Oczyszczanie powinowactwa kompleksów rybonukleoproteinowych wirusa grypy z chromatyny zakażonych komórek

Podsumowanie

Wirusy grypy replikują swój genom RNA w połączeniu z chromatyną komórki gospodarza. W tym miejscu przedstawiamy metodę oczyszczania nienaruszonych wirusowych kompleksów rybonukleoproteinowych z chromatyny zakażonych komórek. Oczyszczone kompleksy wirusowe mogą być analizowane zarówno przez Western blot, jak i rozszerzenie startera odpowiednio zawartości białka i RNA.

Streszczenie

Podobnie jak wszystkie wirusy RNA o ujemnej nici, genom wirusów grypy jest upakowany w postaci wirusowych kompleksów rybonukleoproteinowych (vRNP), w których jednoniciowy genom jest zamknięty w kapsułkach przez nukleoproteinę (NP) i związany z trimerycznym kompleksem polimerazy składającym się z podjednostek PA, PB1 i PB2. Jednak w przeciwieństwie do większości wirusów RNA, wirusy grypy przeprowadzają syntezę wirusowego RNA w jądrach zakażonych komórek. Co ciekawe, synteza wirusowego mRNA wykorzystuje komórkowe pre-mRNA jako startery i zaproponowano, że proces ten zachodzi na chromatynie¹. Scharakteryzowano również interakcje między polimerazą wirusa a polimerazą II RNA gospodarza, a także między NP a nukleosomami gospodarza^1,2.

Ostatnio opisano generację rekombinowanych wirusów grypy kodujących genetycznie połączony znacznik One-Strep-Tag z C-końcem podjednostki PB2 wirusowej polimerazy (rWSN-PB2-Strep³). Te rekombinowane wirusy umożliwiają oczyszczanie zakażonych komórek z kompleksów zawierających PB2, w tym vRNP, z zainfekowanych komórek. Aby uzyskać oczyszczone vRNP, hodowle komórkowe są infekowane, a vRNP są oczyszczane z powinowactwa z lizatów pochodzących z tych komórek. Jednak stosowane do tej pory procedury lizy opierały się na jednoetapowej lizie detergentowej, która pomimo obecności ogólnej nukleazy często tylko nieefektywnie ekstrahuje materiał związany z chromatyną.

Nasze wstępne prace sugerowały, że duża część jądrowych vRNP nie została wyekstrahowana podczas tradycyjnej lizy komórek, a zatem nie mogła być oczyszczona z powinowactwa. Aby zwiększyć tę wydajność ekstrakcji i oddzielić jądrowe vRNP związane z chromatyną od niezwiązanych z chromatyną, dostosowaliśmy etapowy protokół ekstrakcji subkomórkowej do komórek zakażonych wirusem grypy. Krótko mówiąc, procedura ta najpierw oddziela jądra od komórki, a następnie ekstrahuje rozpuszczalne białka jądrowe (tutaj określane jako frakcja "nukleoplazmatyczna"). Pozostały nierozpuszczalny materiał jądrowy jest następnie trawiony benzonazą, niespecyficzną nukleazą DNA/RNA, po czym następują dwa etapy ekstrakcji soli: najpierw przy użyciu 150 mM NaCl (określanego jako "ch150"), a następnie 500 mM NaCl ("ch500") (ryc. 1). Te etapy ekstrakcji soli zostały wybrane na podstawie naszych obserwacji, że 500 mM NaCl było wystarczające do rozpuszczenia ponad 85% jądrowych vRNP, a jednocześnie umożliwiało wiązanie znakowanych vRNP z macierzą powinowactwa.

Po subkomórkowym frakcjonowaniu zainfekowanych komórek, możliwe jest oczyszczenie winowactwa oznaczonych PB2 vRNP z każdej pojedynczej frakcji i analiza ich składników białkowych i RNA za pomocą odpowiednio Western Blot i rozszerzenia startera. Niedawno wykorzystaliśmy tę metodę, aby odkryć, że kompleksy eksportowe vRNP tworzą się w późnych punktach po infekcji na frakcji chromatyny ekstrahowanej 500 mM NaCl (ch500)³.

Protokół

Schematyczny schemat protokołu jest pokazany na rys. 1, a tabela odczynników jest przedstawiona poniżej.

1. Zakażenie (16 - 24 h)

1. Wysiewaj komórki HeLa w 5 plastikowych szalkach do hodowli komórkowych o średnicy 150 mm w zmodyfikowanej pożywce Eagle's (DMEM) firmy Dulbecco o wysokiej zawartości glukozy, tak aby następnego dnia osiągnęły około 80% konfluencji (około 5 x 10⁸ komórek). Ważne jest, aby komórki nie osiągnęły 100% zbieżności.
2. Następnego dnia rozcieńczyć szczep wirusa grypy znakowany paciorkowcem w buforowanym fosforanem soli fizjologicznej (PBS) zawierającej 0,3% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) do wielokrotności zakażenia wynoszącej 3.
3. Usunąć pożywkę wzrostową z komórek, przemyć raz PBS i dodać do komórek 10 ml PBS zawierającego wirusa. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
4. Zastąp pożywkę infekcyjną roztworem glukozy DMEM i kontynuuj inkubację w temperaturze 37 °C.

Długość inkubacji zależy od fazy infekcji, która ma być badana (zobacz Dyskusja).

2. Frakcjonowanie subkomórkowe (3 h)

1. Umyć komórki raz zimnym PBS, a następnie zawiesić komórki w zimnym PBS za pomocą gumowego skrobaka i przenieść do stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
2. Granulki w wirówce stołowej przez 5 minut przy 1,000 obr./min, a następnie odsysać PBS.
3. Zawiesić osad komórkowy w 10 ml zimnego buforu sacharozy (10 mM HEPES pH 7,9, 10 mM KCl, 2 mM octanu Mg (MgOAc), 3 mM CaCl₂, 340 mM sacharozy, 1 mM ditiotreitolu (DTT), 1% mieszaniny inhibitorów proteazy). Po zawieszeniu przepuść komórki przez końcówkę pipety o pojemności 200 μl przymocowaną do plastikowej pipety do surowicy o pojemności 10 ml, aby rozbić grudki komórek.
4. Inkubować 10 minut na lodzie. Delikatnie odwracaj od czasu do czasu, aby ponownie zawiesić komórki.
5. Dodać Nonidet P-40 (NP-40) do końcowego stężenia 0,5% i wirować z dużą prędkością przez 15 sekund. Natychmiast odwirować przez 10 minut przy 3 500 x g w temperaturze 4 °C w wirówce stołowej.
6. Usunąć supernatant i przechowywać w temperaturze 4 °C. To jest frakcja cytoplazmatyczna. Osad powinien być mniejszy i bielszy niż oryginalny osad komórkowy. Wszystkie frakcje można przechowywać przez co najmniej 4 godziny w temperaturze 4 °C.
7. Przemyć osad w 5 ml zimnego buforu sacharozy, ponownie odwirować jak w kroku 2.5 i wyrzucić supernatant.
8. Zawiesić osad (zawierający jądra) w 1,5 ml zimnego buforu do ekstrakcji nukleoplazmatycznej (50 mM HEPES pH 7,9, 150 mM KOAc, 1,5 mM MgCl₂, 0,1% NP-40, 1 mM DTT, 1% mieszanina inhibitorów proteazy).
9. Przenieść do schłodzonego, całkowicie szklanego homogenizatora o pojemności 4 ml za pomocą ciasno dopasowanego tłuczka i homogenizować jądra za pomocą 20 pociągnięć.
   Unikać pienienia podczas homogenizacji. Opór powinien wzrosnąć po około 10 uderzeniach. Efektywną homogenizację można potwierdzić pod mikroskopem z kontrastem fazowym.
   
10. Przenieść homogenizowane jądra do probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml i inkubować przez 20 minut na obracającym się kole w temperaturze 4 °C.
11. Wirować przy 16 000 x g w mikrowirówce w temperaturze 4 °C przez 10 min.
12. Usunąć supernatant i przechowywać w temperaturze 4 °C. To jest frakcja nukleoplazmatyczna.
13. Zawiesić osad w 1,5 ml buforu wytrawiającego (50 mM HEPES pH 7,9, 10 mM NaCl, 1,5 mM MgCl₂, 1 mM DTT, 1% mieszaniny inhibitorów proteazy, 100 U/ml benzonazy (do analizy RNA zastąpić 20 U/ml DNazy I wolnej od RNazy)) wstępnie podgrzanym do 37 °C i inkubować przez 10 minut w temperaturze 37 °C.
14. Dodać 42 μl 5 M NaCl (dla końcowego stężenia 150 mM NaCl) i inkubować dalej 20 minut w temperaturze 4 °C.
15. Wirować przy 16 000 x g w mikrowirówce w temperaturze 4 °C przez 10 min.
16. Usunąć supernatant i przechowywać w temperaturze 4 °C. To jest frakcja ch150.
17. Zawiesić osad w 1,5 ml zimnego buforu o wysokiej zawartości soli (50 mM HEPES pH 7,9, 500 mM NaCl, 1,5 mM MgCl₂, 0,1% NP-40, 1 mM DTT, 1% mieszaniny inhibitorów proteazy) i inkubować 20 minut na lodzie.
18. Wirować przy 16 000 x g w mikrowirówce w temperaturze 4 °C przez 10 min.
19. Usunąć supernatant i przechowywać w temperaturze 4 °C. To jest frakcja ch500.

3. Oczyszczanie znacznika Strep-tag (2 godziny)

1. Dodać 300 μl 5 M NaCl do frakcji cytoplazmatycznej (dla końcowego stężenia 150 mM NaCl).
2. Podwielokrotność 100 μl zapakowanych kulek Strep-Tactin Sepharose na frakcję w stożkowej probówce o pojemności 15 ml.
3. Dodać 10 objętości buforu do płukania Strep (20 mM HEPES pH 7,9, 150 mM NaCl (500 mM NaCl dla próbek ch500), 1 mM EDTA) do kulek, odwrócić probówkę do wymieszania i odwirować 5 minut przy 1,000 x g w wirówce stołowej.
4. Odrzucić supernatant, powtórzyć krok 3.3 dwa razy, a następnie ponownie zawiesić granulkę kulki w równej objętości buforu do płukania Strep.
5. Do każdej frakcji dodać 200 μl przemytej zawiesiny perełkowej Strep-Tactin (w 1,5 ml probówkach do mikrowirówek do frakcji nuceloplazmatycznych, ch150 i ch500 oraz w probówce stożkowej o pojemności 15 ml do frakcji cytoplazmatycznej).
6. Obracać rury przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C na obracającym się kole.
7. Probówki wirówkowe 1 min przy 1 000 x g w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant.
8. Dodać 1 ml zimnego buforu do płukania paciorkowca do każdej probówki. Przenieś kulki z probówki 15 ml (frakcja cytoplazmatyczna) do probówki 1,5 ml. Umyć wszystkie probówki przez 1 minutę w temperaturze 4 °C, odwirowując po kroku 3.7. Powtórz ten krok prania dwukrotnie.
9. Po ostatnim etapie płukania usuń wszelkie ślady buforu do płukania za pomocą płaskiej końcówki pipety. Dodać 100 μl buforu elucyjnego (bufor do płukania Strep zawierający 2,5 mM destiobiotyny) i delikatnie wymieszać.
10. Inkubować 15 minut na lodzie. Od czasu do czasu delikatnie mieszaj koraliki, stukając w spód rurek.
11. Probówki wirówkowe 1 min przy 1000 x g w temperaturze 4 °C w mikrowirówce. Zbierz supernatant zawierający eluowane vRNP znakowane Strep-em.

4. Reprezentatywne wyniki

Skuteczność frakcjonowania najlepiej ocenia analiza Western blot frakcjonowanych lizatów przy użyciu przeciwciał specyficznych dla markerów subkomórkowych (Ryc. 2). W szczególności udane frakcjonowanie subjądrowe powinno wykazywać niewielką lub żadną komórkową polimerazę RNA II (Pol II) w nukleoplazmatycznej lub rozpuszczalnej frakcji jądrowej⁴, a większość powinna być ekstrahowana za pomocą 150 mM NaCl⁵. Degradację Pol II obserwuje się również w sposób powtarzalny w komórkach zakażonych wirusem grypy w porównaniu z komórkami niezakażonymi, co jest zgodne z literaturą⁶.

Oczyszczanie vRNP najlepiej oceniać za pomocą barwienia srebrem lub Coomassie, jak pokazano dla cytoplazmatycznego eluatu na ryc. 3. Z naszego doświadczenia wynika, że większość Strep-PB2 jest oczyszczana jako część w pełni uformowanego vRNP, tj. wychwytywana jest niewielka ilość rozpuszczalnej polimerazy. Znajduje to odzwierciedlenie w wysokim stosunku NP:PA/PB1/PB2 obserwowanym przez barwienie srebrem lub Coomassie. Niższy współczynnik sugeruje zanieczyszczenie buforu RNazami, ponieważ wiadomo, że kilka wszechobecnych RNaz (takich jak RNaza A) rozszczepia wirusowe RNA w taki sposób, że dysocjuje polimerazę od multimerów NP⁷. Co ciekawe, leczenie samą benzonazą, choć wystarczające do trawienia wirusowego RNA, wydaje się nie mieć wpływu na stosunki stochiometryczne białek vRNP. Chociaż nie możemy wyjaśnić tego zjawiska, zaobserwowaliśmy zakłócenie vRNP po trawieniu innymi RNazami (dane nie pokazane), co sugeruje, że benzonaza może pozostawić pewne strukturalnie ważne regiony RNA nienaruszone. Po oczyszczeniu vRNP z cytoplazmy i nukleoplazmy (wykonanym bez trawienia nukleazą), przez barwienie srebrem można zaobserwować 8 słabych, ale dyskretnych prążków o dużej masie cząsteczkowej, które odpowiadają przewidywanym masom cząsteczkowym 8 segmentów genomu grypy (patrz odnośnik 3).

Względne ilości vRNP oczyszczonych z każdej frakcji po 9 godzinach od infekcji są pokazane na rys. 4. Dystrybucja vRNP zmienia się w przebiegu infekcji, przy czym najsilniejsza akumulacja we frakcji ch150 we wczesnych punktach czasowych i zwiększona akumulacja w nukleoplazmie i cytoplazmie w późnych punktach czasowych.

Rysunek 1. Schemat blokowy frakcjonowania subkomórkowego. Na podstawie odnośnika 3.

Rysunek 2. Analiza Western blot frakcji subkomórkowych z komórek zakażonych wirusem grypy. 10⁹ komórek HeLa było zakażonych szczepem wirusa grypy WSN przez 9 godzin przed frakcjonowaniem subkomórkowym. Równe ilości białka całkowitego załadowano na każdym torze i przeanalizowano przy użyciu pokazanych przeciwciał. Polimeraza RNA II (Pol II) została wykryta przy użyciu klonu 8WG16, który rozpoznaje wszystkie formy domeny C-końcowej (najbardziej widoczne jest pasmo hipofosforylowane). Na podstawie odnośnika 3.

Rysunek 3. Analiza barwienia srebrem oczyszczonych vRNP. Komórki HeLa zakażono rWSN (jako kontrola ujemna) lub rWSN-PB2-Strep przez 9 godzin, a następnie oczyszczono Strep z frakcji cytoplazmatycznej. Gwiazdka oznacza prążki, które nie są widoczne po strawieniu RNazy. Na podstawie odnośnika 3.

Rysunek 4. Analiza barwienia srebrem vRNP oczyszczonych z różnych frakcji komórkowych. 10⁹ komórek HeLa zakażono rWSN-PB2-Strep lub rWSN przez 9 godzin, a następnie frakcjonowano subkomórkowo i oczyszczano z paciorkowca. Załadowano równe ilości eluatu z każdej frakcji. Na podstawie odnośnika 3.

Dyskusja

Podczas gdy wiele badań zidentyfikowało ostatnio pojedyncze białka lub sieci komórkowe zaangażowane w zakażenie wirusem grypy⁸, funkcjonalne znaczenie większości tych interakcji pozostaje niejasne. Biorąc pod uwagę bezwzględną zależność funkcji opartych na chromatynie od syntezy RNA wirusa grypy oraz złożoną biofizyczną i biochemiczną naturę jądra⁹, potrzebne będą nowe techniki w celu wyjaśnienia tych funkcji. Prezentowane przez nas frakcjonowanie subjądrowe w połączeniu z oczyszczaniem vRNP z powin...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
DMEM-wysoki poziom glukozy	GIBCO, firmy Life Technologies	11965-092
BSA	Sigma-Aldrich	A9418
Inhibitor proteazy Mix G	SERVA Elektroforeza	39101
Nukleaza benzonazy	Novagen, EMD Millipore	71206	25 U/μ l
DNaza I, bez RNaz	Thermo Fisher Scientific, Inc.	EN0523	50 U/μ l
Homogenizator Dounce	Wheaton	432-1271	Użyj tłuczka typu "B"
Strep-Tactin Sepharose	IBA GmbH	2-1201-025	Można również użyć 50% formatu kolumny zawiesinowej
Desthiobiotin	IBA GmbH	2-1000-002