Przedstawiono metodę owariektomii oraz następującego po niej uzupełniania 17β-estradiolu za pomocą kapsułek silastycznych i podawania Nutelli drogą doustną u szczurów i myszy.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Owarektomia i suplementacja 17β-estradiolu u szczurów i myszy: demonstracja wizualna
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Estrogeny stanowią rodzinę żeńskich hormonów płciowych o wyjątkowo szerokim spektrum działania. W badaniach nad estrogenami z wykorzystaniem szczurów i myszy powszechnie stosuje się owariektomię w celu zniesienia gwałtownie cyklicznej produkcji hormonów, zastępując 17β-estradiol egzogennie. Brakuje jednak konsensusu co do sposobu podawania hormonu w celu uzyskania fizjologicznych stężeń w surowicy. Jest to kwestia kluczowa, ponieważ poziom 17β-estradiolu oraz metoda jego podawania mają głęboki wpływ na wyniki doświadczalne1-3. W serii badań scharakteryzowaliśmy różne tryby podawania 17β-estradiolu, stwierdzając, że podskórne kapsułki silastikowe oraz doustne podawanie w kremie orzechowym Nutella są skuteczniejsze niż dostępne komercyjnie pellety o spowolnionym uwalnianiu (produkowane przez firmę Innovative Research of America) i codzienne iniekcje w kontekście uzyskiwania fizjologicznych stężeń 17β-estradiolu w surowicy4-6. Do zalet metody z kremem orzechowym, która była wcześniej stosowana do podawania buprenorfiny7, należy to, że w przypadku podawania estrogenów przypomina ona doustną hormonalną terapię zastępczą i jest nieinwazyjna. Podskórne kapsułki silastikowe są wygodne i zapewniają najstabilniejsze stężenia w surowicy. Niniejszy artykuł wideo zawiera instrukcje krok po kroku dotyczące owariektomii oraz hormonalnej terapii zastępczej 17β-estradiolami za pomocą kapsułek silastikowych i doustnej Nutelli u szczurów i myszy, a następnie omówienie ważnych aspektów procedur podawania.
Protokół
1. Owariektomia drogą grzbietową
- Zanurz zwierzę w narkozie, na przykład stosując 1,5% isofluranu (4% do indukcji) w mieszaninie tlenu i tlenku azotu 30%/70%. Umieść zwierzę w pozycji brzusznej na płycie grzewczej połączonej z termometrem rektalnym. Ważne jest, aby pomiędzy zwierzęciem a płytą znajdowała się cienka warstwa izolacyjna, a system sprzężenia zwrotnego termometru utrzymywał temperaturę ciała w granicach 37 ± 0.5 °C. Nałóż żel do ochrony oczu i podaj podskórnie, w boczną część szyi zwierzęcia, 5 mg Rimadyl/kg masy ciała rozpuszczonego w soli fizjologicznej w celu uśmierzenia bólu pooperacyjnego.
- Wygol obszar o wymiarach 4*4 cm (3*3 cm dla myszy) w kierunku głowowym od grzebienia biodrowego. Dokładnie przemyj wygolony obszar, na przykład preparatem Jodopax, a następnie przykryj zwierzę polem operacyjnym z otworem 4*4 cm.
- Wykonaj nacięcie w linii środkowej o długości 2-3 cm i rozdziel tępym sposobem skórę od leżącej pod nią powięzi. W odległości 1 cm bocznie od linii środkowej wykonaj kolejne nacięcie przez powięź. Rozdziel tkanki tępym sposobem w kierunku bocznym pod powięzią, tak powierzchownie, jak to możliwe, aż do osiągnięcia jamy brzusznej.
- Za pomocą pęsety chwyć tkankę tłuszczową otaczającą jajnik w jamie brzusznej i ostrożnie ją wyciągnij. Zidentyfikuj jajnik i podwiąż rogi macicy oraz naczynia 0,5-1 cm proksymalnie od tej struktury. Odetnij jajnik wraz z podwiązaną tkanką tłuszczową i umieść pozostałą tkankę z powrotem w jamie brzusznej. Wykonaj kolejne nacięcie w powięzi po przeciwnej stronie i powtórz procedurę.
- Zamknij rany, najlepiej używając nici monofilamentowej, i poczekaj, aż zwierzę wybudzi się z narkozy. Umieść zwierzę w ogrzewanej klatce (25-27 °C) przez co najmniej 2 godziny po operacji. W pierwszych dniach po zabiegu zwierzęta powinny być utrzymywane osobno. Kluczowe jest częste czyszczenie lub wymiana ściółki w klatce w fazie rekonwalescencji. Dwadzieścia cztery godziny po operacji wstrzyknij zwierzętom podskórnie kolejne 5 mg Rimadyl/kg masy ciała rozpuszczonego w soli fizjologicznej.
2. Podskórne podawanie 17β-estradiolu za pomocą kapsułek Silastic
- Dokładnie wymieszać pożądaną ilość 17β-estradiolu w oleju sezamowym. W przypadku stężeń fizjologicznych u szczurów i myszy zaleca się odpowiednio 180 μg/mL oraz 18-36 μg/mL. Kapsułki z placebo wypełnia się czystym olejem sezamowym.
- Odciąć odcinki rurki silastykowej o długości 3 cm (2 cm dla myszy) oraz odcinki drewnianych patyczków aplikatorowych o długości 5 mm (3 mm dla myszy), które będą służyć jako korki. Za pomocą pęsety wcisnąć jeden drewniany korek do kapsułki silastykowej, a następnie wstrzyknąć roztwór 17β-estradiolu w oleju sezamowym, aby wypełnić całą jej długość. Delikatnie zamknąć otwarty koniec kapsułki silastykowej drugim drewnianym korkiem (korki powinny pozostać w kapsułce na stałe). Kapsułki inkubować w pozostałym roztworze 17β-estradiolu przez noc przed implantacją.
- Implantację kapsułki można przeprowadzić podczas znieczulenia stosowanego przy ovariektomii u szczurów. W przypadku myszy zdecydowanie zaleca się jednak 14-dniowy okres rekonwalescencji po ovariektomii, aby zminimalizować ryzyko wypadnięcia kapsułki przez delikatną skórę.
- Po przygotowaniach chirurgicznych zgodnie z punktem 1.1 lub po zamknięciu nacięcia po ovariektomii, ogolić i umyć obszar o wymiarach 2*2 cm na grzbietowej stronie szyi zwierzęcia. Wykonać nacięcie o długości 1 cm i tępą dyssekcją utworzyć podskórną kieszonkę w kierunku kaudalno-bocznym, zapewniając wystarczającą przestrzeń dla kapsułki. Przetrzeć kapsułkę silastykową (która do tego momentu była inkubowana w roztworze 17β-estradiolu) i delikatnie wprowadzić ją przez nacięcie, które następnie zamyka się szwem. Kluczowe jest upewnienie się, że kapsułka w jak najmniejszym stopniu napina skórę, szczególnie w obszarze bliskim rany. Od momentu przygotowania kapsułek do ich implantacji należy bezwzględnie unikać zanieczyszczeń.
3. Podawanie doustne 17β-estradiolu za pomocą kremu orzechowego Nutella
- Całkowicie rozpuść 17β-estradiol w oleju sezamowym, a następnie zmieszaj olej sezamowy z Nutellą. Zalecamy, aby każda dzienna porcja zawierała 28 μg 17β-estradiol, 5 μL oleju sezamowego i 1 g Nutelli na kilogram masy ciała szczura oraz 1,12 μg 17β-estradiol, 0,312 μL oleju sezamowego i 60 mg Nutelli dla każdej myszy o masie 30 g. Krem orzechowy będący placebo przygotowuje się w identyczny sposób, z pominięciem 17β-estradiol.
- Przez pięć dni przed eksperymentem trenuj zwierzęta w spożywaniu kremu orzechowego bez hormonów. Przez pierwsze trzy dni treningu szczury powinny być optymalnie trenowane w grupach (około 0,5 g Nutelli na 2-5 zwierząt), w ich klatkach domowych. Czwartego i piątego dnia treningu zwierzęta są umieszczane w oddzielnych klatkach przed podaniem dziennej porcji, aby odzwierciedlić warunki eksperymentalne.
- W trakcie eksperymentu zwierzęta są umieszczane w oddzielnych klatkach przy każdej okazji karmienia, po czym porcja Nutelli jest podawana na małych płytkach ceramicznych. Jeśli trening został przeprowadzony zgodnie z powyższym opisem, nasze doświadczenie wskazuje, że ponad 95% szczurów i myszy akceptuje krem orzechowy, a po pełnej habituacji większość zwierząt spożywa go w ciągu kilku sekund.
4. Reprezentatywne wyniki
Fizjologiczne stężenia 17β-estradiolu w surowicy, które obecne metody mają na celu odtworzyć, wynoszą około 5-140 pg/mL dla szczurów i 5-35 pg/mL dla myszy4,6. Podskórne kapsułki silastykowe przygotowane zgodnie z powyższymi instrukcjami, po podaniu samicom szczurów Sprague-Dawley o masie 300 g, powodują powolny spadek stężeń 17β-estradiolu w surowicy z około 40 pg/mL w 2. dniu do 10 pg/mL w 35. dniu. Jednak bezpośrednio po podaniu można spodziewać się szczytu stężenia w surowicy na poziomie około 1000 pg/mL, który spada do zakresu fizjologicznego w ciągu 8 godzin (Rysunek 1A)4,5. Opisane powyżej kapsułki silastykowe dla myszy zawierające 36 μg 17β-estradiolu/mL, po podaniu samicom myszy C57BL/6 o masie 25 g, zapewniają stężenia w surowicy, które powoli spadają z około 90 pg/mL w 2. dniu do 25 pg/mL w 35. dniu. Prawdopodobnie poprzedza to podobny szczyt, jaki zaobserwowano u szczurów, choć nie zostało to zbadane (Rysunek 1B)6.
Metoda podawania Nutelli drogą peroralną w opisanych powyżej dawkach, zastosowana u samic szczurów Sprague-Dawley o masie 300 g, zapewnia fizjologiczne poziomy 17β-estradiolu z dobowymi wahaniami w zakresie 10-70 pg/mL (Rycina 2A)4. W przypadku myszy przy zastosowaniu powyższej dawki, poziomy dobowe wahają się w granicach od około 20 do 120 pg/mL (Rycina 2B)6.
Rycina 1. Uproszczone wykresy przedstawiające stężenia 17β-estradiolu u szczurów (A; n=10 w punktach czasowych do 24 h, n=15 w późniejszych punktach czasowych)4,5 oraz myszy (B; n=10)6 po implantacji kapsułek. Kapsułki silastykowe powodują krótki początkowy szczyt stężeń w surowicy do 1000 pg/mL, który jednak w ciągu kilku godzin spada do poziomów poniżej 100 pg/mL. Przez kolejne 4-5 tygodni kapsułki zapewniają stabilne, choć stopniowo malejące stężenia w surowicy. Zacieniowane obszary odpowiadają fizjologicznym stężeniom 17β-estradiolu w surowicy odpowiednio u zdrowych samic szczurów i myszy. Mimo że nie zostało to pokazane graficznie na wykresach, występuje zmienność osobnicza w stężeniach 17β-estradiolu, co przekłada się na współczynniki zmienności od 27 do 183 % u szczurów i od 28 do 115 % u myszy przy zastosowaniu metody z kapsułką silastykową (bardzo niskie średnie stężenia często generują wysokie współczynniki zmienności).
Rysunek 2. Schematyczne wykresy przedstawiające stężenia 17β-estradiolu u szczurów (A; n=15)4 i myszy (B; n=10)6 w wyniku codziennego podawania hormonu w Nutelli. Metoda doustna z użyciem Nutelli powoduje występowanie codziennych szczytów stężeń, które jednak nie są tak wysokie, jak w przypadku metod podskórnych lub dożylnych. Odzwierciedla to farmakokinetykę ludzkiej hormonalnej terapii zastępczej, a leczenie doustne może być prowadzone tak długo, jak jest to konieczne, mimo że powyższy przykład przedstawia jedynie pierwsze 96 godzin. Zacieniowane obszary odpowiadają fizjologicznym stężeniom 17β-estradiolu w surowicy odpowiednio u zdrowych samic szczurów i myszy. Choć nie zostało to przedstawione wizualnie na wykresach, występuje zmienność osobnicza stężeń 17β-estradiolu, co przekłada się na współczynniki zmienności od 40 do 132% u szczurów oraz od 13 do 219% u myszy przy zastosowaniu metody z Nutellą (bardzo niskie stężenia średnie często generują wysokie współczynniki zmienności).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Przedstawione powyżej tryby podawania okazały się w poprzednich badaniach lepsze od komercyjnych pelletów o powolnym uwalnianiu oraz iniekcji pod kątem uzyskiwania fizjologicznych stężeń 17β-estradiolu w surowicy. Podczas gdy pellety o powolnym uwalnianiu powodują bardzo wysokie i przedłużone piki stężenia w surowicy, iniekcje wywołują ekstremalne, dobowe wahania poziomu hormonów i wymagają powtarzalnego, stresującego obchodzenia się ze zwierzętami 4-6. Znaczenie wyboru odpowiedniego trybu podawania podkreślaj...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają żadnych konfliktów interesów do ujawnienia.
Podziękowania
Badanie zostało sfinansowane przez Uniwersytet w Linköping oraz Radę Powiatu Östergötland.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Rimadyl, 50 mg/mL | Pfizer Pharma GmbH | 462986 | Analgezja pooperacyjna po owariektomii. |
| Lubrithal żel do oczu | Leo Laboratories | Ochrona oczu podczas operacji. | |
| Jodopax vet | Pharmaxim | Dezynfekcja chirurgiczna. | |
| Nici Vicryl 4-0 | Johnson & Johnson | Szycie rany i podwiązanie jajnika. | |
| 17β-estradiol, >98% | Sigma-Aldrich | E8875-1G | W oleju sezamowym do kapsułek silastycznych i Nutelli. |
| Olej sezamowy | Sigma-Aldrich | S3547-1L | Rozpuszczanie 17β-estradiolu. |
| Rurki silastyczne, ID/OD: 1,575/3,175 mm | Dow Corning | 508-008 | Wytwarzanie kapsułek silastycznych. |
| Drewniany aplikator | Selefatrade | 12-0783 | Zamykanie kapsułek silastycznych. |
| Nutella | Ferrero | Nośnik do doustnego podawania 17β-estradiolu. |
Bibliografia
- Strom, J. O., Theodorsson, A., Theodorsson, E. Dose-related neuroprotective versus neurodamaging effects of estrogens in rat cerebral ischemia: a systematic analysis. J. Cereb. Blood Flow Metab. 29, 1359-1372 (2009).
- Strom, J. O., Theodorsson, E., Holm, L., Theodorsson, A. Different methods for administering 17beta-estradiol to ovariectomized rats result in opposite effects on ischemic brain damage. BMC Neurosci. 11, 1471-2202 (2010).
- Strom, J. O., Theodorsson, A., Theodorsson, E. Hormesis and Female Sex Hormones. Pharmaceuticals. 4, 15(2011).
- Isaksson, I. M., Theodorsson, A., Theodorsson, E., Strom, J. O. Methods for 17beta-estradiol administration to rats. Scandinavian journal of clinical and laboratory investigation. , (2011).
- Strom, J. O., Theodorsson, E., Theodorsson, A. Order of magnitude differences between methods for maintaining physiological 17beta-oestradiol concentrations in ovariectomized rats. Scand. J. Clin. Lab Invest. 68, 814-822 (2008).
- Ingberg, E., Theodorsson, A., Theodorsson, E., Strom, J. O. Methods for long-term 17beta-estradiol administration to mice. General and comparative endocrinology. , (2011).
- Kalliokoski, O., Jacobsen, K. R., Hau, J., Abelson, K. S. Serum concentrations of buprenorphine after oral and parenteral administration in male mice. Vet. J. 187, 251-254 (2011).
- Simpkins, J. W. Estrogens may reduce mortality and ischemic damage caused by middle cerebral artery occlusion in the female rat. J. Neurosurg. 87, 724-730 (1997).
- Wise, P. M., Dubal, D. B. Estradiol protects against ischemic brain injury in middle-aged rats. Biol. Reprod. 63, 982-985 (2000).
- Saleh, T. M., Cribb, A. E., Connell, B. J. Estrogen-induced recovery of autonomic function after middle cerebral artery occlusion in male rats. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 281, 1531-1539 (2001).
- Bingham, D., Macrae, I. M., Carswell, H. V. Detrimental effects of 17beta-oestradiol after permanent middle cerebral artery occlusion. J. Cereb. Blood Flow Metab. 25, 414-420 (2005).
- Carswell, H. V. Differential effects of 17beta-estradiol upon stroke damage in stroke prone and normotensive rats. J. Cereb. Blood Flow Metab. 24, 298-304 (2004).
- Yong, Y. 17beta-estradiol potentiates ischemia-reperfusion injury in diabetic ovariectomized female rats. Brain Res. 1054, 192-199 (2005).
- Theodorsson, A., Theodorsson, E. Estradiol increases brain lesions in the cortex and lateral striatum after transient occlusion of the middle cerebral artery in rats: no effect of ischemia on galanin in the stroke area but decreased levels in the hippocampus. Peptides. 26, 2257-2264 (2005).
- Levin-Allerhand, J. A., Sokol, K., Smith, J. D. Safe and effective method for chronic 17beta-estradiol administration to mice. Contemp. Top Lab Anim. Sci. 42, 33-35 (2003).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
