Wizualizacja i analiza przepływu krwi i zużycia tlenu w mikrokrążeniu wątrobowym: zastosowanie do modelu ostrego zapalenia wątroby

Podsumowanie

System optyczny został opracowany do wizualizacji mikrokrążenia wątrobowego z erytrocytami znakowanymi FITC i do pomiaru ciśnienia parcjalnego tlenu w mikronaczyniach za pomocą fosforymetrii wspomaganej laserem. Metoda ta może być stosowana do badania mechanizmów fizjologicznych i patologicznych poprzez analizę struktury mikrokrążenia, średnicy, prędkości przepływu krwi i ciśnienia tlenu.

Streszczenie

Istnieje znaczna rozbieżność między podażą a popytem na tlen w wątrobie, ponieważ zużycie tlenu przez wątrobę jest stosunkowo wysokie, ale około 70% dopływu krwi do wątroby to słabo natleniona krew z żyły wrotnej pochodząca z przewodu pokarmowego i śledziony. Tlen jest dostarczany do hepatocytów przez krew przepływającą z końcowej gałęzi żyły wrotnej do żyły centralnej przez sinusoidy, co powoduje gradient tlenu w zrazikach wątrobowych. Gradient tlenu jest ważnym parametrem fizycznym, który obejmuje ekspresję enzymów przed i za mikrokrążeniem wątrobowym, ale brak technik pomiaru zużycia tlenu w mikrokrążeniu wątrobowym opóźnił wyjaśnienie mechanizmów związanych z metabolizmem tlenu w wątrobie. W związku z tym użyliśmy erytrocytów znakowanych FITC do wizualizacji mikrokrążenia wątrobowego i zastosowaliśmy fosforymetrię wspomaganą laserem do pomiaru ciśnienia parcjalnego tlenu w mikronaczyniach. Bezkontaktowy i ciągły pomiar optyczny może określić ilościowo prędkości przepływu krwi, średnice naczyń i gradienty tlenu związane ze zużyciem tlenu w wątrobie. W modelu ostrego zapalenia wątroby, który stworzyliśmy, podając paracetamol myszom, zaobserwowaliśmy zwiększone ciśnienie tlenu zarówno w żyłkach wrotnych, jak i centralnych, ale zmniejszony gradient tlenu w sinusoidach, co wskazuje, że martwica hepatocytów w strefie okołocentralnej może przesunąć ciśnienie tlenu w górę i wpływać na ekspresję enzymu w strefie okołowrotnej. Podsumowując, nasze optyczne metody pomiaru hemodynamiki wątroby i zużycia tlenu mogą ujawnić mechanizmy związane z chorobami wątroby.

Protokół

1. Znakowanie erytrocytów izomerem izomeru izotiocyjanianu fluoresceiny I (FITC)

Wszystkie protokoły eksperymentalne, których używaliśmy, zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami Szkoły Medycznej Uniwersytetu Keio.

1. Znieczulij myszy dawcy, a po wykonaniu nacięcia celiotomii pobierz pełną krew z żyły głównej dolnej za pomocą 1-mililitrowej strzykawki zawierającej niewielką ilość heparyny. Mysz została natychmiast poddana eutanazji przez wstrzyknięcie pentobarbitalu sodu (100 mg/kg i.p.).
2. Przemyć krew pełną dwukrotnie PBS (pH 7,4) przez odwirowanie przez 5 minut przy 400 g w wirniku z odchylanym wiadrem.
3. Rozpuścić 10 mg FITC w 5 ml 100 mM Na₂HPO₄ i przefiltrować za pomocą membrany o porach 0,22 μm.
4. W probówce zmieszać 1 ml roztworu FITC z 0,15 ml 3 mM glukozy, 0,25 ml 180 mM NaH₂PO₄ i 1,5 ml 100 mM Na₂HPO₄. Dodać 0,2 ml granulatu RBC i postukać w probówkę do mieszania.
5. Przechowywać probówkę przez 2 godziny w temperaturze 4 °C, a następnie dwukrotnie umyć poplamione erytrocyty w PBS.
6. Umieść niewielką ilość zawiesiny RBC na trawie ślizgowej i sprawdź, czy RBC wyglądają zdrowo (tj. czy ich kształt i rozmiar są normalne) i czy intensywność fluorescencji jest wystarczająca.
7. Zawiesić 0,1 ml erytrocytów w 0,9 ml PBS o pH 7,4 i utrzymywać zawiesinę w temperaturze 4 °C do momentu wstrzyknięcia.

2. Przygotowanie barwnika wrażliwego na tlen

1. Rozpuścić 500 mg BSA w 10 ml PBS o pH 7,4.
2. Dodać 30 mg Pd(II)-mezo-tetra(4-karboksyfenylo)porfiny (Pd-TCPP) do roztworu BSA i mieszać przez noc.
3. (Opcjonalnie) Ekstrahować Pd-TCPP związany z BSA za pomocą chromatografii grawitacyjnej przepływowej lub kolumny wirowej w celu oddzielenia go od wolnego Pd-TCPP.
4. Odwirować roztwór w celu usunięcia nierozpuszczonego Pd-TCPP i przefiltrować supernatant za pomocą filtra membranowego o porach 0,22 μm.
5. Przechowywać 1 ml porcji w probówkach w temperaturze -20 °C. Unikać powtarzających się cykli zamrażania i rozmrażania.

3. Przygotowanie zwierząt

1. Do mikroskopowej obserwacji mikrokrążenia przygotuj plastikową płytkę z otworem o średnicy 20 mm i przyklej do otworu kwadratową szklankę o średnicy 30 mm.
2. Znieczul mysz, usuń sierść i przygotuj skórę. Umieścić cewnik w ogonie w celu wstrzyknięcia leku za pomocą igły 30 G połączonej z 10-centymetrowym cewnikiem polietylenowym (PE 10) wypełnionym heparynizowanym PBS.
3. Po środkowym nacięciu rozciągnij główny płat wątroby na plastikowej płytce i umieść mysz w pozycji leżącej mostka.
4. Przygotuj małe płytki z folią kuchenną (3 mm x 8 mm) i ułóż je wokół krawędzi płata wątroby, aby zahamować ruchy wątroby podczas oddychania i zapobiec jej wysuszeniu.
5. Obserwuj mikrokrążenie wątrobowe pod mikroskopem (przy świetle przechodzącym) i upewnij się, że przepływ krwi nie ma zastoju w polu widzenia przez co najmniej 15 minut.
6. Powoli wstrzyknąć 0,2 ml znakowanych fluorescencyjnie krwinek czerwonych w celu obserwacji przepływu krwi lub 0,2 ml roztworu Pd-TCPP w celu pomiaru pO₂ . Ta ilość erytrocytów oznaczonych zgodnie z FITC będzie stanowić 1/50 wszystkich krwinek czerwonych w obiegu w wizualizowanym regionie.

4. Wizualizacja przepływu krwi

1. Wzbudzić FITC, naświetlając go światłem lampy rtęciowej, które przeszło przez filtr pasmowoprzepustowy (450–490 nm)¹.
2. Nagraj obraz fluorescencyjny za pomocą kamery CCD.

5. Pomiar pO₂

Fosforescencja Pd-TCPP jest stosunkowo słaba i powinna być wykrywana za pomocą detektora o wysokiej czułości. Wszystkie eksperymenty muszą być przeprowadzane w ciemnym pomieszczeniu.

1. Piki absorpcji Pd-TCPP wynoszą 410 nm i 532 nm, dlatego do wzbudzenia zalecana jest długość fali drugiej harmonicznej 532 nm. Ta długość fali może być generowana przez laser impulsowy Nd:YAG².
2. Wprowadź wiązkę z lasera Nd:YAG do odpowiedniego portu w mikroskopie odwróconym i ustaw plamkę wiązki do centralnej pozycji w płaszczyźnie ogniskowej. Rozdzielczość przestrzenna zależy od wielkości plamki lasera, która jest zmieniana poprzez przepuszczenie wiązki przez otwór otworkowy.
3. Aby wykryć fosforescencję, podłącz filtr długoprzepustowy (>620 nm) i rurkę fotopowielacza (PMT) do drugiego portu mikroskopu. PMT powinien być czuły na fale czerwone, zwłaszcza około 700 nm.
4. Pobrać próbkę sygnału fosforescencji (500 punktów próbkowanych z częstotliwością 200 kHz) i obliczyć stałą czasową rozpadu, dopasowując funkcję wykładniczą do rozpadu.
5. Do kalibracji należy przygotować dwa zestawy próbek roztworu Pd-TCPP o pO₂ 150 mmHg i 0 mmHg. Dodać ditionit sodu o objętości 1% do próbki, aby uzyskać brak tlenu. Podczas kalibracji utrzymywać pH próbek na poziomie 7,4, a temperaturę na poziomie 37 °C.
6. Ustalić stałą Sterna-Volmera k_q i czas zaniku luminescencji beztlenowej τ₀ w równaniu (1)³. W naszym przypadku, z roztworami Pd-TCPP w temperaturze 37 °C i pH 7,4, k_q wynosi 374 mmHg-1 ^s-1, a τ₀ wynosi 0,74 ms. Te parametry pomiarowe zależą od sprzętu (tj. lasera, detektora, innych urządzeń optykalnych) oraz sposobu przetwarzania sygnału, dlatego w każdym układzie pomiarowym⁴ potrzebna jest kalibracja.
   τ₀/τ = 1 + k_q • τ₀ • pO₂     (1)
7. Ustaw mysz na płytce na stoliku mikroskopu, obserwuj mikrokrążenie wątrobowe i dostosuj położenie docelowego mikronaczynia do punktu plamki lasera.

6. Model zapalenia wątroby

1. Szybkie myszy ze swobodnym dostępem do wody w nocy.
2. Przygotować roztwór paracetamolu w dawce 20 mg na ml (APAP) w DMSO.
3. Wstrzykiwać go dootrzewnowo w dawce 1 ml/100 g m.c. (t.j. 200 mg/kg mc.). Po wstrzyknięciu mysz może mieć swobodny dostęp do jedzenia i wody ⁵.
4. 24 godziny po wstrzyknięciu znieczulić mysz i odsłonić wątrobę, wykonując środkowe nacięcie. Jeśli dojdzie do zapalenia wątroby, martwica w okolicy okołocentralnej będzie łatwo widoczna gołym okiem.

7. Reprezentatywne wyniki

Przykładowe obrazy mikrokrążenia wątrobowego są pokazane na rysunku 1, gdzie (a) jest obrazem w świetle przechodzącym, a (b) jest obrazem fluorescencyjnym. Poszczególne erytrocyty znakowane FITC są obserwowane w filmie wideo, a żyłki wrotne, sinusoidy i żyłki centralne są rozpoznawane na podstawie kierunków przepływu krwi.

Jak pokazano na rysunku 2, plamka laserowa naświetlająca centralną żyłę przez soczewkę obiektywu x100 miała około 10 μm średnicy. Wewnątrznaczyniowe pO₂ w mikrokrążeniu wątrobowym mierzono u samców myszy C57BL / 6, a rycina 3 (a) pokazuje relacje między pO₂ a średnicą naczynia w żyłkach wrotnych i centralnych. Gradient pO₂ od żyłek wrotnych do centralnych wskazuje, że erytrocyty skutecznie uwalniają tlen podczas przechodzenia przez sinusoidy. Jak pokazano na rycinie 3(b), średnie pO₂ wynosiło 59,8 mmHg w naczyniach wrotnych, 48,2 mmHg w sinusoidach i 38,9 mmHg w żyłkach centralnych.

Gdy wytworzyliśmy ostre zapalenie wątroby poprzez wstrzyknięcie APAP dootrzewnowo, wewnątrznaczyniowe pO₂ było znacznie podwyższone w każdej części mikrokrążenia wątrobowego: p<0,05 w żyłach wrotnych i p<0,01 w sinusoidach i żyłach centralnych (Rysunek 3(c)).

Rysunek 1. Obrazy w małym powiększeniu przedstawiające mikrokrążenie wątrobowe ze (a) światłem przechodzącym i (b) fluorescencją.

Rysunek 2. Obraz plamki laserowej naświetlającej docelową żyłę centralną do pomiaru pO₂

.

Rycina 3. Gradient pO₂ w mikrokrążeniu wątrobowym zdrowych myszy kontrolnych i myszy z uszkodzeniem wątroby wywołanym paracetamolem. (a) pokazuje pO₂ w funkcji średnicy naczynia dla żyłek wrotnych (PV) i żyłek centralnych (CV), oraz (b) pokazuje gradient tlenu od PV do CV za pomocą sinusoid (S). Różnica pO₂ między PV a CV odzwierciedla zużycie tlenu przez hepatocyty lub inne komórki miąższowe. (c) wykazuje, że w stanach zapalenia wątroby wywołanego podaniem APAP, pO₂ było znacznie podwyższone w PV, S i CV, a gradient pO₂ zmniejszył się, co wskazuje, że zużycie tlenu w wątrobie było upośledzone.

Dyskusja

Dostarczanie tlenu do tkanek jest istotną rolą mikrokrążenia, a wiele prac opisuje choroby związane z anatomią mikronaczyń i reologią⁶. Przepływ krwi w wątrobie to połączenie krwi tętniczej i żylnej. Około 30% przepływu krwi do wątroby to dobrze natleniona krew dostarczana przez tętnicę wątrobową, a pozostałe 70%, dostarczane przez żyłę wrotną, to słabo natleniony odpływ krwi żylnej ze śledziony i przewodu pokarmowego⁷. Choroby wątroby, takie jak stłuszczenie wątroby, wstrząs lub guz, zmieniają prze...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Pd(II) mezo-tetra(4-karboksyfenylo)porfina	Frontier Scientific, Inc.	PdT790
Izomer izotiocyjanianu fluoresceiny I	Sigma-Aldrich Co.	F7250
Paracetamol	Sigma-Aldrich Co.	A7085
Equipment
fotopowielacz	tuba hamamatsu photonics k.k	H10722-20