Opisujemy tutaj technikę, która jest obecnie rutynowo stosowana do izolacji stabilnie związanych kompleksów powstającego łańcucha rybosomalnego (RNCs). Technika ta wykorzystuje odkrycie, że sekwencja „zatrzymująca” SecM o długości 17 aminokwasów może wstrzymać elongację translacji w systemie prokariotycznym (E. coli), gdy zostanie wstawiona do niemal każdego białka (lub połączona z jego końcem C).
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Wykorzystanie sekwencji zatrzymującej SecM jako narzędzia do izolacji polipeptydów związanych z rybosomami
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Szeroko zakrojone badania dostarczyły licznych dowodów sugerujących, że zwijanie białek w komórce jest procesem kotranslacyjnym1-5. Jednak dokładna ścieżka, jaką podąża łańcuch polipeptydowy podczas zwijania kotranslacyjnego, aby osiągnąć swoją funkcjonalną formę, wciąż pozostaje zagadką. Aby zrozumieć ten proces i określić dokładną konformację produktów pośrednich zwijania kotranslacyjnego, niezbędne jest opracowanie technik umożliwiających izolację RNC przenoszących powstające łańcuchy o określonych rozmiarach, co pozwoli na ich dalszą analizę strukturalną.
SecM (monitor sekrecji) jest białkiem E. coli składającym się ze 170 aminokwasów, które reguluje ekspresję położonej poniżej ATP-azy SecA (napędzającej sekrecję) w operonie secM-secA6. Nakatogawa i Ito odkryli pierwotnie, że sekwencja o długości 17 aminokwasów (150-FSTPVWISQAQGIRAGP-166) w regionie C-końcowym białka SecM jest wystarczająca i niezbędna do spowodowania zatrzymania elongacji SecM w pozycji Gly165, co prowadzi do powstania peptidylu-glycylu-tRNA stabilnie związanego z miejscem P rybosomu7-9. Co ważniejsze, stwierdzono, że tę 17-aminokwasową sekwencję można połączyć z końcem C praktycznie każdego pełnowymiarowego i/lub skróconego białka, co umożliwia produkcję RNC niosących nasadzone łańcuchy o określonej wielkości7. Zatem w przypadku połączenia lub wstawienia sekwencji zatrzymującej SecM do białka docelowego, dochodzi do przerwania elongacji łańcucha polipeptydowego i powstają stabilne RNC zarówno in vivo w komórkach E. coli, jak i in vitro w systemie bezkomórkowym. Do izolacji RNC wykorzystuje się następnie wirowanie w gradiencie sacharozy.
Wyizolowane kompleksy RNC mogą być wykorzystane do analizy cech strukturalnych i funkcjonalnych produktów pośrednich zwijania kotranslacyjnego. Ostatnio technika ta została z powodzeniem zastosowana w celu uzyskania informacji na temat struktury kilku nascentnych łańcuchów związanych z rybosomem10,11. W niniejszej pracy opisujemy izolację kompleksów RNC wołowej Gamma-B krystaliny połączonej z SecM, wytworzonych w systemie translacji in vitro.
Protokół
1. Przygotowanie matrycy DNA i transkrypcja in vitro
- Gen będący przedmiotem zainteresowania jest klonowany w dowolnym plazmidzie z promotorem T7 i/lub np. SP6. Aby uzyskać interesujące nas RNC, koniec C-końcowy docelowego polipeptydu zostaje wydłużony poprzez dodanie sekwencji indukującej zatrzymanie SecM FXXXXWIXXXXGIRAGP7. Aby zapewnić, że fragment polipeptydu będzie wystawał z tunelu rybosomalnego, część C-końcowa docelowego białka musi zostać wydłużona o co najmniej 30 aminokwasów12-14. Pomiędzy białkiem a sekwencją zatrzymania SecM można wprowadzić elastyczny linker bogaty w glicynę i serynę, aby uniknąć ewentualnych ograniczeń konformacyjnych.
- Do transkrypcji in vitro matrycowe DNA powinno zostać zlinearyzowane za pomocą enzymu restrykcyjnego tnącego poniżej ramki odczytu (ORF). Należy zweryfikować pełną linearyzację plazmidowego DNA, przeprowadzając elektroforezę produktu trawienia restrykcyjnego na żelu agarozowym.
- Zlinearyzowany plazmid jest następnie wykorzystywany w reakcji transkrypcji in vitro. Można przetestować różne stężenia matrycowego DNA, aby określić optymalne stężenie DNA wymagane do transkrypcji in vitro. Zazwyczaj przy użyciu zestawu MEGAscript High yield Transcription Kit firmy Ambion (Ambion/Life Technologies, Grand Island, NY), 1 μg zlinearyzowanego DNA daje 40-60 μg mRNA. Transkrypcję in vitro przeprowadza się zgodnie z instrukcją producenta (Ambion/Life Technologies, Grand Island, NY).
- Po transkrypcji in vitro mRNA jest oczyszczane poprzez wytrącanie chlorkiem litu zgodnie z instrukcją producenta (zestaw MEGAscript High yield Transcription Kit firmy Ambion, Ambion/Life Technologies, Grand Island, NY).
- Integralność mRNA jest następnie weryfikowana za pomocą elektroforezy na żelach akrylamidowych lub agarozowych.
2. Translacja in vitro
W celu przeprowadzenia translacji in vitro z wykorzystaniem zestawu RTS 100 E. coli HY Kit (5 Prime, Gaithersburg, MD) należy postępować zgodnie z poniższymi krokami:
- Przygotować 100 μl reakcji translacji in vitro zgodnie z instrukcją producenta. W skrócie: do wody wolnej od nukleaz dodać 24 μl mieszaniny aminokwasów bez metioniny (1 mM), 10 jednostek inhibitora rybonukleazy (Invitrogen/Life Technologies, Grand Island, NY), 20 μCi radioaktywnej [35S]-metioniny (MP Biomedicals, Solon, OH), 20 μl mieszanki reakcyjnej, 24 μl buforu do rekonstytucji oraz 24 μl lizatu E. coli.
- Inkubować reakcję w temperaturze 30 °C przez 5 min w celu wstępnego ogrzania układu translacyjnego. Do reakcji translacji dodać 1-2 μg mRNA i inkubować w 30 °C przez 10-15 min.
- Zatrzymać reakcję, umieszczając próbkę na lodzie.
3. Izolacja nowo powstałego polipeptydu z reakcji translacji in vitro
- Aby wyizolować RNC, reakcję translacji nanosi się na 4,5 ml gradientu sacharozy 5-30% w 20 mM HEPES-KOH pH 7,5, 15 mM MgCl2, 100 mM octanu potasu, 1 mM DTT i wiruje przy użyciu rotora Beckman Coulter SW55-Ti z prędkością 41 000 rpm, 4 °C przez 2 h.
- Po wirowaniu gradient sacharozy jest frakcjonowany w celu wyizolowania różnych populacji rybosomów i powiązanych z nimi łańcuchów powstających. Separację monitoruje się za pomocą programowalnego systemu gradientu gęstości ISCO z ciągłym zapisem przy 254 nm przy użyciu detektora absorbancji ISCO UA-6.
- Frakcję(e) zawierające rybosomy 70S zbiera się i poddaje dalszej analizie, zależnie od celu eksperymentu.
4. Obserwacja białka związanego z rybosomem za pomocą elektroforezy SDS-PAGE w układzie Tris-tricine
Aby sprawdzić, czy rozszerzone białko SecM pozostaje przytwierdzone do rybosomu 70S, zebrano frakcje gradientu i poddano je następującym zabiegom:
- Białka w każdej frakcji wytrącono poprzez dodanie kwasu trichlorooctowego (TCA) do stężenia końcowego 10% i inkubowano w temperaturze 4 °C przez noc.
- Po nocnej inkubacji próbki odwirowano przy 14,000 X g przez 15 min w celu wytrącenia białek w formie osadu. Po wirowaniu usunięto supernatant, a osad przemyto dwukrotnie roztworem Aceton: 1 mM Tris-HCl pH 7.6 (4:1). Osad wysuszono na powietrzu, a następnie rozpuszczono w buforze do ładowania SDS-PAGE.
- Przetworzoną próbkę rozdzielono i przeanalizowano za pomocą Tris-tricine SDS-PAGE.
- Po elektroforezie żele utrwalono, wysuszono w próżniowej suszarce do żeli i poddano autoradiografii. Rozkład nowo syntetyzowanych polipeptydów obserwowano przy użyciu obrazowania fosforycznego.
5. Reprezentatywne wyniki
W niniejszej pracy przedstawiamy eksperyment opisujący izolację pełnowymiarowej wołowej Gamma-B krystaliny stabilnie związanej z rybosomem 70S. Rycina 1 przedstawia etapy izolacji kompleksów RNC Gamma-B krystaliny wołowej. Koniec C-końcowy Gamma-B krystaliny został wydłużony o łącznie 32 aminokwasy, aby zapewnić wypchnięcie pełnowymiarowego białka z tunelu rybosomalnego; obejmuje to również sekwencję zatrzymującą SecM umieszczoną na samym końcu C-końcowym polipeptydu fuzyjnego. Po translacji in vitro rybosomy 70S wyizolowano za pomocą wirowania w gradiencie sacharozy (Rycina 2.1). Aby zapewnić stabilne wiązanie białka z rybosomem, frakcje zawierające 70S połączono, odsolono, poddano wymianie buforu i kolejnej rundzie wirowania w gradiencie sacharozy (Rycina 2.2). Wynik przedstawiony na Rycynie 2 wyraźnie sugeruje, że SecM może skutecznie indukować zatrzymanie translacji kompleksów RNC Gamma-B krystaliny.
Rysunek 1. Schematyczne wyjaśnienie etapów izolacji RNC. Koniec C-końcowy krystaliny gamma-B bydlęcej został przedłużony o sekwencję 32 aminokwasów. Te przedłużone regiony C-końcowe zawierają również sekwencję zatrzymującą SecM. Krystalina gamma-B z sekwencją SecM została sklonowana w plazmidzie pIVEX 2.3 (opartym na T7). Dla in vitro transkrypcja matryca DNA została zlinearyzowana za pomocą XbaI. Zlinearyzowaną matrycę wykorzystano następnie do in vitro transkrypcja. Sekwencja T7 w matrycy DNA jest rozpoznawana przez polimerazę RNA T7, która transkrybuje gen Gamma-B krystaliny znajdujący się za promotorem T7. mRNA oczyszczono metodą wytrącania chlorkiem litu. Oczyszczone mRNA wykorzystano następnie do translacji in vitro. Po inkubacji reakcję translacji naniesiono na gradient sacharozy 5-30% i odwirowano w wirówce z rotorem Beckman Coulter SW55-Ti przy 41 000 obr./min. 4 °C przez 2 godz.
Rycina 2. Izolacja kompleksów RNC Gamma-B krystaliny bydlęcej stabilnie związanych z rybosomem 70S. 1 μg mRNA zmieszano w 100 μl mieszaniny reakcyjnej systemu ekstraktu S30 E. coli, zgodnie z opisem w sekcji protokołu, z 20 μCi [35S]-metioniną i inkubowano w 30 °C przez 15 min. Po inkubacji reakcję translacji nałożono na gradient sacharozy 5-30% w 20 mM HEPES-KOH pH 7,5, 15 mM MgCl2, 100 mM octanu potasu, 1 mM DTT i odwirowano w rotorze Beckman Coulter SW55-Ti przy 41 000 rpm, 4 °C przez 2 h. Po sedymentacji w zależności od prędkości gradient został rozładowany i uzyskano profil rybosomów. Dane zarejestrowano za pomocą programu PeakTrak (system frakcjonowania gradientowego gęstości ISCO). Zebrano frakcje, białko wytrącono TCA i rozdzielono w żelu PAGE Tris-Tricine 16,5% T, 6% C15. Żel wysuszono i poddano autoradiografii. Po ekspozycji żel przeskanowano za pomocą skanera obrazującego Typhoon 9410. Rycina 2.1 pokazuje, że pełnowartościowa Gamma-B krystalina znajduje się w frakcjach rybosomów 70S. Zatem sekwencja zatrzymująca SecM umożliwia izolację stabilnych kompleksów RNC Gamma-B krystaliny bydlęcej. Dane na Rycynie 2.2 wyraźnie wskazują, że wyizolowane kompleksy RNC są rzeczywiście stabilne. W obecnym doświadczeniu frakcje 70S po pierwszej rundzie wirowania w gradiencie sacharozy połączono, a sacharozę usunięto za pomocą jednostki filtra odśrodkowego Amicon Ultra-4 (Millipore), po czym dokonano wymiany buforu na roztwór zawierający 20 mM HEPES-KOH pH 7,5, 15 mM MgCl2, 100 mM octanu potasu, 1 mM DTT. Próbkę tę poddano dodatkowej rundzie wirowania w gradiencie sacharozy 5-30% i ufrakcjonowano. Każdą frakcję poddano obróbce i analizie analogicznie jak na Rycynie 2.1.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Aby uzyskać powtarzalne wyniki, kluczowe jest zachowanie odpowiedniej jakości i stężenia komponentów stosowanych do transkrypcji i translacji in vitro. Wykorzystaliśmy dostępne komercyjnie ekstrakty do transkrypcji i translacji in vitro, które przy ostrożnym obchodzeniu się z nimi dają wydajne i powtarzalne rezultaty. Jakość mRNA może wpływać na translację, dlatego przed użyciem mRNA do translacji in vitro najwyższej wagi ma sprawdzenie jego integralności. Czas inkubacji w procesie translacji <...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Praca ta została sfinansowana z grantu RGP0024 programu Human Frontier Science Program.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Zestaw do transkrypcji o wysokiej wydajności MEGAscript T7 | Ambion | AM1333 | |
| Zestaw RTS 100 E.coli HY | 5 Prime | 2401100 | |
| Inhibitor rybonukleazy | Invitrogen | 15518012 | |
| Znacznik Trans [35S] | MP Biomedicals | 0151006 | |
| Odwirnik Amicon Ultra-4 | Millipore | UFC801008 | |
| Autoradiografia na fosforze magazynującym | GE Healthcare | Obrazownik Typhoon 9410 w trybie zmiennym | |
| Systemy frakcjonowania w gradiencie gęstości | Teledyne Isco, Inc. | Programowalny system gradientu gęstości ISCO | |
| Wirowanie w gradiencie sacharozy | Beckman Coulter | Ultracentryfuga preparatywna Optima L-90 K |
Bibliografia
- Fedorov, A. N., Baldwin, T. O. Cotranslational protein folding. J. Biol. Chem. 272, 32715-32718 (1997).
- Hardesty, B., Kramer, G. Folding of a nascent peptide on the ribosome. Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 66, 41-66 (2001).
- Kramer, G., Boehringer, D., Ban, N., Bukau, B. The ribosome as a platform for co-translational processing, folding and targeting of newly synthesized proteins. Nat. Struct. Mol. Biol. 16, 589-597 (2009).
- Komar, A. A. A pause for thought along the co-translational folding pathway. Trends Biochem. Sci. 34, 16-24 (2009).
- Cabrita, L. D., Dobson, C. M., Christodoulou, J. Protein folding on the ribosome. Curr. Opin. Struct. Biol. 20, 33-45 (2010).
- Oliver, D., Norman, J., Sarker, S. Regulation of Escherichia coli secA by cellular protein secretion proficiency requires an intact gene X signal sequence and an active translocon. J. Bacteriol. 180, 5240-5242 (1998).
- Nakatogawa, H., Ito, K. The ribosomal exit tunnel functions as a discriminating gate. Cell. 108, 629-636 (2002).
- Nakatogawa, H., Ito, K. Secretion monitor, SecM, undergoes self-translation arrest in the cytosol. Mol. Cell. 7, 185-192 Forthcoming.
- Muto, H., Nakatogawa, H., Ito, K. Genetically encoded but non polypeptide prolyl-tRNA functions in the A site for SecM-mediated ribosomal stall. Mol. Cell. 22, 545-552 (2006).
- Cabrita, L. D., Hsu, S. T., Launay, H., Dobson, C. M., Christodoulou, J. Probing ribosome-nascent chain complexes produced in vivo by NMR spectroscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 22239-22244 (2009).
- Eichmann, C., Preissler, S., Riek, R., Deuerling, E. Cotranslational structure acquisition of nascent polypeptides monitored by NMR spectroscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107, 9111-9116 (2010).
- Kolb, V. A., Makeyev, E. V., Spirin, A. S. Enzymatic activity of the ribosome-bound nascent polypeptide. FEBS Lett. 378, 166-170 (1996).
- Ban, N., Nissen, P., Hansen, J., Moore, P. B. The complete atomic structure of the large ribosomal subunit at 2.4 Å resolution. Science. 289, 905-920 (2000).
- Voss, N. R., Gerstein, M., Steitz, T. A., Moore, P. B. The geometry of the ribosomal polypeptide exit tunnel. J. Mol. Biol. 360, 893-906 (2006).
- Schägger, H., von Jagow, G. Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa. Anal. Biochem. 166, 368-379 (1987).
- Komar, A. A., Kommer, A., Krasheninnikov, I. A., Spirin, A. S. Cotranslational folding of globin. J. Biol. Chem. 272, 10646-10651 (1997).
- Keiler, K. C., Waller, P. R., Sauer, R. T. Role of a peptide tagging system in degradation of proteins synthesized from damaged messenger RNA. Science. 271, 990-993 (1996).
- Evans, M. S., Ugrinov, K. G., Frese, M. A., Clark, P. L. Homogeneous stalled ribosome nascent chain complexes produced in vivo or in vitro. Nat. Methods. 2, 757-762 (2005).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
