Tomografia fluorescencji rozproszonej w dziedzinie czasu pod kontrolą tomografii komputerowej u małych zwierząt w celu lokalizacji biomarkerów nowotworowych

Summary

Dyfuzyjna tomografia fluorescencyjna oferuje stosunkowo tanie i potencjalnie kompleksowe podejście do przedklinicznego obrazowania nowotworów in vivo. Przedstawiono metodologię gromadzenia danych optycznych, kalibracji i rekonstrukcji obrazu dla bezkontaktowego systemu w dziedzinie czasu pod kontrolą tomografii komputerowej wykorzystującego fluorescencyjne celowanie w receptor naskórkowego czynnika wzrostu biomarkera nowotworu w modelu glejaka myszy.

Abstract

Obrazowanie molekularne fluorescencji małych zwierząt (FMI) może być potężnym narzędziem do przedklinicznych badań nad odkrywaniem i rozwojem leków¹. Jednak absorpcja światła przez chromofory tkankowe (np. hemoglobinę, wodę, lipidy, melaninę) zazwyczaj ogranicza propagację sygnału optycznego przez grubości większe niż kilka milimetrów². W porównaniu z innymi długościami fal widzialnych, absorpcja tkankowa dla absorpcji światła czerwonego i bliskiej podczerwieni (bliskiej podczerwieni) dramatycznie spada, a rozpraszanie nieelastyczne staje się dominującym mechanizmem interakcji światło-tkanka. Stosunkowo niedawny rozwój środków fluorescencyjnych, które pochłaniają i emitują światło w bliskiej podczerwieni (600-1000 nm), przyczynił się do rozwoju systemów obrazowania i modeli propagacji światła, które mogą osiągnąć trójwymiarowe obrazowanie całego ciała u małych zwierząt³.

Pomimo wielkich postępów w tej dziedzinie, niekorzystna natura rozproszonej tomografii fluorescencyjnej pozostaje poważnym problemem dla stabilności, odzyskiwania kontrastu i rozdzielczości przestrzennej technik rekonstrukcji obrazu, a optymalne podejście do FMI u małych zwierząt nie zostało jeszcze uzgodnione. Większość grup badawczych zainwestowała w systemy oparte na urządzeniach ze sprzężeniem ładunkowym (CCD), które zapewniają obfite pobieranie próbek tkanek, ale nieoptymalną czułość^4-9, podczas gdy nasza grupa i kilka innych^10-13 szukało systemów opartych na detektorach o bardzo wysokiej czułości, które w tej chwili pozwalają na uzyskanie gęstego próbkowania tkanek tylko kosztem niskiej przepustowości obrazowania. Tutaj demonstrujemy metodologię zastosowania technologii wykrywania pojedynczych fotonów w systemie tomografii fluorescencyjnej do lokalizacji nowotworowej zmiany mózgu w modelu mysim.

System tomografii fluorescencyjnej (FT) wykorzystywał zliczanie pojedynczych fotonów za pomocą fotopowielaczy (PMT) i bogatą w informacje detekcję światła w dziedzinie czasu w konformacji bezkontaktowej¹¹. Zapewnia to jednoczesne zbieranie transmitowanego światła wzbudzonego i emisyjnego oraz obejmuje automatyczną kontrolę ekspozycji na wzbudzenie fluorescencji¹⁴, odniesienie laserowe i korejestrację z systemem tomografii komputerowej małych zwierząt (microCT)¹⁵. Do obrazowania wykorzystano nagi model myszy. Zwierzę zostało zaszczepione ortotopowo ludzką linią komórkową glejaka (U251) w lewej półkuli mózgu i zobrazowane 2 tygodnie później. Guz został poddany fluorescencji przez wstrzyknięcie znacznika fluorescencyjnego, IRDye 800CW-EGF (LI-COR Biosciences, Lincoln, NE) ukierunkowanego na receptor naskórkowego czynnika wzrostu, białka błony komórkowej, o którym wiadomo, że ulega nadekspresji w linii guza U251 i wielu innych nowotworach¹⁸. Drugi, nieukierunkowany znacznik fluorescencyjny, Alexa Fluor 647 (Life Technologies, Grand Island, NY), został również wstrzyknięty, aby uwzględnić wpływ niezależny od receptora na wychwyt docelowych znaczników, aby zapewnić sposób ilościowego określania wiązania znacznika i dostępności/gęstości receptora²⁷. Algorytm sterowany tomografią komputerową w dziedzinie czasu został wykorzystany do zrekonstruowania lokalizacji obu znaczników fluorescencyjnych (tj. lokalizacji guza) w mózgu myszy, a ich zdolność do lokalizacji guza zweryfikowano za pomocą rezonansu magnetycznego wzmocnionego kontrastem.

Chociaż wykazano obrazowanie fluorescencyjne w mysim modelu glejaka, metodologia przedstawiona w tym filmie może być rozszerzona na różne modele nowotworów w różnych małych modelach zwierzęcych, potencjalnie do wielkości szczura¹⁷.

Protocol

1. Przygotowanie zwierząt

1. Znieczulić nagą mysz (Charles River, Wilmington, MA) wstrzyknięciem dootrzewnowym ketaminy-ksylazyny (100 mg / kg: 10 mg / kg i.p.).
2. Umieść mysz w ramce stereotaktycznej, wykonaj nacięcie w skórze głowy po lewej stronie czaszki i za pomocą igły o rozmiarze 18 wykonaj otwór w czaszce o średnicy 1 mm 2 mm od linii środkowej i 2 mm za bregmą.
3. Wstrzyknąć 5×10⁵ U251 ludzkich komórek glejaka neuronalnego (uprzejmie dostarczonych przez dr Marka Israela z Dartmouth College, Hanower, NH) w 5 μl roztworu buforu fosforanowego do lewej półkuli mózgu na głębokości około 2 mm pod powierzchnią mózgu. Do implantacji komórek użyj mikrostrzykawki Hamiltona¹⁸ i igły o rozmiarze 27 i włóż końcówkę igły 3 mm od zewnętrznej powierzchni czaszki, a następnie wycofaj 1 mm, aby utworzyć kieszeń na komórki.
4. Zszyj miejsce nacięcia i pozwól na powrót do zdrowia po operacji.
5. Odczekaj ~ 14 dni, aby guz mógł urosnąć przed obrazowaniem.

2. Kalibracja systemu tomografii fluorescencyjnej

1. W dniu obrazowania za pomocą myszy należy uruchomić system i pozwolić laserom i detektorom światła rozgrzać się przez około 20 minut, aby uniknąć wahań czułości systemu.
2. Umieść dyfuzor liniowy o wymiarach 100° na 4° (Thorlabs, Newton, NJ) w bezpośrednim środku bramy obrazowania, normalnie do lasera wzbudzającego: pikosekundowa wielomodowa dioda laserowa 635 nm o częstotliwości 80 MHz (PicoQuant Photonics North America Inc., Westfield, MA). Dostosuj kąt dyfuzora, aby zmaksymalizować ilość sygnału wykrywanego przez wszystkie pięć kanałów zbierania światła. Pełny opis geometrii obrazowania znajduje się w innym miejscu^11,14,15.
3. Umieść filtry o neutralnej gęstości OD 2 (Thorlabs, Newton, NJ) przed wszystkimi fotopowielaczami do wykrywania fluorescencji (PMT) i filtry o neutralnej gęstości OD 1 (Thorlabs, Newton, NJ) przed wszystkimi PMT do wykrywania transmitancji. Zbierz 100 profili czasowego rozprzestrzeniania się impulsów (TPSF) lasera, każdy z czasem integracji 1 s.
4. Znormalizuj każdy TPSF przez odniesienie lasera, skoryguj dryft czasowy w odniesieniu lasera i uśrednij ze wszystkich iteracji dla każdego detektora. Te uśrednione TPSF są specyficznymi dla detektora funkcjami odpowiedzi instrumentu (IRF) używanymi w optycznej rekonstrukcji obrazu.

3. Protokół obrazowania

1. Znieczulić mysz 2% izofluranem w tlenie (1 l/min).
2. Wstrzyknąć 1 nanomol IRDye 800CW-EGF i 1 nanomol Alexa Fluor 647 w 100 μl roztworu buforu fosforanowego, dootrzewnowo, 12 godzin przed obrazowaniem, aby zdążyć za nadekspresję receptora naskórkowego czynnika wzrostu w guzie.
3. Umieść mysz na wspornikach z włókna szklanego łóżka do obrazowania, układając mysz tak, aby jej nos pozostawał w stożku dostarczającym znieczulenie izofluranem.
4. Upewnij się, że mysz jest odpowiednio umieszczona na łóżku: tj. gdy łóżko jest przymocowane do systemu tomografii fluorescencyjnej, mysz znajduje się w przybliżeniu w środku gantry obrazowania. Pozycjonowanie to można kierować, obracając laser wzbudzający o 180° wokół myszy, zapewniając, że punkt ogniskowy lasera oświetla punkt mniej więcej na środku myszy z perspektywy lasera pod wszystkimi kątami.
5. Po ustawieniu ostrożnie przenieś łóżko obrazowe i mysz do skanera microCT (eXplore Locus, GE Healthcare, London, ON) i zbierz informacje anatomiczne w rozdzielczości izotropowej 93 μm dla całej głowy myszy.
6. Zwizualizuj stos obrazów CT i wybierz wycinki, które mają być obrazowane za pomocą systemu tomografii fluorescencyjnej.
7. Ostrożnie przenieś stół obrazowania i mysz z powrotem do systemu tomografii fluorescencyjnej. Wybierz liczbę pozycji źródłowych do zbierania danych o myszy dla każdego wycinka obrazowania (32), czas integracji dla każdego pomiaru TPSF (1 s), liczbę iteracji dla każdej pozycji źródła (10) oraz pozycję i liczbę żądanych wycinków obrazowania ze stosu obrazów CT z kroku 3.6. Liczby w nawiasach są typowymi wartościami dla każdego parametru obrazowania, co daje ~ 5 minut zbierania danych na wycinek obrazowania.
8. Umieść filtry z potrójnym wycięciem (Chroma Technology Corp., Bellows Falls, VT) przed PMT detekcji fluorescencji, aby ograniczyć docieranie światła laserowego do detektorów fluorescencji, a filtry o neutralnej gęstości OD 2 przed PMT wykrywania transmitancji, aby uniknąć nasycenia tych detektorów.
9. Uruchom oprogramowanie do akwizycji danych, zbierając TPSF fluorescencji i transmitancji w każdej zdefiniowanej pozycji detektora źródła i dla każdej długości fali wzbudzenia (635 nm i 755 nm do wzbudzenia znaczników Alexa Fluor 647 i IRDye 800CW-EGF odpowiednio). Dla każdego zestawu zebranych TPSF należy monitorować i rejestrować intensywność lasera za pomocą referencyjnego kanału PMT.

4. Rekonstrukcja obrazu

1. Określ zewnętrzną powierzchnię myszy i położenie prętów nośnych łóżka do obrazowania na podstawie obrazów CT i utwórz maski, które osobno zakrywają granice myszy i prętów obrazowania.
2. Użyj maski myszy, aby utworzyć siatkę elementów skończonych zwierzęcia za pomocą oprogramowania NIRFAST¹⁹.
3. Zlokalizuj pozycje źródła i detektora z systemu tomografii fluorescencyjnej na powierzchni siatki w oparciu o mikroCT i współrzędne przestrzennej rejestracji fluorescencji²⁰.
4. Usuń optyczne punkty danych powiązane z pozycjami źródła lub detektora, które oddziałują z położeniem prętów nośnych stołu obrazowania.
5. Znormalizuj dane zebrane w każdej pozycji detektora źródła przez odniesienie lasera, skoryguj dryft czasowy w odniesieniu lasera i skoryguj czułość filtra, które zostały określone za pomocą testów eksperymentalnych w momencie zakupu¹⁵.
6. Weź współczynnik Borna danych (fluorescencja podzielona przez transmitancję) dla każdej pozycji źródło-detektor i pomnóż przez symulację transmisji w modelu do przodu opartą na siatce zwierzęcej elementów skończonych w celu uzyskania jednolitych właściwości optycznych. Ma to na celu ograniczenie błędów związanych ze sprzężeniem źródło-lub detektor-tkanka²¹, kalibrację danych do modelu²² oraz dostosowanie danych do innych aspektów niezgodności model-dane^23,24.
7. Skonstruuj wektor danych złożony ze skalowanej różnicy danych współczynnika urodzonego zebranych na obu długościach fal. Współczynnik skalowania jest dobierany tak, aby zmaksymalizować kontrast wiązania EGFR. Wykonaj rekonstrukcję obrazu w dziedzinie czasu ze skalibrowanymi danymi różnicowymi, używając TPSF dla każdego kanału detekcji jako danych wejściowych i utwórz mapy fluorescencyjne ukierunkowanego znacznika¹⁵ ze wzmocnieniem kontrastu.

5. Reprezentatywne wyniki

Przykład rekonstrukcji fluorescencyjnej nałożonej na współzarejestrowany obraz anatomiczny CT z głowy myszy z ortotopowym guzem glejaka U251 jest przedstawiony na rysunku 1b. Środek masy glejaka wyznaczony przez rekonstrukcję fluorescencyjną (ryc. 1b) znajdował się w odległości 1 mm od środka masy guza określonego za pomocą rezonansu magnetycznego ze wzmocnieniem kontrastowym (ryc. 1a). Obrazy CT i MRI zostały zarejestrowane jednocześnie w oparciu o transformację wzajemnej informacji.

Rysunek 1. Obraz głowy myszy z rezonansem magnetycznym o wzmocnieniu kontrastowym (gadolin) (a). Mysz została zaszczepiona ortotopowo ludzką linią komórkową glejaka U251. Lokalizacja guza, który pochłania więcej środka kontrastowego niż normalny mózg, można zobaczyć w lewej półkuli mózgu (po prawej stronie obrazu) i wskazać białą strzałką. Odpowiedni obraz tomografii komputerowej (z tego samego miejsca na głowie myszy) jest przedstawiony w (b) z nasadką ukierunkowanej fluorescencji naskórkowego czynnika wzrostu pomniejszoną o nałożoną nieukierunkowaną rekonstrukcję fluorescencyjną. Jednostki fluorescencji są odwrotnie proporcjonalne mm i odnoszą się do współczynnika absorpcji związanej fluorescencji celowanej pomnożonego przez jej sprawność kwantową i przez jej stężenie.

Discussion

Tomografia fluorescencyjna (FT) to czuła, wolna od promieniowania jonizującego metoda obrazowania molekularnego oparta na transporcie światła widzialnego i bliskiej podczerwieni przez tkankę biologiczną. Większość zainteresowania FT skupia się na jej potencjale w zakresie przyspieszenia odkrywania i opracowywania leków w modelach eksperymentalnych na małych zwierzętach¹ , a jednym z kluczowych obszarów badań jest badanie ekspresji biomarkerów nowotworowych i odpowiedzi na terapie molekularne²⁶. Obecnie istnieją dwa konkurencyjne podejścia do projektowania systemów FT. Najpopularniejsza konstrukcja opiera się na chłodzonych kamerach ze sprzężeniem ładunkowym (CCD) do detekcji fluorescencji^4-9. Taka konstrukcja zapewnia wysoką gęstość pomiarów, maksymalizując pobieranie próbek tkanek, ponieważ każdy piksel w kamerze CCD może wykryć światło, które przebyło unikalną ścieżkę przez tkankę. Jednak kamery CCD mają ograniczony zakres dynamiki, a szum odczytu ogranicza ich ostateczną czułość. Drugi projekt pozwala uniknąć potencjalnych ograniczeń detekcji kamer CCD poprzez zastosowanie bardzo czułej technologii zliczania pojedynczych fotonów opartej na wykorzystaniu takich detektorów jak fotopowielacze lub fotodiody lawinowe^10-13. Wadą tych bardziej czułych metod wykrywania jest to, że każdy detektor może zbierać światło tylko w jednym punkcie; W związku z tym, aby uzyskać gęste pobieranie próbek tkanek, albo trzeba użyć wielu detektorów (co jest bardzo drogie), albo zobrazować wiele projekcji za pomocą tego samego detektora (co może być czasochłonne). Chociaż optymalny poziom pobierania próbek tkanek dla FT małych zwierząt nie został uzgodniony i może się różnić w zależności od przypadku, zgadza się, że oprzyrządowanie do liczenia pojedynczych fotonów jest lepiej przystosowane do badania granic czułości FT pod względem jego zdolności do wykrywania niskich stężeń markerów molekularnych. W tym badaniu przedstawiamy metodologię przeprowadzania FT przy użyciu oprzyrządowania do wykrywania zliczania pojedynczych fotonów w celu zlokalizowania guzów u myszy.

Istnieją cztery kluczowe etapy tworzenia solidnych zestawów danych ze skorelowanym w czasie zliczaniem pojedynczych fotonów FT. Pierwszym z nich jest zastosowanie odpowiedniej i prostej procedury kalibracji. W przedstawionej metodyce odpowiednie czułości każdego kanału detekcji są uwzględniane poprzez zebranie podstawowego pomiaru światła wzbudzenia przekazywanego przez dyfuzor liniowy zaprojektowany do kierowania równych frakcji światła do każdego detektora¹⁵. Co więcej, światło wykryte podczas eksperymentu jest w sposób ciągły kalibrowane do lasera referencyjnego, zarówno pod względem natężenia, jak i średniego czasu, który może ulegać wahaniom w czasie, przez działanie laserowego kanału referencyjnego^11,15. Drugim krytycznym krokiem jest dokładne pobranie i jednoczesna rejestracja obrazowania anatomicznego do kontrolowanych rekonstrukcji fluorescencyjnych. Same dane FT nie dostarczają żadnych informacji anatomicznych; w związku z tym, aby stworzyć model transportu światła, który można wykorzystać do zrekonstruowania lokalizacji źródeł fluorescencyjnych w próbce na podstawie wykrytej fluorescencji na powierzchni próbki, anatomia próbki w stosunku do układu FT musi być dokładnie znana. W naszym systemie informacje anatomiczne są pozyskiwane przez system mikrotomografii komputerowej ze współrzędnymi przestrzennymi, które zostały zarejestrowane przestrzennie ze współrzędnymi systemu FT^15,20. Trzecim krytycznym krokiem jest zapewnienie, że optymalna ekspozycja (tj. całkowity czas wykrywania fotonów dla każdej projekcji laserowej) jest stosowana w każdej pozycji źródło-detektor. Jest to ważne z dwóch powodów: po pierwsze, aby zapewnić odpowiednią proporcję sygnału do szumu w każdej pozycji detekcji, a po drugie, aby uniknąć nasycenia detektora, co mogłoby uszkodzić jednostki detekcyjne. W celu uzyskania optymalnej ekspozycji w każdej pozycji detektora stosowana jest automatyczna kontrola ekspozycji, która zasadniczo trianguluje optymalną ekspozycję z dwóch ekspozycji o niskim sygnale¹⁴. Czwartym krytycznym krokiem metodologii jest odniesienie zebranych danych fluorescencyjnych do ilości transmitowanego światła wzbudzającego. To odniesienie jest często nazywane współczynnikiem Borna i zapewnia FT wiele korzyści, z których główną jest łagodzenie błędów niezgodności modelu z danymi^23,24. Prezentowany układ został zaprojektowany do jednoczesnego wykrywania zarówno fluorescencji, jak i przechodzącego światła wzbudzonego poprzez kierowanie światła w każdym kanale detekcji do 2 oddzielnych fotopowielaczy. W ten sposób unikamy wpływu ruchu na dokładność współczynnika Borna.

Dysponując solidnym zestawem danych, rekonstrukcja obrazu danych w dziedzinie czasu polega na rozwiązaniu odwrotnego problemu siatki elementów skończonych o wyrażeniu:

d=Jx

gdzie d jest wektorem z n x m elementami dla n projekcji źródło-detektor i m bramek czasowych TPSF; J jest macierzą czułości n x m-by-l (lub jakobianem) dla l węzłów w siatce; a x jest wektorem właściwości optycznych fluorescencji w każdym węźle, o rozmiarze l. d jest skalibrowanymi danymi zebranymi podczas eksperymentu, a J jest symulowane przy użyciu rozwiązania elementów skończonych do przybliżenia dyfuzji w dziedzinie czasu transportu fluorescencji²⁵. Wymiar czasowy J jest również powiązany z funkcjami odpowiedzi instrumentu specyficznymi dla detektora. x jest reprezentacją interesującej nas mapy fluorescencji i jest rozwiązywane przy użyciu nieujemnego podejścia Levenberga-Marqardta najmniejszych kwadratów z regularyzacją Tichonowa¹⁵.

Przedstawiona tutaj metodologia, która opisuje procedurę zdolną do lokalizacji guzów znakowanych fluorescencyjnie u myszy przy użyciu wysoce czułej detekcji fluorescencji zliczającej fotony, ma potencjał, aby przesunąć granice FT. W poprzednim badaniu wykazano potencjał zastosowania tego podejścia w modelach zwierząt większych niż myszy, takich jak szczury, a także lepszą czułość w porównaniu z istniejącymi konstrukcjami systemów w próbkach wielkości^myszy17. Bezpośrednim zastosowaniem tego podejścia byłoby monitorowanie ekspresji biomarkerów in vivo w modelach nowotworów małych zwierząt w celu oceny skuteczności leku w sposób wysokoprzepustowy. Zdolność systemu do wzbudzania i wykrywania fluorescencji na wielu długościach fal pozwala na jednoczesne wykrywanie wielu markerów fluorescencyjnych. Dodatkowe markery fluorescencyjne umożliwiają jednoczesne badanie wielu aspektów patologii lub mogą być wykorzystane, jak w tym badaniu, do zastosowania bardziej ilościowych podejść do obrazowania, takich jak metody podwójnego reportera pomiaru potencjału wiązania in vivo , markera gęstości receptora^26,27.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
IRDye 800CW-EGF	LI-COR Biosciences	926-08446
Alexa Fluor 647, ester sukcynimidylowy	Life Technologies	A20106	Wrażliwa z wodą w celu zminimalizowania niespecyficznego wiązania