Wizualizacja i analiza przepływu krwi oraz zużycia tlenu w mikrokrążeniu wątrobowym: zastosowanie w modelu ostrego zapalenia wątroby

Podsumowanie

Opracowano system optyczny służący do wizualizacji mikrokrążenia wątrobowego z wykorzystaniem erytrocytów znakowanych FITC oraz do pomiaru ciśnienia parcjalnego tlenu w naczyniach mikrokrążenia za pomocą fosforymetrii wspomaganej laserem. Metoda ta może być wykorzystana do badania mechanizmów fizjologicznych i patologicznych poprzez analizę struktury mikrokrążenia, średnicy naczyń, prędkości przepływu krwi oraz napięcia tlenowego.

Streszczenie

Wątroba charakteryzuje się znaczną rozbieżnością między podażą a zapotrzebowaniem na tlen, ponieważ zużycie tlenu w tym narządzie jest stosunkowo wysokie, podczas gdy około 70% dopływu krwi do wątroby stanowi słabo utlenowana krew z żyły wrotnej pochodząca z przewodu pokarmowego i śledziony. Tlen jest dostarczany do hepatocytów przez krew płynącą z końcowej gałęzi żyły wrotnej do żyłki centralnej poprzez sinusoidy, co tworzy gradient tlenowy w zrazikach wątrobowych. Gradient tlenowy jest istotnym parametrem fizycznym, który wpływa na ekspresję enzymów w górnym i dolnym odcinku mikrokrążenia wątrobowego, jednak brak technik pomiaru zużycia tlenu w tym obszarze opóźnił wyjaśnienie mechanizmów związanych z metabolizmem tlenu w wątrobie. W związku z tym zastosowaliśmy erytrocyty znakowane FITC do wizualizacji mikrokrążenia wątrobowego oraz laserową fosforymetrię do pomiaru ciśnienia parcjalnego tlenu w tamtejszych mikronaczyniach. Bezkontaktowy i ciągły pomiar optyczny pozwala na ilościowe określenie prędkości przepływu krwi, średnic naczyń oraz gradientów tlenowych związanych z zużyciem tlenu w wątrobie. W modelu ostrego zapalenia wątroby, indukowanego podaniem paracetamolu myszom, zaobserwowaliśmy zwiększone ciśnienie tlenu zarówno w żyłkach wrotnych, jak i centralnych, ale zmniejszony gradient tlenowy w sinusoidach, co wskazuje, że martwica hepatocytów w strefie okołocentralnej może prowadzić do wzrostu ciśnienia tlenu i wpływać na ekspresję enzymów w strefie okołowrotnej. Podsumowując, nasze optyczne metody pomiaru hemodynamiki wątrobowej i zużycia tlenu mogą ujawnić mechanizmy związane z chorobami wątroby.

Protokół

1. Znakowanie erytrocytów izomerem I izotiocyjanianu fluoresceiny (FITC)

Wszystkie zastosowane protokoły eksperymentalne zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami Wydziału Medycyny Uniwersytetu Keio.

1. Znieczulić mysz dawcę, a po wykonaniu nacięcia laparotomijnego pobrać krew pełną z żyły głównej dolnej za pomocą strzykawki 1-ml zawierającej niewielką ilość heparyny. Myszy natychmiast uśmiercono poprzez wstrzyknięcie pentobarbitalu sodu (100 mg/kg i.p.).
2. Krew pełną przemyć dwukrotnie w PBS (pH 7.4) poprzez wirowanie przez 5 min przy 400 g w rotorze z koszyczkami odchylanymi.
3. Rozpuścić 10 mg FITC w 5 ml 100 mM Na₂HPO₄ i przefiltrować roztwór przez membranę o porach 0.22-μm.
4. W probówce wymieszać 1 ml roztworu FITC z 0.15 ml 3 mM glukozy, 0.25 ml 180 mM NaH₂PO₄ oraz 1.5 ml 100 mM Na₂HPO₄. Dodać 0.2 ml osadu RBC i delikatnie opukać probówkę, aby wymieszać zawartość.
5. Przechowywać probówkę przez 2 godziny w temperaturze 4 °C, a następnie dwukrotnie przemyć barwione RBC w PBS.
6. Nanieść niewielką ilość zawiesiny RBC na szkiełko podstawowe i sprawdzić, czy RBC wyglądają prawidłowo (tj. czy ich kształt i rozmiar są normalne) oraz czy intensywność fluorescencji jest wystarczająca.
7. Zawiesić 0.1 ml RBC w 0.9 ml PBS o pH 7.4 i przechowywać zawiesinę w temperaturze 4 °C do momentu wstrzyknięcia.

2. Przygotowanie barwnika wrażliwego na tlen

1. Rozpuścić 500 mg BSA w 10 ml PBS o pH 7.4.
2. Dodać 30 mg Pd(II)-meso-tetra(4-carboxyphenyl)porphine (Pd-TCPP) do roztworu BSA i mieszać przez noc.
3. (Opcjonalnie) Wyodrębnić Pd-TCPP związany z BSA, stosując chromatografię grawitacyjną lub kolumnę wirową, aby oddzielić go od wolnego Pd-TCPP.
4. Odwirować roztwór w celu usunięcia nierozpuszczonego Pd-TCPP, a następnie przefiltrować nadsącz przez filtr membranowy o porach 0.22-μm.
5. Przechowywać aliquoty po 1 ml w probówkach w temperaturze -20 °C. Unikać wielokrotnych cykli zamrażania i rozmrażania.

3. Przygotowanie zwierząt

1. Do obserwacji mikroskopowej mikrokrążenia przygotuj plastikową płytkę z otworem o średnicy 20 mm i przytwierdź taśmą nad otworem kwadratowe szkiełko nakrywkowe o boku 30 mm.
2. Zanurz mysz w narkozie, usuń sierść i przygotuj skórę. Umieść cewnik w żyle ogonowej do podawania leków, używając igły 30 G połączonej z 10-cm cewnikiem polietylenowym (PE 10) wypełnionym heparynowanym PBS.
3. Po nacięciu pośrodkowym wyciągnij główny płat wątroby na plastikową płytkę i ułóż mysz w pozycji brzusznej.
4. Przygotuj małe paski folii spożywczej (3 mm x 8 mm) i ułóż je wokół krawędzi płata wątroby, aby ograniczyć ruchy wątroby podczas oddychania i zapobiec jej wysychaniu.
5. Obserwuj mikrokrążenie wątrobowe pod mikroskopem (w świetle przechodzącym) i potwierdź, że w polu widzenia nie występuje zastój przepływu krwi przez co najmniej 15 min.
6. Powoli wstrzyknij 0,2 ml znakowanych fluorescencyjnie RBC do obserwacji przepływu krwi lub 0,2 ml roztworu Pd-TCPP do pomiaru pO₂. Taka ilość RBC znakowanych FITC będzie stanowić 1/50 wszystkich RBC krążących w wizualizowanym obszarze.

4. Wizualizacja przepływu krwi

1. Wzbudzić FITC poprzez naświetlanie światłem lampy rtęciowej przepuszczonym przez filtr pasmowy (450–490 nm)¹.
2. zarejestrować obraz fluorescencyjny za pomocą kamery CCD.

5. Pomiar pO₂

Fosforescencja Pd-TCPP jest stosunkowo słaba i powinna być wykrywana za pomocą detektora o wysokiej czułości. Wszystkie eksperymenty muszą być przeprowadzane w ciemni.

1. Makiama absorpcyjna Pd-TCPP przypada na 410 nm i 532 nm, dlatego do wzbudzenia zaleca się zastosowanie długości fali drugiej harmonicznej wynoszącej 532 nm. Długość fali ta może zostać wygenerowana przez impulsowy laser Nd:YAG².
2. Wprowadź wiązkę z lasera Nd:YAG do odpowiedniego portu w mikroskopie odwróconym i ustaw plamkę wiązki w pozycji centralnej w płaszczyźnie ogniskowej. Rozdzielczość przestrzenna zależy od rozmiaru plamki lasera, który zmienia się poprzez przepuszczenie wiązki przez otwór zwężający (pinhole).
3. Aby wykryć fosforescencję, zamocuj filtr długoprzepustowy (>620 nm) oraz fotopowielacz (PMT) do drugiego portu mikroskopu. PMT powinien być czuły na długości fal z zakresu czerwieni, szczególnie w okolicach 700 nm.
4. Próbkuj sygnał fosforescencji (500 punktów próbkowanych przy 200 kHz) i oblicz stałą czasową zaniku, dopasowując funkcję wykładniczą do krzywej zaniku.
5. Do kalibracji przygotuj dwa zestawy próbek roztworu Pd-TCPP z pO₂ 150 mmHg i 0 mmHg. Do próbki dodaj 1% objętościowo ditionianu sodu, aby uzyskać warunki beztlenowe. Podczas kalibracji utrzymuj pH próbek na poziomie 7,4 oraz temperaturę 37 °C.
6. Wyznacz stałą Sterna-Volmera k_q oraz czas zaniku luminescencji w warunkach beztlenowych τ₀ w równaniu (1)³. W naszym przypadku, dla roztworów Pd-TCPP w temperaturze 37 °C i pH 7,4, k_q wynosi 374 mmHg^-1 s^-1, a τ₀ wynosi 0,74 ms. Parametry pomiarowe te zależą od aparatury (tj. lasera, detektora, innych urządzeń optycznych) oraz metody przetwarzania sygnału, dlatego kalibracja jest niezbędna w każdym systemie pomiarowym⁴.
   τ₀/τ = 1 + k_q • τ₀ • pO₂     (1)
7. Umieść mysz na płytce na stole mikroskopu, obserwuj mikrokrążenie wątroby i dopasuj pozycję docelowego mikronaczynia do punktu plamki lasera.

6. Model zapalenia wątroby

1. Pozostawić myszy na czczo z wolnym dostępem do wody przez noc.
2. Przygotować roztwór paracetamolu (APAP) w DMSO o stężeniu 20 mg/ml.
3. Wstrzyknąć go dootrzewnowo w dawce 1 ml/100 g mc (tj. 200 mg/kg mc). Po iniekcji mysz może mieć wolny dostęp do pożywienia i wody ⁵.
4. 24 godziny po iniekcji znieczulić mysz i odsłonić wątrobę, wykonując nacięcie pośrodkowe. W przypadku wywołania zapalenia wątroby, martwica w obszarze okołodocentralnym będzie łatwo widoczna gołym okiem.

7. Reprezentatywne wyniki

Przykładowe obrazy mikrokrążenia wątrobowego przedstawiono na Rysunku 1, gdzie (a) jest obrazem w świetle przechodzącym, a (b) obrazem fluorescencyjnym. W filmie wideo widoczne są pojedyncze erytrocyty znakowane FITC, a żyłki wrotne, sinusoidy i żyłki centralne rozpoznano na podstawie kierunków przepływu krwi.

Jak pokazano na Rysunku 2, plamka lasera naświetlająca żyłę środkową przez obiektyw x100 miała średnicę około 10 μm. Wewnątrznaczyniowe pO₂ w mikrokrążeniu wątrobowym mierzono u samców myszy C57BL/6, a Rysunek 3(a) przedstawia zależności między pO₂ a średnicą naczyń w żyłach wrotnych i środkowych. Gradient pO₂ od żył wrotnych do środkowych wskazuje, że erytrocyty efektywnie uwalniają tlen podczas przechodzenia przez zatoki wątrobowe. Jak pokazano na Rysunku 3(b), średnie pO₂ wynosiło 59,8 mmHg w naczyniach wrotnych, 48,2 mmHg w zatokach i 38,9 mmHg w żyłach środkowych.

Kiedy wywołaliśmy ostre zapalenie wątroby poprzez domięśniowe wstrzyknięcie APAP, wewnątrznaczyniowe pO₂ uległo znacznemu podwyższeniu w każdej części mikrokrążenia wątrobowego: p<0,05 w żyłach wrotnych oraz p<0,01 w zatokach i żyłach centralnych (Rycina 3(c)).

Rycina 1. Obrazy przy małym powiększeniu przedstawiające mikrokrążenie wątrobowe w (a) świetle przechodzącym i (b) fluorescencji.

Rysunek 2. Obraz plamki laserowej naświetlającej docelową żyłkę centralną w celu pomiaru pO₂.

Rysunek 3. Gradient pO₂ w mikrokrążeniu wątrobowym zdrowych myszy kontrolnych oraz myszy z uszkodzeniem wątroby wywołanym podaniem paracetamolu. (a) przedstawia pO₂ w zależności od średnicy naczyń dla żyłek wrotnych (PV) i żyłek centralnych (CV), a (b) przedstawia gradient tlenu od PV do CV poprzez sinusoidy (S). Różnica pO₂ między PV a CV odzwierciedla zużycie tlenu przez hepatocyty lub inne komórki miąższowe. (c) pokazuje, że w warunkach zapalenia wątroby wywołanego podaniem APAP, pO₂ było znacząco podwyższone w PV, S i CV, a gradient pO₂ uległ zmniejszeniu, co wskazuje na upośledzenie zużycia tlenu w wątrobie.

Dyskusja

Dostarczanie tlenu do tkanek jest kluczową funkcją mikrokrążenia, a wiele publikacji opisuje choroby związane z anatomią i reologią mikronaczyniową⁶. Przepływ krwi w wątrobie stanowi kombinację krwi tętniczej i żylnej. Około 30% przepływu krwi do wątroby to dobrze natlenowana krew dostarczana przez tętnicę wątrobową, a pozostałe 70%, dostarczane przez żyłę wrotną, to słabo natlenowany odpływ żylny z śledziony i przewodu pokarmowego⁷. Choroby wątroby, takie jak stłuszczenie wątroby, wstrząs czy nowot...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Pd(II) meso-tetra(4-karboksyfenyl)porfina	Frontier Scientific, Inc.	PdT790
Izomer I izotiocyjanianu fluoresceiny	Sigma-Aldrich Co.	F7250
Paracetamol	Sigma-Aldrich Co.	A7085
Sprzęt
fotopowielacz	hamamatsu photonics k.k	H10722-20