Test α: Szybkie bezkomórkowe oznaczanie liczby limfocytów CD4 z wykorzystaniem całej śliny

Podsumowanie

Opisano metodę enumeracji CD4, tzw. α-test, która wykorzystuje pełną ślinę do szybkiego i dokładnego oznaczania liczby komórek CD4. α-test jest niezwykle tani i eliminuje konieczność specjalistycznego szkolenia technicznego, stosowania kosztownych odczynników, takich jak przeciwciała monoklonalne, użycia aparatury, chłodzenia, transportu próbek, a także pobierania i przetwarzania krwi.

Streszczenie

Istnieje pilna potrzeba zapewnienia przystępnego cenowo oznaczania liczby komórek CD4 w celu monitorowania przebiegu HIV. Oznaczanie liczby CD4 jest nieosiągalne w regionach o ograniczonych zasobach ze względu na ograniczenia czasowe i temperaturowe, zaawansowanie techniczne oraz koszt odczynników, w szczególności przeciwciał monoklonalnych służących do pomiaru CD4 na komórkach krwi, co obecnie stanowi jedyną akceptowalną metodę. Powszechnie stosowaną strategią laboratoryjną pozwalającą na oszczędność kosztów i czasu jest obliczanie, a nie mierzenie niektórych wartości krwi. Na przykład poziom LDL jest obliczany na podstawie zmierzonych poziomów cholesterolu całkowitego, HDL i tryglicerydów¹. Zatem identyfikacja bezkomórkowych korelatów, które bezpośrednio regulują liczbę limfocytów T CD4⁺, mogłaby zapewnić dokładną metodę obliczania liczby CD4 ze względu na fizjologiczne znaczenie tych korelatów.

Liczba komórek macierzystych, które przedostają się do krwi i są przeznaczone do przekształcenia w krążące limfocyty T CD4⁺, jest określana przez chemokinę CXCL12 oraz jej receptor CXCR4 ze względu na ich wpływ na lokomocję². Proces lokomocji komórek macierzystych do krwi jest dodatkowo regulowany przez powierzchniową elastazę leukocytarną człowieka (HLE_CS) oraz reaktywny wobec HLE_CS aktywny inhibitor α₁proteinazy (α₁PI, α₁antytrypsyna, SerpinA1)³. W przebiegu zakażenia HIV-1 α₁PI ulega inaktywacji w wyniku procesów chorobowych ⁴. W wczesnych, bezobjawowych stadiach zakażenia HIV-1 stwierdzono, że poziom aktywnego α₁PI był poniżej normy u 100% nieleczonych pacjentów z HIV-1 (mediana=12 μM), a poziomy prawidłowe osiągano w stadiach objawowych^{4, 5}. Wzorzec ten przypisano inaktywacji immunologicznej, a nie niewystarczającej syntezie, inaktywacji proteolitycznej lub utlenianiu. Zaobserwowaliśmy, że u osób z HIV-1 z liczbą >220 komórek CD4/μl, liczba komórek CD4 korelowała z surowiczymi poziomami aktywnego α₁PI (r²=0.93, p<0.0001, n=26) oraz nieaktywnego α₁PI (r²=0.91, p<0.0001, n=26) ⁵. Podanie α₁PI osobom zakażonym i niezakażonym HIV-1 doprowadziło do gwałtownego wzrostu liczby komórek CD4, co sugeruje, że α₁PI bierze udział w regulacji liczby limfocytów T CD4⁺ we krwi ³.

Przy stymulacji ślina całkowita zawiera wystarczającą ilość eksudatu surowiczego (osocza zawierającego materiał białkowy, który przenika przez ściany naczyń krwionośnych do śliny), aby umożliwić pomiar aktywnej α₁PI, a korelacja tego pomiaru stanowi dowód na to, że jest to dokładna metoda obliczania liczby komórek CD4. W skrócie, sialogogi, takie jak guma do żucia lub kwas cytrynowy, stymulują wysięk surowicy do śliny z całej jamy ustnej. Po stymulacji wysięku surowicy aktywność surowiczej α₁PI w ślinie jest mierzona poprzez jej zdolność do hamowania aktywności elastazy. Elastaza trzustkowa świni (PPE) jest łatwo dostępnym i tanim źródłem elastazy. PPE wiąże się z α₁PI, tworząc kompleks w stosunku jeden do jednego, co zapobiega rozszczepianiu specyficznych substratów przez PPE, jednym z których jest kolorymetryczny peptyd, sukcynylo-L-Ala-L-Ala-L-Ala-p-nitroanilid (SA³NA). Inkubacja śliny z nasycającym stężeniem PPE przez 10 min w temperaturze pokojowej pozwala na związanie PPE z całą aktywną α₁PI w ślinie. Wynikowe zahamowanie PPE przez aktywną α₁PI można zmierzyć poprzez dodanie substratu PPE SA³NA. (Rycina 1). Chociaż liczby CD4 są mierzone w odniesieniu do objętości krwi (komórki CD4/μl), stężenie α₁PI w ślinie jest powiązane ze stężeniem surowicy w ślinie, a nie z objętością śliny, ponieważ objętość ta może znacznie różnić się w ciągu dnia oraz między osobami⁶. Jednakże niemal wszystkie białka w ślinie pochodzą z zawartości surowicy, a zawartość białka w ślinie jest mierzalna⁷. Zatem aktywną α₁PI w ślinie oblicza się jako stosunek do zawartości białka w ślinie, co określa się mianem indeksu α₁PI. Wyniki przedstawione w niniejszym opracowaniu wykazują, że indeks α₁PI stanowi dokładną i precyzyjną fizjologiczną metodę obliczania liczby komórek CD4.

Protokół

1. Przygotowanie świeżych roztworów roboczych

1. TBS: 0,05 M roztwór soli buforowanej Trisem, pH 7,8 (TBS). Przygotować 60 ml TBS na płytkę mikrotitracyjną.
2. PPE: Elastaza trzustkowa świńska, typ 1 (PPE) dostarczana jest w formie zawiesiny. Wstrząsnąć dokładnie i rozcieńczyć PPE w TBS do stężenia około 0,01 U/ml. Przygotować 6 ml roztworu roboczego na płytkę mikrotitracyjną.
3. SA³NA: Succinyl-L-Ala-L-Ala-L-Ala-p-nitroanilid (SA³NA). Przygotować 0,1 M roztwór zapasowy SA³NA w dimetylosulfotlenku (DMSO) i użyć natychmiast lub przechowywać w temperaturze -20 °C. Przygotować 6 ml roztworu roboczego na płytkę mikrotitracyjną poprzez rozcieńczenie roztworu zapasowego SA³NA 1/100 w TBS.
4. COOMASSIE BLUE: Przygotować 10% roztwór zapasowy Coomassie Brilliant Blue R-250 (Coomassie Blue) w TBS i użyć natychmiast lub przechowywać w temperaturze -20 °C. Przygotować 6 ml roztworu roboczego poprzez rozcieńczenie roztworu zapasowego 1/1000 w TBS.

2. Przygotowanie śliny

1. POBIERANIE ŚLINY: W pozycji stojącej pobudź wydzielanie surowicy do śliny, umieszczając w jamie ustnej sialogog, taki jak kwas cytrynowy lub guma do żucia. W przypadku pacjentów z HIV-1, którzy często są bezzębni i nie mogą żuć gumy, wygodnym rozwiązaniem jest bezcukrowy cukierek cytrynowy. Przez pierwsze 3 min połykaj ślinę w razie potrzeby, a przez kolejne 3 min zbieraj ślinę z całej jamy ustnej do zakręcanego kubka. Pozwoli to na uzyskanie około 2 ml śliny. Próbkę należy wykorzystać natychmiast lub przechowywać w temperaturze -80 °C.
2. OBRÓBKA ŚLINY: Jeśli próbka była zamrożona, rozmrozić ją w temperaturze 37 °C i umieścić na lodzie. Świeżą lub rozmrożoną próbkę przechowywać w temperaturze 2-4 °C nie dłużej niż przez 3 dni. Nie mieszać śliny w vortexie i unikać pipetowania mucyn, które nie zawierają wysięku surowiczego. Podczas pracy ze śliną należy stosować standardowe środki ostrożności http://www.cdc.gov/hicpac/pdf/isolation/Isolation2007.pdf .

3. Przygotowanie mikropłytki

1. BUFOR: Pomiary wykonuje się w trzech powtórzeniach. Do każdego dołka płytki mikrotitracyjnej dodaje się 130 μL TBS.
2. PRÓBKI: Do każdego dołka testowego dodaje się 20 μL śliny, aby uzyskać objętość końcową 150 μl/dołek. Mieszamy poprzez pipetowanie, unikając tworzenia pęcherzyków powietrza.
3. KONTROLE: Kontrola pozytywna zawiera PPE, ale nie zawiera śliny. Kontrola negatywna zawiera ślinę, ale nie zawiera PPE. Do dołka kontroli pozytywnej dodaje się 20 μL TBS. Do dołka kontroli negatywnej dodaje się 20 μL śliny.
4. INKUBACJA PPE: Dobrze wstrząśnąć roztworem roboczym PPE. Do każdego dołka, z wyjątkiem dołków kontroli negatywnej, dodać 50 μL roztworu roboczego PPE. Do dołków kontroli negatywnej dodać 50 μL TBS. Inkubować przez 10 min w temperaturze 23 °C.
5. INKUBACJA SUBSTRATU: Do każdego dołka dodać 50 μL roztworu roboczego SA³NA. Inkubować przez 45 min w temperaturze 23 °C.
6. COOMASSIE BLUE: Dodać 50 μL roztworu roboczego Coomassie Blue.
7. ODCZYT: Odczytać absorbancję w czytniku płytek mikroprzestrzennych przy A_{405 nm} w celu wykrycia rozszczepienia SA³NA, co reprezentuje aktywną α₁PI, oraz przy A_{595 nm} w celu wykrycia Coomassie Blue, co reprezentuje zawartość białek.

4. Oblicz indeks α₁PI

1. NORMALIZACJA ŚREDNICH A_{405 nm} ORAZ A_{595 nm}: Dla każdego pomiaru wykonanego w trzech powtórzeniach obliczyć średnią. Od średniej dla próbki odjąć średnią dla kontroli negatywnej. Aby zminimalizować różnice między płytkami, znormalizować średnie, dzieląc każdą średnią dla próbki przez średnią dla kontroli pozytywnej w następujący sposób:
   

2. OBLICZ WSKAŹNIK α₁PI INEX: Podziel znormalizowaną wartość A_{405 nm} przez znormalizowaną wartość A_{595 nm}:
   

5. Reprezentatywne wyniki

Aby ustalić, czy test α może być odpowiedni do zastosowania jako szybki test przesiewowy w punkcie opieki (point-of-care) do monitorowania liczby limfocytów CD4 w regionach endemicznych o ograniczonych zasobach, pobrano stymulowaną ślinę od 20 kobiet i 11 mężczyzn zakażonych HIV-1, którzy zgłosili się do kliniki na rutynowe badania w Kamerunie. Zgodnie z wstępnymi obserwacjami poczynionymi podczas opracowywania testu α przy użyciu śliny pobranej w Nowym Jorku, indeks α₁PI w ślinie pobranej w Kamerunie korelował z liczbą CD4 (r²=0,91, p<0,0001. n=31). Zależność tę określono za pomocą trzymającej się parametrów krzywej sigmoidalnej, co jest spójne z zależnością dawka-odpowiedź (Rysunek 2A). 95% przedziały ufności i predykcji przedstawiono odpowiednio liniami niebieskimi i czerwonymi (Rysunek 2B).

W poprzednim badaniu ustaliliśmy, że limfocyty T CD4⁺ wykazują cykl sinusoidalny o periodyczności 23±3,5 dnia u osób z HIV-1 oraz u osób z dziedziczną postacią niedoboru α₁PI (PIZZ)³. Przedstawiono tutaj reprezentatywny przykład komputerowej analizy krzywej sinusoidalnej cykliczności CD4 u zdrowej kontroli bez HIV-1, wykazującej periodyczność 27 dni (Rycina 3A).

Analiza wygenerowanej komputerowo krzywej sinusoidalnej zmian liczby limfocytów T CD4⁺ u 6 badanych pozwoliła uzyskać wartości amplitudy szczyt-szczyt oraz osi oscylacji³. Zgodnie z oczekiwaniami, oś oscylacji była skorelowana z amplitudą (r²=0,96, p=0,009, n=6) (Rycina 3B). U pacjentów z niską liczbą limfocytów T CD4⁺ cykliczne zmiany ich liczby były niewielkie, natomiast u pacjentów z wysoką liczbą limfocytów T CD4⁺ zmiany cykliczne były duże.

Ponieważ linia regresji przedstawiona na Ryc. 2 szacuje oś oscylacji, a oś oscylacji jest skorelowana z amplitudą, można obliczyć amplitudę dla linii regresji, szacując tym samym, o ile powyżej i poniżej linii regresji spodziewane są wahania limfocytów T CD4⁺ wynikające z cykliczności (Ryc. 3C). Po nałożeniu amplitudy obliczonej na Ryc. 3C oraz przedziału ufności obliczonego na Ryc. 2B stwierdzono, że amplituda (linia zielona) mieści się w 95% przedziale ufności (linia niebieska) (Ryc. 3D).

Rysunek 1. Podsumowanie procedury: Umieszczenie kwasu cytrynowego w jamie ustnej i pobranie śliny. Dodanie rozcieńczonej śliny do studzienek mikropłytki w trzech powtórzeniach. Dodanie PPE do każdej studzienki i inkubacja przez 15 min w 23 °C. Dodanie substratu PPE do każdej studzienki i inkubacja przez 45 min w 23 °C. Dodanie Coomassie Blue i odczyt przy 405 nm w celu wykrycia aktywności PPE oraz przy 595 nm w celu wykrycia białek.

Rysunek 2. Porównanie testu α ze standardową metodą zliczania komórek CD4. A) Test α przeprowadzono poprzez ilościowe oznaczenie indeksu α₁PI w stymulowanej całej ślinie jam ustnej. Liczbę komórek CD4 oznaczono w niezależnym laboratorium medycznym przy użyciu standardowej cytometrii przepływowej. Krew do cytometrii przepływowej oraz ślinę pobrano podczas tej samej wizyty w klinice. Zależność między indeksem α₁PI a liczbą komórek CD4 określono za pomocą 3-parametrycznej krzywej sigmoidalnej (r²=0,91, p<0,0001, n=31). B) 95% przedziały ufności i predykcji przedstawiono odpowiednio liniami niebieskimi i czerwonymi.

Rysunek 3. Dokładność obliczania liczby komórek CD4 przy użyciu indeksu α1PI. A) Komórki CD4⁺ T wykazywały cykle sinusoidalne z 27-dniową periodycznością u zdrowej kontroli niezakażonej HIV-1. Przedstawiono oś oscylacji (czerwona przerywana linia). B) Komputerowa analiza fali sinusoidalnej cykliczności limfocytów T CD4 została wykorzystana do obliczenia amplitudy szczyt-szczyt oraz osi oscylacji u 4 pacjentów z HIV-1, 1 pacjenta z PIzz niezakażonego HIV-1 oraz u zdrowej kontroli niezakażonej HIV-1 przedstawionej w części A. Zależność między amplitudą limfocytów T CD4⁺ a osią oscylacji została określona przez 3-parametryczną krzywą sigmoidalną (r²=0,96, p=0,009, n=6). C) Zależność sigmoidalna między amplitudą a osią oscylacji wyprowadzona w części B) została wykorzystana do obliczenia oczekiwanej amplitudy (zielone linie) punktów wzdłuż linii regresji (czarna linia) z Rysunku 2. D) Przedział oczekiwanej amplitudy (zielone linie) różnił się znacząco od 95% przedziału ufności (niebieskie linie), co określono za pomocą testu suma rang Manna-Whitneya (na podstawie porównania mediany różnicy między 95% przedziałem ufności a linią regresji (63 komórki/μl) oraz mediany różnicy między linią amplitudy a linią regresji (37 komórek/μl); p=0,001).

Dyskusja

Nierozcieńczona surowica zawiera medianowo 36 μM α₁PI oraz 3,6 μM α₂makroglobuliny (α₂M), co stanowi 10-krotną różnicę ⁸. Oba białka konkurują o wiązanie z PPE. Te dwie właściwości – stężenie i powinowactwo do PPE – zostały wykorzystane do opracowania metody umożliwiającej specyficzne pomiary α₁PI w normalnej surowicy w obecności konkurującej α₂M ⁸. Metoda ta pozwala na wykrycie stężenia μ₁PI już na poziomie 50 nM w 0,3% surowicy. Prz...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Sialogog, 0,05M kwas cytrynowy	Eda’s Sugarfree Candies, 4900 Rear N.20th Street, Philadelphia, PA 19144	Sugar-Free Lemon dropS
Elastaza trzustkowa świńska, typ 1 (EC 3.4.21.36)	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63103	E1250
Succinyl-L-Ala-L-Ala-L-Ala-p-nitroanilide	Sigma-Aldrich	S4760
Coomassie Brilliant Blue R-250	Sigma-Aldrich	B7920
Mikropłytki 96-dołkowe, traktowane do hodowli tkankowych	Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ 07417-1886	35-3072
Czytnik mikropłytek z filtrami dla 405nm i 595nm	MTX Lab Systems, 8456 Tyco Road, Building D, Vienna, Virginia 22182	Dynex P97277