2,2 g/L wodorowęglanu sodu w obecności 5 ng/ml mFlt3L i 1 ng/ml mIL-7.

Rycina 2. Różnicowanie limfocytów T z komórek iPS. Mysie komórki iPS współhodowano z komórkami OP9-DL1 zgodnie z opisem w Rycini 1. W 22. dniu wyizolowano i przeanalizowano komórki pochodzące z iPS. A) Komórki CD4⁺ CD8^- lub CD4^- CD8⁺ po bramkowaniu populacji CD3⁺ i TCRβ⁺. B) Komórki stymulowano przeciwciałami anty-CD3 unieruchomionymi na płytce oraz rozpuszczalnymi przeciwciałami anty-CD28 przez 5 godzin w 37 °C przy 5% CO₂. Poziomy IL-2 i IFN-γ analizowano za pomocą barwienia wewnątrzkomórkowego po bramkowaniu żywych limfocytów T CD4^- CD8⁺.

Rycina 3. Antygenspecyficzne CD8⁺ Różnicowanie komórek iPS w limfocyty T in vivoWstrzyknięto komórki iPS z przetransdukowanym genem TCR OT-I. dożylnie myszy C57BL/6. Po sześciu do dziesięciu tygodniach swoiste dla OVA limfocyty CD8⁺ Vβ5⁺ Określono stopień rozwoju limfocytów T. A) CD8⁺ Vβ5⁺ Limfocyty T z połączonych węzłów chłonnych i śledziony przeanalizowano metodą cytometrii przepływowej po wyznaczeniu bramki dla CD8.⁺ populacji. B) Produkcję IL-2 i IFN-γ (linie ciemne; obszary zacieniowane wskazują kontrole izotypowe) określono za pomocą wewnątrzkomórkowego barwienia cytokin po wyznaczeniu bramki dla CD8⁺ Vβ5⁺ populacji. C) In vivo test proliferacji/cytotoksyczności. CFSE^Witaj (prawe piki) i CFSE^lo (lewe piki) komórki docelowe poddano impulsowej elektroporacji OVA_257-264 odpowiednio peptyd oraz kontrolę, a następnie wstrzyknięto je myszom dziesięć tygodni po transferze komórek iPS lub jeden dzień po transferze CTL OT-I.

Rysunek 4. Adoptywny transfer iPS z transdukcją genu TCR OT-I hamuje wzrost nowotworu. iPS z transdukcją genu TCR OT-I zostały przetransferowane adoptywnie do myszy C57BL/6. Jednej grupie myszy wstrzyknięto reaktywne na OVA limfocyty T CD8⁺ pochodzące z transgenicznych myszy TCR OT-I, a w drugiej grupie myszy nie przeprowadzono transferu komórek. Po sześciu tygodniach lub w dniu następującym po transferze komórek, myszy poddano wyzwaniu komórkami nowotworowymi E. G7. W 20. dniu policzono komórki nowotworowe w jamie otrzewnej.

Rycina 5. CTL swoiste wobec antygenu pochodzące z komórek iPS infiltrują tkanki nowotworowe. W 30. do 35. dnia po wywołaniu nowotworu badano tkanki nowotworowe pod kątem infiltracji limfocytów T reaktywnych przeciwko nowotworowi. A) Barwienie H&E. Komórki zapalne infiltrujące tkanki nowotworowe (↓). B) Barwienie immunohistochemiczne. OVA-swoiste CTL Vα2⁺ (czerwone) infiltrujące tkanki nowotworowe wykazujące ekspresję OVA (zielone). C) Zawiesiny pojedynczych komórek z tkanek nowotworowych analizowano pod kątem ekspresji Vα2⁺ oraz Vβ5⁺ za pomocą cytometrii przepływowej po wyselekcjonowaniu populacji CD8⁺.

Rycina 6. Adoptywny transfer iPS komórek przetransdukowanych genem TCR OT-I podtrzymuje przeżywalność myszy. iPS komórki przetransdukowane genem OVA TCR zostały przeniesione adoptywnie do myszy C57BL/6 poddanych wyzwaniu komórkami nowotworowymi E. G7, zgodnie z opisem w Ryc. 4. Przeżywalność myszy w 50. dniu przedstawiono za pomocą krzywych przeżycia Kaplana-Meiera (n=6).

Dyskusja

W przypadku terapii opartych na ACT, optymalnym podejściem jest generowanie in vitro dużej liczby wysoce reaktywnych limfocytów T swoistych dla Ag w celu ponownego wprowadzenia ich in vivo. Chociaż nasza metoda in vitro pozwala na uzyskanie funkcjonalnych limfocytów T z komórek iPS, znaczna liczba komórek pochodzących z iPS obumiera w ciągu czterech tygodni, szczególnie w czwartym tygodniu. Wnioskujemy, że sygnały przeżycia z szlaku Notch pośredniczone przez DL1, a także IL-7 i FLt3L, są niewys...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Myszy C57BL/6J	Jackson Laboratory	000664
B6.129S7-Rag1tm1Mom/J	Jackson Laboratory	002216
Przeciwciało anty-CD3 (2C11)	BD Biosciences	553058
Przeciwciało anty-CD28 (37.51)	BD Biosciences	553295
Przeciwciało anty-CD3 (17A2)	BioLegend	100202
Przeciwciało anty-CD4 (GK1.5)	BioLegend	100417
Przeciwciało anty-CD8 (53-6.7)	BioLegend	100714
Przeciwciało anty-CD25 (3C7)	BioLegend	101912
Przeciwciało anty-CD44 (1M7)	BioLegend	103012
Przeciwciało anty-CD117 (2B8)	BioLegend	105812
Przeciwciało anty-TCR-β (H57597)	BioLegend	109220
Przeciwciało anty-IL-2 (JES6-5H4)	BioLegend	503810
Przeciwciało anty-IFN-γ (XMG1.2)	BioLegend	505822
DMEM	Invitrogen	ABCD1234
α-MEM	Invitrogen	A10490-01
FBS	Hyclone	SH3007.01
Brefeldyna A	Sigma-Aldrich	B7651
Polybrene	Sigma-Aldrich	107689
GeneJammer	Integrated Sciences	204130
Zestaw do izolacji RNA	Qiagen	74104
Zestaw do izolacji DNA	Qiagen	69504
Zestaw do izolacji CD8	Miltenyi Biotec	130-095-236
Bufor lizujący ACK	Lonza Inc.	10-548E
mFlt-3L	PeproTech Inc	250-31L
mIL-7	PeproTech Inc	217-17
Żelatyna	Sigma-Aldrich	G9391
Przeciwciało FITC-anty-OVA	Rockland Immunochemicals	200-4233
Bufor do permeabilizacji	Biolegend	421002
BSA	Sigma-Aldrich	A7906
Formaldehyd	Sigma-Aldrich	F8775
Filtr 0,4 μm	EMD Millipore
Sorter komórkowy Moflo	Dako
Cytometr przepływowy Calibur	BD Biosciences
Cytometr przepływowy LSR II	BD Biosciences
Restryktor dla myszy	Braintree Scientific, Inc.