Zrozumienie funkcji ośrodkowego układu nerwowego kręgowców wymaga rejestracji aktywności wielu neuronów, ponieważ funkcje kory powstają na poziomie populacji neuronów. Opisujemy tutaj optyczną metodę rejestracji nadprogowej aktywności neuronalnej z rozdzielczością pojedynczych komórek i pojedynczych impulsów (spikes), zwaną skanowaniem z losowym dostępem z ditherowaniem (dithered random-access scanning). Metoda ta rejestruje somatyczne sygnały fluorescencji wapnia z maksymalnie 100 neuronów z wysoką rozdzielczością czasową. Algorytm maksymalnej wiarygodności dekonwoluje podstawową nadprogową aktywność neuronalną z somatycznych sygnałów fluorescencji wapnia. Metoda ta niezawodnie wykrywa impulsy z wysoką wydajnością detekcji i niskim wskaźnikiem wyników fałszywie dodatnich i może być stosowana do badania populacji neuronów in vitro oraz in vivo.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Optyczna rejestracja ponadprogowej aktywności neuronalnej z rozdzielczością pojedynczych komórek i pojedynczych impulsów
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Przekazywanie informacji w ośrodkowym układzie nerwowym kręgowców często odbywa się za pomocą populacji neuronów, a nie pojedynczych komórek. Podobnie propagacja aktywności impulsowej powyżej progu pobudzenia angażuje populacje neuronów. Badania empiryczne bezpośrednio dotyczące funkcji kory wymagają zatem rejestracji aktywności populacji neuronów z wysoką rozdzielczością. W niniejszej pracy opisujemy metodę optyczną oraz algorytm dekonwolucji służące do rejestrowania aktywności neuronalnej do 100 neuronów z rozdzielczością pojedynczej komórki i pojedynczego impulsu. Metoda ta opiera się na detekcji przejściowych wzrostów wewnątrzkomórkowego stężenia wapnia w somie, związanych z elektrycznymi impulsami (potencjałami czynnościowymi) powyżej progu pobudzenia w neuronach korowych. Wysoka rozdzielczość czasowa rejestracji optycznych jest osiągana dzięki technice szybkiego skanowania z dostępem swobodnym przy użyciu deflektorów akustyczno-optycznych (AODs)1. Dwufotonowe wzbudzanie barwnika wrażliwego na wapń zapewnia wysoką rozdzielczość przestrzenną w nieprzezroczystej tkance mózgowej2. Rekonstrukcja impulsów z fluorescencyjnych pomiarów wapnia jest realizowana za pomocą metody maksymalnej wiarygodności. Równoczesne rejestracje elektrofizjologiczne i optyczne wskazują, że nasza metoda niezawodnie wykrywa impulsy (wydajność detekcji impulsów >97%), charakteryzuje się niską częstotliwością fałszywie dodatnich detekcji impulsów (< 0,003 impulsów/s) oraz wysoką precyzją czasową (około 3 ms) 3. Ta optyczna metoda detekcji impulsów może być stosowana do rejestracji aktywności neuronalnej in vitro oraz u znieczulonych zwierząt in vivo3,4.
Protokół
1. Układ optyczny (Rysunek 1)
- Do wzbudzenia dwufotonowego wykorzystuje się impulsowy system laserowy w podczerwieni z impulsami femtosekundowymi. Wymagana jest wysoka moc wyjściowa lasera (w niektórych przypadkach >2W przy długości fali 890 nm), aby zrekompensować duże straty wprowadzane przez komponenty optyczne układu.
- System prechirpera składający się z dwóch pryzmatów nadaje impulsom laserowym ujemną dyspersję prędkości grupowej (GVD) przed deflektorami akustooptycznymi (AOD), aby skompensować dyspersję czasową wprowadzaną przez AOD1.
- Dwa AOD o dużych aperturach (10 mm dla obiektywu imersyjnego wodnego 40x o NA 0,8) odchylają wiązkę laserową w dwóch wymiarach.
- Refleksyjna siatka dyfrakcyjna z 100 rowkami/mm jest umieszczona 13 cm za AOD, aby skompensować dyspersję przestrzenną wprowadzaną przez AOD podczas korzystania z krótkich impulsów laserowych.
- Wiązka laserowa jest kierowana za pomocą dwóch teleskopów przekaźnikowych do portu kamery mikroskopu pionowego.
- Przysłony irysowe są rozmieszczone w regularnych odstępach w celu wyrównania komponentów optycznych.
- Dichroiczny dzielnik wiązki przed obiektywem przepuszcza podczerwone światło wzbudzenia do preparatu i odbija światło fluorescencyjne z preparatu na detektor.
- Detektory epi- i transfluorescencji (fotopowielacze, PMTs) zbierają sygnał fluorescencji poprzez obiektyw oraz – jeśli dotyczy – przez kondensator.
- Kolorowe filtry szklane (BG-39, 3-5 mm) są umieszczone przed detektorami, aby zapobiec przedostawaniu się światła wzbudzenia do detektorów.
- Kąty odchylenia AOD są sterowane przez komputer wyposażony w kartę przetwornika cyfrowo-analogowego (częstotliwość taktowania 156,25 kHz), która z kolei steruje oscylatorami sterowanymi napięciowo.
- Sygnał z fotopowielaczy jest przekazywany przez filtr dolnoprzepustowy Butterwortha (częstotliwość odcięcia 100 kHz) i digitalizowany przez przetwornik analogowo-cyfrowy (częstotliwość taktowania 156,25 kHz) przed zapisaniem w komputerze do analizy.
- Wyrównanie i szum elektryczny są testowane poprzez rejestrację rozkładu sygnałów fluorescencji z i bez światła laserowego, przy niskim i wysokim wzmocnieniu fotopowielaczy, a także z i bez wskaźnika. Skaner jest prawidłowo skonfigurowany i ekranowany, gdy szerokość rozkładu sygnałów fluorescencji przy wysokim wzmocnieniu i ze wskaźnikiem jest znacznie większa niż szerokości pozostałych rozkładów sygnałów fluorescencji (Rycina 2).
2. Procedury eksperymentalne
- Skanowanie z losowym dostępem z ditheringiem opiera się na detekcji wewnątrzkomórkowych wzrostów poziomu wapnia. Dużą liczbę neuronów można zabarwić poprzez iniekcję bolusową estrowej formy wskaźnika wapnia (na przykład Oregon Green 488 Bapta-1 AM) do tkanki nerwowej5.
- Z ciała komórkowego każdego neuronu rejestrowanych jest kilka lokalizacji, każda przez krótki czas („dithering”, 4 lokalizacje, 6,4 μsec na każdą lokalizację = 25,6 μsec czasu rejestracji dla każdego neuronu w każdym cyklu, Rysunek 3C). W celu wyboru interesujących neuronów pozyskiwana jest pełna klatka składająca się z 256x256 pikseli (Rysunek 3A). Centrum ciała komórkowego każdego neuronu do rejestracji jest wybierane ręcznie na tym obrazie. Oprogramowanie sterujące automatycznie dodaje trzy punkty w odległości 2 μm wokół tego centrum.
- W każdym cyklu sygnał fluorescencji jest rejestrowany z każdego z 40 neuronów (Rysunek 3B). Proces ten jest powtarzany przez cały czas trwania jednej rejestracji (rejestracja 5 sec = 3 255 cykli, 1 cykl = 1,536 msec).
3. Narzędzia programowe online w celu zmaksymalizowania wydajności detekcji kolców
- Wykrywanie impulsów (spike'ów) na podstawie somatycznych sygnałów fluorescencyjnych wapnia opiera się na wysokim stosunku sygnału do szumu (S/N) tych sygnałów. Wysoki S/N można osiągnąć poprzez zwiększenie intensywności wzbudzenia. Intensywność wzbudzenia można jednak zwiększać tylko do określonego limitu ze względu na fotouszkodzenia. Wykrywanie impulsów jest skuteczne jedynie w bardzo wąskim zakresie intensywności wzbudzenia, w którym sygnały fluorescencyjne charakteryzują się wysokim S/N, a jednocześnie obserwuje się bardzo niewielkie fotouszkodzenia3. Aby upewnić się, że rejestrowane sygnały mieszczą się w zakresie wysokiej skuteczności wykrywania impulsów podczas pomiarów, monitorujemy tempo emisji fotonów (patrz równanie 3.2) oraz spadek fluorescencji bazowej przy użyciu analizy online.
- Przybliżone tempo emisji fotonów na neuron oblicza się z krótkiego okna czasowego (100-200 ms) szumu bazowego. Liczbę fotonów (Nλ) oraz tempo emisji fotonów (λ = Nλ / Δt) oblicza się z wartości fluorescencji poprzez dopasowanie rozkładu (σ) względnych zmian fluorescencji do następującego równania:
Równanie to przedstawia rozkład Poissona dla szumu śrutowego fotonów po zmianie zmiennej na względną zmianę fluorescencji: ΔF/F = (G*Nλ(t)-G*Nλ,0)/G*Nλ,0, gdzie G oznacza całkowite wzmocnienie fotopowielacza i wszystkich pozostałych komponentów elektronicznych. Należy zauważyć, że równanie to nie określa poprawnie liczby wykrytych fotonów w pomiarach in vivo, ponieważ oprócz szumu śrutowego fotonów występują inne źródła szumu (artefakty ruchowe). Niemniej jednak równanie to jest przydatne w pomiarach in vivo do szacowania poziomu szumu.
- Fluorescencję bazową oblicza się z tego samego okna czasowego i przedstawia jako funkcję czasu lub prób. Średni spadek poziomu bazowego utrzymuje się poniżej 0,0002/sec poprzez regulację mocy lasera, ponieważ detekcja impulsów gwałtownie spada po przekroczeniu tej granicy.
- Co 10-20 min pozycje somat neuronów są weryfikowane poprzez ponowną akwizycję pełnego obrazu klatki. W razie potrzeby koryguje się miejsca rejestracji. Lokalizacje można dostosować dla wszystkich neuronów jednocześnie lub dla poszczególnych neuronów.
4. Rekonstrukcja czasu wystąpienia potencjałów czynnościowych z sygnałów fluorescencyjnych (dekonwolucja)
- Sygnały fluorescencji wynikające z aktywności neuronalnej często sumują się w czasie, ponieważ zanik przejściowych zmian stężenia wapnia jest długotrwały (kilkaset ms). Metoda dekonwolucji pozwala na odtworzenie impulsów oraz momentów ich wystąpienia na podstawie sygnałów fluorescencji.
- Aby wyznaczyć najbardziej prawdopodobny ciąg impulsów leżący u podstaw zarejestrowanego sygnału fluorescencji, porównuje się różne modele. W tym przypadku zastosowano algorytm genetyczny w celu wyłonienia modelu – a tym samym ciągu impulsów i momentów ich wystąpienia – o maksymalnym prawdopodobieństwie.
- W niejednorodnych populacjach neuronów sygnał wapniowy wywołany impulsem może różnić się między poszczególnymi komórkami. Do nienadzorowanej analizy zestawów danych zaprojektowano algorytm, który uwzględnia zmienność sygnału wapniowego wywołanego impulsem w zależności od neuronu.
- Aby uniknąć dużej liczby fałszywie dodatnich detekcji, użyteczne jest ograniczenie dopuszczalnej amplitudy oraz stałej czasu zaniku w modelu sygnału wapniowego wywołanego impulsem. Wspólny rozkład amplitudy i stałej czasu zaniku przejściowych zmian stężenia wapnia wywołanych pojedynczym impulsem jest rejestrowany w oddzielnym zestawie eksperymentów na tym samym typie neuronów, w tych samych warunkach doświadczalnych, przy użyciu jednoczesnych pomiarów elektrofizjologicznych i optycznych.
- Aby uwzględnić powolne zmiany linii bazowej oraz zmniejszyć koszty obliczeniowe dekonwolucji, dłuższe nagrania są dzielone na kilka krótszych śladów o długości 1-5 sec.
- Dla każdego neuronu i każdego nagrania algorytm dekonwolucji może testować dużą liczbę modeli (do 1 000 000 różnych modeli lub więcej). W celu przyspieszenia procesu, dekonwolucja jednego eksperymentu jest przeprowadzana równolegle na maksymalnie 10 różnych komputerach.
- Po dekonwolucji dane dotyczące impulsów są analizowane i weryfikowane. W sposób zautomatyzowany obliczany jest histogram czasu peri-stymulacyjnego, prawdopodobieństwo wystąpienia impulsu oraz częstotliwość wyładowań (średnia liczba impulsów na neuron).
5. Reprezentatywne wyniki
Skuteczne wykrywanie impulsów (spike'ów) zależy od wysokiego stosunku sygnału do szumu rejestrowanych sygnałów fluorescencji wapniowej w somie. Samo stosowanie wysokich częstotliwości wzbudzenia (wysokiej mocy lasera) może prowadzić do negatywnego wpływu efektów fotochemicznych na materiał biologiczny (fotouszkodzeń). W skanowaniu z losowym dostępem z ditherem fotouszkodzenia objawiają się spadkiem fluorescencji bazowej oraz zmniejszeniem sygnałów fluorescencji wapniowej wywoływanych przez impulsy. Spadek sygnału wywołanego impulsem może szybko doprowadzić do braku możliwości wykrycia spike'ów. Istnieje tylko bardzo wąski zakres intensywności wzbudzenia, w którym skuteczność wykrywania impulsów z sygnałów fluorescencji jest wysoka. Górna granica tego zakresu jest ograniczona przez fotouszkodzenia, natomiast dolna przez niski stosunek sygnału do szumu sygnałów fluorescencji. Dla neuronów kory w skrawkach ostrych stosujemy moc lasera skutkującą natężeniem strumienia fotonów na poziomie około 400 000-1 500 000 photon/sec podczas rejestracji w głębokości około 100 μm poniżej powierzchni skrawka. Przy zastosowaniu wskaźnika o wysokim powinowactwie — w tym przypadku Oregon Green 488 BAPTA - 1 — sygnał ten jest wystarczający do wykrycia pojedynczych impulsów. Rycina 3E przedstawia przykład sygnału fluorescencji zarejestrowanego przy bardzo niskim stopniu wzbudzenia, przykład rejestracji w obrębie okna detekcji oraz przykład przy bardzo wysokim stopniu wzbudzenia.
W porównaniu z innymi technikami rejestracji aktywności neuronalnej z rozdzielczością pojedynczych komórek i pojedynczych impulsów, skanowanie z losowym dostępem z ditherowaniem (dithered random-access scanning) pozwala na rejestrację sygnałów z większej liczby neuronów z tej samej, lokalnej populacji i jest mniej inwazyjne, na przykład w porównaniu z rejestracjami za pomocą tetrod lub wieloelektrod. W związku z tym skanowanie z losowym dostępem z ditherowaniem może być wykorzystywane do rejestracji aktywności wielu neuronów w celu pomiaru informacji wzajemnej przekazywanej przez aktywność ponadprógową6 (Rycina 4A), zmian aktywności neuronalnej w populacji neuronów (plastyczność korowa) oraz propagacji aktywności ponadprogowej przez populacje neuronów14 (Rycina 4B)
Rycina 1. Projekt optyczny układu skanowania z ditherowanym dostępem swobodnym.
Rycina 2. Wyrównanie i testowanie: rozkłady sygnałów fluorescencji zarejestrowane w różnych warunkach. A) Brak światła laserowego i niskie wzmocnienie fotopowielacza, B) Przy wyższym wzmocnieniu PMT, ale bez światła laserowego, rozkład jest szerszy ze względu na prąd ciemny fotopowielacza. C) Przy włączonym laserze i rejestracji przy wysokim wzmocnieniu PMT. Różnica między rozkładami pokazanymi w B a tym rozkładem wskazywałaby, że światło wzbudzenia dociera do detektorów PMT. D) Rozkład sygnałów fluorescencji zarejestrowanych przy wysokim wzmocnieniu z somat neuronów. Jeśli nie występują inne źródła szumów, rozkład ten wynika wyłącznie z szumu śrutowego fotonów.
Rysunek 3. A) Pełny obraz fluorescencyjny służący do wykrywania i wyboru pozycji somat neuronów, B) Ścieżka skanowania jednego cyklu, C) Ilustracja zasady ditheringu; w każdym somacie (okrąg) rejestrowanych jest kilka lokalizacji przed przesunięciem wiązki do następnego somatu, D) Ilustracja wyjścia dwóch kanałów C/A. Dla każdego somatu neuronu sygnał fluorescencyjny jest rejestrowany z 4 różnych punktów w każdym somacie (s1-s4). Lokalizacja każdego punktu jest określona przez jego pozycję x i y. Pozycje x i y dla wszystkich punktów i wszystkich neuronów są przesyłane do przetwornika cyfrowo-analogowego w sposób sekwencyjny. Podczas przemieszczania wiązki między dwoma somatami neuronów żaden sygnał nie jest pozyskiwany (przerwa). E) Przykłady sygnałów fluorescencyjnych. Należy zauważyć, że każdy przykład pokazuje odpowiedź na jeden potencjał czynnościowy (zmierzony za pomocą elektrofizjologicznej rejestracji z metodą cell-attached).
Rycina 4. Badanie funkcji kory mózgowej z wykorzystaniem skanowania z losowym dostępem i ditherowaniem. A) Pomiar informacji wzajemnej przekazywanej przez populacje neuronów. Górny obraz przedstawia fotomikrografię ostrego skrawka mózgu oraz dwie pipety stymulacyjne umieszczone w tej samej kolumnie korowej w warstwie 4(L4). Wykresy w części środkowej pokazują odpowiedzi neuronalne dla każdego powtórzenia bodźca. Dolny wykres przedstawia informację wzajemną Shannona przekazywaną przez rejestrowaną populację neuronów. B) Pomiar propagacji aktywności kolcowej powyżej progu (propagacja sygnału) między populacjami neuronów korowych. Górny wykres ilustruje schemat doświadczenia, środkowy obraz przedstawia obraz fluorescencyjny, linie przerywane wskazują granice beczułek (barrels), a dolny wykres pokazuje wykryte kolce w odpowiedzi na stymulację elektryczną włókien wzgórzowo-korowych (trójkąty).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Skanowanie z losowym dostępem z ditherowaniem (dithered random-access scanning) pośrednio wykrywa aktywność impulsacyjną powyżej progu na podstawie wzrostów wewnątrzkomórkowego wapnia w somie, związanych z każdym impulsem w somie neuronu. Wzrosty wewnątrzkomórkowego wapnia są wykrywane za pomocą fluorescencyjnych barwników wapniowych. Ograniczenia skanowania z losowym dostępem z ditherowaniem wynikają w dużej mierze z ograniczonego stosunku sygnału do szumu sygnałów fluorescencji wapnia. Stosunek sygnału do szumu jest z ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Dziękujemy dr. Randy'emu Chitwoodowi za krytyczne przeczytanie rękopisu. Praca ta była wspierana przez granty Whitehall Foundation oraz Alfred P. Sloan Foundation przyznane dla HJK.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Komponenty optyczne wymieniono w kolejności, zaczynając od lasera | |||
| Laser tytanowo-szafirowy | Coherent Inc. | Chameleon Ultra 2 | Zalecana wysoka moc wyjściowa (>2W przy 900 nm) |
| Soczewka achromatyczna f = 30 mm | Thor labs | AC254-030-B | Powłoka antyrefleksyjna (AR) dla 650-1050 nm |
| Soczewka achromatyczna f = 100 mm | Thor labs | AC254-100-B | AR 650-1050 nm |
| soczewka f = 75 mm | Thor labs | LA1608-B | AR 650-1050 nm |
| soczewka f = 175 mm | Thor labs | LA1229-B | AR 650-1050 nm |
| Soczewka achromatyczna f = 300 mm | Thor labs | AC254-300-B | AR 650-1050 nm |
| Soczewka achromatyczna f = 100 mm | Thor labs | AC254-100-B | AR 650-1050 nm |
| Soczewka achromatyczna f = 100 mm | Thor labs | AC254-100-B | AR 650-1050 nm |
| Akustyczno-optyczne odchylacze | Intraaction Corp | ATD 6510CD2 | |
| Refleksyjna siatka dyfrakcyjna | Newport | 53-011R | 100 rowków/mm dla AOD o szerokości pasma 65 MHz i kącie skanowania 45 mrad |
| Pryzmaty Brewstera 21,6 mm | Lambda Research Optics Inc. | IBP21.6SF10 | |
| Szkło kolorowe | Schott | BG-39 | |
| Lustro dichroiczne | Chroma Technology Corp | Z532RDC | |
| Moduły fotopowielaczy | Hamamatsu | H9305-03 | |
| Karta DAC-ADC | National Instruments | PCI-6115 | |
| Oregon Green 488 Bapta-1 AM | Invitrogen | O-6807 |
Bibliografia
- Iyer, V., Hoogland, T. M., Saggau, P. Fast functional imaging of single neurons using random-access multiphoton (RAMP) microscopy. J. Neurophysiol. 95, 535-545 (2006).
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248, 73(1990).
- Ranganathan, G. N., Koester, H. J. Optical recording of neuronal spiking activity from unbiased populations of neurons with high spike detection efficiency and high temporal precision. J. Neurophysiol. 104, 1812-1824 (2010).
- Grewe, B. F., Langer, D., Kasper, H., Kampa, B. M., Helmchen, F. High-speed in vivo calcium imaging reveals neuronal network activity with near-millisecond precision. Nat. Methods. 7, 399-405 (2010).
- Stosiek, C., Garaschuk, O., Holthoff, K., Konnerth, A. In vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 7319-7324 (2003).
- Pita-Almenar, J. D., Ranganathan, G. N., Koester, H. J. Impact of cortical plasticity on information signaled by populations of neurons in the cerebral cortex. J. Neurophysiol. 106, 1118-1124 (2011).
- Kerr, J. N., Greenberg, D., Helmchen, F. Imaging input and output of neocortical networks in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 14063-14068 (2005).
- Lin, B. J., Chen, T. W., Schild, D. Cell type-specific relationships between spiking and [Ca2+]i in neurons of the Xenopus tadpole olfactory bulb. J. Physiol. 582, 163-175 (2007).
- Zeng, S., Lv, X., Zhan, C., Chen, W. R. Simultaneous compensation for spatial and temporal dispersion of acousto-optical deflectors for two-dimensional scanning with a single prism. Opt. Lett. 31, 1091-1093 (2006).
- Otsu, Y., Bormuth, V., Wong, J., Mathieu, B. Optical monitoring of neuronal activity at high frame rate with a digital random-access multiphoton (RAMP) microscope. J. Neurosci. Methods. 173, 259-270 (2008).
- Vogelstein, J. T., Watson, B. O., Packer, A. M., Yuste, R. Spike inference from calcium imaging using sequential Monte Carlo methods. Biophys. J. 97, 636-655 (2009).
- Yaksi, E., Friedrich, R. W. Reconstruction of firing rate changes across neuronal populations by temporally deconvolved Ca2+ imaging. Nat. Methods. 3, 377-383 (2006).
- Hendel, T., Mank, M., Schnell, B., Griesbeck, O. Fluorescence changes of genetic calcium indicators and OGB-1 correlated with neural activity and calcium in vivo and in vitro. J. Neurosci. 28, 7399-7411 (2008).
- Ranganathan, G. N., Koester, H. J. Correlations decrease with propagation of spiking activity in the mouse barrel cortex. Front Neural Circuits. 5, 8(2011).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
