Wirusy grypy replikują swój genom RNA w powiązaniu z chromatyną komórki gospodarza. W niniejszej pracy przedstawiamy metodę oczyszczania nienaruszonych kompleksów wirusowych rybonukleoprotein z chromatyny zainfekowanych komórek. Oczyszczone kompleksy wirusowe można analizować zarówno za pomocą techniki Western blot, jak i metody przedłużania starterów w celu oceny zawartości białek i RNA.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Oczyszczanie powinowactwem kompleksów rybonukleoprotein wirusa grypy z chromatyny zakażonych komórek
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Podobnie jak wszystkie wirusy RNA o ujemnej polarności nici, genom wirusów grypy jest pakowany w formie wirusowych kompleksów rybonukleoproteinowych (vRNP), w których jednoniciowy genom jest enkapsydowany przez nukleoproteinę (NP) i powiązany z trymerycznym kompleksem polimerazy składającym się z podjednostek PA, PB1 i PB2. Jednak w przeciwieństwie do większości wirusów RNA, wirusy grypy przeprowadzają syntezę wirusowego RNA w jądrach zakażonych komórek. Co ciekawe, synteza wirusowego mRNA wykorzystuje komórkowe pre-mRNA jako primery i zasugerowano, że proces ten zachodzi na chromatynie1. Scharakteryzowano również oddziaływania między polimerazą wirusową a komórkową polimerazą RNA II, a także między NP a komórkowymi nukleosomami1,2.
Niedawno opisano generowanie rekombinowanych wirusów grypy kodujących One-Strep-Tag genetycznie połączony z końcem C podjednostki PB2 polimerazy wirusowej (rWSN-PB2-Strep3). Rekombinowane wirusy te umożliwiają oczyszczanie kompleksów zawierających PB2, w tym vRNP, z zainfekowanych komórek. Aby uzyskać oczyszczone vRNP, infekuje się kultury komórkowe, a następnie vRNP są oczyszczane za pomocą chromatografii powinowactwa z lizatów otrzymanych z tych komórek. Jednakże procedury lizy stosowane do tej pory opierały się na jednostopniowej lizie detergentowej, która, mimo obecności ogólnej nukleazy, często mało efektywnie ekstrahuje materiał związany z chromatyną.
Nasze wstępne badania sugerowały, że znaczna część jądrowych vRNP nie została wyekstrahowana podczas tradycyjnej lizy komórek, a w konsekwencji nie mogła zostać poddana oczyszczaniu powinowactwem. Aby zwiększyć wydajność tej ekstrakcji oraz oddzielić jądrowe vRNP związane z chromatyną od tych niezwiązanych, dostosowaliśmy protokół stopniowej ekstrakcji subkomórkowej do komórek zakażonych wirusem grypy. W skrócie, procedura ta najpierw oddziela jądra od komórek, a następnie ekstrahuje rozpuszczalne białka jądrowe (tutaj określone jako frakcja „nukleoplazmatyczna”). Pozostały nierozpuszczalny materiał jądrowy jest następnie trawiony Benzonazą, nieswoistą nukleazą DNA/RNA, po czym następują dwa etapy ekstrakcji solnej: najpierw z użyciem 150 mM NaCl (określone jako „ch150”), a następnie 500 mM NaCl („ch500”) (Rys. 1). Etapy ekstrakcji solnej wybrano na podstawie naszej obserwacji, że 500 mM NaCl było wystarczające do solubilizacji ponad 85% jądrowych vRNP, a jednocześnie pozwalało na wiązanie znakowanych vRNP z macierzą powinowactwa.
Po frakcjonowaniu subkomórkowym zainfekowanych komórek możliwe jest oczyszczenie za pomocą powinowactwa vRNP znakowanych PB2 z każdej poszczególnej frakcji oraz analiza ich komponentów białkowych i RNA odpowiednio za pomocą Western Blot i metody przedłużania starterów. Niedawno wykorzystaliśmy tę metodę, aby odkryć, że kompleksy eksportowe vRNP tworzą się w późnych punktach po infekcji w frakcji chromatyny ekstrahowanej za pomocą 500 mM NaCl (ch500)3.
Protokół
Schematyczny przebieg protokołu przedstawiono na Rys. 1, a tabela z odczynnikami znajduje się poniżej.
1. Infekcja (16 - 24 h)
- Wysiać komórki HeLa do 5 plastikowych szalek hodowlanych o średnicy 150 mm w pożywce DMEM-high glucose (Dulbecco's modified Eagle's medium-high glucose) w taki sposób, aby następnego dnia osiągnęły około 80% konfluencji (około 5 x 108 komórek). Ważne jest, aby komórki nie osiągnęły 100% konfluencji.
- Następnego dnia rozcieńczyć zapas wirusa grypy z tagiem Strep w soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS) zawierającej 0,3% albuminy surowicy bydlęcej (BSA), aby uzyskać wielokrotność infekcji (MOI) równą 3.
- Usunąć pożywkę wzrostową z komórek, przepłukać raz PBS i dodać do komórek 10 ml PBS zawierającego wirusa. Inkubować przez 1 h w temperaturze pokojowej.
- Zastąpić pożywkę do infekcji pożywką DMEM-high glucose i kontynuować inkubację w temperaturze 37 °C.
Długość inkubacji zależy od fazy infekcji poddawanej badaniu (patrz sekcja Dyskusja).
2. Frakcjonowanie subkomórkowe (3 h)
- Przemyć komórki raz zimnym PBS, a następnie zawiesić je w zimnym PBS za pomocą gumowego skrobaka i przenieść do probówki stożkowej o pojemności 50 ml.
- Zwirwić komórki w wirówce stołowej przez 5 min przy 1,000 rpm, a następnie odessać PBS.
- Resuspendować osad komórkowy w 10 ml zimnego buforu sacharozowego (10 mM HEPES pH 7.9, 10 mM KCl, 2 mM Mg Acetate (MgOAc), 3 mM CaCl2, 340 mM sucrose, 1 mM dithiothreitol (DTT), 1% protease inhibitor mix). Po zawieszeniu przepuścić komórki przez końcówkę pipety 200 μl przymocowaną do plastikowej pipety seryjnej 10 ml, aby rozbić skupiska komórek.
- Inkubować przez 10 min na lodzie. Okresowo i delikatnie odwracać probówkę, aby resuspendować komórki.
- Dodać Nonidet P-40 (NP-40) do stężenia końcowego 0.5% i mieszać w vortexie z wysoką prędkością przez 15 sec. Natychmiast wirować przez 10 min przy 3,500 x g w temperaturze 4 °C w wirówce stołowej.
- Oddzielić nadsącz i przechowywać w 4 °C. Jest to frakcja cytoplazmatyczna. Osad powinien być mniejszy i bielszy niż pierwotny osad komórkowy. Wszystkie frakcje można przechowywać przez co najmniej 4 h w 4 °C.
- Przemyć osad w 5 ml zimnego buforu sacharozowego, ponownie wirować zgodnie z krokiem 2.5 i odrzucić nadsącz.
- Resuspendować osad (zawierający jądra) w 1.5 ml zimnego buforu do ekstrakcji nukleoplazmatycznej (50 mM HEPES pH 7.9, 150 mM KOAc, 1.5 mM MgCl2, 0.1% NP-40, 1 mM DTT, 1% protease inhibitor mix).
- Przenieść do schłodzonego, w pełni szklanego homogenizatora Dounce o pojemności 4 ml z dopasowanym tłokiem i homogenizować jądra za pomocą 20 pociągnięć.
Należy unikać pienienia podczas homogenizacji. Opór powinien wzrosnąć po około 10 pociągnięciach. Skuteczność homogenizacji można potwierdzić pod mikroskopem fazowo-kontrastowym.
- Przenieść zhomogenizowane jądra do probówki do mikrowirówki o pojemności 1.5 ml i inkubować przez 20 min na rotatorze w 4 °C.
- Wirować przy 16,000 x g w mikrowirówce w 4 °C przez 10 min.
- Oddzielić nadsącz i przechowywać w 4 °C. Jest to frakcja nukleoplazmatyczna.
- Resuspendować osad w 1.5 ml buforu do trawienia (50 mM HEPES pH 7.9, 10 mM NaCl, 1.5 mM MgCl2, 1 mM DTT, 1% protease inhibitor mix, 100 U/ml Benzonase (w przypadku analizy RNA zastąpić 20 U/ml RNase-free DNase I)) uprzednio ogrzanego do 37 °C i inkubować przez 10 min w 37 °C.
- Dodać 42 μl 5 M NaCl (do uzyskania stężenia końcowego 150 mM NaCl) i inkubować przez kolejne 20 min w 4 °C.
- Wirować przy 16,000 x g w mikrowirówce w 4 °C przez 10 min.
- Oddzielić nadsącz i przechowywać w 4 °C. Jest to frakcja ch150.
- Resuspendować osad w 1.5 ml zimnego buforu wysokosolnego (50 mM HEPES pH 7.9, 500 mM NaCl, 1.5 mM MgCl2, 0.1% NP-40, 1 mM DTT, 1% protease inhibitor mix) i inkubować przez 20 min na lodzie.
- Wirować przy 16,000 x g w mikrowirówce w 4 °C przez 10 min.
- Oddzielić nadsącz i przechowywać w 4 °C. Jest to frakcja ch500.
3. Oczyszczanie za pomocą Strep-tagu (2 h)
- Do frakcji cytoplazmatycznej dodać 300 μl 5 M NaCl (aby uzyskać stężenie końcowe 150 mM NaCl).
- Do probówki stożkowej o pojemności 15 ml odmierzyć 100 μl upakowanych kulek Strep-Tactin Sepharose na każdą frakcję.
- Do kulek dodać 10 objętości buforu do przemywania Strep (20 mM HEPES pH 7.9, 150 mM NaCl (500 mM NaCl dla próbek ch500), 1 mM EDTA), odwrócić probówkę w celu wymieszania i wirować przez 5 min przy 1,000 x g w wirówce nakładkowej.
- Usunąć nadsącz, powtórzyć krok 3.3 dwukrotnie, a następnie resuspendować osad z kulek w równiej objętości buforu do przemywania Strep.
- Do każdej frakcji dodać 200 μl zawiesiny przemytych kulek Strep-Tactin (do probówek mikrowirówkowych 1,5 ml dla frakcji nukleoplazmatycznej, ch150 i ch500 oraz do probówki stożkowej 15 ml dla frakcji cytoplazmatycznej).
- Inkubować probówki przez 1 h w 4 °C na rotatorze.
- Wirować probówki przez 1 min przy 1,000 x g w 4 °C. Usunąć nadsącz.
- Do każdej probówki dodać 1 ml zimnego buforu do przemywania Strep. Przenieść kulki z probówki 15 mL (frakcja cytoplazmatyczna) do probówki 1,5 mL. Przemywać wszystkie probówki przez 1 min w 4 °C, a następnie wirować zgodnie z krokiem 3.7. Powtórzyć ten etap przemywania dwukrotnie.
- Po ostatnim etapie przemywania usunąć wszystkie pozostałości buforu do przemywania za pomocą ściętej końcówki pipety. Dodać 100 μl buforu elucyjnego (bufor do przemywania Strep zawierający 2,5 mM desthiobiotyny) i delikatnie wymieszać.
- Inkubować przez 15 min na lodzie. Co jakiś czas delikatnie mieszać kulki, opukując dno probówek.
- Wirować probówki przez 1 min przy 1000 x g w 4 °C w mikrowirówce. Zebrać nadsącz zawierający eluowane vRNP z tagiem Strep.
4. Reprezentatywne wyniki
Wydajność frakcjonowania najlepiej ocenia się za pomocą analizy Western blot frakcjonowanych lizatów przy użyciu przeciwciał specyficznych dla markerów subkomórkowych (Rys. 2). W szczególności, prawidłowe frakcjonowanie subnuklearne powinno wykazać niewielką ilość lub brak komórkowej polimerazy RNA II (Pol II) we frakcji nukleoplazmatycznej, czyli rozpuszczalnej frakcji jądrowej4, a większość powinna zostać wyekstrahowana za pomocą 150 mM NaCl5. W komórkach zainfekowanych wirusem grypy, w porównaniu z komórkami niezainfekowanymi, powtarzalnie obserwuje się również degradację Pol II, co jest zgodne z literaturą6.
Oczyszczanie vRNP najlepiej oceniać za pomocą barwienia srebrem lub Coomassie, co przedstawiono dla eluatu cytoplazmatycznego na Rys. 3. Z naszego doświadczenia wynika, że większość Strep-PB2 jest oczyszczana jako część w pełni sformowanej vRNP, co oznacza, że wychwytywana jest niewielka ilość rozpuszczalnej polimerazy. Odzwierciedla to wysoki stosunek NP:PA/PB1/PB2 obserwowany w barwieniu srebrem lub Coomassie. Niższy stosunek sugeruje zanieczyszczenie buforu nukleazami RNazami, ponieważ wiadomo, że kilka powszechnie występujących RNaz (takich jak RNaza A) przecina viralne RNA w sposób prowadzący do dysocjacji polimerazy z multimery NP7. Co ciekawe, sama obróbka Benzonazą, choć wystarczająca do strawienia viralnego RNA, wydaje się nie mieć wpływu na stosunki stechiometryczne białek vRNP. Choć nie potrafimy wyjaśnić tego zjawiska, zaobserwowaliśmy rozpad vRNP po trawieniu innymi RNazami (dane nie pokazane), co sugeruje, że Benzonaza może pozostawiać nienaruszone niektóre strukturalnie ważne regiony RNA. Po oczyszczaniu vRNP z cytoplazmy i nukleoplazmy (przeprowadzonym bez trawienia nukleazą), w barwieniu srebrem można zaobserwować 8 słabych, ale wyraźnych prążków o wysokich masach cząsteczkowych, które odpowiadają przewidywanym masom cząsteczkowym 8 segmentów genomu grypy (patrz ref. 3).
Względne ilości vRNP oczyszczonych z każdej frakcji w 9 h po infekcji przedstawiono na Rys. 4. Rozkład vRNP zmienia się w czasie trwania infekcji, przy czym najsilniejsza akumulacja występuje we frakcji ch150 we wczesnych punktach czasowych, a zwiększona akumulacja w nukleoplazmie i cytoplazmie w późnych punktach czasowych.
Rycina 1. Schemat blokowy frakcjonowania subkomórkowego. Adaptacja z ref. 3.
Rysunek 2. Analiza Western blot frakcji subkomórkowych z komórek zakażonych wirusem grypy. 109 komórek HeLa zakażono szczepem wirusa grypy WSN na 9 h przed frakcjonowaniem subkomórkowym. Na każdą ścieżkę naniesiono równą ilość całkowitego białka i przeanalizowano za pomocą pokazanych przeciwciał. Polimerazę RNA II (Pol II) wykryto za pomocą klonu 8WG16, który rozpoznaje wszystkie formy domeny C-końcowej (najbardziej wyraźny jest prążek hipofosforylowany). Adaptowano z ref. 3.
Rysunek 3. Analiza barwienia srebrem oczyszczonych vRNP. Komórki HeLa zainfekowano rWSN (jako kontrolę negatywną) lub rWSN-PB2-Strep przez 9 h, a następnie przeprowadzono oczyszczanie Strep z frakcji cytoplazmatycznej. Gwiazdka oznacza prążki, które nie są widoczne po trawieniu RNazą. Adaptowano z ref. 3.
Rycina 4. Analiza barwieniem srebrem vRNP oczyszczonych z różnych frakcji komórkowych. 109 komórek HeLa zainfekowano rWSN-PB2-Strep lub rWSN przez 9 h, a następnie przeprowadzono frakcjonowanie subkomórkowe i oczyszczanie za pomocą Strep. Na żel naniesiono równe ilości eluatu z każdej frakcji. Adaptowano z ref. 3.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Chociaż w wielu niedawnych badaniach zidentyfikowano poszczególne białka lub sieci komórkowe zaangażowane w infekcję wirusem grypy8, znaczenie funkcjonalne większości tych oddziaływań pozostaje niejasne. Biorąc pod uwagę absolutną zależność syntezy RNA wirusa grypy od funkcji opartych na chromatynie oraz złożoną naturę biofizyczną i biochemiczną jądra komórkowego9, niezbędne będą nowe techniki w celu wyjaśnienia tych funkcji. Przedstawione tutaj frakcjonowanie subnuklearne, w połączeniu z oczyszczan...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zadeklarowano konfliktów interesów.
Podziękowania
Autorzy chcieliby podziękować Nadzie Naffakh i Marie-Anne Rameix-Welti (Institut Pasteur) za udostępnienie wirusa rWSN-PB2-Strep.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| DMEM z wysoką zawartością glukozy | GIBCO, by Life Technologies | 11965-092 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Mieszanina inhibitorów proteaz G | Elektroforeza SERVA | 39101 | |
| Nukleaza Benzonase | Novagen, EMD Millipore | 71206 | 25 U/μl |
| DNaza I, wolna od RNaz | Thermo Fisher Scientific, Inc. | EN0523 | 50 U/μl |
| homogenizator Dounce'a | Wheaton | 432-1271 | Typ zastosowania "B" tłuczek |
| Strep-Tactin Sepharose | IBA GmbH | 2-1201-025 | Można również zastosować format kolumny z 50% zawiesiną |
| Desthiobiotyna | IBA GmbH | 2-1000-002 |
Bibliografia
- Engelhardt, O. G., Smith, M., Fodor, E. Association of the influenza A virus RNA-dependent RNA polymerase with cellular RNA polymerase II. J. Virol. 79, 5812-5812 (2005).
- Garcia-Robles, I., Akarsu, H., Müller, C. W., Ruigrok, R., Baudin, F. Interaction of influenza virus proteins with nucleosomes. Virology. 332, 329(2005).
- Chase, G. P., Rameix-Welti, M. A., Zvirbilene, A., Zvirblis, G., Götz, V., Wolff, T., Naffakh, N., Schwemmle, M. Influenza virus ribonucleoprotein complexes gain preferential access to cellular export machinery through chromatin targeting. PLoS Pathogens. 7, e1002187(2011).
- Kimura, H., Tao, Y., Roeder, R. G., Cook, P. R. Quantitation of RNA polymerase II and its transcription factors in an HeLa cell: little soluble holoenzyme but significant amounts of polymerases attached to the nuclear substructure. Mol. Cell. Biol. 19, 5383-5383 (1999).
- Henikoff, S., Henikoff, J. G., Sakai, A., Loeb, G. B., Ahmad, K. Genome-wide profiling of salt fractions maps physical properties of chromatin. Genome Res. 19, 460(2009).
- Rodriguez, A., Perez-Gonzalez, A., Nieto, A. Influenza virus infection causes specific degradation of the largest subunit of cellular RNA polymerase II. J. Virol. 81, 5315-5315 (2007).
- Ye, Z., Liu, T., Offringa, D. P., McInnis, J., Levandowski, R. A. Association of influenza virus matrix protein with ribonucleoproteins. J. Virol. 73, 7467-7467 (1999).
- Watanabe, T., Watanabe, S., Kawaoka, T., Y, Cellular networks involved in the influenza virus life cycle. Cell Host Microbe. 7, 427(2010).
- Engelhardt, O. G., Fodor, E. Functional association between viral and cellular transcription during influenza virus infection. Rev. Med. Virol. 16, 329-345 (2006).
- Schwartz, L. B., Sklar, V. E., Jaehning, J. A., Weinmann, R., Roeder, R. G. Isolation and partial characterization of the multiple forms of deoxyribonucleic acid-dependent ribonucleic acid polymerase in the mouse myeloma, MOPC 315. J. Biol. Chem. 249, 5889(1974).
- Lambert, J. P., Baetz, K., Figeys, D. Of proteins and DNA--proteomic role in the field of chromatin research. Mol. Biosyst. 6, 30(2010).
- Wu, C. Y., Jeng, K. S., Lai, M. M. The SUMOylation of matrix protein M1 modulates the assembly and morphogenesis of influenza A virus. J. Virol. 85, 6618(2011).
- Liao, T. L., Wu, C. Y., Su, W. C., Jeng, K. S., Lai, M. M. Ubiquitination and deubiquitination of NP protein regulates influenza A virus RNA replication. EMBO J. 29, 3879(2010).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
