Generowanie unieśmiertelnionej linii komórek śródbłonka mikrokrążenia mózgu myszy jako modelu bariery krew-mózg in vitro

Podsumowanie

Niniejsza metoda opisuje sposób izolacji i unieśmiertelniania mikro naczyniowych komórek śródbłonka z mózgu myszy. Przedstawiamy szczegółowy protokół, obejmujący kolejno homogenizację tkanki mózgowej, etapy trawienia, wysiew oraz unieśmiertelnianie komórek. Uzyskanie homogennej, unieśmiertelnionej linii mikro naczyniowych komórek śródbłonka zajmuje zazwyczaj około pięciu tygodni.

Streszczenie

Komórki nabłonkowe i śródbłonkowe (EC) tworzą bariery parakomórkowe, które chronią tkankę przed środowiskiem zewnętrznym i wewnętrznym. Bariera krew-mózg (BBB), składająca się z EC, stóp końcowych astrocytów, pericytów i błony podstawnej, odpowiada za ochronę i homeostazę miąższu mózgu. Modele BBB in vitro są powszechnymi narzędziami służącymi do badania struktury i funkcji BBB na poziomie komórkowym. Do tej pory w różnych laboratoriach opracowano znaczną liczbę odmiennych modeli BBB in vitro. Zazwyczaj komórki pozyskuje się z tkanki mózgowej bydła, świni, szczura lub myszy (szczegółowo omówione w przeglądzie Wilhelma et al. ¹). Próbki ludzkich tkanek są dostępne tylko w ograniczonej liczbie laboratoriów lub firm ^2,3. Ponieważ przygotowanie pierwotnych hodowli komórkowych jest czasochłonne, a hodowle EC mogą różnić się między partiami, przedmiotem zainteresowania naukowego jest tworzenie unieśmiertelnionych linii EC.

W niniejszej pracy przedstawiamy metodę tworzenia unieśmiertelnionej linii komórek śródbłonka (EC) mikroznaczyniowych mózgu z mózgu noworodka myszy. Opisujemy procedurę krok po kroku, wymieniając zastosowane odczynniki i roztwory. Metoda opracowana w naszym laboratorium pozwala na izolację homogenicznej, unieśmiertelnionej linii komórek śródbłonka w ciągu czterech do pięciu tygodni. Linie komórek śródbłonka mikroznaczyniowych mózgu nazwane cEND ⁴ (z kory mózgu) oraz cerebEND ⁵ (z kory móżdżku) zostały wyizolowane zgodnie z tą procedurą w laboratorium Förstera i były skutecznie wykorzystywane do wyjaśniania różnych procesów fizjologicznych i patologicznych w obrębie barier krew-mózg (BBB). Wykorzystując cEND i cerebEND wykazaliśmy, że komórki te reagują na leczenie glikokortykosterydami ^4,6-9 i estrogenami ¹⁰, a także na mediatory prozapalne, takie jak TNFalpha ^5,8. Ponadto zbadaliśmy patologię stwardnienia rozsianego ¹¹ oraz hipoksji ^12,13 na poziomie komórek śródbłonka. Linie cEND i cerebEND mogą być uznane za wartościowe narzędzie do badania struktury i funkcji BBB, reakcji komórkowych EC na różne bodźce lub oddziaływania EC z limfocytami bądź komórkami nowotworowymi.

Protokół

1. Izolacja mikronaczyń mózgowych

1. Do każdego przygotowania należy wykorzystać od pięciu do dziesięciu noworodków myszy obu płci (w wieku 3-5 dni).
2. Mysz należy uśmiercić zgodnie z lokalnymi zaleceniami IACUC/lekarza weterynarii, niezwłocznie wyciąć mózg i przenieść go do szalki Petriego zawierającej następujący roztwór: 15 mM Hepes (pH 7,4), 153 mM NaCl, 5,6 mM KCl, 2,3 mM CaCl₂x 2H₂O, 2,6 mM MgCl₂x 6H₂O, 1% (w/v) BSA (dalej określany jako bufor A).
3. O ile nie wskazano inaczej, wszystkie procedury izolacji powinny być przeprowadzane w temperaturze pokojowej (RT) (22-24 °C) pod laminarnym nawiewem. Po usunięciu opon mózgowych i fragmentów naczyń kapilarnych, mózgi (mózgowie bez móżdżku i pnia mózgu) należy pociąć w buforze A za pomocą sterylnego skalpela. Fragmenty tkanki należy pipetować w górę i w dół za pomocą pipety 10 ml, aż do całkowitego rozbicia grudek. Zawiesinę należy przenieść do probówki Falcon 50 ml i wirować przy 250 x g przez 5 min w RT.

Uwaga: Ośnie mogą być zidentyfikowane jako cienkie, przezroczyste błony na powierzchni tkanki mózgowej. Można je ostrożnie usunąć za pomocą sterylnej pęsety.

4. Odciąć supernatant.
5. Rozpuścić osad w 4,5 ml Buforu A z dodatkiem 1,5 ml 0,75% (w/v) kolagenazy/dispazy (Roche) i inkubować przez 45 min w temperaturze 37 °C w kąpieli wodnej (okazjonalnie wstrząsając).
6. W międzyczasie przygotować płytki 12-dołkowe, pokrywając cztery dołki kolagenem IV (0,1 mg/ml rozpuszczonym w 50 mM kwasie octowym). Pozostawić do adsorpcji na 1 h.
7. Zatrzymać trawienie poprzez dodanie 15 ml lodowatego buforu A. Dokładnie resuspender osad.
8. Odwirować zawiesinę przy 250 x g przez 10 min w temperaturze pokojowej (RT).
9. Odciąć supernatant.
10. W celu usunięcia mieliny dodać 10 ml 25% (w/v) BSA (Sigma, czystość > 98%) i odwirować przy 1 000 x g przez 20 min w temperaturze 4 °C. 25% BSA powinno być rozpuszczone w 1x PBS (PAA Laboratories) i przefiltrowane przez filtr 0,2 μm).
11. Ostrożnie odciąć supernatant, rozpuścić osad w 10 ml Buforu A i przenieść do nowej probówki Falcon.
12. Odwirować zawiesinę przy 250 x g przez 5 min w temperaturze pokojowej (RT). Otrzymany osad zawiera komórki śródbłonka.
13. Przemyć dwukrotnie pokrytą kolagenem IV płytkę 12-dołkową za pomocą PBS.
14. Resuspender osad w 4 ml pożywki wzrostowej (DMEM zawierającej 10% FCS, 50U/ml penicyliny/streptomycyny, 1% L-glutaminy) i nanieść zawiesinę komórkową do dwóch dołków, po 2 ml do każdego. Dodać puromycynę do stężenia końcowego 4 μg/ml i inkubować przez 45 min w temperaturze 37 °C w inkubatorze do hodowli komórkowych. Krok ten pozwala na usunięcie szybko przylegających komórek. Uwaga: Puromycynę dodaje się na 24 h. Tylko komórki śródbłonka mózgu potrafią ją metabolizować; dla innych typów komórek puromycyna jest toksyczna ¹⁴.
15. Przenieść 2 ml pożywki zawierającej nieprzylegające komórki z kroku 1.14 do dwóch nowych dołków (te dołki zawierają frakcję komórek śródbłonka). Dopełnić dołki z komórkami przylegającymi z kroku 1.14 za pomocą 2 ml świeżej pożywki (dołki te zawierają inne typy komórek, np. fibroblasty, astrocyty i mogą być hodowane równolegle oraz wykorzystywane do porównania morfologii).
16. Wymienić pożywkę następnego dnia.

2. Unieśmiertelnianie komórek śródbłonka mikrokrążenia mózgowego

1. Hodować fibroblasty GP + E-86 Neo (GPENeo) ¹⁵, wydzielające wirusa z defektem replikacyjnym z onkogenem T środkowym polyoma, w pożywce DMEM zawierającej 10% inaktywowanego ciepłem FCS, 50U/ml penicyliny/streptomycyny oraz 2 mg/ml G418 (PAA Laboratories) w kolbach pokrytych żelatyną. Uwaga: Transfekcja onkogenem T środkowym polyoma powoduje przewagę wzrostu komórek śródbłonka (EC) nad komórkami niebędącymi EC, co prowadzi do powstania jednorodnej monowarstwy komórek o morfologii śródbłonka po 4 do 6 tygodniach hodowli. GPENeo nie są dostępne komercyjnie i mogą być pozyskane jako publiczny materiał udostępniony (proszę odnieść się do oryginalnych publikacji ^4,16).
2. Aby wykorzystać pożywkę zawierającą wirusa do uniesmiertelnienia, hodować komórki GPENeo w pożywce wolnej od G418 przez 24 h.
3. Odlać 10 ml supernatantu GPEneo i dodać Polybrene (bromek heksadymetryny) (Sigma) do stężenia końcowego 8 μg/ml, a następnie wysterylizować przez filtr 0,45 μm w celu usunięcia fragmentów komórkowych.
4. Usunąć pożywkę wzrostową z kultur EC przygotowanych w Części 1 i dodać do dołków 2 ml mieszaniny supernatantu GPEneo/Polybrene. Powtórzyć czynność następnego dnia, używając świeżej mieszaniny supernatantu GPEneo/Polybrene. Uwaga: Polybrene jest używany do tworzenia porów w ścianie komórkowej, aby ułatwić infekcję cząstkami wirusowymi.
5. Następnego dnia usunąć mieszaninę supernatantu GPEneo/Polybrene, dwukrotnie przemyć komórki PBS i utrzymywać je w pożywce wzrostowej, wymieniając ją co 3 dni. Po osiągnięciu konfluencji przenieść komórki w stosunku 1:2 na płytki pokryte kolagenem IV.
6. Zazwyczaj stabilne linie komórek śródbłonka mózgowego (cEND) powinny zostać otrzymane po 4-5 tygodniach.

3. Hodowla komórek śródbłonka mikrokrążenia mózgowego

1. Rozmrozić komórki z krioalikwotu w kąpieli wodnej i przenieść do probówki Falcon 15 ml z 10 ml podgrzanej wcześniej pożywki.
2. Odwirować zawiesinę z prędkością 250 x g przez 5 min w RT.
3. Usunąć pożywkę, przenieść osad do kolby hodowlanej T_{25 cm}² powlekanej kolagenem IV z podgrzaną wcześniej pożywką wzrostową (gęstość komórek podczas wysiewania powinna wynosić co najmniej 1x 10⁴ komórek/ml).
4. Wymienić pożywkę następnego dnia, a po osiągnięciu przez komórki konfluencji (zazwyczaj po 5 dniach) dokonać pasażowania komórek.

4. Pasażowanie komórek cEND (Uwaga: pasażowanie powinno być wykonywane tylko raz w tygodniu, należy unikać rozcieńczeń większych niż 1:4).

1. Usunąć medium, a następnie przemyć komórki PBS.
2. Dodać 3 ml podgrzanego roztworu trypsyny-EDTA (PAA Laboratories) (kolba T_{75 cm}²), inkubować w temperaturze 37 °C i czekać do momentu rozproszenia warstwy komórek (zazwyczaj od 5 do 15 min).
3. Dodać 5 ml medium wzrostowego, pipetować w górę i w dół, a następnie przenieść do nowej kolby powlekanej kolagenem IV.

5. Zamrażanie komórek cEND

1. Przygotować zawiesinę komórkową zgodnie z opisem w kroku 4.
2. Odwirować zawiesinę przy 250 x g przez 5 min w temperaturze pokojowej (RT).
3. Resuspender osad komórkowy (uzyskany z jednej kolby T_{75 cm}²) w 6 ml medium do mrożenia (95% medium wzrostowe, 5% DMSO).
4. Podzielić zawiesinę komórkową na cztery krioprzaliki po 1,5 ml. Uwaga: Jeden krioprzalik można zasiać do kolby T_{25 cm}².
5. Przechowywać krioprzaliki w temperaturze par ciekłego azotu.

Pożywka wzrostowa cEND: 450 ml DMEM, 10% FCS, 10 ml L-glutaminy, 2% MEM-Kit, 2% NEAA, 10 ml pirogronianu sodu, 50 U/ml penicyliny/streptomycyny

6. Reprezentatywne wyniki

Komórki cEND i cerebEND scharakteryzowano za pomocą immunobarwień markerów śródbłonka i BHE (bariery krew-mózg) oraz poprzez pomiary transepithelialnej oporności elektrycznej (TEER) i przepuszczalności. Komórki cEND i cerebEND wykazywały morfologię podobną do kultur pierwotnych EC (komórek śródbłonka) mózgu, tworząc monowarstwy gęsto upakowanych, wydłużonych komórek, które wykazywały zahamowanie wzrostu po osiągnięciu konfluencji. Komórki wykazywały wyraźnie wykrywalne poziomy białek claudin-5, occludin i VE-cadherin, które lokalizowały się w połączeniach międzykomórkowych, co wykazano w badaniu immunofluorescencji (Rycina 3) ^4,5. Hodowla komórek cEND w medium o obniżonej zawartości surowicy prowadziła do wzrostu TEER (z 150 Ωcm² w obecności 10% surowicy do 500 Ωcm² w obecności 2% surowicy), co zostało wzmocnione przez dodatek hydrokortyzonu (800 Ωcm²) lub insuliny (1,000 Ωcm²)⁴. Monowarstwy cEND hodowane w medium o obniżonej zawartości surowicy przez 21 dni osiągnęły wartość TEER wynoszącą 900 Ωcm² (Rycina 4). TEER mierzono przy użyciu zestawu zawierającego elektrody do przepływu prądu i pomiaru napięcia (World Precision Instruments). Dla porównania, w literaturze zgłoszono, że pierwotne EC mikro naczyniowe mózgu mają wartości TEER w zakresie 200-600 Ωcm², a komercyjnie dostępna mysia linia komórkowa bEnd.3 wykazuje wartości TEER rzędu 100-140 Ωcm² (nowszy przegląd: Abbot 2005 oraz Toth et al., 2011 ^17,18). Ponadto, przenikanie makrocząsteczek, takich jak nieładowane FITC-dekstrany o masach cząsteczkowych 4, 10, 70 i 500 kDa lub fluoresceina (300 Da), przez monowarstwę cEND w medium różnicującym z 2% FCS w ciągu 4 h było mniejsze w porównaniu z komórkami kontrolnymi utrzymywanymi w medium wzrostowym zawierającym 10% FCS: przepływ parakomórkowy został zredukowany do 30% w stosunku do komórek kontrolnych dla fluoresceiny, do 26% dla FITC-dekstranów 10 i 70 kDa oraz do 4,5% dla FITC-dekstranu 500 kDa. Podobnie jak w przypadku wartości TEER, przepuszczalność była najniższa w komórkach hodowanych w obecności glikokortykosteroidów (GC) ⁴. W dalszych badaniach zidentyfikowano geny docelowe glikokortykosteroidów: occludin, claudin-5 i VE-cadherin w śródbłonku naczyniowym mózgu ^4,7,9. Leczenie GC prowadziło do zwiększenia ekspresji tych białek oraz do reorganizacji VE-cadherin względem cytoszkieletu. Bezpośrednia regulacja białek połączeń ścisłych occludin i claudin-5 przez GC odbywa się poprzez elementy odpowiedzi na GC w ich regionach promotorowych ^4,7,19. Dodatkowo claudin-5 został zidentyfikowany jako nowy cel estrogenowy w śródbłonku naczyniowym ¹⁰.

Dysfunkcja śródbłonka leży u podstaw wielu różnych chorób. Hodowaliśmy komórki cEND w warunkach deprywacji tlenu i glukozy (OGD). OGD doprowadziła do zaburzenia funkcji BBB, która mogła zostać przywrócona po zastosowaniu łącznej terapii GC oraz inhibitora proteasomów bortezomibu ¹². Warunki OGD doprowadziły do silnego wzrostu poboru glukozy oraz ekspresji transporterów glukozy w komórkach cerebEND, co mogło zostać złagodzone poprzez dodanie MK801, niekonkurencyjnego inhibitora receptora NMDA ¹³.

Rycina 1. Morfologia komórek śródbłonka naczyń mózgowych (cEND) tydzień po izolacji. Zdjęcia mikroskopowe wykonano przy powiększeniu 6x (A) i 15x (B). Widoczne są tworzące wyspy kolonie komórek śródbłonka.

Rysunek 2. Morfologia komórek śródbłonka mikrokrążenia mózgu (cEND) miesiąc po izolacji i unieśmiertelnieniu. Zdjęcia wykonano za pomocą mikroskopii świetlnej przy 15-krotnym powiększeniu. Można zaobserwować konfluencyjną, jednorodną monowarstwę komórek śródbłonka.

Rycina 3. Unieśmiertelnione komórki śródbłonka mikro naczyniowego mózgu wykazują ekspresję claudin-5, occludin i VE-cadherin.Komórki CEND hodowano na szkiełkach podstawkowych pokrytych kolagenem IV i barwiono przeciwciałami przeciwko claudin-5 (A), occludin (B) oraz VE-cadherin (C). Obrazy wykonano przy użyciu mikroskopu Zeiss Axioscop2 z powiększeniem 40x.

Rycina 4. Pomiar transendotelialnego oporu elektrycznego (TEER) monowarstwy cEND. Komórki cEND hodowano na filtrach transwell pokrytych kolagenem IV (wielkość porów 0,4 μm). Po osiągnięciu konfluencji komórki utrzymywano w pożywce zawierającej 2% FCS. TEER mierzono po 7, 14 i 21 dniach przy użyciu układu zawierającego elektrody do przepływu prądu i pomiaru napięcia.

Dyskusja

Opisana procedura może być wykorzystywana do izolacji mikro naczyniowych komórek śródbłonka (EC) z różnych szczepów myszy, jak również z różnych szczepów myszy z nokautem genów, w celu badania specyficznych zmian w funkcji śródbłonka naczyniowego. Jako metodę unieśmiertelnienia zastosowano transformację onkoproteiną mysiego polyomavirusa, antygenem Polyoma middle T. Przekształca on szybko niedojrzałe komórki śródbłonka in vivo oraz in vitro ^20,21,22. Inne metody unieśmiertelniania komórek EC opisane w literaturze obejmują na przykład unieśmiertelnianie antygenem SV40 large T wirusa Simian Vacuolating Virus 40 ²³, produktem genu E1A adenowirusa ²⁴ lub nadekspresję podjednostki katalitycznej ludzkiej telomerazy ³. Unieśmiertelnianie za pomocą PymT jest specyficzne dla niedojrzałych mysich komórek EC, co pozwala na szybkie uzyskanie homogennej hodowli komórek EC z noworodków myszy. Unieśmiertelnienie zmienia właściwości komórek, a wyniki uzyskane z unieśmiertelnionych linii komórkowych powinny być porównywane albo z komórkami pierwotnymi, albo z eksperymentami in vivo na myszach. Opisano, że unieśmiertelnione PymT komórki EC wykazują wysoką aktywność fibrinolityczną, wynikającą ze zwiększonej produkcji aktywatora plazminogenu typu urokinazy oraz zmniejszonej produkcji inhibitorów aktywatora plazminogenu ²⁵. Bezpośrednie porównanie unieśmiertelnionej PymT linii komórek bEND5 z pierwotnymi komórkami EC wykazało, że oba modele BWE in vitro są dobrze dostosowane do badań adhezji limfocytów T ²⁶.

Linie komórkowe ustanowione zgodnie z opisaną procedurą można stosować przy niskim numerze pasażu, aby zachować właściwości barierowe dzięki wysokiej ekspresji białek połączeń BBB i EC, ponieważ komórki tracą te właściwości wraz z wiekiem. W związku z tym, po utracie właściwości barierowych, należy rozważyć przygotowanie nowej linii komórkowej. Gęstość wysiewu komórek EC powinna być wysoka, ponieważ jest to kluczowe dla proliferacji komórek. Należy to uwzględnić zarówno podczas procedury izolacji, jak i w trakcie hodowli unieśmiertelnionych EC. Każda nowa linia komórkowa powinna zostać przetestowana pod kątem właściwości barierowych oraz ewentualnych zanieczyszczeń innymi typami komórek. Monowarstwy EC można barwić przeciwciałami anty-galaktocerebrosydowymi, anty-gliofibrylarnym białkiem kwaśnym oraz anty-antygenem mięśni gładkich jako przeciwciałami pierwszorzędowymi, aby wykluczyć zanieczyszczenie oligodendrocytami, astrocytami i perycytami ^4,27. Aby wykluczyć zanieczyszczenie naczyniami oponowymi, można zbadać ekspresję trombomoduliny, która jest wyrażana we wszystkich łożach naczyniowych z wyjątkiem mózgu ²⁸.

Interesujące jest to, że unieśmiertelnione linie mikrovascularnych komórek śródbłonka izolowane z różnych obszarów mózgu różnią się właściwościami barierowymi i podatnością na bodźce prozapalne. Jako przykład można przywołać linie komórkowe cEND z mózgowia oraz cerebEND z móżdżku ^4,5. W porównaniu z cEND, linia cerebEND wykazała niższe poziomy ekspresji głównych składników połączeń ścisłych: claudin-1 i occludin. Jednakże poziomy claudin-3 i -12 były wyższe w cerebEND. Funkcja barierowa komórek cerebEND uległa znacznie większemu pogorszeniu pod wpływem mediatora zapalnego TNFα niż właściwości barierowe komórek cEND ⁵. Wyższą podatność móżdżku na bodźce zapalne można zaobserwować in vivo u pacjentów z stwardnieniem rozsianym oraz w jego modelu zwierzęcym — eksperymentalnym autoimmunologicznym zapaleniuu mózgu i rdzenia ²⁹. Te interesujące wyniki wskazują na konieczność tworzenia i charakteryzowania oddzielnych modeli in vitro dla różnych obszarów mózgu, aby w przyszłości usprawnić dostarczanie leków do mózgu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Siarczan albuminy wołowej (BSA)	Sigma-Aldrich	A7906	Czystość > 98%
kolagen IV	Sigma-Aldrich	C5533	50 μg/ml w 50 mM kwasie octowym
Kolagenaza/Dyspaza	Roche	10269638001
Pożywka Eagle'a modyfikowana przez Dulbecco (DMEM)	Sigma-Aldrich	D5796
Dimetylosulfoksyd (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2650
Płódka surowica cielęca (FCS)	PAA Laboratories	A15110-1333	stężenie końcowe 10%, inaktywowana termicznie (30 min w 56 °C)
L-glutamina	Biochrom AG	K0282	Przechowywanie: ≤ -15 °C
Witaminy MEM	Biochrom AG	K0373	Przechowywanie: ≤ -15 °C
Pirowinian sodu	Biochrom AG	L0473
Neomycyna (G418)	PAA Laboratories	P11-012
Niezbędne aminokwasy (NEA)	Biochrom AG	K0293	Przechowywanie w 4 °C
Penicylina/Streptomycyna	Biochrom AG	A2212	Przechowywanie: ≤ -15 °C
Bufor fosforanowy (PBS)	Biochrom AG	L1825
Polybrene (bromek heksadymetryny)	Sigma-Aldrich	107689	0,8 mg/ml w PBS, przechowywanie w -20 °C
Puromycyna	Sigma-Aldrich	P8833
Trypsyna/EDTA	Biochrom AG	L1825	0,05%, 0,02% EDTA w PBS