Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Analiza reporterowa Oct4GiP w celu badania genów regulujących utrzymanie i samoodnawianie macierzystych komórek embrionalnych myszy

10.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/3987

⸱

30 maja 2012

 , 
1Laboratory of Molecular Carcinogenesis, National Institute of Environmental Health Sciences

W tym artykule

Podsumowanie

Opisujemy test z reporterem fluorescencyjnym służący do szybkiej identyfikacji i charakterystyki genów regulujących utrzymanie oraz samoodnawianie embrionalnych komórek macierzystych myszy.

Streszczenie

Pluripotencjalność i zdolność do samoodnowy to dwie definiujące cechy embrionalnych komórek macierzystych (komórek ES). Zrozumienie podstawowych mechanizmów molekularnych znacznie ułatwi wykorzystanie komórek ES w badaniach nad biologią rozwoju, modelowaniu chorób, odkrywaniu leków oraz w medycynie regeneracyjnej (przegląd w 1,2).

Aby przyspieszyć identyfikację i charakterystykę nowych regulatorów utrzymania oraz samoodnawiania komórek ES, opracowaliśmy test oparty na fluorescencyjnym reporterze do ilościowego pomiaru stanu samoodnawiania w mysich komórkach ES z wykorzystaniem linii Oct4GiP 3. Komórki Oct4GiP wykazują ekspresję zielonego białka fluorescencyjnego (GFP) pod kontrolą regionu promotora genu Oct4 4,5. Oct4 jest niezbędny do samoodnawiania komórek ES, wykazuje wysoką ekspresję w tych komórkach i jest szybko wyciszany podczas różnicowania 6,7. W rezultacie ekspresja GFP i fluorescencja w komórkach reporterowych ściśle korelują z tożsamością komórek ES 5, a analiza za pomocą sortowania komórek aktywowanego fluorescencją (FACS) może być wykorzystana do precyzyjnego monitorowania stanu samoodnawiania komórek na poziomie pojedynczej komórki 3,8.

W połączeniu z RNAi, test reporterowy Oct4GiP może być wykorzystany do szybkiej identyfikacji i badania regulatorów utrzymania oraz samoodnawiania komórek ES 3,8. W porównaniu do innych metod oceny samoodnawiania jest on wygodniejszy, bardziej czuły, ilościowy i tańszy. Może być przeprowadzany w płytkach 96- lub 384-dołkowych w celu prowadzenia badań na dużą skalę, takich jak przesiewy wysokoprzepustowe czy analiza epistazy genetycznej. Wreszcie, dzięki zastosowaniu innych linii komórek ES z reporterami specyficznymi dla danej linii komórkowej, opisany tutaj test może zostać zmodyfikowany w celu badania specyfikacji losu podczas różnicowania komórek ES.

Protokół

1. Hodowla komórek ES myszy Oct4GiP

Komórki Oct4GiP zostały uprzejmie udostępnione przez dr. Austina Smitha. Pochodzą one od myszy szczepu 129/Ola niosących transgen Oct4-GFPiresPac 4,5 . Są one utrzymywane na płytkach do hodowli tkankowej powlekanych żelatyną w pełnej pożywce ESGRO complete plus clonal grade (Millipore) lub w pożywce M15: DMEM (Invitrogen) uzupełnionej o 15% FBS, 1000 U/ml ESGRO (Millipore), 1x nieessential amino acids (Invitrogen), 1x EmbryoMax Nucleasides (Millipore) oraz 10 μM β-merkaptoetanolu.

  1. Pokryć płytki 0,1% żelatyną (Sigma) w temperaturze pokojowej przez 30 minut (0,1 ml roztworu żelatyny/cm2).
  2. Wysiać komórki Oct4GiP na płytkach pokrytych żelatyną w zagęszczeniu ~2 x 104/cm2.
  3. Przesiewać komórki co dwa dni przy użyciu 0,05% trypsyny.

2. Transfekcja siRNA w komórkach Oct4GiP

Test reportera Oct4GiP najwygodniej jest przeprowadzać w płytkach 96- lub 384-dołkowych z płaskim dnem, pokrytych żelatyną (Corning lub BD), w pożywce M15. Ogólna procedura została przedstawiona na Rysunku 1.

  1. Przygotowanie kompleksów siRNA-lipid:
    1. W przypadku transfekcji na płytkach 96-dołkowych, przygotować kompleksy siRNA-lipid w płytkach 96-dołkowych z dnem w kształcie litery U.
    2. W każdym dołku zmieszać 10 μl OptiMEM (Invitrogen) oraz 0.3 μl Lipofectamine 2000 (Invitrogen) i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 min.
    3. Do mieszaniny lipid-OptiMEM dodać 5 pmol siRNA i inkubować przez kolejne 15 minut. Stosunek siRNA : lipid wynosi 100 pmol : 6ul.
    4. Przenieść kompleksy siRNA-lipid w OptiMEM z płytki z dnem w kształcie litery U do płytki z płaskim dnem pokrytej żelatyną za pomocą pipety wielokanałowej.
    5. W przypadku transfekcji na płytkach 384-dołkowych, przygotować kompleksy siRNA-lipid, stosując 0.1 μl Lipofectamine 2000 i 2 pmol siRNA w 10 μl OptiMEM.

Uwaga: Końcowe stężenie siRNA w transfekcjach wynosi 50 nM. Należy wykonać 3-4 powtórzenia biologiczne dla każdej transfekcji siRNA. Przygotować mieszaniny główne (master mix) kompleksów siRNA-lipid w płytce z wypukłym dnem (U-bottom), a następnie rozdzielić je do płytki z płaskim dnem pokrytej żelatyną.

  1. Wysiew i transfekcja komórek Oct4GiP:
    1. W przypadku transfekcji w płytkach 96-dołkowych, zebrać komórki Oct4GiP i resuspender je w świeżym medium M15 do stężenia 9 x 104 komórek/ml.
    2. Za pomocą pipety wielokanałowej nanieść 100 μl zawiesiny komórkowej do każdego dołka.
    3. Wymieszać zawiesinę komórkową z wcześniej naniesionymi kompleksami siRNA-lipidami w dołku, pipetując ciecz w górę i w dół 3-5 razy. Zmieniać końcówki przy transfekcjach różnymi siRNA.
    4. W przypadku transfekcji w płytkach 384-dołkowych, resuspender komórki Oct4GiP do stężenia 6 x 104 komórek/ml i nanieść 30 μl zawiesiny komórkowej do każdego dołka.

Uwaga: Optymalna gęstość wysiewu komórek to zazwyczaj 3 x 105 cells/cm2, jednak może ona wymagać dalszej optymalizacji w przypadku siRNAs, które drastycznie wpływają na wzrost lub żywotność komórek. Niska gęstość wysiewu prowadzi do słabej przeżywalności komórek podczas transfekcji. Wysoka gęstość wysiewu prowadzi do wysokiego tła z powodu różnicowania indukowanego wysoką konfluencją komórek. W razie potrzeby należy przetestować gęstość wysiewu w zakresie 2-4 x 105 cells/cm2.

  1. Wymiana pożywki:
    1. Usunąć starą pożywkę za pomocą aspiratora wielokanałowego (Corning) lub końcówki do aspiracji próżniowej (VP-Scientific). Należy uważać, aby nie uszkodzić komórek znajdujących się na dnie płytek.
    2. Codziennie dostarczać komórkom świeżą pożywkę dla komórek ES (100 μl dla płytki 96-dołkowej i 30 μl dla płytki 384-dołkowej) przy użyciu pipety wielokanałowej.

3. Analiza FACS

  1. Dysocjacja komórek:
    1. Cztery dni po transfekcji usunąć medium za pomocą aspiratora wielokanałowego (Corning) lub ssawki próżniowej (VP-Scientific).
    2. W przypadku płytek 96-dołkowych wypłukać komórki raz 100 μl PBS.
    3. Do każdego dołka dodać 25 μl 0,25% trypsyny za pomocą pipety wielokanałowej.
    4. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut, okresowo wytrząsając i wizualnie sprawdzając, czy komórki całkowicie się odkleiły.
    5. Dodać 90 μl PBS z 10% FBS, aby dezaktywować trypsynę, a następnie dysocjować komórki do postaci zawiesiny pojedynczych komórek poprzez wielokrotne pipetowanie.
    6. W przypadku płytek 384-dołkowych zdysocjować komórki za pomocą 10 μl trypsyny i zneutralizować 30 μl PBS z 10% FBS.
  2. Analiza FACS:
    1. Analizę fluorescencji GFP przeprowadzić na analizatorze FACS BD LSRII wyposażonym w moduł HTS lub innym podobnie wyposażonym analizatorze FACS (np. Accuri lub Intellicyt).
    2. Użyć trybu wysokoprzepustowego w HTS i przeanalizować 10 μl zawiesiny komórek. Ustawić próg zliczania na 1,0 x 104 komórek.
    3. Dostosować napięcie PMT oraz próg, aby uchwycić komórki na wykresie rozrzutu forward vs. side-scatter. Wyznaczyć bramkę dla populacji żywych komórek na wykresie forward vs. side-scatter.
    4. Utworzyć histogram dla kanału GFP. Ustawić bramkę w kanale GFP tak, aby w komórkach poddanych transfekcji mock lub kontrolnym siRNA około 10% komórek wydawało się być GFP-ujemnych.
    5. Wyznaczyć % komórek GFP-ujemnych dla każdej próby: % komórek zróżnicowanych = % komórek GFP-ujemnych. Porównać % komórek zróżnicowanych między transfekcjami siRNA eksperymentalnymi a kontrolnymi za pomocą obustronnego testu t, a wyniki pozytywne ocenić przy wartościach p < 0,01.

4. Reprezentatywne wyniki

Oct4, Nanog i Sox2 to trzy geny, które odgrywają krytyczną rolę w utrzymaniu zdolności do samoodnawiania komórek ES 6,7,9-11. Rycina 2 pokazuje, że test reporterowy Oct4GiP pozwala na łatwe wykrycie różnicowania wywołanego wyciszeniem tych czynników w komórkach ES Oct4GiP.

Rycina 2A pokazuje, że komórki ES Oct4GiP są dodatnie pod kątem GFP, gdy są utrzymywane jako komórki ES. Rycina 2B przedstawia wykres rozrzutu forward scatter vs. side scatter oraz histogram kanału GFP dla komórek Oct4GiP transfekowanych kontrolnymi siRNA lub siRNA przeciwko Oct4. Konieczne jest wyznaczenie bramki dla żywych komórek na wykresie forward scatter vs. side scatter, ponieważ martwe komórki i debris są ujemne pod kątem GFP i zwiększą tło. Z drugiej strony, dyskryminacja dubletów w celu wykluczenia możliwych skupisk komórek nie zawsze jest wymagana. W komórkach transfekowanych kontrolnym siRNA zdecydowana większość komórek powinna być dodatnia pod kątem GFP. Jeśli w studzienkach z komórkami transfekowanymi kontrolnym siRNA występują wyraźne populacje ujemne pod kątem GFP, może to oznaczać, że wyjściowe komórki Oct4GiP lub procedura transfekcji zostały naruszone, a wynik może być nieinterpretowalny.

Rycina 2C przedstawia wykres słupkowy obrazujący % zróżnicowanych komórek (% zróżnicowanych komórek = % komórek GFP-ujemnych) z komórek transfekowanych siRNA kontrolnym, Oct4-, Nanog- oraz Sox2-.

Schemat transfekcji siRNA w komórkach ES Oct4GiP; analiza FACS komórek GFP-ujemnych.
Rysunek 1. Schemat testu reporterowego Oct4GiP.

Cytometria przepływowa, analiza FACS dla GFP, efekty siRNA. Wykres słupkowy: procent różnicowania komórek.
Rysunek 2. Test reporterowy Oct4GiP umożliwia wykrycie różnicowania komórek ES wywołanego wyciszeniem Nanog, Oct4 lub Sox2. A) Komórki E14Tg2a (typ dziki, czarna linia) oraz Oct4GiP (zielona linia) poddano analizie FACS. Histogram kanału GFP pokazuje, że komórki Oct4GiP są dodatnie pod kątem GFP. B) Komórki Oct4GiP w płytkach 96-dołkowych przetransfekowano siRNA kontrolnym lub siRNA przeciwko Oct4, a następnie poddano analizie FACS 4 dni po transfekcji. Przedstawiono wykresy rozrzutu forward scatter vs side scatter oraz histogramy kanału GFP dla przetransfekowanych komórek. C) Komórki Oct4GiP przetransfekowano siRNA kontrolnym lub siRNA przeciwko Nanog, Oct4 lub Sox2. Procent zróżnicowanych komórek (% Differentiated Cells) określono na podstawie procentu komórek ujemnych pod kątem GFP 4 dni po transfekcji i przedstawiono jako średnią +/- błąd standardowy średniej (n = 4). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony rysunek.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opisany powyżej test reporterowy Oct4GiP pozwala na ilościowy pomiar zakresu samoodnawiania w stosunku do różnicowania. W porównaniu z innymi dostępnymi metodami, takimi jak testy oparte na morfologii 12 oraz proliferacji/żywotności, oferuje on wyższą czułość i przepustowość, a także bardziej bezpośredni pomiar stanu komórek ES. Jest on zatem odpowiedni do prowadzenia przesiewów na dużą skalę oraz analizy epistazy genetycznej. Rzeczywiście, my oraz inni badacze z sukcesem wykorzystaliśmy test reporterowy Oct4G...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Dziękujemy Bradowi Lackfordowi za przeczytanie i redakcję manuskryptu. Badania te były wspierane przez National Institute of Environmental Health Sciences, National Institutes of Health Intramural Research Program Z01ES102745 (dla G. H.).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
pożywka ESGRO complete plus clonal gradeEMD MilliporeSF001-500P
DMEM (wysoka zawartość glukozy, 1X)Invitrogen11965
0,25% trypsyna-EDTAInvitrogen25200
Lipofectamine 2000Invitrogen1001817
OPTI-MEM (pożywka z obniżoną zawartością surowicy)Invitrogen31985
ESGRO mLIF (107 jednostek/1 ml)EMD MilliporeDAM1776540
MEM NEAA (aminokwasy nieessentialne)Invitrogen11140
100x nukleozydy dla komórek ES EMD Millipore10620-1
2-merkapto–etanolSigma-AldrichM7522-100ml
płodowa surowica bydlęca kwalifikowana pod kątem ESInvitrogen10437
siRNA przeciwko NanogInvitrogenMSS231181
siRNA przeciwko Oct4DharmaconD-046256-02
siRNA przeciwko Sox2DharmaconM-058489-01
Kontrolne siRNA: dupleks siRNA celujący w lucyferazę świetlika (5’-CGTACGCGGAATACTTCGA) zsyntezowany przez firmę Dharamcon.

Bibliografia

  1. Keller, G. Embryonic stem cell differentiation: emergence of a new era in biology and medicine. Genes Dev. 19, 1129-1155 (2005).
  2. Murry, C. E., Keller, G. Differentiation of embryonic stem cells to clinically relevant populations: lessons from embryonic development. Cell. 132, 661-680 (2008).
  3. Hu, G. A genome-wide RNAi screen identifies a new transcriptional module required for self-renewal. Genes Dev. 23, 837-848 (2009).
  4. Ying, Q. L., Nichols, J., Evans, E. P., Smith, A. G. Changing potency by spontaneous fusion. Nature. 416, 545-548 (2002).
  5. Ying, Q. L., Smith, A. G. Defined conditions for neural commitment and differentiation. Methods Enzymol. 365, 327-341 (2003).
  6. Nichols, J. Formation of pluripotent stem cells in the mammalian embryo depends on the POU transcription factor Oct4. Cell. 95, 379-391 (1998).
  7. Niwa, H., Miyazaki, J., Smith, A. G. Quantitative expression of Oct-3/4 defines differentiation, dedifferentiation or self-renewal of ES cells. Nat. Genet. 24, 372-376 (2000).
  8. Ding, L. A genome-scale RNAi screen for Oct4 modulators defines a role of the Paf1 complex for embryonic stem cell identity. Cell Stem Cell. 4, 403-415 (2009).
  9. Chambers, I. Functional expression cloning of Nanog, a pluripotency sustaining factor in embryonic stem cells. Cell. 113, 643-655 (2003).
  10. Masui, S. Pluripotency governed by Sox2 via regulation of Oct3/4 expression in mouse embryonic stem cells. Nat. Cell Biol. 9, 625-635 (2007).
  11. Mitsui, K. The homeoprotein Nanog is required for maintenance of pluripotency in mouse epiblast and ES cells. Cell. 113, 631-642 (2003).
  12. Fazzio, T. G., Huff, J. T., Panning, B. An RNAi screen of chromatin proteins identifies Tip60-p400 as a regulator of embryonic stem cell identity. Cell. 134, 162-174 (2008).
  13. Pease, S., Braghetta, P., Gearing, D., Grail, D., Williams, R. L. Isolation of embryonic stem (ES) cells in media supplemented with recombinant leukemia inhibitory factor. 141, 344-352 (1990).
  14. Young, R. A. Control of the embryonic stem cell state. Cell. 144, 940-954 (2011).
  15. Chambers, I. Nanog safeguards pluripotency and mediates germline development. Nature. 450, 1230-1234 (2007).
  16. Maherali, N. Directly reprogrammed fibroblasts show global epigenetic remodeling and widespread tissue contribution. Cell Stem Cell. 1, 55-70 (2007).
  17. Rodda, D. J. Transcriptional regulation of nanog by OCT4 and SOX2. J. Biol. Chem. 280, 24731-24737 (2005).
  18. Schaniel, C. Delivery of short hairpin RNAs--triggers of gene silencing--into mouse embryonic stem cells. Nat. Methods. 3, 397-400 (2006).
  19. Toyooka, Y., Shimosato, D., Murakami, K., Takahashi, K., Niwa, H. Identification and characterization of subpopulations in undifferentiated ES cell culture. Development. 135, 909-918 (2008).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

embrionalne kom rki macierzyste myszyanaliza samoodnawianiaanaliza cytometrycznapomiar ekspresji GFPwyciszanie gen w RNAiprzesiew wysokoprzepustowyanaliza epistazy genetycznejsortowanie kom rek FACSr nicowanie kom rek ES
Analiza reporterowa Oct4GiP w celu badania genów regulujących utrzymanie i samoodnawianie macierzystych komórek embrionalnych myszy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.