Generowanie unieśmiertelnionej linii komórek śródbłonka mikrokrążenia mózgu myszy jako modelu bariery krew-mózg in vitro

Podsumowanie

Niniejsza metoda opisuje sposób izolacji i unieśmiertelniania mikro naczyniowych komórek śródbłonka z mózgu myszy. Przedstawiamy szczegółowy protokół, obejmujący kolejno homogenizację tkanki mózgowej, etapy trawienia, wysiew oraz unieśmiertelnianie komórek. Uzyskanie homogennej, unieśmiertelnionej linii mikro naczyniowych komórek śródbłonka zajmuje zazwyczaj około pięciu tygodni.

Streszczenie

Komórki nabłonkowe i śródbłonkowe (EC) tworzą bariery parakomórkowe, które chronią tkankę przed środowiskiem zewnętrznym i wewnętrznym. Bariera krew-mózg (BBB), składająca się z EC, stóp końcowych astrocytów, pericytów i błony podstawnej, odpowiada za ochronę i homeostazę miąższu mózgu. Modele BBB in vitro są powszechnymi narzędziami służącymi do badania struktury i funkcji BBB na poziomie komórkowym. Do tej pory w różnych laboratoriach opracowano znaczną liczbę odmiennych modeli BBB in vitro. Zazwyczaj komórki pozyskuje się z tkanki mózgowej bydła, świni, szczura lub myszy (szczegółowo omówione w przeglądzie Wilhelma et al. ¹). Próbki ludzkich tkanek są dostępne tylko w ograniczonej liczbie laboratoriów lub firm ^2,3. Ponieważ przygotowanie pierwotnych hodowli komórkowych jest czasochłonne, a hodowle EC mogą różnić się między partiami, przedmiotem zainteresowania naukowego jest tworzenie unieśmiertelnionych linii EC.

W niniejszej pracy przedstawiamy metodę tworzenia unieśmiertelnionej linii komórek śródbłonka (EC) mikroznaczyniowych mózgu z mózgu noworodka myszy. Opisujemy procedurę krok po kroku, wymieniając zastosowane odczynniki i roztwory. Metoda opracowana w naszym laboratorium pozwala na izolację homogenicznej, unieśmiertelnionej linii komórek śródbłonka w ciągu czterech do pięciu tygodni. Linie komórek śródbłonka mikroznaczyniowych mózgu nazwane cEND ⁴ (z kory mózgu) oraz cerebEND ⁵ (z kory móżdżku) zostały wyizolowane zgodnie z tą procedurą w laboratorium Förstera i były skutecznie wykorzystywane do wyjaśniania różnych procesów fizjologicznych i patologicznych w obrębie barier krew-mózg (BBB). Wykorzystując cEND i cerebEND wykazaliśmy, że komórki te reagują na leczenie glikokortykosterydami ^4,6-9 i estrogenami ¹⁰, a także na mediatory prozapalne, takie jak TNFalpha ^5,8. Ponadto zbadaliśmy patologię stwardnienia rozsianego ¹¹ oraz hipoksji ^12,13 na poziomie komórek śródbłonka. Linie cEND i cerebEND mogą być uznane za wartościowe narzędzie do badania struktury i funkcji BBB, reakcji komórkowych EC na różne bodźce lub oddziaływania EC z limfocytami bądź komórkami nowotworowymi.

Protokół

1. Izolacja mikronaczyń mózgowych

1. Do każdej preparacji należy wykorzystać od pięciu do dziesięciu noworodków myszy obu płci (w wieku 3-5 dni).
2. Mysz należy uśmiercić zgodnie z lokalnymi zaleceniami IACUC/weterynaryjnymi, niezwłocznie usunąć mózg i przenieść go do szalki Petriego zawierającej następujący roztwór: 15 mM Hepes (pH 7.4), 153 mM NaCl, 5.6 mM KCl, 2.3 mM CaCl₂x 2H₂O, 2.6 mM MgCl₂x 6H₂O, 1% (w/v) BSA (zwany dalej buforem A).
3. O ile nie wskazano inaczej, wszystkie procedury izolacji powinny być przeprowadzane w temperaturze pokojowej (RT) (22-24 °C) pod dygestorium z laminarnym przepływem powietrza. Po usunięciu opon mózgowych i fragmentów naczyń włosowatych, mózgi (mózgowie bez móżdżku i pnia mózgu) należy pociąć w buforze A za pomocą sterylnego skalpela. Fragmenty tkanki należy pipetować w górę i w dół za pomocą pipety 10 ml, aż do całkowitego rozbicia grudek. Zawiesinę należy przenieść do probówki Falcon 50 ml i wirować przy 250 x g przez 5 min w RT.

Uwaga: Oponami mózgowymi są cienkie, przezroczyste błony znajdujące się na powierzchni tkanki mózgowej. Można je ostrożnie usunąć za pomocą sterylnej pincety.

4. Odrzuć nadsącz.
5. Rozpuść osad w 4,5 ml Buforu A z dodatkiem 1,5 ml 0,75% (w/v) kolagenazy/dispazy (Roche) i inkubuj przez 45 min w 37 °C w łaźni wodnej (okazjonalnie wstrząsając).
6. W międzyczasie przygotuj płytki 12-dołkowe, pokrywając cztery dołki kolagenem IV (0,1 mg/ml rozpuszczonym w 50 mM kwasie octowym). Pozostaw na 1 hr w celu adhezji.
7. Zatrzymaj trawienie poprzez dodanie 15 ml lodowatego buforu A. Dokładnie resuspenduj osad.
8. Wirowaj zawiesinę przy 250 x g przez 10 min w RT.
9. Odrzuć nadsącz.
10. Aby usunąć mielinę, dodaj 10 ml 25% (w/v) BSA (Sigma, czystość > 98%) i wirować przy 1 000 x g przez 20 min w 4 °C. 25% BSA należy rozpuścić w 1x PBS (PAA Laboratories) i przefiltrować przez filtr 0,2 μm).
11. Ostrożnie odrzuć nadsącz, rozpuść osad w 10 ml Buforu A i przenieś do nowej probówki Falcon.
12. Wirowaj zawiesinę przy 250 x g przez 5 min w RT. Otrzymany osad zawiera komórki śródbłonka.
13. Przemyj dwukrotnie płytkę 12-dołkową pokrytą kolagenem IV za pomocą PBS.
14. Resuspenduj osad w 4 ml pożywki wzrostowej (DMEM zawierającej 10% FCS, 50U/ml penicyliny/streptomycyny, 1% L-glutaminy) i nanieś zawiesinę komórek do dwóch dołków, po 2 ml do każdego. Dodaj puromycynę do stężenia końcowego 4 μg/ml i inkubuj przez 45 min w 37 °C w inkubatorze do hodowli komórkowych. Krok ten umożliwia usunięcie szybko przylegających komórek. Uwaga: Puromycynę dodaje się na 24 hr. Tylko komórki śródbłonka mózgu potrafią ją metabolizować; dla innych typów komórek puromycyna jest toksyczna ¹⁴.
15. Przenieś 2 ml pożywki zawierającej nieprzyległe komórki z kroku 1.14 do dwóch nowych dołków (dołki te zawierają frakcję komórek śródbłonka). Dopełnij dołki z przyległymi komórkami z kroku 1.14 2 ml świeżej pożywki (dołki te zawierają inne typy komórek, np. fibroblasty, astrocyty i mogą być hodowane równolegle oraz wykorzystane do porównania morfologii).
16. Wymień pożywkę następnego dnia.

2. Unieśmiertelnianie komórek śródbłonka mikrokrążenia mózgowego

1. Hodować fibroblasty GP + E-86 Neo (GPENeo) ¹⁵, wydzielające wirusa z defektem replikacji z onkogenem T środkowym poliomawirusa, w pożywce DMEM zawierającej 10% inaktywowanego ciepłem FCS, 50U/ml penicyliny/streptomycyny oraz 2 mg/ml G418 (PAA Laboratories) w kolbach powlekanych żelatyną. Uwaga: Transfekcja onkogenem T środkowym poliomawirusa powoduje przewagę wzrostu EC nad nie-EC, co prowadzi do powstania homogenicznej monowarstwy komórek o morfologii śródbłonkowej po 4 do 6 tygodniach hodowli. Linia GPENeo nie jest dostępna komercyjnie i może zostać pozyskana jako materiał publiczny (należy odnieść się do oryginalnych publikacji ^4,16).
2. Aby wykorzystać pożywkę zawierającą wirusa do immortalizacji, hodować komórki GPENeo w pożywce wolnej od G418 przez 24 h.
3. Odebrać 10 ml supernatantu GPENeo i dodać Polybrene (bromek heksadymetryny) (Sigma) do stężenia końcowego 8 μg/ml, a następnie wysterylizować przez filtr 0,45 μm w celu usunięcia fragmentów komórkowych.
4. Usunąć pożywkę wzrostową z kultur EC przygotowanych w części 1 i dodać do dołków 2 ml mieszaniny supernatantu GPENeo/Polybrene. Powtórzyć tę czynność następnego dnia, używając świeżej mieszaniny supernatantu GPENeo/Polybrene. Uwaga: Polybrene jest stosowany w celu utworzenia porów w ścianie komórkowej, aby ułatwić infekcję cząsteczkami wirusa.
5. Następnego dnia usunąć mieszaninę supernatantu GPENeo/Polybrene, przemyć komórki dwukrotnie PBS i utrzymywać komórki w pożywce wzrostowej, wymieniając ją co 3 dni. Po osiągnięciu konfluencji przenieść komórki w rozcieńczeniu 1:2 na płytki powlekane kolagenem IV.
6. Zazwyczaj stabilne linie komórek śródbłonka mózgowego (cEND) powinny zostać otrzymane po 4-5 tygodniach.

3. Hodowla komórek śródbłonka naczyniów mózgowych

1. Rozmrozić komórki z krioprobki w łaźni wodnej i przenieść do probówki typu Falcon 15 ml zawierającej 10 ml uprzednio ogrzanej pożywki.
2. Wirować zawiesinę z prędkością 250 x g przez 5 min w temperaturze pokojowej.
3. Usunąć pożywkę, a osad przenieść do kolby hodowlanej T_{25 cm}² pokrytej kolagenem IV z uprzednio ogrzaną pożywką wzrostową (gęstość komórek podczas wysiewu powinna wynosić co najmniej 1x 10⁴ komórek/ml).
4. Wymienić pożywkę następnego dnia, a po osiągnięciu przez komórki konfluencji (zazwyczaj po 5 dniach) przeprowadzić pasaż komórek.

4. Pasażowanie komórek cEND (Uwaga: Pasażowanie należy przeprowadzać tylko raz w tygodniu, unikając stosunku podziału większego niż 1:4).

1. Usunąć medium, a komórki przemyć PBS.
2. Dodać 3 ml podgrzanego roztworu trypsyny-EDTA (PAA Laboratories) (kolba T_{75 cm}²), inkubować w temperaturze 37 °C i czekać do czasu rozproszenia warstwy komórek (zazwyczaj od 5 do 15 min).
3. Dodać 5 ml medium wzrostowego, pipetować w górę i w dół, a następnie przenieść do nowej kolby powlekanej kolagenem IV.

5. Mrożenie komórek cEND

1. Uzyskać zawiesinę komórek zgodnie z opisem w kroku 4.
2. Odwirować zawiesinę z prędkością 250 x g przez 5 min w temperaturze pokojowej (RT).
3. Resuspendować osad komórkowy (uzyskany z jednej kolby T_{75 cm}²) w 6 ml medium do zamrażania (95% medium wzrostowe, 5% DMSO).
4. Podzielić zawiesinę komórek na cztery krioporce o objętości 1,5 ml. Uwaga: Jedną krioporcję można wysiać do kolby T_{25 cm}².
5. Przechowywać krioporcje w temperaturze oparów ciekłego azotu.

pożywka wzrostowa cEND: 450 ml DMEM, 10% FCS, 10 ml L-glutaminy, 2% MEM-Kit, 2% NEAA, 10 ml pirogronianu sodu, 50 U/ml penicyliny/streptomycyny

6. Reprezentatywne wyniki

Komórki cEND i cerebEND scharakteryzowano za pomocą immunobarwień markerów śródbłonka i bariery krew-mózg (BBB) oraz poprzez pomiary transepitelialnej oporności elektrycznej (TEER) i przepuszczalności. Komórki cEND i cerebEND wykazywały morfologię podobną do kultur pierwotnych komórek śródbłonka (EC) mózgu, tworząc monowarstwy z gęsto upakowanych, wydłużonych komórek, u których zaobserwowano hamowanie wzrostu po osiągnięciu konfluencji. Komórki wykazywały wyraźnie wykrywalne poziomy białek claudin-5, occludin i VE-cadherin, które lokalizowały się w złączach międzykomórkowych, co wykazano za pomocą immunofluorescencji (Rycina 3) ^4,5. Hodowla komórek cEND w medium o obniżonej zawartości surowicy prowadziła do wzrostu TEER (ze 150 Ωcm² w obecności 10% surowicy do 500 Ωcm² w obecności 2% surowicy), co zostało wzmocnione przez dodatek hydrokortyzonu (800 Ωcm²) lub insuliny (1,000 Ωcm²)⁴. Monowarstwy cEND hodowane w medium o obniżonej zawartości surowicy przez 21 dni osiągały TEER na poziomie 900 Ωcm² (Rycina 4). TEER mierzono za pomocą zestawu zawierającego elektrody do przepływu prądu i pomiaru napięcia (World Precision Instruments). Dla porównania, w literaturze zgłaszano wartości TEER dla pierwotnych komórek śródbłonka naczyniów mózgowych w zakresie 200-600 Ωcm², natomiast komercyjnie dostępna mysia linia komórkowa bEnd.3 wykazywała wartości TEER w zakresie 100-140 Ωcm² (zob. aktualne przeglądy: Abbot 2005 oraz Toth et al., 2011 ^17,18). Dodatkowo, przenikanie makrocząsteczek, takich jak niezaładowane dekstrany FITC o masach cząsteczkowych 4, 10, 70 i 500 kDa lub fluoresceina (300 Da), przez monowarstwę cEND w medium różnicującym z 2% FCS w ciągu 4 h było zmniejszone w porównaniu z komórkami kontrolnymi utrzymywanymi w medium wzrostowym zawierającym 10% FCS: strumień parakomórkowy został zredukowany do 30% wartości kontrolnej dla fluoresceiny, do 26% dla dekstranów FITC 10 i 70 kDa oraz do 4,5% dla dekstranu FITC 500 kDa. Podobnie jak w przypadku wartości TEER, przepuszczalność była najniższa w komórkach hodowanych w obecności glikokortykosteroidów (GC) ⁴. W dalszych badaniach zidentyfikowaliśmy geny docelowe glikokortykosteroidów: occludin, claudin-5 i VE-cadherin w śródbłonku naczyniowym mózgu ^4,7,9. Leczenie GC prowadziło do zwiększenia ekspresji tych białek oraz do reorganizacji VE-cadherin względem cytoszkieletu. Bezpośrednia regulacja białek złączy ścisłych, occludin i claudin-5, pośredniczona przez GC, odbywa się poprzez elementy odpowiedzi na GC w regionach promotorowych ^4,7,19. Ponadto claudin-5 zidentyfikowano jako nowy cel estrogenowy w śródbłonku naczyniowym ¹⁰.

Dysfunkcja śródbłonka leży u podstaw wielu różnych chorób. Hodowaliśmy cEND w warunkach deprywacji tlenu i glukozy (OGD). OGD doprowadziło do zaburzenia funkcji BBB, którą można było przywrócić po zastosowaniu łącznej terapii GC i inhibitora proteasomów bortezomibu ¹². Warunki OGD doprowadziły do silnego wzrostu poboru glukozy oraz ekspresji transporterów glukozy w cerebEND, co można było złagodzić poprzez dodanie MK801, niekonkurencyjnego inhibitora receptora NMDA ¹³.

Rysunek 1. Morfologia komórek śródbłonka mikronaczyniowego mózgu (cEND) tydzień po izolacji. Zdjęcia mikroskopowe wykonano przy powiększeniu 6x (A) i 15x (B). Widoczne są wyspowe kolonie komórek śródbłonka.

Rycina 2. Morfologia komórek śródbłonka mikrokrążenia mózgowego (cEND) miesiąc po izolacji i unieśmiertelnieniu. Zdjęcia wykonano za pomocą mikroskopii świetlnej przy 15-krotnym powiększeniu. Widoczna jest konfluenta, jednorodna warstwa pojedyncza komórek śródbłonka.

Rycina 3. Unieśmiertelnione komórki śródbłonka mikrokrążenia mózgowego wykazują ekspresję claudin-5, occludin oraz VE-cadherin.Komórki CEND hodowano na szkiełkach podstawkowych pokrytych kolagenem IV i barwiono przeciwciałami przeciwko claudin-5 (A), occludin (B) oraz VE-cadherin (C). Obrazy wykonano za pomocą mikroskopu Zeiss Axioscop2 przy powiększeniu 40x.

Rysunek 4. Pomiar transepitelialnego oporu elektrycznego (TEER) monowarstwy cEND.Komórki cEND hodowano na filtrach transwell pokrytych kolagenem IV (rozmiar porów 0.4 μm). Po osiągnięciu konfluencji komórki utrzymywano w medium zawierającym 2% FCS. TEER mierzono po 7, 14 i 21 dniach przy użyciu zestawu zawierającego elektrody do przepływu prądu i pomiaru napięcia.

Dyskusja

Opisana procedura może być wykorzystywana do izolacji mikro naczyniowych komórek śródbłonka (EC) z różnych szczepów myszy, jak również z różnych szczepów myszy z nokautem genów, w celu badania specyficznych zmian w funkcji śródbłonka naczyniowego. Jako metodę unieśmiertelnienia zastosowano transformację onkoproteiną mysiego polyomavirusa, antygenem Polyoma middle T. Przekształca on szybko niedojrzałe komórki śródbłonka in vivo oraz in vitro ^20,21,22. Inne metody unieśmiertelniania komórek EC opisane w literaturze obejmują na przykład unieśmiertelnianie antygenem SV40 large T wirusa Simian Vacuolating Virus 40 ²³, produktem genu E1A adenowirusa ²⁴ lub nadekspresję podjednostki katalitycznej ludzkiej telomerazy ³. Unieśmiertelnianie za pomocą PymT jest specyficzne dla niedojrzałych mysich komórek EC, co pozwala na szybkie uzyskanie homogennej hodowli komórek EC z noworodków myszy. Unieśmiertelnienie zmienia właściwości komórek, a wyniki uzyskane z unieśmiertelnionych linii komórkowych powinny być porównywane albo z komórkami pierwotnymi, albo z eksperymentami in vivo na myszach. Opisano, że unieśmiertelnione PymT komórki EC wykazują wysoką aktywność fibrinolityczną, wynikającą ze zwiększonej produkcji aktywatora plazminogenu typu urokinazy oraz zmniejszonej produkcji inhibitorów aktywatora plazminogenu ²⁵. Bezpośrednie porównanie unieśmiertelnionej PymT linii komórek bEND5 z pierwotnymi komórkami EC wykazało, że oba modele BWE in vitro są dobrze dostosowane do badań adhezji limfocytów T ²⁶.

Linie komórkowe ustanowione zgodnie z opisaną procedurą można stosować przy niskim numerze pasażu, aby zachować właściwości barierowe dzięki wysokiej ekspresji białek połączeń BBB i EC, ponieważ komórki tracą te właściwości wraz z wiekiem. W związku z tym, po utracie właściwości barierowych, należy rozważyć przygotowanie nowej linii komórkowej. Gęstość wysiewu komórek EC powinna być wysoka, ponieważ jest to kluczowe dla proliferacji komórek. Należy to uwzględnić zarówno podczas procedury izolacji, jak i w trakcie hodowli unieśmiertelnionych EC. Każda nowa linia komórkowa powinna zostać przetestowana pod kątem właściwości barierowych oraz ewentualnych zanieczyszczeń innymi typami komórek. Monowarstwy EC można barwić przeciwciałami anty-galaktocerebrosydowymi, anty-gliofibrylarnym białkiem kwaśnym oraz anty-antygenem mięśni gładkich jako przeciwciałami pierwszorzędowymi, aby wykluczyć zanieczyszczenie oligodendrocytami, astrocytami i perycytami ^4,27. Aby wykluczyć zanieczyszczenie naczyniami oponowymi, można zbadać ekspresję trombomoduliny, która jest wyrażana we wszystkich łożach naczyniowych z wyjątkiem mózgu ²⁸.

Interesujące jest to, że unieśmiertelnione linie mikrovascularnych komórek śródbłonka izolowane z różnych obszarów mózgu różnią się właściwościami barierowymi i podatnością na bodźce prozapalne. Jako przykład można przywołać linie komórkowe cEND z mózgowia oraz cerebEND z móżdżku ^4,5. W porównaniu z cEND, linia cerebEND wykazała niższe poziomy ekspresji głównych składników połączeń ścisłych: claudin-1 i occludin. Jednakże poziomy claudin-3 i -12 były wyższe w cerebEND. Funkcja barierowa komórek cerebEND uległa znacznie większemu pogorszeniu pod wpływem mediatora zapalnego TNFα niż właściwości barierowe komórek cEND ⁵. Wyższą podatność móżdżku na bodźce zapalne można zaobserwować in vivo u pacjentów z stwardnieniem rozsianym oraz w jego modelu zwierzęcym — eksperymentalnym autoimmunologicznym zapaleniuu mózgu i rdzenia ²⁹. Te interesujące wyniki wskazują na konieczność tworzenia i charakteryzowania oddzielnych modeli in vitro dla różnych obszarów mózgu, aby w przyszłości usprawnić dostarczanie leków do mózgu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Siarczan albuminy wołowej (BSA)	Sigma-Aldrich	A7906	Czystość > 98%
kolagen IV	Sigma-Aldrich	C5533	50 μg/ml w 50 mM kwasie octowym
Kolagenaza/Dyspaza	Roche	10269638001
Pożywka Eagle'a modyfikowana przez Dulbecco (DMEM)	Sigma-Aldrich	D5796
Dimetylosulfoksyd (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2650
Płódka surowica cielęca (FCS)	PAA Laboratories	A15110-1333	stężenie końcowe 10%, inaktywowana termicznie (30 min w 56 °C)
L-glutamina	Biochrom AG	K0282	Przechowywanie: ≤ -15 °C
Witaminy MEM	Biochrom AG	K0373	Przechowywanie: ≤ -15 °C
Pirowinian sodu	Biochrom AG	L0473
Neomycyna (G418)	PAA Laboratories	P11-012
Niezbędne aminokwasy (NEA)	Biochrom AG	K0293	Przechowywanie w 4 °C
Penicylina/Streptomycyna	Biochrom AG	A2212	Przechowywanie: ≤ -15 °C
Bufor fosforanowy (PBS)	Biochrom AG	L1825
Polybrene (bromek heksadymetryny)	Sigma-Aldrich	107689	0,8 mg/ml w PBS, przechowywanie w -20 °C
Puromycyna	Sigma-Aldrich	P8833
Trypsyna/EDTA	Biochrom AG	L1825	0,05%, 0,02% EDTA w PBS