Owarektomia i suplementacja 17β-estradiolu u szczurów i myszy: demonstracja wizualna

Podsumowanie

Przedstawiono metodę owariektomii oraz następującego po niej uzupełniania 17β-estradiolu za pomocą kapsułek silastycznych i podawania Nutelli drogą doustną u szczurów i myszy.

Streszczenie

Estrogeny stanowią rodzinę żeńskich hormonów płciowych o wyjątkowo szerokim spektrum działania. W badaniach nad estrogenami z wykorzystaniem szczurów i myszy powszechnie stosuje się owariektomię w celu zniesienia gwałtownie cyklicznej produkcji hormonów, zastępując 17β-estradiol egzogennie. Brakuje jednak konsensusu co do sposobu podawania hormonu w celu uzyskania fizjologicznych stężeń w surowicy. Jest to kwestia kluczowa, ponieważ poziom 17β-estradiolu oraz metoda jego podawania mają głęboki wpływ na wyniki doświadczalne^1-3. W serii badań scharakteryzowaliśmy różne tryby podawania 17β-estradiolu, stwierdzając, że podskórne kapsułki silastikowe oraz doustne podawanie w kremie orzechowym Nutella są skuteczniejsze niż dostępne komercyjnie pellety o spowolnionym uwalnianiu (produkowane przez firmę Innovative Research of America) i codzienne iniekcje w kontekście uzyskiwania fizjologicznych stężeń 17β-estradiolu w surowicy^4-6. Do zalet metody z kremem orzechowym, która była wcześniej stosowana do podawania buprenorfiny⁷, należy to, że w przypadku podawania estrogenów przypomina ona doustną hormonalną terapię zastępczą i jest nieinwazyjna. Podskórne kapsułki silastikowe są wygodne i zapewniają najstabilniejsze stężenia w surowicy. Niniejszy artykuł wideo zawiera instrukcje krok po kroku dotyczące owariektomii oraz hormonalnej terapii zastępczej 17β-estradiolami za pomocą kapsułek silastikowych i doustnej Nutelli u szczurów i myszy, a następnie omówienie ważnych aspektów procedur podawania.

Protokół

1. Owariektomia drogą grzbietową

1. Zanurzyć zwierzę w znieczuleniu, na przykład stosując 1,5% izofluranu (4% do indukcji) w mieszaninie tlenu i tlenku azotu 30%/70%. Umieścić zwierzę w pozycji brzusznej na płycie grzewczej połączonej z termometrem rektalnym. Ważne jest zastosowanie cienkiej warstwy izolacyjnej pomiędzy zwierzęciem a płytą oraz upewnienie się, że system sprzężenia zwrotnego termometru utrzymuje temperaturę ciała w zakresie 37 ± 0,5 °C. Nałożyć żel chroniący oczy i podać podskórnie w bocznej części szyi zwierzęcia 5 mg Rimadyl/kg masy ciała rozcieńczonego w soli fizjologicznej w celu pooperacyjnego uśmierzenia bólu.
2. O strutszyć obszar o wymiarach 4*4 cm (3*3 cm dla myszy) w kierunku głowowym od grzebienia biodrowego. Dokładnie przemyć ogolony obszar, na przykład preparatem Jodopax, przed przykryciem zwierzęcia prześcieradłem chirurgicznym z otworem 4*4 cm.
3. Wyonać nacięcie w linii środkowej o długości 2-3 cm i tępym sposobem oddzielić skórę od leżącej pod nią powięzi. Jeden centymetr bocznie od linii środkowej wykonać kolejne nacięcie przez powięź. Tępym sposobem rozdzielić tkankę bocznie pod tą powięzią tak powierzchownie, jak to możliwe, aż do dotarcia do jamy brzusznej.
4. Za pomocą pęsety uchwycić tkankę tłuszczową otaczającą jajnik w jamie brzusznej i delikatnie ją wyciągnąć. Zidentyfikować jajnik i podwiązać rogi macicy oraz naczynia 0,5-1 cm proksymalnie od tej struktury. Wyciąć jajnik wraz z podwiązaną tkanką tłuszczową i umieścić pozostałą tkankę z powrotem w jamie brzusznej. Wykonać kolejne nacięcie w powięzi przeciwległej strony i powtórzyć procedurę.
5. Zamknąć rany, najlepiej używając nici monofilamentowej, i pozwolić zwierzęciu wybudzić się z narkozy. Umieścić zwierzę w ogrzewanej klatce (25-27 °C) przez co najmniej 2 godziny po operacji. Zwierzęta powinny być utrzymywane oddzielnie przez pierwsze dni po zabiegu. Kluczowe jest częste czyszczenie lub wymiana klatki w fazie rekonwalescencji. Dwadzieścia cztery godziny po operacji wstrzyknąć zwierzętom podskórnie kolejne 5 mg Rimadyl/kg masy ciała rozcieńczonego w soli fizjologicznej.

2. Podskórne podawanie 17β-estradiolu za pomocą kapsułek silastykowych

1. Dokładnie wymieszać pożądaną ilość 17β-estradiolu w oleju sezamowym. W przypadku stężeń fizjologicznych u szczurów i myszy zaleca się odpowiednio 180 μg/mL oraz 18-36 μg/mL. Kapsułki placebo wypełnia się czystym olejem sezamowym.
2. Odciąć kawałki rurki silastycznej o długości 3 cm (2 cm dla myszy) oraz kawałki drewnianych patyczków aplikacyjnych o długości 5 mm (3 mm dla myszy), które posłużą jako zatyczki. Za pomocą pęsety wcisnąć jedną drewnianą zatyczkę do kapsułki silastycznej przed wstrzyknięciem roztworu 17β-estradiolu w oleju sezamowym w celu wypełnienia całej jej długości. Delikatnie zamknąć otwarty koniec kapsułki silastycznej drugą drewnianą zatyczką (zatyczki powinny pozostać w kapsułce na stałe). Inkubować kapsułki w pozostałym roztworze 17β-estradiolu przez noc przed implantacją.
3. Implantację kapsułki można przeprowadzić podczas znieczulenia stosowanego przy owariektomii u szczurów. W przypadku myszy zdecydowanie zaleca się jednak 14-dniowy okres rekonwalescencji po owariektomii, aby zminimalizować ryzyko wypadnięcia kapsułki przez delikatną skórę.
4. Po przygotowaniach chirurgicznych zgodnie z punktem 1.1 lub po zamknięciu nacięcia po owariektomii, ogolić i umyć obszar o wymiarach 2*2 cm na grzbietowej stronie karku zwierzęcia. Wykonać nacięcie o długości 1 cm i metodą tępej dyssekcji utworzyć podskórną kieszeń w kierunku brzuszno-bocznym, zapewniając wystarczającą przestrzeń dla kapsułki. Przetrzeć kapsułkę silastyczną (która do tego momentu była inkubowana w roztworze 17β-estradiolu) i delikatnie umieścić ją przez nacięcie, które następnie zamyka się szwem. Kluczowe jest upewnienie się, że kapsułka w jak najmniejszym stopniu napina skórę, szczególnie w obszarze blisko rany. Od momentu przygotowania kapsułek do ich implantacji należy bezwzględnie unikać kontaminacji.

3. Podawanie 17β-estradiolu drogą doustną za pomocą kremu orzechowego Nutella

1. Dokładnie rozpuść 17β-estradiol w oleju sezamowym, a następnie wymieszaj olej sezamowy z Nutellą. Zaleca się, aby każda dzienna porcja zawierała 28 μg 17β-estradiol, 5 μL oleju sezamowego i 1 g Nutelli na kilogram masy ciała szczura oraz 1,12 μg 17β-estradiol, 0,312 μL oleju sezamowego i 60 mg Nutelli dla każdej myszy o masie 30 g. Krem orzechowy będący placebo przygotowuje się w identyczny sposób, z pominięciem 17β-estradiol.
2. Przez pięć dni przed eksperymentem przyuczaj zwierzęta do spożywania kremu orzechowego bez hormonów. Przez pierwsze trzy dni treningu szczury powinny być optymalnie trenowane w grupach (około 0,5 g Nutelli na 2-5 zwierząt) w ich klatkach macierzystych. W czwartym i piątym dniu treningu zwierzęta są umieszczane w osobnych klatkach przed otrzymaniem dziennej porcji, aby odzwierciedlić warunki eksperymentalne.
3. W trakcie eksperymentu zwierzęta są umieszczane w osobnych klatkach przy każdym karmieniu, po czym porcja Nutelli jest podawana na małych płytkach ceramicznych. Jeśli trening został przeprowadzony w opisany wyżej sposób, z naszego doświadczenia wynika, że ponad 95% szczurów i myszy akceptuje krem orzechowy, a po pełnej habituacji większość zwierząt spożywa go w ciągu kilku sekund.

4. Reprezentatywne wyniki

Fizjologiczne stężenia 17β-estradiolu w surowicy, które obecne metody mają na celu odtworzyć, wynoszą około 5-140 pg/mL dla szczurów oraz 5-35 pg/mL dla myszy^4,6. Podskórne kapsułki silastykowe przygotowane zgodnie z powyższymi instrukcjami, po podaniu samicom szczurów Sprague-Dawley o masie 300 g, powodują powolny spadek stężeń 17β-estradiolu w surowicy od około 40 pg/mL w 2. dniu do 10 pg/mL w 35. dniu. Jednak natychmiast po podaniu można spodziewać się szczytowego stężenia w surowicy wynoszącego około 1000 pg/mL, które spadnie do zakresu fizjologicznego w ciągu 8 godzin (Rycina 1A)^4,5. Opisane powyżej kapsułki silastykowe dla myszy zawierające 36 μg 17β-estradiolu/mL, po podaniu samicom myszy C57BL/6 o masie 25 g, zapewniają stężenia w surowicy, które powoli spadają od około 90 pg/mL w 2. dniu do 25 pg/mL w 35. dniu. Prawdopodobnie poprzedza to podobny wzrost stężenia, jaki zaobserwowano u szczurów, choć nie zostało to przebadane (Rycina 1B)⁶.

Metoda peroralna z wykorzystaniem Nutelli przy dawkach opisanych powyżej, podawana samicom szczurów Sprague-Dawley o masie 300 g, zapewnia fizjologiczne poziomy 17β-estradiolu z dobowymi wahaniami w zakresie 10-70 pg/mL (Rycina 2A)⁴. W przypadku myszy przy zastosowaniu powyższej dawki poziomy dobowe wahają się w przybliżeniu od 20 do 120 pg/mL (Rycina 2B)⁶.

Rysunek 1. Uproszczone wykresy przedstawiające stężenia 17β-estradiolu u szczurów (A; n=10 w punktach czasowych do 24 h, n=15 w późniejszych punktach czasowych)^4,5 oraz myszy (B; n=10)⁶ po implantacji kapsułek. Kapsułki silastykowe powodują krótki początkowy wzrost stężeń w surowicy do 1000 pg/mL, które następnie w ciągu kilku godzin spadają do poziomu poniżej 100 pg/mL. Przez kolejne 4-5 tygodni kapsułki zapewniają stabilne, choć stopniowo malejące, stężenia w surowicy. Zacieniowane obszary odpowiadają fizjologicznym stężeniom 17β-estradiolu w surowicy odpowiednio u nienaruszonych samic szczurów i myszy. Mimo że nie zostało to przedstawione wizualnie na wykresach, występuje zmienność międzyosobnicza stężeń 17β-estradiolu, co skutkuje współczynnikami zmienności od 27 do 183 % u szczurów i od 28 do 115 % u myszy przy zastosowaniu metody z kapsułką silastykową (bardzo niskie średnie stężenia często generują wysokie współczynniki zmienności).

Rycina 2. Schematyczne wykresy przedstawiające stężenia 17β-estradiolu u szczurów (A; n=15)⁴ i myszy (B; n=10)⁶ w wyniku codziennego podawania hormonu w Nutelli. Metoda peroralna z użyciem Nutelli powoduje występowanie codziennych szczytów stężeń, jednak nie są one tak wysokie, jak w przypadku metod podskórnych lub dożylnych. Odzwierciedla to farmakokinetykę ludzkiej hormonalnej terapii zastępczej, a leczenie peroralne może być prowadzone tak długo, jak jest to konieczne, mimo że powyższy przykład przedstawia jedynie pierwsze 96 godzin. Zacieniowane obszary odpowiadają fizjologicznym stężeniom 17β-estradiolu w surowicy odpowiednio u zdrowych samic szczurów i myszy. Choć nie zostało to przedstawione wizualnie na wykresach, występuje zmienność osobnicza stężeń 17β-estradiolu, co przekłada się na współczynniki zmienności od 40 do 132 % u szczurów i od 13 do 219 % u myszy przy zastosowaniu metody z Nutellą (bardzo niskie średnie stężenia często generują wysokie współczynniki zmienności).

Dyskusja

Przedstawione powyżej tryby podawania okazały się w poprzednich badaniach lepsze od komercyjnych pelletów o powolnym uwalnianiu oraz iniekcji pod kątem uzyskiwania fizjologicznych stężeń 17β-estradiolu w surowicy. Podczas gdy pellety o powolnym uwalnianiu powodują bardzo wysokie i przedłużone piki stężenia w surowicy, iniekcje wywołują ekstremalne, dobowe wahania poziomu hormonów i wymagają powtarzalnego, stresującego obchodzenia się ze zwierzętami ^4-6. Znaczenie wyboru odpowiedniego trybu podawania podkreślaj...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Rimadyl, 50 mg/mL	Pfizer Pharma GmbH	462986	Analgezja pooperacyjna po owariektomii.
Lubrithal żel do oczu	Leo Laboratories		Ochrona oczu podczas operacji.
Jodopax vet	Pharmaxim		Dezynfekcja chirurgiczna.
Nici Vicryl 4-0	Johnson & Johnson		Szycie rany i podwiązanie jajnika.
17β-estradiol, >98%	Sigma-Aldrich	E8875-1G	W oleju sezamowym do kapsułek silastycznych i Nutelli.
Olej sezamowy	Sigma-Aldrich	S3547-1L	Rozpuszczanie 17β-estradiolu.
Rurki silastyczne, ID/OD: 1,575/3,175 mm	Dow Corning	508-008	Wytwarzanie kapsułek silastycznych.
Drewniany aplikator	Selefatrade	12-0783	Zamykanie kapsułek silastycznych.
Nutella	Ferrero		Nośnik do doustnego podawania 17β-estradiolu.