Podstawowe metody Caenorhabditis elegans: synchronizacja i obserwacja

Summary

Łatwość utrzymania i rozmnażania nicienia C. elegans sprawia, że jest to ciekawy organizm modelowy do pracy. Możliwość synchronizacji robaków pozwala na pracę ze znaczną liczbą osób na tym samym etapie rozwoju, co ułatwia badanie jednego konkretnego procesu u wielu zwierząt.

Abstract

Badania nad biologią molekularną i rozwojową nicienia Caenorhabditis elegans zostały rozpoczęte na początku lat siedemdziesiątych przez Sydneya Brennera i od tego czasu są one szeroko stosowane jako organizm modelowy ¹. C. elegans posiada kluczowe cechy, takie jak prostota, przejrzystość i krótki cykl życia, które sprawiły, że od wielu lat jest odpowiednim systemem eksperymentalnym do podstawowych badań biologicznych ². Odkrycia dotyczące tego nicienia mają szerokie implikacje, ponieważ wiele procesów komórkowych i molekularnych, które kontrolują rozwój zwierząt, jest ewolucyjnie konserwatywnych ³.

Cykl życiowy C. elegans przechodzi przez stadium embrionalne i cztery stadia larwalne, zanim zwierzęta osiągną dorosłość. Rozwój może trwać od 2 do 4 dni w zależności od temperatury. W każdym z etapów można zaobserwować kilka charakterystycznych cech. Wiedza o jego pełnej linii komórkowej ^4,5 wraz z głęboką adnotacją jego genomu sprawiają, że nicień ten staje się doskonałym modelem w dziedzinach tak różnych, jak neurobiologia ⁶, starzenie się ^7,8, biologia komórek macierzystych ⁹ i biologia linii zarodkowej ¹⁰.

Dodatkową cechą, która czyni C. elegans atrakcyjnym modelem do pracy, jest możliwość uzyskania populacji robaków zsynchronizowanych na określonym etapie za pomocą stosunkowo łatwego protokołu. Łatwość utrzymania i rozmnażania tego nicienia w połączeniu z możliwością synchronizacji stanowią potężne narzędzie do uzyskiwania dużych ilości robaków, które można wykorzystać do szerokiej gamy małych lub wysokoprzepustowych eksperymentów, takich jak między innymi badania przesiewowe RNAi, mikromacierze, masowe sekwencjonowanie, immunoblot lub hybrydyzacja in situ.

Ze względu na swoją przezroczystość, struktury C. elegans mogą być rozróżniane pod mikroskopem za pomocą mikroskopii z kontrastem różnicowym, znanej również jako mikroskopia Nomarskiego. Zastosowanie fluorescencyjnego spoiwa DNA, DAPI (4',6-diamidino-2-fenyloindol), na przykład, może prowadzić do specyficznej identyfikacji i lokalizacji poszczególnych komórek, a także związanych z nimi struktur/defektów subkomórkowych.

Protocol

1. Protokół A: Hodowla robaków do wybielania ¹¹

Duże populacje C. elegans można uzyskać poprzez hodowlę ich w płynnych podłożach lub na stałych podłożach na płytkach. Zwykle są hodowane na stałych pożywkach NGM (Nematode Growth Systems) i karmione bakteriami E. coli, które są dodawane do płytek żywych lub martwych (zabijanych przez UV¹², przez ciepło¹³ lub przez zimno¹⁴). Najczęstsza procedura wykorzystuje żywą OP50 E. coli, która jest wadliwa w syntezie uracylu i nie może przerosnąć do grubej warstwy, która zasłaniałaby robaki.

1. Wymieszaj 3 g NaCl, 17 g agaru i 2,5 g peptonu i dodaj 975 ml H_2O. Autoklaw przez 50 minut.
2. Schłodzić kolbę do temperatury 55 °C.
3. Dodać 1 ml 1 M CaCl₂, 1 ml 5 mg/ml cholesterolu w etanolu, 1 ml 1 M_MgSO4 i 25 ml 1 M buforu KPO₄ (wszystkie z wyjątkiem cholesterolu uprzednio autoklawowanego).
4. Stosując sterylne procedury, dozuj roztwór NGM do płytek Petriego; wypełnij płytki do 2/3 ich objętości.
5. Po wyschnięciu zaleca się pozostawienie płytek w temperaturze pokojowej na 2-3 dni przed użyciem w celu wykrycia zanieczyszczeń. Przygotuj smugę OP50 E. coli z wywaru glicerolowego (OP50 można uzyskać w Centrum Genetyki Caenorhabditis).
6. Zbierz pojedynczą rodzinę i hoduj ją w LB przez noc w temperaturze 37 °C z mieszaniem.
7. Pozwól, aby nadmiar wilgoci odparował z płytek, zdejmując pokrywkę w przepływie laminarnym i dodaj OP50 do środka płytek za pomocą sterylnej pipety Pasteura.
8. Pozostaw trawnik OP50 E. coli do wzrostu przez noc w temperaturze pokojowej lub w temperaturze 37 °C przez 8 godzin.
9. Dodać żądaną ilość robaków do płytek (w przypadku inkubacji w temperaturze 37 °C płytki należy przed użyciem schłodzić w temperaturze pokojowej).

WSKAZÓWKI:

• Wlanie tej samej ilości pożywki do płytek za pomocą pipety lub dozownika z pompką zapewnia taką samą objętość agaru do płytek i ułatwia przesuwanie płytki bez konieczności ponownego ustawiania ostrości mikroskopu stereoskopowego.
• Talerze (zarówno z nasionami, jak i bez nasion z bakteriami) mogą być używane kilka tygodni po przygotowaniu, jeśli są przechowywane w pojemniku w temperaturze pokojowej lub 4 °C.
• Unikaj przyklejania bakterii do krawędzi płytki. Jeśli trawnik rozciąga się do krawędzi talerza, robaki mogą pełzać po bokach, wysychać i umierać.
• Robaki żyją dłużej, jeśli bakterie wysiane na talerzach są już martwe ¹⁵.

2. Protokół B: Leczenie alkalicznym roztworem podchlorynu ("Wybielanie")¹¹

Technika bielenia jest używana do synchronizacji kultur C. elegans w pierwszym stadium larwalnym (L1). Zasada metody polega na tym, że robaki są wrażliwe na wybielacz, podczas gdy skorupka jaja chroni przed nim zarodki. Po potraktowaniu alkalicznym roztworem podchlorynu zarodki inkubuje się w płynnym podłożu bez pożywienia, co umożliwia wykluwanie się, ale uniemożliwia dalszy rozwój.

1. Pozwól robakom rosnąć aż do osiągnięcia dorosłości.
2. Odzyskaj ciężarne dorosłe osobniki w probówkach o pojemności 15 ml, myjąc płytki buforem M9.
3. Robaki peletowe przez wirowanie przez 2 minuty przy 400xg (~1500 obr./min na standardowej wirówce stołowej) w temperaturze pokojowej i odrzuć supernatant.
4. Wykonaj 1-3 prania, aż bufor okaże się wolny od bakterii.
5. Dodać żądany roztwór wybielający (Tabela I) i mieszać przez kilka minut (zniszczenie dorosłej tkanki powinno być monitorowane pod mikroskopem preparacyjnym, a reakcja zatrzymana, gdy ślady dorosłych osobników są nadal widoczne, co zwykle trwa od 3 do 9 minut, w zależności od kilku kwestii, takich jak objętość osadu robaka, wspomniana w dyskusji) (ryc. 3).
6. Zatrzymaj reakcję, dodając bufor M9 w celu napełnienia probówki.
7. Szybko odwirować (ponieważ obróbka może być nadal aktywna) przez 1 minutę przy 400 x g i odrzucić supernatant.
8. Przemyć pellet jeszcze trzy razy, napełniając probówkę buforem M9.
9. Dodać 1 ml buforu M9 do osadu lub umieścić jaja na niewysiewanych płytkach NGM i inkubować w żądanej temperaturze z delikatnym mieszaniem. Należy zapewnić odpowiednie napowietrzenie (rys. 4).

WSKAZÓWKI:

• Istnieją różne rozwiązania wybielające, wybierz ten, który lepiej sprawdza się w dłoniach (tabela 1, ryc. 1).
• Jaja już złożone na płytkach można odzyskać, zeskrobując powierzchnię agaru miękkim materiałem, takim jak kawałek filmu rentgenowskiego.
• Zbyt duża ilość szczątków dorosłych zwierząt może zaburzać synchronizację, ponieważ stanowią one pożywienie dla niedawno wyklutych larw.
• Wyższe temperatury nieznacznie przyspieszają rozwój, co jest niewygodne, jeśli jakiś robak pomija synchronizację, ponieważ różnica w rozwoju między zsynchronizowanymi i niezsynchronizowanymi robakami będzie większa w wyższych temperaturach.
• Roztwór wybielający należy wykonać tuż przed jego użyciem. Ponadto wybielacz traci moc po pewnym czasie otwarcia, częściowo ze względu na jego wrażliwość na światło. Sugerujemy przetaczanie każdej nowej butelki do małych bursztynowych butelek, aby zapobiec takiej utracie i zminimalizować ekspozycję na światło.

3. Protokół C: Powlekanie robaków

1. Odczekaj od 12 do 24 godzin (czas do zakończenia rozwoju zarodka zależy od temperatury) po wykonaniu bielenia i odzyskaj robaki przez odwirowanie (2 minuty przy 400 x g).
2. Wyrzuć supernatant, robaki nasienne na wymagane płytki i pozostaw pozostałą ciecz do wyschnięcia.
3. Umieść talerze w wymaganej temperaturze.

WSKAZÓWKI:

• Larwy L1 w buforze M9 mogą być trzymane w temperaturze 15 °C przez co najmniej jeden tydzień bez widocznych zmian.
• Bądź ostrożny przy obliczaniu robaków, które wysiejesz, ponieważ zbyt wiele może wyczerpać pokarm szybciej niż oczekiwano i zrujnować twój eksperyment. Około 500 L1 może osiągnąć dorosłość na płytce 55 mm bez wyczerpania pokarmu.

4. Protokół D: Obserwacja C. elegans

D.1 Obserwacja Nomarskiego

Mikroskopia kontrastu z interferencją, to technika oświetlenia mikroskopii optycznej używana do zwiększania kontrastu w niebarwionych przezroczystych próbkach. Słowo Nomarski odnosi się do użytego pryzmatu, nazwanego tak na cześć jego wynalazcy. Obserwując żywe zwierzęta, jesteśmy w stanie zbadać fizjologię zwierzęcia z jedynymi zmianami wynikającymi z unieruchomienia. Ponadto, ponieważ nie dodaje się utrwalacza, można zaobserwować markery fluorescencyjne in vivo. Fakt ten oraz możliwość fuzji markerów fluorescencyjnych z genem będącym przedmiotem zainteresowania sprawiają, że możliwe jest śledzenie procesów, w których badane białko może być zaangażowane. Stosując technikę opisaną w tym protokole, można nie tylko zaobserwować żywe robaki, ale także je odzyskać i ponownie posiać.

Przygotowanie podkładki agarowej (tuż przed użyciem):

1. Przygotuj agarozę 2% w wodzie i rozpuść. Przechowywać w stanie stopionym w temperaturze 65 °C.
2. Umieść na nich dwa szkiełka z kawałkiem taśmy po obu stronach trzeciego, czystego szkiełka.
3. Za pomocą pipety Pasteura umieść kroplę agaru na czystej powierzchni.
4. Przykryj agar kolejnym czystym szkiełkiem umieszczonym prostopadle na trzech szkiełkach.
5. Dociśnij delikatnie, aby kropla agaru spłaszczyła się do grubości przekładek taśmy.
6. Gdy agar zastygnie, delikatnie wyciągnij zaklejone szkiełka i oddziel dwa pozostałe szkiełka, przesuwając je względem drugiego.

Montaż żywych zwierząt

7. Umieść jedną kroplę (10 μl) lewamizolu 1mM lub azydku sodu 10-30 mM na środku podkładki.
8. Przenieś zwierzęta do zrzutu za pomocą kilofa do robaków.
9. Delikatnie nałóż szkiełko nakrywkowe na zwierzęta i przymocuj je po obu stronach lakierem do paznokci lub silikonem.

WSKAZÓWKI:

• Porcje agarozy należy przechowywać w temperaturze 4 °C.
• Stopiona agaroza może być przechowywana w temperaturze 65 °C przez co najmniej jeden dzień.
• Uwaga: Lewaizol jest agonistą receptora nikotynowego, który wywołuje spastyczny paraliż mięśni¹⁶.
• Bądź ostrożny, azydek sodu jest niezwykle toksyczny!

D.2 Utrwalanie etanolu i barwienie DAPI

Opisany tutaj protokół reprezentuje szybki sposób barwienia robaków za pomocą DAPI, jednak z powodu rozszczepienia robaka niektóre struktury mogą ulec pewnym zmianom. Istnieje kilka innych metod naprawy robaków przed barwieniem DAPI, takich jak utrwalanie roztworem Carnoya lub formaldehydem, które lepiej zachowują integralność robaka ¹⁷.

Utrwalanie etanolu (zmodyfikowane z ¹⁸)

1. Umieścić ~10 μl buforu M9 (lub wody) na szkiełku mikroskopowym.
2. Za pomocą kilofa ostrożnie przenieś 10-25 robaków do kropli.
3. Za pomocą bibuły filtracyjnej lub mikropipety usuń jak najwięcej buforu M9, nie usuwając robaków ani nie pozostawiając ich do wyschnięcia.
4. Dodaj ~10 μl 90% etanolu i pozostaw do wyschnięcia.
5. Powtórz krok 4 raz lub dwa razy.

4',6-diamidino-2-fenyloindol (DAPI) barwienie

6. Wymieszać DAPI z żądanymi mediami montażowymi do końcowego stężenia 2 ng/μl.
7. Po całkowitym odparowaniu etanolu dodać 7 μl mieszaniny DAPI:podłoże montażowe.
8. Umieść szkiełko nakrywkowe i przymocuj je po obu stronach odrobiną lakieru do paznokci lub silikonu. Preparaty będą gotowe do obserwacji po około 5 minutach od dodania DAPI.

WSKAZÓWKI:

• Podłoże montażowe zawiera glicerol, więc niewielka ilość wystarczy, aby pokryć cały preparat.
• Istnieje szeroka gama komercyjnych nośników montażowych (na przykład Fluoromount lub Prolong), ich jakość i cena zależą od tego, jak długo chcesz przechowywać próbkę.
• Bądź ostrożny, DAPI jest znanym mutagenem, który silnie wiąże się z regionami bogatymi w A-T w DNA.

Przepisy

Pożywka dla nicieni (NGM)

.7% (w/v) Agar
50 mM NaCl
0,25% (w/v) Pepton
1 mM CaCl₂
5 μg/ml Cholesterol
25 mM KPO₄
1 mM_MgSO4

Bufor M9

22mM KH₂PO₄
42 mM na₂HPO₄
86 mM NaCl
1 mM_MgSO4

Przetestowane roztwory wybielające

  Przepis #1 Przepis #2 Przepis #3 Przepis #4 Przepis #5 Woda (ml) Godzina 2,75 3,5 0,5 0,5 1,5 Wodorotlenek sodu (ml) 1,25 (1 mln) 0,5 (5 mln) 2,5 (1 mln) 2,5 (2 mln) 2,5 (1 mln) Podchloryn sodu ~ 4% (ml) 1 1 1 cyfra arabska 1 Ogółem (ml) 5 5 4 5 5

Tabela I. Różne receptury roztworów wybielających przetestowane na potrzeby tego artykułu. Przepisy #3 i #4 są 2x i powinny być dodane do tej samej objętości M9. Przepisy na #1, #2 i #5 zostały wcześniej zgłoszone ^{2, 11, 19}. Stężenia końcowe: #1 NaOH 0,25M, NaOCl ~0,8%, #2 NaOH 0,5M, NaOCl ~0,8%, #3 NaOH 0,625M, NaOCl ~1%, #4 NaOH 1 M, NaOCl ~1,6%, #5 NaOH 0,5M, NaOCl ~0,8%.

5. Reprezentatywne wyniki

Rysunek 1. Porównanie pięciu różnych roztworów wybielających w dwóch różnych czasach inkubacji. Robaki N2 przemyte dwukrotnie M9 podzielono na pięć stożkowych probówek o pojemności 15 ml zawierających każdy roztwór wybielający. Probówki energicznie wstrząsano i 1 ml przeniesiono do nowej probówki z M9 w celu zatrzymania reakcji po upływie określonego czasu. Po zabiegu wybielania robaki inkubowano z 1 ml M9 w temperaturze 20 °C przez 24 godziny. W każdym przypadku dolne zdjęcie zostało wykonane tuż po wybielaniu, górne 24 godziny później.

Rysunek 2. Temperatura roztworu wybielającego wpływa na skuteczność zabiegu. Równe ilości robaków N2 bielono tym samym roztworem wybielającym, uprzednio schładzano na lodzie przez 20 minut lub przechowywano w temperaturze 25 °C przez ten sam czas. Dwie kolumny po lewej stronie pokazują zdjęcia tuż po wybielaniu. Po poddaniu działaniu substancji robaki inkubowano w stożkowych probówkach o pojemności 15 ml z 1 ml M9 w temperaturze 20 °C przez 24 godziny. Kolumny po prawej stronie wyświetlają zdjęcia 24 godziny później.

Rysunek 3. Stosunek granulek robaków do czasu inkubacji alkalicznego podchlorynu wpływa na skuteczność zabiegu. 50, 100, 250 i 500 μl osadu robaka inkubowano z 2 ml roztworu wybielającego #3 przez 3, 6 i 9 minut. Wylęgnięte L1, martwe zarodki i szczątki dorosłych fragmentów oznaczono ilościowo po inkubacji w temperaturze 20 °C przez 24 godziny w stożkowych probówkach o pojemności 15 ml z 1 ml buforu M9. Aby uzyskać 100 μl granulatu robaka, potrzebne są około trzy zlewające się płytki o średnicy 55 mm z dorosłymi robakami.

Rysunek 4. Odpowiednie napowietrzenie jest wymagane do wylęgu i przeżycia zarodków C. elegans. 100 μl osadu robaków N2 bielono przez 6 minut i inkubowano w stożkowych probówkach o pojemności 15 ml z 1, 5 lub 10 ml, zgodnie ze specyfikacją, M9 w temperaturze 20 °C przez 24 godziny. W górnej części rysunku wyświetlane są zdjęcia kultur po 24 godzinach, gdzie strzałki wskazują jaja, które się nie wykluły. Na dole znajduje się wykres przedstawiający liczbę larw (jasnoszary) i martwych zarodków (ciemnoszary) 48 godzin po wybieleniu w podanych warunkach.

Rysunek 5. Cykl życiowy C. elegans. a. Przybliżona długość robaków na różnych etapach. Godziny wymagane do osiągnięcia każdego etapu w zależności od temperatury (zmodyfikowane z ²⁰). b. Nomarski (góra) i DAPI (dół) zdjęcia różnych robaków we wskazanych stadiach rozwojowych. Najważniejsze cechy w każdej fazie są powiększone. L1: strzałka wskazuje prekursory gonady somatycznej i linię zarodkową. Wczesne L4: strzałka (nomarski) wskazuje rozwijający się srom; białe strzałki (DAPI) wskazują dwa ramiona gonad. Średnio późne L4: strzałka wskazuje rozwijający się srom w tak zwanym stadium choinki. Młody dorosły: strzałka oznacza zarodek w macicy, grot strzałki wskazuje na spermatekę, biała strzałka wskazuje oocyt. Gravid adult: grot strzałki (DAPI) wskazuje zapłodnione zarodki. Strzałka na obrazie DAPI wskazuje spermatekę.

Rysunek 6. Morfologia sromu w stadiach L3, L4 i dorosłych. W stadium L3 można zaobserwować tylko małe światło, w którym tworzy się srom. W punkcie L4 światło to rozszerza się formując tzw. "choinkę". U osoby dorosłej srom jest już zamknięty. Żółte linie wskazują położenie sromu na tych trzech etapach.

Rysunek 7. Barwienie DAPI w stadium L3, wczesnym L4, późnym L4 i dorosłym. W L3 linia zarodkowa jest wydłużona. W L4 ramiona gonad mają morfologię w kształcie litery U. W późnym stadium L4 plemniki można zaobserwować w dystalnej części gonady. Młodzi dorośli prezentują oocyty. Linia rozrodcza Adult składa się z oocytów i zarodków. Żółte linie wyznaczają linie zarodkowe na różnych określonych etapach.

Rysunek 8. Rozwój C. elegans w temperaturze 15 i 25 °C. Robaki N2 wybielono, inkubowano przez noc w M9 i mieszano w temperaturze 15 °C, przeniesiono na płytki i wyhodowano we wskazanych czasach w podanych temperaturach.

Discussion

Synchronizacja nicieni

Opisano kilka roztworów wybielających. Wypróbowaliśmy pięć różnych receptur (Tabela I) i w naszych rękach nie wykazały one istotnych różnic w synchronizacji populacji robaków (ryc. 1). Jednak nasze eksperymenty wykazały, że parametry takie jak temperatura (ryc. 2), stosunek roztworu bielącego do objętości robaków (ryc. 3) i objętość M9, z którą zarodki są inkubowane do wylęgu (ryc. 4) wpływ...