Optyczny zapis ponadprogowej aktywności neuronalnej z rozdzielczością pojedynczej komórki i pojedynczego skoka

Podsumowanie

Zrozumienie funkcji ośrodkowego układu nerwowego kręgowców wymaga nagrań z wielu neuronów, ponieważ funkcja kory mózgowej powstaje na poziomie populacji neuronów. W tym miejscu opisujemy optyczną metodę rejestrowania ponadprogowej aktywności neuronalnej z rozdzielczością pojedynczej komórki i pojedynczego skoku, skanowanie o swobodnym dostępie dithered. Metoda ta rejestruje somatyczne fluorescencyjne sygnały wapniowe z maksymalnie 100 neuronów z wysoką rozdzielczością czasową. Algorytm maksymalnego prawdopodobieństwa dekonwolucjonuje podstawową ponadprogową aktywność neuronalną od sygnałów wapniowych somatycznej fluorescencji. Metoda ta niezawodnie wykrywa skoki z wysoką skutecznością wykrywania i niskim odsetkiem wyników fałszywie dodatnich i może być stosowana do badania populacji neuronów in vitro i in vivo.

Streszczenie

Sygnalizacja informacji w ośrodkowym układzie nerwowym kręgowców jest często przenoszona przez populacje neuronów, a nie przez pojedyncze neurony. Również propagacja ponadprogowej aktywności impulsowej obejmuje populacje neuronów. Badania empiryczne dotyczące bezpośrednio funkcji kory mózgowej wymagają zatem nagrań z populacji neuronów o wysokiej rozdzielczości. W tym miejscu opisujemy metodę optyczną i algorytm dekonwolucji do rejestrowania aktywności neuronalnej z maksymalnie 100 neuronów z rozdzielczością pojedynczej komórki i pojedynczego skoku. Metoda ta polega na wykrywaniu przejściowych wzrostów wewnątrzkomórkowego stężenia wapnia somatycznego związanych z ponadprogowymi skokami elektrycznymi (potencjałami czynnościowymi) w neuronach korowych. Wysoka rozdzielczość czasowa nagrań optycznych jest osiągana dzięki szybkiej technice skanowania o dostępie swobodnym z wykorzystaniem deflektorów akustyczno-optycznych (AD)¹. Wzbudzenie dwufotonowe barwnika wrażliwego na wapń skutkuje wysoką rozdzielczością przestrzenną w nieprzezroczystej tkance mózgowej². Rekonstrukcję skoków na podstawie fluorescencyjnych zapisów wapnia uzyskuje się metodą maksymalnego prawdopodobieństwa. Jednoczesne zapisy elektrofizjologiczne i optyczne wskazują, że nasza metoda niezawodnie wykrywa skoki (>97% skuteczności wykrywania skoków), ma niski wskaźnik wykrywania fałszywie dodatnich szczytów (< 0,003 skoków/s) i wysoką precyzję czasową (około 3 ms)³. Ta optyczna metoda wykrywania kolców może być stosowana do rejestrowania aktywności neuronalnej in vitro oraz u znieczulonych zwierząt in vivo^3,4.

Protokół

1. Konfiguracja optyczna (Rysunek 1)

1. Do wzbudzenia dwufotonowego stosuje się system lasera impulsowego w podczerwieni z impulsami femtosekundowymi. Wysoka moc wyjściowa lasera (w niektórych przypadkach >2 W przy długości fali 890 nm) jest wymagana do skompensowania dużych strat wprowadzanych przez elementy optyczne systemu.
2. System prechirper składający się z dwóch pryzmatów nadaje ujemną dyspersję prędkości grupowej (GVD) na impulsy laserowe przed deflektorami akustyczno-optycznymi (AD) w celu skompensowania dyspersji czasowej wprowadzonej przez^AOD-1.
3. Dwa przetworniki ADED z dużymi otworami przysłony (10 mm dla obiektywu z 40-krotnym zanurzeniem w wodzie z NA 0,8) odchylają wiązkę lasera w dwóch wymiarach.
4. Odblaskowa siatka dyfrakcyjna o średnicy 100 rowków/mm jest umieszczona 13 cm za AOD, aby skompensować dyspersję przestrzenną wprowadzaną przez AOD-y podczas stosowania krótkich impulsów laserowych.
5. Wiązka laserowa jest kierowana za pomocą dwóch teleskopów przekaźnikowych do portu kamery mikroskopu pionowego.
6. Przysłony są umieszczone w regularnych odstępach w celu wyrównania elementów optycznych.
7. Dichroiczny rozdzielacz wiązki umieszczony przed obiektywem przesyła światło wzbudzenia w podczerwieni do próbki i odbija światło fluorescencyjne z próbki na detektor.
8. Detektory epi- i transfluorescencyjne (fotopowielacze, PMT) zbierają sygnał fluorescencyjny przez obiektyw i - w razie potrzeby - przez kondensator.
9. Przed detektorami umieszczono kolorowe filtry szklane (BG-39, 3-5 mm), które zapobiegają przedostawaniu się światła wzbudzającego do detektorów.
10. Kąty odchylenia AOD są kontrolowane przez komputer wyposażony w płytkę przetwornika cyfrowo-analogowego (częstotliwość taktowania 156,25 kHz), która z kolei napędza oscylatory sterowane napięciem.
11. Sygnał z fotopowielaczy jest przekazywany przez dolnoprzepustowy filtr Butterwortha (częstotliwość odcięcia 100 kHz) i digitalizowany przez przetwornik analogowo-cyfrowy (częstotliwość zegara 156,25 kHz) przed zapisaniem w komputerze w celu analizy.
12. Wyrównanie i szum elektryczny są testowane poprzez rejestrację rozkładu sygnałów fluorescencyjnych ze światłem laserowym i bez niego, przy niskim i wysokim wzmocnieniu fotopowielaczy, a także ze wskaźnikiem i bez. Skaner jest prawidłowo ustawiony i ekranowany, gdy szerokość rozkładu sygnałów fluorescencyjnych o dużym wzmocnieniu i ze wskaźnikiem jest znacznie większa niż szerokość pozostałych rozkładów sygnałów fluorescencyjnych (ilustracja 2).

2. Procedury eksperymentalne

1. Skanowanie o swobodnym dostępie dithereed opiera się na wykrywaniu wewnątrzkomórkowego wzrostu stężenia wapnia. Dużą liczbę neuronów można wybarwić za pomocą wstrzyknięcia w bolusie estrowej formy wskaźnika wapnia (na przykład Oregon Green 488 Bapta-1 AM) do tkanki nerwowej⁵.
2. Rejestruje się kilka lokalizacji z każdego neuronu soma, każde przez krótki czas ("dithering", 4 lokalizacje, 6,4 μs dla każdej lokalizacji = 25,6 μs czasu zapisu dla każdego neuronu w każdym cyklu, ryc. 3C). Aby wybrać interesujące nas neurony, uzyskuje się pełną klatkę składającą się z pikseli o wymiarach 256x256 pikseli (ryc. 3A). Środek każdej somy neuronu, który ma zostać zarejestrowany, jest wybierany ręcznie na tym obrazie. Oprogramowanie sterujące automatycznie dodaje trzy punkty w odległości 2 μm wokół tego środka.
3. W każdym cyklu sygnał fluorescencyjny jest rejestrowany z każdego z 40 neuronów (ryc. 3B). Proces ten jest powtarzany przez cały czas trwania jednego nagrania (5 sekund nagrywania = 3 255 cykli, 1 cykl = 1,536 ms).

3. Narzędzia do oprogramowania online maksymalizujące skuteczność wykrywania skoków

1. Wykrywanie skoków na podstawie fluorescencyjnych somatycznych sygnałów wapniowych opiera się na wysokim stosunku sygnału do szumu (S/N) sygnałów somatycznej fluorescencji wapnia. Wysoki S/N można osiągnąć poprzez zwiększenie intensywności wzbudzenia. Intensywność wzbudzenia można jednak zwiększyć tylko do pewnego limitu z powodu fotouszkodzenia. Wykrywanie skoków jest wysokie w bardzo małym oknie intensywności wzbudzenia tylko tam, gdzie sygnały fluorescencyjne mają wysoki S/N, ale obserwuje się tylko bardzo małe fotouszkodzenia³. W celu upewnienia się, że zarejestrowane sygnały mieszczą się w oknie wykrywania wysokiego skoku podczas nagrań, monitorujemy szybkość fotonów (patrz równanie 3.2) i spadek podstawowej fluorescencji za pomocą analizy online.
2. Przybliżona szybkość fotonów na neuron jest obliczana na podstawie krótkiego okna czasowego (100-200 ms) wyjściowego szumu. Liczbę fotonów (N_λ) i szybkość fotonów (λ = N_λ / Δt) oblicza się na podstawie wartości fluorescencji, dopasowując rozkład (σ) względnych zmian fluorescencji do następującego równania:

Równanie to przedstawia rozkład Poissona dla szumu wystrzeliwanego fotonu ze zmianą zmiennej na względną zmianę fluorescencji: ΔF/F = (G*N_λ(t)-G*N_λ,0)/G*N_λ,0, gdzie G oznacza skumulowane wzmocnienie fotopowielacza i wszystkich innych elementów elektronicznych. Należy zauważyć, że równanie to nie określa poprawnie liczby wykrytych fotonów dla nagrań in vivo, ponieważ oprócz szumu wystrzeliwanego fotonami istnieją inne źródła szumu (artefakty ruchu). Niemniej jednak równanie to jest przydatne w przypadku nagrań in vivo w celu oszacowania szumu.

3. Fluorescencja wyjściowa jest obliczana w tym samym oknie czasowym i wykreślana jako funkcja czasu lub prób. Średni spadek linii bazowej jest utrzymywany poniżej 0,0002/s poprzez dostosowanie mocy lasera, ponieważ wykrywanie skoków gwałtownie spada po przekroczeniu tego limitu.
4. Co 10-20 minut pozycje somatów neuronów są weryfikowane poprzez ponowne uzyskanie obrazu pełnoklatkowego. W razie potrzeby lokalizacje nagrywania są dostosowywane. Lokalizacje można dostosować dla wszystkich neuronów jednocześnie lub dla poszczególnych neuronów.

4. Rekonstrukcja czasów skoków na podstawie sygnałów fluorescencyjnych (Dekonwolucja)

1. Sygnały fluorescencyjne wynikające z aktywności neuronalnej często sumują się w czasie, ponieważ rozpad stanów przejściowych wapnia jest długi (kilkaset milisekund). Metoda dekonwolucji rekonstruuje czasy skoków i skoków na podstawie sygnałów fluorescencyjnych.
2. Aby określić najbardziej prawdopodobny ciąg kolców leżący u podstaw zarejestrowanego sygnału fluorescencji, porównuje się różne modele. W tym przypadku użyliśmy algorytmu genetycznego do określenia modelu - a tym samym ciągu kolców i czasów skoków - z maksymalnym prawdopodobieństwem.
3. W niejednorodnych populacjach neuronów sygnał wapniowy wywołany kłosem może się różnić między neuronami. Do nienadzorowanej analizy zbiorów danych zaprojektowaliśmy algorytm, który uwzględnia zmienność sygnału wapniowego wywołanego kłosem z neuronu na neuron
.
4. Aby uniknąć dużej liczby fałszywych alarmów, przydatne jest zawężenie dozwolonej amplitudy i stałej czasowej zaniku modelu sygnału wapnia wywołanego przez skok. Łączny rozkład amplitudy i stałej czasowej zaniku wywołanych pojedynczym kolcem stanów przejściowych wapnia rejestruje się w oddzielnym zestawie eksperymentów z tego samego typu neuronów w tych samych warunkach eksperymentalnych przy użyciu jednoczesnych zapisów elektrofizjologicznych i optycznych.
5. Aby uwzględnić powolne zmiany linii bazowej i zmniejszyć koszty obliczeniowe dekonwolucjonizacji, dłuższe nagrania są dzielone na kilka krótszych ścieżek trwających od 1 do 5 sekund.
6. Dla każdego neuronu i każdego nagrania algorytm dekonwolucji może testować dużą liczbę modeli (do 1 000 000 różnych modeli lub więcej). Aby przyspieszyć dekonwolucję, jeden eksperyment jest dekonwoluowany na maksymalnie 10 różnych komputerach równolegle.
7. Po dekonwolucji dane spajków są analizowane i sprawdzane. Histogram czasu okołobodźcowego, prawdopodobieństwo skoku i szybkość wypalania (średni skok na neuron) są obliczane w sposób zautomatyzowany.

5. Reprezentatywne wyniki

Skuteczne wykrycie skoku zależy od wysokiego stosunku sygnału do szumu zarejestrowanych fluorescencyjnych somatycznych sygnałów wapniowych. Samo zastosowanie wysokich współczynników wzbudzenia (duża moc lasera) może spowodować niekorzystny wpływ fotoefektów na materiał biologiczny (fotouszkodzenie). W skanowaniu o swobodnym dostępie dithered fotouszkodzenie objawia się spadkiem podstawowej fluorescencji i spadkiem sygnałów fluorescencji wapnia wywołanych przez kolce. Spadek sygnału wywołanego przez skoki może szybko spowodować niepowodzenie w wykrywaniu skoków. Istnieje tylko bardzo małe okno intensywności wzbudzenia, w którym wykrywanie skoków na podstawie sygnałów fluorescencyjnych jest wysokie. Na wyższym końcu to okno jest ograniczone przez fotouszkodzenia, na dolnym końcu sygnały fluorescencyjne mają niski stosunek sygnału do szumu. W przypadku neuronów korowych w ostrych wycinkach używamy mocy lasera, co skutkuje szybkością fotonów około 400 000-1 500 000 fotonów na sekundę podczas nagrywania na głębokości około 100 μm poniżej powierzchni warstwy. W przypadku korzystania ze wskaźnika o wysokim powinowactwie - tutaj Oregon Green 488 BAPTA - 1 - sygnał ten jest wystarczający do wykrycia pojedynczych skoków. Rysunek 3E przedstawia przykład sygnału fluorescencyjnego zarejestrowanego przy bardzo niskiej szybkości wzbudzenia, jeden przykład zapisu w oknie detekcji i jeden przy bardzo wysokim współczynniku wzbudzenia.

W porównaniu do innych technik rejestrowania aktywności neuronalnej z rozdzielczością pojedynczej komórki i pojedynczego skoku, skanowanie losowe z ditheredem może rejestrować z większej liczby neuronów z tej samej, lokalnej populacji i jest mniej inwazyjne, na przykład w porównaniu do nagrań tetrodowych/wieloelektrodowych. W ten sposób skanowanie o swobodnym dostępie może być wykorzystane do rejestrowania aktywności neuronalnej z wielu neuronów w celu pomiaru wzajemnych informacji sygnalizowanych przez aktywność ponadprogową⁶ (ryc. 4A), zmiany aktywności neuronalnej w populacji neuronów (plastyczność korowa) i propagację aktywności nadprogowej przez populacje neuronów¹⁴ (ryc. 4B)

Rysunek 1. Konstrukcja optyczna konfiguracji skanowania o dostępie swobodnym z ditheredem.

Rysunek 2. Wyrównanie i testowanie: rozkłady sygnałów fluorescencyjnych zarejestrowanych w różnych warunkach. A) Brak światła laserowego i niskie wzmocnienie fotopowielacza, B) Przy wyższym wzmocnieniu PMT, ale bez światła laserowego, rozkład jest szerszy ze względu na ciemny prąd fotopowielacza. C) Z włączonym laserem i nagranym z wysokim wzmocnieniem PMT. Różnica między rozkładami pokazanymi na rysunku B a tym rozkładem wskazywałaby, że światło wzbudzenia dociera do detektorów PMT. D) Rozkład sygnałów fluorescencyjnych zarejestrowanych przy dużym wzmocnieniu z somatów neuronów. Jeśli żadne inne źródło szumu nie przyczynia się do powstania, rozkład ten wynika tylko z szumu wystrzelonego fotonu.

Rysunek 3. A) Pełnoklatkowy obraz fluorescencyjny do wykrywania i wyboru pozycji somatów neuronów, B) Ścieżka skanowania jednego cyklu, C) Ilustracja zasady ditheringu; w każdej somie (okręgu) rejestrowanych jest kilka lokalizacji przed przeniesieniem wiązki do następnej somy, D) Ilustracja wyjścia dwóch kanałów D/A. Dla każdej somy neuronu rejestrowany jest sygnał fluorescencyjny z 4 różnych miejsc w każdej somie (s1-s4). Lokalizacja każdego punktu jest określona przez jego położenie x i y. Pozycje x i y dla wszystkich miejsc i wszystkich neuronów są przesyłane do przetwornika cyfrowo-analogowego w sposób sekwencyjny. Podczas gdy wiązka jest przenoszona między dwoma somatami neuronów, nie jest uzyskiwany żaden sygnał (ślepy). E) Przykłady sygnałów fluorescencyjnych. Zauważ, że każdy przykład pokazuje reakcję na jeden skok (mierzony za pomocą zapisu elektrofizjologicznego dołączonego do komórki).

Rysunek 4. Badanie funkcji kory mózgowej za pomocą skanowania o dostępie swobodnym z ditheredem. A) Pomiar wzajemnej informacji sygnalizowanej przez populacje neuronów. Górny obraz przedstawia mikrofotografię ostrego wycinka mózgu i dwóch pipet stymulacyjnych umieszczonych w tej samej kolumnie korowej w warstwie 4 (L4). Wykresy środkowe pokazują odpowiedzi neuronalne dla każdego powtórzenia bodźca. Dolny wykres przedstawia wzajemną informację Shannona sygnalizowaną przez zarejestrowaną populację neuronów. B) Pomiar propagacji ponadprogowej aktywności impulsowej (propagacji sygnału) między populacjami neuronów korowych. Górny wykres ilustruje projekt eksperymentalny, środkowy obraz pokazuje obraz fluorescencyjny, linie przerywane wskazują granice lufy, dolny wykres pokazuje wykryte skoki w odpowiedzi na elektryczną stymulację włókien wzgórzowo-korowych (trójkątów).

Dyskusja

Skanowanie o swobodnym dostępie dithereed pośrednio wykrywa ponadprogową aktywność impulsową wynikającą ze wzrostu wewnątrzkomórkowego wapnia somatycznego związanego z każdym skokiem w somacie neuronów. Wzrost wewnątrzkomórkowego wapnia jest wykrywany przez fluorescencyjne barwniki wapniowe. Ograniczenia skanowania o dostępie swobodnym z rozdrobnieniem wynikają w dużej mierze z ograniczonego stosunku sygnału do szumu sygnałów fluorescencji wapnia. Stosunek sygnału do szumu jest z kolei ograniczony przez fotouszkodzenia, ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Komponenty optyczne są wymienione w kolejności, zaczynając od lasera
Titan:Sapphire Laser	Coherent Inc.	Chameleon Ultra 2	Zalecana wysoka moc wyjściowa (> 2W przy 900 nm)
Soczewka achromatyczna f = 30 mm	Thor labs	AC254-030-B	Powłoka antyrefleksyjna (AR) dla 650-1050 nm
Soczewka achromatyczna f = 100 mm	Thor labs	AC254-100-B	Soczewka AR 650-1050 nm
f = 75 mm	Thor labs	LA1608-B	AR 650-1050 nm
obiektyw f = 175 mm	Thor labs	LA1229-B	AR 650-1050 nm
Soczewka achromatyczna f = 300 mm	Thor labs	AC254-300-B	AR 650-1050 nm
Soczewka achromatyczna f = 100 mm	Thor labs	AC254-100-B	AR 650-1050 nm
Soczewka achromatyczna f = 100 mm	Thor labs	AC254-100-B	AR 650-1050 nm
Deflektory akustyczno-optyczne	Intraaction Corp	ATD 6510CD2
Odblaskowa siatka dyfrakcyjna	Newport	53-011R	100 rowków/mm dla ADED o szerokości pasma 65 MHz i kącie skanowania 45 mrad
21,6 mm pryzmatów Brewstera	Lambda Research Optics Inc.	IBP21.6SF10
Kolorowe szkło	Schott	BG-39
Lustro dichroiczne	Chroma Technology Corp	Z532RDC
Moduły fotopowielacza	Hamamatsu	H9305-03
Płyta DAC-ADC	National Instruments	PCI-6115
Oregon Green 488 Bapta-1 AM	Invitrogen	O-6807