Podstawowe metody pracy z Caenorhabditis elegans: Synchronizacja i obserwacja

Podsumowanie

Łatwość utrzymania i propagacji nicieni C. elegans sprawia, że są one doskonałym organizmem modelowym. Możliwość synchronizacji nicieni pozwala na pracę ze znaczną liczbą osobników w tym samym stadium rozwojowym, co ułatwia badanie konkretnego procesu u wielu zwierząt.

Streszczenie

Badania nad biologią molekularną i rozwojową nicieni Caenorhabditis elegans rozpoczęto na początku lat siedemdziesiątych Sydney Brenner, od tego czasu organizm ten jest szeroko wykorzystywany jako organizm modelowy ¹. C. elegans posiada kluczowe cechy, takie jak prostota, przezroczystość i krótki cykl życiowy, dzięki którym od wielu lat stanowi odpowiedni system eksperymentalny do podstawowych badań biologicznych ². Odkrycia dokonane u tego nicienia mają szerokie znaczenie, ponieważ wiele procesów komórkowych i molekularnych kontrolujących rozwój zwierząt jest konserwatywne ewolucyjnie ³.

C. elegans przechodzi cykl życiowy obejmujący stadium embrionalne i cztery stadia larwalne, zanim zwierzęta osiągną wiek dorosły. Rozwój może trwać od 2 do 4 dni w zależności od temperatury. W każdym z tych stadiów można zaobserwować kilka charakterystycznych cech. Znajomość pełnego rodowodu komórkowego ^4,5 wraz z głęboką adnotacją genomu czynią ten nicień doskonałym modelem w tak zróżnicowanych dziedzinach jak neurobiologia ⁶, starzenie ^7,8, biologia komórek macierzystych ⁹ oraz biologia linii zarodkowej ¹⁰.

Dodatkową cechą, która sprawia, że C. elegans jest atrakcyjnym modelem badawczym, jest możliwość uzyskania populacji nicieni zsynchronizowanych na konkretnym etapie rozwoju dzięki stosunkowo prostemu protokołowi. Łatwość utrzymania i namnażania tego nicienia, w połączeniu z możliwością synchronizacji, stanowi potężne narzędzie do pozyskiwania dużych ilości osobników, które mogą być wykorzystane w szerokiej gamie eksperymentów niskoprzepustowych lub wysokoprzepustowych, takich jak między innymi przesiewy RNAi, mikromacierze, sekwencjonowanie masowe, immunoblotting czy hybrydyzacja in situ.

Ze względu na swoją przezroczystość, struktury C. elegans można rozróżnić pod mikroskopem, wykorzystując mikroskopię kontrastu interferencyjnego, znaną również jako mikroskopia Nomarskiego. Zastosowanie fluorescencyjnego związku wiążącego DNA, np. DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), pozwala na specyficzną identyfikację i lokalizację poszczególnych komórek, a także powiązanych z nimi struktur lub defektów wewnątrzkomórkowych.

Protokół

1. Protokół A: Hodowla nicieni do wybielania ¹¹

Duże populacje C. elegans można uzyskać poprzez hodowlę w pożywkach płynnych lub na pożywkach stałych na płytkach. Zazwyczaj są one hodowane na stałym podłożu NGM (Nematode Growth Media) i karmione bakteriami E. coli, które dodaje się do płytek w formie żywej lub martwej (uśmierconych promieniami UV¹², ciepłem¹³ lub zimnem¹⁴). W najczęściej stosowanej procedurze używa się żywych E. coli szczepu OP50, które wykazują defekt w syntezie uracylu i nie mogą przerodzić się w grubą warstwę, która zasłoniłaby nicienie.

1. Wymieszać 3 g NaCl, 17 g agaru i 2,5 g peptonu, a następnie dodać 975 ml H₂O. Autoklawować przez 50 min.
2. Ostudzić kolbę do 55 °C.
3. Dodać 1 ml 1 M CaCl₂, 1 ml cholesterolu w stężeniu 5 mg/ml w etanolu, 1 ml 1 M MgSO₄ oraz 25 ml buforu 1 M KPO₄ (wszystkie składniki poza cholesterolem powinny być uprzednio autoklawowane).
4. Stosując procedury sterylne, rozlać roztwór NGM do szalek Petriego, wypełniając je do 2/3 ich objętości.
5. Po wyschnięciu zaleca się pozostawienie szalek w temperaturze pokojowej przez 2-3 dni w celu wykrycia ewentualnych zanieczyszczeń. Przygotować posiew OP50 E. coli z zapasu w glicerolu (OP50 można pozyskać z Caenorhabditis Genetics Center).
6. Wybrać pojedynczą kolonię i hodować ją przez noc w podłożu LB w 37 °C z wytrząsaniem.
7. Pozwolić nadmiarowi wilgoci odparować z szalek poprzez zdjęcie pokrywek w komorze z laminarnym przepływem powietrza, a następnie nanieść OP50 na środek szalek za pomocą sterylnej pipety Pasteura.
8. Pozostawić trawnik OP50 E. coli do wzrostu przez noc w temperaturze pokojowej lub w 37 °C przez 8 godzin.
9. Nanieść na szalki pożądaną liczbę nicieni (jeśli inkubacja odbywała się w 37 °C, szalki należy uprzednio ostudzić do temperatury pokojowej przed użyciem).

WSKAZÓWKI:

• Wlewanie takiej samej ilości pożywki do szalek za pomocą pipety lub dozownika pompowego zapewnia jednakową objętość agaru w szalkach i ułatwia przesuwanie szalki bez konieczności ponownego ustawiania ostrości stereomikroskopu.
• Szalki (zarówno z posianymi, jak i bez posianych bakteriami) można wykorzystać kilka tygodni po przygotowaniu, jeśli są przechowywane w pojemniku w temperaturze pokojowej lub 4 °C.
• Należy unikać wysiewania bakterii do krawędzi szalki. Jeśli trawnik bakterii rozciąga się do krawędzi szalki, nicienie mogą wspiąć się po ściankach, wyschnąć i zginąć.
• Nicienie żyją dłużej, jeśli bakterie posiane na szalkach są już martwe ¹⁵.

2. Protokół B: Obróbka zasadowym roztworem podchlorynu („wybielanie”)¹¹

Technika wybielania jest stosowana w celu synchronizacji kultur C. elegans w pierwszym stadium larwalnym (L1). Zasada tej metody opiera się na fakcie, że nicienie są wrażliwe na wybielacz, podczas gdy skorupa jaja chroni embriony przed jego działaniem. Po traktowaniu zasadowym roztworem podchlorynu embriony inkubuje się w płynnym medium bez pożywki, co umożliwia ich wyklucie, ale zapobiega dalszemu rozwojowi.

1. Pozostawić nicienie do osiągnięcia stadium dorosłego.
2. zebrać dorosłe osobniki z jajami do probówek 15 ml, przemywając płytki buforem M9.
3. Wirować nicienie przez 2 minuty przy 400xg (~1500 rpm w standardowej wirówce stołowej) w temperaturze pokojowej w celu utworzenia osadu, a następnie odlać nadsącz.
4. Przeprowadzić od 1 do 3 płukań, aż bufor będzie wolny od bakterii.
5. Dodać odpowiedni roztwór do wybielania (Tabela I) i mieszać przez kilka minut (proces niszczenia tkanek osobników dorosłych należy monitorować pod mikroskopem stereoskopowym i przerwać reakcję, gdy wciąż widoczne są ślady osobników dorosłych, co zazwyczaj trwa od 3 do 9 minut w zależności od kilku czynników, takich jak objętość osadu z nicieni, wspomniane w dyskusji) (Rys. 3).
6. Przerwać reakcję, dopełniając probówkę buforem M9.
7. Szybko odwirować (ponieważ działanie odczynnika może być nadal aktywne) przez 1 minutę przy 400 x g i odlać nadsącz.
8. Przemyć osad jeszcze trzy razy, napełniając probówkę buforem M9.
9. Dodać 1 ml buforu M9 do osadu lub przenieść jaja na niezasiane płytki NGM i inkubować w pożądanej temperaturze przy delikatnym mieszaniu. Należy zapewnić odpowiednie napowietrzanie (Rys. 4).

WSKAZÓWKI:

• Istnieje kilka różnych roztworów do wybielania; należy wybrać ten, który sprawdza się najlepiej w danej praktyce (Tabela 1, Rys. 1).
• Jaja złożone już na płytkach można zebrać, zeskrobując powierzchnię agaru miękkim materiałem, takim jak kawałek folii rentgenowskiej.
• Zbyt duża ilość szczątków osobników dorosłych może zaburzyć synchronizację, ponieważ stanowią one źródło pożywienia dla świeżo wyklutych larw.
• Wyższe temperatury nieznacznie przyspieszają rozwój, co jest niekorzystne w przypadku pominięcia synchronizacji przez niektóre nicienie, gdyż różnica w rozwoju między nicieniami zsynchronizowanymi a niezsynchronizowanymi będzie większa w wyższych temperaturach.
• Roztwór do wybielania należy przygotować bezpośrednio przed użyciem. Ponadto wybielacz traci swoją aktywność po pewnym czasie od otwarcia, częściowo ze względu na światłoczułość. Sugerujemy rozlewanie każdej nowej butelki do małych butelek z ciemnego szkła, aby zapobiec tym stratom i zminimalizować ekspozycję na światło.

3. Protokół C: Wysiewanie nicieni na płytki

1. Odczekać od 12 do 24 godzin (czas zakończenia rozwoju embrionalnego zależy od temperatury) po przeprowadzeniu wybielania, a następnie odzyskać nicienie poprzez wirowanie (2 minuty przy 400 x g).
2. Odlać nadsącz, zasiać nicienie na odpowiednie płytki i pozwolić pozostałej cieczy wyschnąć.
3. Umieścić płytki w wymaganej temperaturze.

WSKAZÓWKI:

• Larwy L1 w buforze M9 można przechowywać w temperaturze 15 °C na wytrząsarce przez co najmniej tydzień bez widocznych zmian.
• Należy zachować ostrożność podczas obliczania liczby wysiewanych nicieni, ponieważ zbyt duża ich liczba może doprowadzić do szybszego niż oczekiwano wyczerpania pożywki i zniweczyć eksperyment. Na płytce 55 mm około 500 L1 może osiągnąć wiek dorosły bez braku pożywienia.

4. Protokół D: Obserwacja C. elegans

D.1 Obserwacja nomarski

Mikroskopia kontrastowo-fazowa (DIC) to technika oświetlenia w mikroskopii optycznej stosowana w celu zwiększenia kontrastu w niebarwionych, przezroczystych próbkach. Termin Nomarski odnosi się do zastosowanego pryzmatu, nazwanego na cześć jego wynalazcy. Obserwując żywe zwierzęta, jesteśmy w stanie badać ich fizjologię, przy czym jedyne zmiany wynikają z unieruchomienia. Ponadto, ponieważ nie dodaje się utrwalacza, markery fluorescencyjne można obserwować in vivo. Ten fakt oraz możliwość fuzji markerów fluorescencyjnych z badanym genem umożliwiają śledzenie procesów, w których może uczestniczyć analizowane białko. Stosując technikę opisaną w niniejszym protokole, można nie tylko obserwować żywe nicienie, ale także je odzyskać i ponownie wysiać na podłoże.

Przygotowanie podkładek agarowych (bezpośrednio przed użyciem):

1. Przygotować 2% roztwór agarozy w wodzie i go stopić. Utrzymywać w stanie stopionym w temperaturze 65 °C.
2. Umieścić dwa szkiełka z przyklejonymi po bokach kawałkami taśmy po obu stronach trzeciego, czystego szkiełka.
3. Za pomocą pipety Pasteura nanieść kroplę agaru na czystą powierzchnię.
4. Przykryć agar innym czystym szkiełkiem, kładąc go prostopadle na wierzchu trzech szkiełek.
5. Przycisnąć delikatnie, aby kropla agaru spłaszczyła się do grubości taśm dystansowych.
6. Po zastygnięciu agaru delikatnie wysunąć szkiełka z taśmą i rozdzielić dwa pozostałe szkiełka, przesuwając jedno względem drugiego.

Mocowanie żywych zwierząt

7. Nanieś jedną kroplę (10 μl) lewamisolu 1mM lub azotku sodu 10-30 mM na środek podkładki.
8. Przenieś zwierzęta do kropli za pomocą zgłębnika do nicieni.
9. Ostrożnie nałóż szkiełko nakrywkowe na zwierzęta i utrwal je po obu stronach za pomocą lakieru do paznokci lub silikonu.

WSKAZÓWKI:

• Alikwoty 2% agarozy należy przechowywać w temperaturze 4 °C.
• Roztopioną agarozę można przechowywać w temperaturze 65 °C przez co najmniej jeden dzień.
• Uwaga: Lewamizol jest agonistą receptorów nikotynowych, który wywołuje spastyczny paraliż mięśni¹⁶.
• Należy zachować ostrożność, azotek sodu jest niezwykle toksyczny!

D.2 Fixacja etanolem i barwienie DAPI

Protokół opisany w niniejszym opracowaniu stanowi szybką metodę barwienia nicieni DAPI, jednak ze względu na sekcję organizmu niektóre struktury mogą wykazywać pewne zmiany. Istnieje kilka innych metod utrwalania nicieni przed barwieniem DAPI, takich jak utrwalanie roztworem Carnoya lub formaldehydem, które w lepszy sposób zachowują integralność organizmu ¹⁷.

Fiksacja etanolem (zmodyfikowana na podstawie ¹⁸)

1. Nanieść ~10 μl buforu M9 (lub wody) na szkiełko przedmiotowe.
2. Za pomocą pęsety do nicieni ostrożnie przenieść 10-25 nicieni do kropli.
3. Używając papieru filtracyjnego lub mikropipety, usunąć jak najwięcej buforu M9, uważając, aby nie usunąć nicieni i nie dopuścić do ich wyschnięcia.
4. Dodać ~10 μl 90% etanolu i pozostawić do wyschnięcia.
5. Powtórzyć krok 4 raz lub dwa razy.

Barwienie 4',6-diamidino-2-fenyloindolem (DAPI)

6. Wymieszaj DAPI z wybranym medium montującym do stężenia końcowego 2 ng/μl.
7. Po całkowitym odparowaniu etanolu dodaj 7 μl mieszaniny DAPI i medium montującego.
8. Nałóż szkiełko nakrywkowe i utrwal je po obu stronach lakierem do paznokci lub silikonem. Preparaty będą gotowe do obserwacji około 5 min po dodaniu DAPI.

WSKAZÓWKI:

• Medium montażowe zawiera glicerol, więc niewielka ilość wystarczy, aby pokryć cały preparat.
• Istnieje szeroka gama komercyjnych mediów montażowych (np. Fluoromount lub Prolong), których jakość i cena zależą od tego, jak długo zamierzamy przechowywać próbkę.
• Należy zachować ostrożność, ponieważ DAPI jest znanym mutagenem, który silnie wiąże się z regionami bogatymi w pary A-T w DNA.

Przepisy

Pożywka do wzrostu nicieni (NGM)

1,7% (w/v) agar
50 mM NaCl
0,25% (w/v) pepton
1 mM CaCl₂
5 μg/ml cholesterolu
25 mM KPO₄
1 mM MgSO₄

Bufor M9

22mM KH₂PO₄
42 mM Na₂HPO₄
86 mM NaCl
1 mM MgSO₄

Przetestowane roztwory do wybielania

	przepis nr 1	przepis nr 2	przepis nr 3	przepis nr 4	przepis nr 5
woda (ml)	2.75	3.5	0.5	0.5	1.5
wodorotlenek sodu (ml)	1.25 (1M)	0.5 (5M)	2.5 (1M)	2.5 (2M)	2.5 (1M)
podchloryn sodu ~ 4% (ml)	1	1	1	2	1
łącznie (ml)	5	5	4	5	5

Tabela I. Różne przepisy na roztwory do wybielania przetestowane w tym artykule. Przepisy nr 3 i nr 4 są stężone 2x i powinny zostać dodane do takiej samej objętości pożywki M9. Przepisy nr 1, nr 2 i nr 5 były raportowane wcześniej ^{2, 11, 19}. Stężenia końcowe: #1 NaOH 0.25M, NaOCl ~0.8%, #2 NaOH 0.5M, NaOCl ~0.8%, #3 NaOH 0.625M, NaOCl ~1%, #4 NaOH 1 M, NaOCl ~1.6%, #5 NaOH 0.5M, NaOCl ~0.8%.

5. Reprezentatywne wyniki

Rysunek 1. Porównanie pięciu różnych roztworów wybielających przy dwóch różnych czasach inkubacji. Nicienie N2 przemyte dwukrotnie w M9 podzielono na pięć stożkowych probówek o pojemności 15 ml, z których każda zawierała inny roztwór wybielający. Probówki energicznie wstrząsano, a po upływie określonego czasu 1 ml zawartości przeniesiono do nowej probówki z M9 w celu zatrzymania reakcji. Po procedurze wybielania nicienie inkubowano z 1 ml M9 w temperaturze 20 °C przez 24 godziny. W każdym przypadku dolne zdjęcie wykonano bezpośrednio po wybielaniu, a górne zdjęcie 24 godziny później.

Rysunek 2. Temperatura roztworu do wybielania wpływa na skuteczność traktowania. Równe objętości nicieni N2 poddano wybielaniu tym samym roztworem, który był albo wcześniej schłodzony na lodzie przez 20 minut, albo utrzymywany w temperaturze 25 °C przez ten sam czas. Dwie kolumny po lewej stronie przedstawiają zdjęcia wykonane bezpośrednio po wybielaniu. Po traktowaniu nicienie inkubowano w stożkowych probówkach 15 ml z 1 ml buforu M9 w temperaturze 20 °C przez 24 godziny. Kolumny po prawej stronie przedstawiają zdjęcia wykonane 24 godziny później.

Rycina 3. Stosunek osadu z nicieni do czasu inkubacji w alkalicznym podchlorynie wpływa na skuteczność traktowania. 50, 100, 250 i 500 μl osadu z nicieni inkubowano z 2 ml roztworu wybielającego nr 3 przez 3, 6 i 9 minut. Liczbę wyklutych L1, martwych embrionów oraz pozostałości fragmentów dorosłych osobników oznaczono po inkubacji w temperaturze 20 °C przez 24 godziny w 15 ml probówkach stożkowych z 1 ml buforu M9. Aby uzyskać 100 μl osadu z nicieni, potrzebne są około trzy w pełni zarośnięte płytki 55 mm z dorosłymi nicieniami.

Rysunek 4. Prawidłowe napowietrzanie jest niezbędne do wylęgu i przetrwania embrionów C. elegans. Osad 100 μl nicieni N2 poddano działaniu podchlorynu przez 6 minut, a następnie inkubowano w stożkowych probówkach 15 ml z 1, 5 lub 10 ml (zależnie od warunku) buforu M9 w temperaturze 20 °C przez 24 godziny. Górna część rysunku przedstawia zdjęcia kultur po 24 godzinach, gdzie strzałki wskazują jaja, które nie wykluły się. Na dole znajduje się wykres przedstawiający liczbę larw (jasnoszary) i martwych embrionów (ciemnoszary) 48 godzin po poddaniu działaniu podchlorynu w określonych warunkach.

Rycina 5. Cykl życiowy C. elegans. a . Przybliżona długość nicieni na różnych etapach. Liczba godzin wymaganych do osiągnięcia każdego etapu w zależności od temperatury (zmodyfikowano na podstawie ²⁰). b. Zdjęcia w kontraście Nomarskiego (góra) i po barwieniu DAPI (dół) różnych nicieni na wskazanych etapach rozwoju. Najistotniejsze cechy każdej fazy zostały powiększone. L1: strzałka wskazuje prekursory gonady somatycznej i linii zarodkowej. Wczesne L4: czarna strzałka (Nomarski) wskazuje rozwijającą się wulwę; białe strzałki (DAPI) wskazują dwa ramiona gonady. Środkowe i późne L4: strzałka wskazuje rozwijającą się wulwę w tzw. stadium choinki. Młody osobnik dorosły: czarna strzałka wskazuje embrion wewnątrz macicy, grot strzałki wskazuje spermatekę, biała strzałka wskazuje oocyt. Dorosły osobnik z jajami: grot strzałki (DAPI) wskazuje zapłodnione embriony. Strzałka na obrazie DAPI wskazuje spermatekę.

Rycina 6. Morfologia sromu w stadiach L3, L4 i postaci dorosłej. W stadium L3 można zaobserwować jedynie niewielkie światło w miejscu formowania się sromu. W stadium L4 światło to rozszerza się, tworząc tzw. „choinkę”. U osobnika dorosłego srom jest już zamknięty. Żółte linie wskazują położenie sromu w tych trzech stadiach.

Rysunek 7. Barwienie DAPI w stadiach L3, wczesnym L4, późnym L4 oraz u osobników dorosłych. W stadium L3 linia zarodkowa jest wydłużona. W stadium L4 ramiona gonady wykazują morfologię w kształcie litery U. W stadium późnym L4 w dystalnej części gonady można zaobserwować plemniki. Młode osobniki dorosłe posiadają oocyty. Linia zarodkowa osobników dorosłych zawiera oocyty i embriony. Żółte linie wyznaczają linie zarodkowe w poszczególnych wymienionych stadiach.

Rysunek 8. Rozwój C. elegans w temperaturach 15 i 25 °C. Nicienie N2 poddano procesowi wybielania, inkubowano przez noc w buforze M9 z mieszaniem w 15 °C, a następnie przeniesiono na płytki i hodowano przez wskazany czas w określonych temperaturach.

Dyskusja

Synchronizacja nicieni

Opisano kilka roztworów do wybielania. Przetestowaliśmy pięć różnych receptur (Tabela I), które w naszych badaniach nie wykazały istotnych różnic w synchronizacji populacji nicieni (Rys. 1). Jednak nasze eksperymenty wykazały, że parametry takie jak temperatura (Rys. 2), stosunek roztworu wybielającego do objętości nicieni (Rys. 3) oraz objętość buforu M9, w którym inkubowane są embriony w celu wyklucia (