Wykorzystanie sekwencji zatrzymania SecM jako narzędzia do izolowania polipeptydów związanych z rybosomami

Podsumowanie

Opisujemy tutaj technikę, która jest obecnie rutynowo używana do izolowania stabilnie związanych kompleksów łańcuchowych rybosomów (RNC). Technika ta wykorzystuje odkrycie, że "sekwencja zatrzymania" SecM o długości 17 aminokwasów może zatrzymać wydłużenie translacji w systemie prokariotycznym (E. coli), gdy zostanie wprowadzona do (lub połączona z C-końcem) praktycznie dowolnego białka.

Streszczenie

Obszerne badania dostarczyły wielu dowodów sugerujących, że fałdowanie białek w komórce jest procesem kotranslacyjnym^1-5. Jednak dokładna ścieżka, którą podąża łańcuch polipeptydowy podczas fałdowania kotranslacyjnego, aby osiągnąć swoją funkcjonalną formę, jest nadal zagadką. Aby zrozumieć ten proces i określić dokładną konformację współtranslacyjnych produktów pośrednich fałdowania, konieczne jest opracowanie technik, które pozwolą na izolację RNC przenoszących powstające łańcuchy o z góry określonych rozmiarach, aby umożliwić ich dalszą analizę strukturalną.

SecM (monitor wydzielania) to 170-aminokwasowe białko E. coli, które reguluje ekspresję ATPazy SecA (napędzającej wydzielanie) w operonie secM-secA ⁶. Nakatogawa i Ito pierwotnie odkryli, że sekwencja o długości 17 aminokwasów (150-FSTPVWISQAQGIRAGP-166) w regionie C-końcowym białka SecM jest wystarczająca i konieczna, aby spowodować zatrzymanie wydłużania SecM w Gly165, wytwarzając w ten sposób peptydylo-glicylo-tRNA stabilnie związane z rybosomalnym miejscem P^7-9. Co ważniejsze, odkryto, że ta długa sekwencja 17 aminokwasów może być połączona z C-końcem praktycznie każdego białka o pełnej długości i/lub skróconego, umożliwiając w ten sposób produkcję RNC przenoszących powstające łańcuchy o określonych rozmiarach⁷. Tak więc, po fuzji lub wstawieniu do białka docelowego, sekwencja zatrzymująca SecM powoduje zatrzymanie wydłużenia łańcucha polipeptydowego i generuje stabilne RNC zarówno in vivo w komórkach E. coli, jak i in vitro w systemie bezkomórkowym. Wirowanie w gradionym sucharenie jest dalej wykorzystywane do izolowania RNC.

Izolowane RNC mogą być używane do analizy strukturalnych i funkcjonalnych cech współtranslacyjnych produktów pośrednich. Ostatnio technika ta została z powodzeniem wykorzystana do uzyskania wglądu w strukturę kilku powstających łańcuchów związanych z rybosomami^10,11. Tutaj opisujemy izolację bydlęcych krystalicznych RNC Gamma-B połączonych z SecM i wygenerowanych w systemie translacji in vitro.

Protokół

1. Przygotowanie szablonu DNA i transkrypcja in vitro

1. Interesujący nas gen jest klonowany w dowolnym plazmidzie opartym na T7 i/lub np. SP6 opartym na promotorze. Aby uzyskać interesujące RNC, C-koniec docelowego polipeptydu wydłuża się poprzez dodanie sekwencji indukującej zatrzymanie SecM FXXXXWIXXXXGIRAGP⁷. Aby zapewnić, że interesujący nas fragment polipeptydu wydobędzie się z tunelu rybosomalnego, C-końcowa część białka docelowego musi zostać przedłużona o co najmniej 30 aminokwasów^12-14. Elastyczny łącznik bogaty w glicynę i serynę można wprowadzić między białko a sekwencję zatrzymującą SecM, aby uniknąć wszelkich możliwych ograniczeń konformacyjnych.
2. W przypadku transkrypcji in vitro, matrycowy DNA powinien być linearyzowany za pomocą enzymu restrykcyjnego przecinającego za ORF. Należy zweryfikować całkowitą linearyzację plazmidowego DNA, uruchamiając produkt trawienia restrykcyjnego na elektroforezie w żelu agarozowym.
3. Zlinearyzowany plazmid jest dalej wykorzystywany do reakcji transkrypcji in vitro. Można badać różne stężenia matrycowego DNA w celu określenia optymalnego stężenia DNA wymaganego do transkrypcji in vitro. Ogólnie rzecz biorąc, w przypadku zestawu do transkrypcji MEGAscript High Yield firmy Ambion (Ambion/Life Technologies, Grand Island, NY), 1 μg zlinearyzowanego DNA daje 40-60 μg mRNA. Transkrypcja in vitro odbywa się zgodnie z instrukcją producenta (Ambion/Life Technologies, Grand Island, NY).
4. Po transkrypcji in vitro mRNA jest oczyszczane przez wytrącanie chlorku litu zgodnie z instrukcją producenta (Ambion's MEGAscript High Yield Transcription Kit, Ambion/Life Technologies, Grand Island, NY).
5. Integralność mRNA jest dodatkowo weryfikowana za pomocą elektroforezy przy użyciu żeli akrylowych lub agarozowych.

2. Tłumaczenie in vitro

Dla translacji in vitro za pomocą zestawu RTS 100 E. coli HY (5 Prime, Gaithersburg, MD) wykonaj następujące kroki:

1. Przygotować 100 μl reakcji translacji in vitro zgodnie z instrukcją producenta. Krótko mówiąc, do wody wolnej od nukleaz dodać 24 μl mieszaniny aminokwasów minus metionina (1 mM), 10 jednostek inhibitora rybonukleazy (Invitrogen/Life Technologies, Grand Island, NY), 20 μCi radioaktywnej [³⁵S]-metioniny (MP Biomedicals, Solon, OH), 20 μl mieszaniny reakcyjnej, 24 μl buforu do rekonstytucji i 24 μl lizatu E. coli.
2. Inkubować reakcję w temperaturze 30 °C przez 5 minut w celu wstępnego ogrzania reakcji translacji. Dodać 1-2 μg mRNA do reakcji translacji i inkubować w temperaturze 30 °C przez 10-15 minut.
3. Zatrzymaj reakcję, umieszczając reakcję translacji na lodzie.

3. Izolacja powstającego polipeptydu z reakcji translacji in vitro

1. Aby wyizolować RNC, reakcję translacji nakłada się warstwami na 4,5 ml 5-30% gradientu sacharozy w 20 mM HEPES-KOH pH 7,5, 15 mM MgCl₂, 100 mM octanu potasu, 1 mM DTT i odwirowuje za pomocą rotora Beckman Coulter SW55-Ti przy 41 000 obr./min, 4 °C przez 2 godziny.
2. Po odwirowaniu gradient sacharozy jest frakcjonowany w celu wyizolowania różnych populacji rybosomów i związanych z nimi powstających łańcuchów. Separacja jest monitorowana za pomocą programowalnego systemu gradientu gęstości ISCO z ciągłym zapisem przy długości fali 254 nm przy użyciu detektora absorbancji ISCO UA-6.
3. Frakcje zawierające rybosomy 70S są zbierane i dalej analizowane w zależności od celu eksperymentu.

4. Obserwacja białka związanego z rybosomem za pomocą tris-trycyny SDS STRONA

Aby sprawdzić, czy rozszerzone białko SecM pozostaje przyłączone do rybosomu 70S, zebrano frakcje gradientowe i potraktowano je w następujący sposób:

1. Białko w każdej frakcji wytrącono przez dodanie kwasu trichlorooctowego (TCA) do końcowego stężenia 10% i inkubowano w temperaturze 4 °C przez noc.
2. Po całonocnej inkubacji próbki odwirowywano przy 14 000 x g przez 15 minut w celu osadzenia białka. Po odwirowaniu usunięto supernatant i dwukrotnie przemyto osad roztworem zawierającym aceton: 1 mM Tris-HCl pH 7,6 (4:1). Granulat był następnie suszony na powietrzu i rozpuszczany w buforze ładującym SDS-PAGE.
3. Leczoną próbkę rozdzielono i przeanalizowano za pomocą Tris-tricine SDS-PAGE.
4. Po elektroforezie żele utrwalono, wysuszono za pomocą próżniowego barwnika żelowego i poddano autoradiografii. Rozkład powstających polipeptydów obserwowano za pomocą fosfoobrazowania.

5. Reprezentatywne wyniki

Tutaj prezentujemy eksperyment opisujący izolację pełnowymiarowego bydlęcego kryształu Gamma-B stabilnie związanego z rybosomem 70S. Rysunek 1 przedstawia etapy związane z izolacją bydlęcych krystalinowych krystalinowych RNC Gamma-B. C-koniec krystaliny Gamma-B został ogólnie rozszerzony o 32 aminokwasy, aby zapewnić, że białko na całej długości wydostaje się z tunelu rybosomalnego; obejmuje to również sekwencję zatrzymania SecM umieszczoną na samym C-końcu polipeptydu fuzyjnego. Po translacji in vitro rybosomy 70S wyizolowano przez wirowanie w gradionym smaku sacharozy (ryc. 2.1). W celu zapewnienia, że białko pozostaje stabilnie związane z rybosomem, frakcje zawierające 70S zostały połączone, odsolone, wymienione buforem i poddane dodatkowej rundzie wirowania w gradientu sacharozy (ryc. 2.2). Wynik przedstawiony na rysunku 2 wyraźnie sugeruje, że SecM może skutecznie indukować zatrzymanie translacyjne krystalinowych RNC Gamma-B.

Rysunek 1. Schematyczne wyjaśnienie kroków występujących w izolacji RNC. C-koniec bydlęcej krystaliny Gamma-B został wydłużony o sekwencję 32 aminokwasów. Ten rozszerzony obszar C-końcowy obejmuje również sekwencję zatrzymania SecM. Krystalina Gamma-B z sekwencją SecM została sklonowana w plazmidzie pIVEX 2.3 (opartym na T7). W przypadku transkrypcji in vitro matrycowy DNA został zlinearyzowany za pomocą XbaI. Zlinearyzowany szablon został następnie wykorzystany do transkrypcji in vitro. T7 w matrycy DNA jest rozpoznawany przez polimerazę RNA T7, która transkrybuje gen krystaliny Gamma-B znajdujący się poniżej promotora T7. mRNA oczyszczono metodą wytrącania chlorku litu. Oczyszczone mRNA wykorzystano następnie do translacji in vitro. Po inkubacji reakcję translacji nałożono na 5-30% gradient sacharozy i odwirowano w wirniku Beckman Coulter SW55-Ti przy 41 000 obr./min, 4 °C przez 2 godziny.

Rysunek 2. Izolacja bydlęcych krystalinowych RNC Gamma-B stabilnie związanych z rybosomem 70S. 1 μg mRNA zmieszano w 100 μl reakcyjnym systemie ekstrakcji E. coli S30, jak wspomniano w sekcji protokołu, z 20 μCi [³⁵S]-metioniną i inkubowano w temperaturze 30 °C przez 15 min. Po inkubacji reakcję translacji nałożono na 5-30% gradient sacharozy w 20 mM HEPES-KOH pH 7,5, 15 mM MgCl₂, 100 mM octanu potasu, 1 mM DTT i odwirowano w wirniku Beckman Coulter SW55-Ti przy 41 000 obr./min, 4 °C przez 2 godziny. Po sedymentacji prędkości gradient został rozładowany i uzyskano pro le rybosomu. Dane zostały zarejestrowane przez program PeakTrak (ISCO gradient density gradient fractionation system). Pobrano frakcje, białko wytrącono TCA i rozdzielono na 16,5% T, 6% C Tris-Tricine PAGE żel¹⁵. Żel został wysuszony i wystawiony na działanie promieni słonecznych w celu przeprowadzenia autoradiografii. Po ekspozycji żel został zeskanowany za pomocą skanera obrazującego Typhoon 9410. Rysunek 2.1 pokazuje, że krystalina Gamma-B na całej długości jest obecna we frakcjach rybosomów 70S. W ten sposób sekwencja zatrzymania SecM pozwala na izolację stabilnych bydlęcych krystalinowych RNC Gamma-B. Dane na rysunku 2.2 wyraźnie wskazują, że izolowane RNC są rzeczywiście stabilne. W obecnym eksperymencie frakcje 70S po pierwszej rundzie wirowania gradientowego sacharozy zostały połączone, a sacharoza została usunięta za pomocą jednostki filtra odśrodkowego Amicon Ultra-4 (Millipore), a następnie nastąpiła wymiana buforu w roztworze zawierającym 20 mM HEPES-KOH pH 7,5, 15 mM MgCl₂, 100 mM octanu potasu, 1 mM DTT. Próbka ta została następnie poddana dodatkowej rundzie wirowania przez 5-30% gradient sacharozy i frakcjonowana. Każda frakcja została potraktowana i przeanalizowana jak na rysunku 2.1.

Dyskusja

Aby uzyskać powtarzalne wyniki, kluczowe znaczenie ma jakość i stężenie składników używanych do transkrypcji i translacji in vitro . Użyliśmy dostępnych na rynku ekstraktów do transkrypcji i translacji in vitro , które dają wydajne i powtarzalne wyniki, jeśli są traktowane ostrożnie. Jakość mRNA może wpływać na translację, dlatego niezwykle ważne jest przetestowanie integralności mRNA przed użyciem go do translacji in vitro . Czas inkubacji translacji in vitro różni się w zależności od...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
MEGAscript T7 Wysokowydajny zestaw do transkrypcji	Ambion	AM1333
RTS 100 E.coli HY Kit	5 Prime	2401100
Inhibitor rybonukleazy	Invitrogen	15518012
Trans [35S]-Label	MP Biomedicals	0151006
Filtr odśrodkowy Amicon Ultra-4	Millipore	UFC801008
Autoradiografia fosforowa do przechowywania	Healthcare	Typhoon 9410 kamera o zmiennym trybie
Systemy frakcjonowania gradientu gęstości	Teledyne Isco, Inc.		gradientu gęstości ISCO
Wirowanie w gradinie sacharozy		preparatywna Beckman Coulter	Optima L-90 K