Artykuł metodologiczny

Model ludzkiego jajowodu do badania infekcji C. trachomatis

15.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/4036

⸱

11 sierpnia 2012

 ,  ,  ,  , 
1Institute of Medical Microbiology and Hygiene, University of Lübeck, 2Institute of Anatomie, University of Lübeck, 3Department of Obstetrics and Gynecology, University Hospital of Schleswig-Holstein, University of Lübeck, 4Medical Clinic III, University Hospital of Schleswig-Holstein, University of Lübeck

W tym artykule

Podsumowanie

Opisujemy model infekcji ex vivo służący do wizualizacji bezpośrednich oddziaływań patogenów bakteryjnych z komórkami ludzkich jajowodów. Model tkankowy całego narządu został opracowany w celu zbadania patologii wywołanej przez C. trachomatis w żeńskich jajowodach w warunkach zbliżonych do naturalnych.

Streszczenie

Zakażenia dróg rodnych wywołane przez Chlamydia trachomatis (C. trachomatis) są najczęstszą chorobą przenoszoną drogą płciową u kobiet na całym świecie. Niewydolne eliminowanie lub przetrwanie patogenów może prowadzić do infekcji wstępujących górnych dróg rodnych i prawdopodobnie powodować przewlekłe uszkodzenia zapalne zakażonych tkanek 1,2. W konsekwencji mogą wystąpić poważne następstwa kliniczne, takie jak zapalenie miednicy mniejszej (PID), niedrożność jajowodów oraz niepłodność 3,4.

Większość badań z wykorzystaniem *C. trachomatis* przeprowadzono w liniach komórek nabłonkowych (np. komórkach HEp-2 i HeLa-229) lub u myszy. Jednakże, podobnie jak w modelach opartych na hodowlach komórkowych, nie odzwierciedlają one ani fizjologii tkanki natywnej, ani patofizjologii C. trachomatis infekcje dróg rodnych in vivo 5Dalsze ograniczenia wynikają z faktu, że centralne kaskady sygnalizacyjne (np. szlak sygnalizacyjny JAK/STAT zależny od IFN-γ), które kontrolują wewnątrzkomórkowy wzrost chlamydii, różnią się zasadniczo u myszy i ludzi. 6,7W związku z tym my oraz inne zespoły opracowaliśmy model całego narząduu trąbki jajowodnej, aby zbadać bezpośrednie oddziaływania pomiędzy *C. trachomatis* oraz ludzkie komórki jajdowodu ex vivo 8,9.

W tym celu pobrano ludzkie jajowody od kobiet poddawanych histerektomii i zainfekowano je C. trachomatis serotypu D. W ciągu 24 h po infekcji próbki poddano analizie z wykorzystaniem skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM) oraz transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM) w celu wykrycia uszkodzeń nabłonka wywołanych przez Chlamydia trachomatis, a także formowania się inkluzji C. trachomatis w tkance jajowodu.

Protokół

1. Przygotowanie zapasu Chlamydia trachomatis serotypu D

  1. Zainfekuj konfluencyjną butelkę do hodowli komórkowej o powierzchni 175 cm2 zawierającą komórki HeLa-229, dodając 4 ml C. trachomatis D w buforze SPG.
  2. Inkubuj przez jedną godzinę w temperaturze 37 °C przy ciągłym mieszaniu.
  3. Dodaj 20 ml DMEM z 10% FCS i 240 μl cykloheksymidy.
  4. Inkubuj w wilgotnym inkubatorze przez 48 h w temperaturze 37 °C i przy 5% CO2.
  5. Dodaj 5 ml sterylnych szklanych kulek i energicznie wstrząśnij, aby odczepić i zniszczyć komórki HeLa-229 zawierające C. trachomatis.
  6. Zbierz nadsącz i dodaj kolejne 5 ml sterylnych szklanych kulek.
  7. Potrząsaj trzy razy przez 1 min, aby zniszczyć wszystkie komórki HeLa-229 i uwolnić C. trachomatis.
  8. Wirować przez 5 min przy 1000 rpmi w temperaturze 4 °C, aby usunąć debris komórkowy.
  9. Zbierz nadsącz do zakażenia od 8 do 10 butelek do hodowli komórkowej o powierzchni 175 cm2 z konfluencyjnie wyhodowanymi komórkami HeLa 229.
  10. Inkubuj każdą butelkę z 4 ml buforu SPG i 4 ml nadsączu z poprzedniej infekcji przez jedną godzinę w temperaturze 37 °C przy ciągłym mieszaniu.
  11. Po jednej godzinie dodaj 15 ml DMEM z 10% FCS i 230 μl cykloheksymidy, a następnie inkubuj przez 48 h w temperaturze 37 °C i przy 5% CO2.
  12. Dodaj 5 ml sterylnych szklanych kulek i wstrząśnij, aby odczepić i zniszczyć komórki HeLa-229 zawierające C. trachomatis.
  13. Zbierz nadsącz i dodaj kolejne 5 ml sterylnych szklanych kulek.
  14. Potrząsaj trzy razy przez 1 min, aby zniszczyć wszystkie komórki HeLa-229 i uwolnić C. trachomatis.
  15. Wirować przez 5 min przy 1000 rpmi w temperaturze 4 °C, aby usunąć debris komórkowy.
  16. Zbierz nadsącz.
  17. Przenieś 40 ml nadsączu do probótek Falcon 50 ml i wirować przez 99 min przy 11000 rpmi.
  18. Po wirowaniu odlej nadsącz i przemyj osad 1 ml buforu SPG.
  19. Zhomogenizuj osad w 1 ml SPG i rozdziel alikwoty po 20 μl do probótek Eppendorf 1,5 ml, przechowuj w temperaturze -70 °C do momentu użycia. Aktywność biologiczną przygotowanego zapasu potwierdzono w ustalonym modelu infekcji komórek HeLa-229.

2. Przygotowanie ludzkiej trąbki jajowej

  1. Przechowywać ludzkie jajowody (HFT) pobrane od kobiet poddawanych histerektomii bezpośrednio po operacji w pożywce RPMI z dodatkiem 5% FCS bez antybiotyków w temperaturze 4 °C do momentu przygotowania. Protokół został zatwierdzony przez komisję etyczną Uniwersytetu w Lubece (09-153). Kobiety włączone do badania (w wieku od 34 do 53 lat) nie miały w wywiadzie wcześniejszych zakażeń C. trachomatis. Tkankę jajowodów pobierano podczas sterylizacji okołoporodowej na prośbę matki podczas cięć cesarskich lub podczas histerektomii z powodu objawowych mięśniaków macicy w fazie lutealnej. Wszystkie próbki HFT w teście PCR dały wynik negatywny w kierunku C. trachomatis.
  2. Przeprowadzić sekcję HFT w szalce Petri zawierającej pożywkę RPMI z 5% FCS bez antybiotyków. Przez cały czas obróbki tkanka powinna być zanurzona w pożywce, aby zapobiec jej wysychaniu.
  3. Odciąć i usunąć tkankę łączną oraz tkankę uszkodzoną podczas operacji.
  4. Po sekcji ostrożnie otworzyć HFT za pomocą małego skalpela.
  5. Do dalszych eksperymentów przygotować fragmenty tkanki o rozmiarach od 0,5 cm x 0,5 cm do 1 cm x 1 cm.
  6. W celu zakażenia przechowywać próbki HFT w 1 ml RPMI z dodatkiem 5% FCS bez antybiotyków. Próbki HFT zakażono dawką 5,5x105 IFU (inclusion forming units) C. trachomatis.
  7. Inkubować próbki HFT w temperaturze 37 °C, przy 5% CO2 i 21% O2, a także w temperaturze 37 °C, przy 5% CO2 i 2% O2 przez 24 h.
  8. Po czasie inkubacji zebrać próbki i przechowywać w utrwalaczu Montiego przez co najmniej trzy dni w temperaturze 4 °C do czasu przygotowania do SEM/TEM.

3. Przygotowanie preparatu HFT do TEM

  1. Do badań TEM należy wyjąć preparat z fiksaty Montiego i wyciąć fragmenty o wymiarach od 2 x 2 mm do 4 x 5 mm. Pozostała tkanka może zostać wykorzystana do badań SEM.
  2. Fragmenty należy przemywać buforem z kacodylanu sodu, pH 7.35 przez 1 h.
  3. Inkubować w 1% (w/v) tetroksydzie osmu w aqua dest. przez noc.
  4. Nadmiar tetroksydu osmu należy usunąć, przemywając preparaty 6 x 5 min w buforze z kacodylanu sodu, pH 7.35.
  5. Odwodnienie przeprowadza się poprzez inkubację w rosnących stężeniach etanolu w wodzie (v/v) (30% przez 2 h, 40% przez 2 h, 50% przez 2 h, 60% przez 2 h, 70% przez noc, 80% przez 2 h, 90% przez 1 h, 95% przez 1 h, 100% przez 1 h).
  6. Etanol należy wypłukać, inkubując preparaty 2 x 15 min w tlenku propylenu, a następnie przenieść do mieszaniny 50% (v/v) świeżo przygotowanego aralditu (zawierającego wszystkie komponenty) w tlenku propylenu i inkubować przez noc.
  7. Przenieść do świeżo przygotowanego aralditu (zawierającego wszystkie komponenty) na co najmniej 1 h.
  8. Przenieść do płaskich form do zatapiania i wypełnić aralditem.
  9. Pozostawić araldit do utwardzenia na co najmniej 48 h w temperaturze 60 °C.
  10. Po przycięciu zatopionej próbki wykonać cienkie przekroje (700 nm) na ultramikrotomie przy użyciu noży szklanych lub diamentowego noża histologicznego i barwić barwnikiem Richardsona.
  11. Wyciąć ultracienkie przekroje (ok. 70 nm) przy użyciu noża diamentowego i przenieść na siatki miedziane (np. o oczkach 150 mesh).
  12. Ultracienkie przekroje należy barwić 0.5% (w/v) octanem uranylu w aqua dest., a następnie 3% (w/v) cytrynianem ołowiu w aqua dest. w automatycznej barwiarce do przekrojów. Alternatywnie przekroje można barwić ręcznie, pozostawiając siatki na 15 min w nasyconym odwirowanym roztworze octanu uranylu w aqua dest., a następnie w 0.3% (w/v) cytrynianie ołowiu w aqua dest.

4. Przygotowanie preparatu HFT do SEM

  1. Do analizy SEM wyjąć preparat z utrwalacza Montiego, ułożyć go nabłonkiem do góry na arkuszu korkowym o wymiarach 1,5 x 1 cm i unieruchomić za pomocą igieł entomologicznych.
  2. Przenieść preparat wraz z korkiem do odpowiednich koszyczków metalowych i płukać przez 30 min w buforze kakodylanu sodu, pH 7,35.
  3. Odwodnić preparat poprzez inkubację w mieszaninach acetonu z wodą (v/v) o rosnącym stężeniu: 30% przez 6 h, 40% przez 6 h, 60% przez 8 h, 70% przez noc, 80% przez 2 h, 90% przez 2 h oraz 100% przez noc (należy zachować szczególną ostrożność, aby preparat był stale zanurzony).
  4. Przenieść do świeżego 100% acetonu i wysuszyć preparat metodą punktu krytycznego (temperatura 40 °C, ciśnienie 80 bar).
  5. Usunąć igły i korek, a następnie przykleić preparat nabłonkiem do góry do uchwytu do SEM wyposażonego w przewodzącą taśmę węglową, używając przewodzącego cementu węglowego. Aby zwiększyć przewodnictwo między uchwytem a przewodzącą taśmą węglową, zastosować ciekłe przewodzące srebro.
  6. Przygotować przewodzącą powłokę z platyny, złota lub palladu na powierzchni preparatu za pomocą napylacza (sputter coater).

5. Barwienie półcienkich przekrojów barwnikiem Richardsona

  1. Pozostawić półcienkie przekroje do wyschnięcia na szkiełku.
  2. Barwić przekroje roztworem barwiącym w temperaturze 60 °C przez 1-2 min.
  3. Przemyć w aqua dest.
  4. Wysuszyć przekroje i przykryć szkiełkiem zakrywowym.

6. Reprezentatywne wyniki

W modelu infekcji ludzkiego jajowodu byliśmy w stanie zwizualizować różnice w morfologii nabłonka pomiędzy kontrolami niezinfekowanymi (Rycina 1) a jajowodami zakażonymi C. trachomatis (Rycina 2) w warunkach normoksji. Charakterystyczne różnice morfologiczne wskazywały na indukowany przez patogen obrzęk i lizę komórek nabłonka jajowodu, których nie stwierdzono w kontrolach niezinfekowanych. Wykorzystując przekroje półcienkie i transmisyjną mikroskopię elektronową, zdołaliśmy udowodnić tworzenie się wewnątrzkomórkowych inkluzji C. trachomatis w zakażonej ex vivo tkance ludzkiego jajowodu (Rycina 3, 5), natomiast nie zaobserwowano ich w kontrolach niezinfekowanych (Rycina 4). Ponieważ stężenia tlenu w żeńskich drogach rodnych są niskie już w warunkach fizjologicznych 11, a następnie ulegają dalszemu obniżeniu podczas procesu zapalnego, zbadaliśmy nasz model również w warunkach hipoksji. Wstępne wyniki wskazują, że model ten jest użyteczny do analizy wzrostu chlamydii i ich potomstwa przy różnych stężeniach tlenu. Uszkodzenia komórek nabłonka wywołane przez chlamydie należy odróżnić od artefaktów wynikających z nieostrożnego przygotowania i obchodzenia się z jajowodami przed infekcją (Rycina 6).

Obraz z rozpylnego mikroskopu elektronowego przedstawiający ziarna pyłku, ukazujący teksturę powierzchni i morfologię.
Rycina 1. Skaningowa mikroskopia elektronowa (SEM) niezakażonego ludzkiego jajowodu po jednym dniu inkubacji w medium kontrolnym (zielona strzałka wskazuje komórkę rzęskową, niebieska strzałka wskazuje komórkę nierzęskową).

Obraz z elektronowego mikroskopu skaningowego, struktura błony komórkowej, skala 3 μm.
Rysunek 2. Skaningowa mikroskopia elektronowa (SEM) ludzkiego jajowodu zainfekowanego ex vivo C. trachomatis jeden dzień po infekcji (biała strzałka wskazuje przerwane włączenie).

Histologia, obraz mikroskopowy próbki komórek; analiza struktury i morfologii komórkowej, skala 10µm.
Rycina 3. Półcienkie skrawki ukazują typowe inkluzje wewnątrzkomórkowe (białe strzałki) 1 dzień po zakażeniu ludzkiego jajowodu C. trachomatis ex vivo.

Struktura komórkowa na mikrografii elektronowej, ukazująca organelle i błonę komórkową w skali 5 µm.
Rysunek 4. Transmisyjna mikroskopia elektronowa (TEM) niezakażonego ludzkiego jajowodu po jednym dniu inkubacji w medium kontrolnym.

Obraz mikroskopowy struktury komórki, ultrastruktura, analiza TEM, organelle, biologia komórki.
Rysunek 5. Transmisyjna mikroskopia elektronowa (TEM) ludzkiej trąbki jajowej zainfekowanej ex vivo C. trachomatis jeden dzień po infekcji (białe strzałki wskazują inkluzje chlamydii).

Mikroskopia, mikrograf elektronowy; struktura biofilmu bakteryjnego; morfologia powierzchni; badanie drobnoustrojów; skala 500 µm.
Rycina 6. Skaningowa mikroskopia elektronowa (SEM) nabłonka jajowodu uszkodzonego w wyniku nieostrożnego przygotowania i obchodzenia się z próbką (białe strzałki wskazują zniszczoną tkankę nabłonkową).

Dyskusja

Wizualizacja uszkodzeń tkanki zainfekowanej przez patogen jest trudna i często ograniczona do procedur eksperymentalnych na myszach. Opracowaliśmy model infekcji ex vivo w ludzkich jajowodach, aby analizować infekcje C. trachomatis w górnym odcinku żeńskiego układu rozrodczego. Dzięki zastosowaniu tej metody byliśmy w stanie zwizualizować uszkodzenia nabłonka ludzkiego jajowodu wywołane przez C. trachomatis w ciągu jednego dnia po zakażeniu. Obrzęk oraz lizę komórkową były typowymi zmianami morfologicznymi obserwowanymi w jajowodach zainfekowanych C. trachomatis, których nie stwierdzono w niezinfekowanych próbkach kontrolnych. Analizy TEM wykazały, że chlamydie realizują typowy wewnątrzkomórkowy cykl rozwojowy w zainfekowanych tkankach, wykazując duże inkluzje z redyferencjowanymi ciałami elementarnymi, ale także mniejsze inkluzje z powiększonymi ciałami siточkowatymi, co może wskazywać na persistencję. Jednak sam obraz morfologiczny nie jest wystarczający do rozróżnienia między infekcjami replikującymi a persistentnymi, które charakteryzują się obniżonym metabolizmem i zwiększoną odpornością na środki przeciwdrobnoustrojowe 10.

Zniszczenie nabłonka w zainfekowanych jajowodach wynika albo z rozpadu zainfekowanych C. trachomatis komórek nabłonkowych po zakończeniu wewnątrzkomórkowego cyklu rozwojowego i uwolnieniu zakaźnych ciał elementarnych, albo z uwalniania cytokin prozapalnych 8. Przypuszcza się, że uszkodzenia tkanek wywołane przez patogen oraz indukowane przez gospodarza reakcje immunologiczne przeciwko C. trachomatis są głównymi czynnikami prowadzącymi do utraty funkcji komórek nabłonkowych, przebudowy fibroblastów, a w konsekwencji do bezpłodności jajowodowej in vivo 8,11.

Jednym z głównych ograniczeń tego modelu jest brak komórek zapalnych, co utrudnia analizę efektów wtórnych do pierwotnego zakażenia nabłonka jajowodu przez C. trachomatis. Niemniej jednak model ten jest odpowiedni do badania różnych warunków środowiskowych (np. zawartości tlenu) oraz wstępnej odpowiedzi immunologicznej gospodarza w ostrych zakażeniach C. trachomatis 8,9. Dalsze plany obejmują opracowanie modelu do testowania środków przeciwdrobnoustrojowych przeciwko C. trachomatis w całych ludzkich jajowodach oraz charakterystykę stanów metabolicznych różnych etapów rozwojowych obserwowanych w nabłonku jajowodu za pomocą dwufotonowej laserowej mikroskopii skanującej.

Oświadczenia

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Praca ta była wspierana przez DFG-Cluster of Excellence „Inflammation at Interfaces” (RA-If, RA-D). Jesteśmy wdzięczni za doskonałą pomoc techniczną Kristin Wischnat.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
DMEMPAAE15-843
RPMI PAAR15-802
FCSPAAA15-101
Cyklheksymida Sigma - Aldrich
Bufor SPGróżnepatrz receptura poniżej
Fiksatyw Montiego różnepatrz receptura poniżej
bufor kakodylanu soduróżnepatrz receptura poniżej
Barwienie Richardsonaróżnepatrz receptura poniżej

Receptury:

1. Bufor SPG

  1. Dodać 75 g sacharozy.
  2. Dodać 2.47 g fosforanu disodowego.
  3. Dodać 0.36 g fosforanu monosodowego.
  4. Dodać 0.72 g kwasu glutaminowego.
  5. Uzupełnić aqua dest. do objętości 1 l.
  6. Dostosować pH do 7.3.

2. 0.1 M bufor kakodylanu sodu, pH 7.35.

  1. Dodać 42.80 g soli sodowej kwasu dimetylarsenowego.
  2. Dodać 68.46 g sacharozy.
  3. Uzupełnić aqua dest. do objętości 1 l, aby otrzymać 0.2 M bufor kakodylanu sodu.
  4. Przed użyciem rozcieńczyć roztwór aqua dest. do pożądanego stężenia i w razie potrzeby dostosować pH do 7.35.

3. Fiksatyw Montiego

  1. Dodać 156 ml 0.12 M buforu kakodylanu sodu. 3.2 Dodać 25 ml 25% glutaraldehydu w aqua dest.
  2. Dodać 19 ml 10% paraformaldehydu w aqua dest.
  3. Dodać 3 ml 3% CaCl2 w aqua dest.
  4. Dostosować pH do 7.35 i uzupełnić aqua dest. do końcowej objętości roztworu 312 ml.

4. Barwienie Richardsona

  1. Wymieszać w równych częściach 1% roztwór błękitu metylenowego w 1% wodnym roztworze boraksu oraz 1% roztwór Azuru II w aqua dest.

Bibliografia

  1. Dean, D., Suchland, R. J., Stamm, W. E. Evidence for long-term cervical persistence of Chlamydia trachomatis by omp1 genotyping. J. Infect. Dis. 182, 909-916 (2000).
  2. Campbell, L. A., Patton, D. L., Moore, D. E., Cappuccio, A. L., Mueller, B. A., Wang, S. P. Detection of Chlamydia trachomatis deoxyribonucleic acid in women with tubal infertility. Fertil. Steril. 59, 45-50 (1993).
  3. Peipert, J. F. Clinical practice. Genital chlamydial infections. N. Engl. J. Med. 349, 2424-2430 (2003).
  4. Mardh, P. A. Tubal factor infertility, with special regard to chlamydial salpingitis. Curr. Opin. Infect. Dis. 17, 49-52 (2004).
  5. Ertel, A., Verghese, A., Byers, S. W., Ochs, M., Tozeren, A. Pathway-specific differences between tumor cell lines and normal and tumor tissue cells. Mol. Cancer. 5, 55(2006).
  6. Roshick, C., Wood, H., Caldwell, H. D., McClarty, G. Comparison of gamma interferon-mediated antichlamydial defense mechanisms in human and mouse cells. Infect. Immun. 74, 225-238 (2006).
  7. Mestas, J., Hughes, C. C. Of mice and not men: differences between mouse and human immunology. J. Immunol. 172, 2731-2738 (2004).
  8. Hvid, M., Baczynska, A., Deleuran, B., Fedder, J., Knudsen, H. J., Christiansen, G., Birkelund, S. Interleukin-1 is the initiator of Fallopian tube destruction during Chlamydia trachomatis infection. Cell Microbiol. 9, 2795-2803 (2007).
  9. Roth, A., Konig, P., van, Z. G., Klinger, M., Hellwig-Burgel, T., Daubener, W., Bohlmann, M. K., Rupp, J. Hypoxia abrogates antichlamydial properties of IFN-gamma in human fallopian tube cells in vitro and ex vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 19502-19507 (2010).
  10. Wyrick, P. B., Knight, S. T. Pre-exposure of infected human endometrial epithelial cells to penicillin in vitro renders Chlamydia trachomatis refractory to azithromycin. J. Antimicrob. Chemother. 54, 79-85 (2004).
  11. Van Voorhis, W. C., Barrett, L. K., Sweeney, Y. T., Kuo, C. C., Patton, D. L. Repeated Chlamydia trachomatis infection of Macaca nemestrina fallopian tubes produces a Th1-like cytokine response associated with fibrosis and scarring. Infect. Immun. 65, 2175-2182 (1997).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Chlamydia trachomatisskaningowa mikroskopia elektronowatransmisyjna mikroskopia elektronowamodel tkankowy ex vivoutrwalacz Monty egosuszarka w punkcie krytycznymnapylacz metalicznyultramikrotomkomora hipoksyczna

Powiązane artykuły