Funkcjonalne obrazowanie neuronaukowe z wykorzystaniem ultrasonicznego otwierania bariery krew-mózg i MRI z wzmocnieniem manganem

Podsumowanie

Opisano technikę szerokiego otwierania bariery krew-mózg u myszy z wykorzystaniem mikropęcherzyków i ultradźwięków. Dzięki zastosowaniu tej metody do mózgu myszy można wprowadzić mangan. Ponieważ mangan jest środkiem kontrastowym do MRI, który kumuluje się w zdepolaryzowanych neuronach, podejście to umożliwia obrazowanie aktywności neuronalnej.

Streszczenie

Mimo że myszy są dominującym systemem modelowym w badaniach nad genetycznymi i molekularnymi podstawami neuronauki, funkcjonalne obrazowanie neuronów u myszy pozostaje wyzwaniem technicznym. Jedną z metod, która znalazła zastosowanie w mapowaniu aktywności neuronalnej u gryzoni, jest MRI z wzmocnieniem manganem indukowanym aktywacją (AIM MRI) ^1-5. W metodzie AIM MRI Mn²⁺ pełni rolę analogu wapnia i gromadzi się w zdepolaryzowanych neuronach ^6,7. Ponieważ Mn²⁺ skraca czas T₁ tkanki, obszary o podwyższonej aktywności neuronalnej wykazują wzmocnienie sygnału w obrazowaniu MRI. Co więcej, Mn²⁺ powoli usuwa się z aktywowanych obszarów, dzięki czemu stymulację można przeprowadzić poza magnesem przed rozpoczęciem obrazowania, co zapewnia większą elastyczność eksperymentalną. Jednakże fakt, że Mn²⁺ nie przenika łatwo przez barierę krew-mózg (BBB), sprawia, że konieczność otwarcia BBB ograniczyła zastosowanie AIM MRI, szczególnie w przypadku myszy.

Jednym z narzędzi służących do otwierania BBB są ultradźwięki. Choć mogą być one potencjalnie szkodliwe, w przypadku podania ultradźwięków w połączeniu z wypełnionymi gazem mikropęcherzykami (tj. środkami kontrastowymi do USG), ciśnienie akustyczne wymagane do otwarcia BBB jest znacznie niższe. Taka kombinacja ultradźwięków i mikropęcherzyków może być wykorzystana do niezawodnego otwierania BBB bez powodowania uszkodzeń tkanki ^8-11.

W niniejszym opracowaniu przedstawiono metodę wykonywania AIM MRI z wykorzystaniem mikropęcherzyków i ultradźwięków w celu otwarcia BBB. Po dożylnym wstrzyknięciu mikropęcherzyków perflutrenu, na ogoloną głowę myszy przez 3 minuty przykładana jest nieskupiona wiązka ultradźwięków impulsowych. Dla uproszczenia tę technikę otwierania BBB za pomocą mikropęcherzyków i ultradźwięków (BOMUS) określamy mianem BOMUS ¹². Po wykorzystaniu BOMUS do otwarcia BBB w obu półkulach mózgu, do całego mózgu myszy podaje się mangan. Po stymulacji eksperymentalnej lekko zsedowanych myszy, AIM MRI jest wykorzystywane do mapowania odpowiedzi neuronalnej.

Aby zademonstrować to podejście, w niniejszej pracy wykorzystano BOMUS oraz AIM MRI do mapowania jednostronnej stymulacji mechanicznej wibrysów u lekko zsedowanych myszy ¹³. Ponieważ BOMUS może otwierać BBB w obu półkulach, niestymulowana strona mózgu służy jako kontrola dla nieswoistej stymulacji tła. Wynikowa mapa aktywacji 3D jest zgodna z opublikowanymi przedstawieniami regionów wibrysów w korze pola beczułkowego ¹⁴. Ultradźwiękowe otwieranie BBB jest szybkie, nieinwazyjne i odwracalne; w związku z tym podejście to nadaje się do badań wysokoprzepustowych i/lub podłużnych u czuwających myszy.

Protokół

1. Montaż i kalibracja systemu ultradźwiękowego

1. Układ ultradźwiękowy składa się z jednoprzetwornikowego przetwornika ultradźwiękowego o średnicy wystarczającej do pokrycia mózgu myszy i częstotliwości centralnej z zakresu 2 MHz. Przetwornik jest sterowany przez wzmacniacz mocy 50 dB, który jest połączony z generatorem sygnałów wytwarzającym sekwencję impulsów ultradźwiękowych.
2. Aby skalibrować ciśnienie akustyczne układu ultradźwiękowego, należy użyć hydrofonu w celu ustalenia zależności między przyłożonym napięciem a wynikowym ciśnieniem akustycznym. Umieść przetwornik w zbiorniku z wodą nad hydrofonem. Przyłóż do przetwornika prosty impuls (np. sinusoidę o długości 10 cykli o częstotliwości przetwornika z częstotliwością repetycji impulsów 10 Hz). Użyj trójosiowego stołu translacyjnego, aby znaleźć odpowiedź szczytową, która powinna znajdować się w centrum wiązki ultradźwiękowej w naturalnej ogniskowej przetwornika (około 60 mm dla naszego przetwornika o średnicy 13 mm i częstotliwości 2,15 MHz).
3. Wykonaj kilka pomiarów dla zakresu napięć wejściowych (np. 50-400 mV_pp), aby zweryfikować liniowość układu. Wykorzystaj prostą regresję liniową do oszacowania zależności między napięciem wejściowym a ciśnieniem akustycznym. W naszym układzie napięcia wejściowe 258 i 167 mV_pp odpowiadały szczytowym ujemnym ciśnieniom akustycznym wynoszącym odpowiednio 0,52 i 0,36 MPa.
4. Zaprogramuj generator sygnałów tak, aby wytwarzał sekwencję impulsów ultradźwiękowych składającą się z paczek impulsów sinusoidalnych o częstotliwości przetwornika, z 50000 cyklami na paczkę i okresem paczki wynoszącym 64 ms. Na podstawie pomiarów kalibracyjnych ustaw amplitudę impulsu tak, aby generować szczytowe ujemne ciśnienie akustyczne 0,36 MPa w centrum naturalnej ogniskowej przetwornika.

2. Przygotowanie odczynników

1. Rozpuścić tetrachydrat chlorku manganu (MnCl₂·4H₂O) w sterylnej wodzie do stężenia 100 mM (300 mOsM), a następnie poddać sterylizacji przez filtrowanie.
2. Przygotować lipidowe mikrosfery perflutrenowe poprzez „aktywację” fiolki w mieszalniku dostarczonym przez producenta przez 45 s. W dniu przeprowadzania eksperymentów pojedynczą fiolkę można aktywować raz na początku dnia i używać bez ponownej aktywacji przez resztę dnia.
3. Bezpośrednio przed podaniem mikrosfer wstrząsnąć fiolką ręcznie przez 1 min, aby resuspender mikrosfery. Podczas pobierania mikropęcherzyków z fiolki nie należy wstrzykiwać do niej powietrza z otoczenia, ponieważ prowadzi to do degradacji pozostałych mikropęcherzyków. Pozostawić fiolkę poza lodówką aż do ostatniego użycia w danym dniu, a następnie przechowywać ją w lodówce. Przechowywane w ten sposób pojedyncze opakowanie może być wykorzystywane przez kilka dni. Przed pierwszym użyciem w kolejnych dniach ponowić aktywację przechowywanej fiolki w mieszalniku.

3. Przygotowanie zwierząt

1. Zanurz zwierzęta w narkozie przy użyciu izofluranu podawanego przez stożek nosowy. Aparatura stożka nosowego powinna być zaprojektowana tak, aby precyzyjnie i niezawodnie utrwalać głowę zwierzęcia w tej samej pozycji za każdym razem. Nasze urządzenie ¹⁵ utrzymuje głowę w pozycji „płaskiej czaszki” (tj. grzbietowa powierzchnia czaszki jest pozioma), stosowanej w atlasie mózgu Paxinosa ¹⁶. Titruj środek znieczulający tak, aby utrzymać częstotliwość oddychania między 85 a 125 oddechami na minutę. Utrzymuj temperaturę ciała za pomocą lampy grzewczej lub nadmuchiwanego powietrza. Chroń oczy za pomocą środka nawilżającego.
2. Usuń włosy ze skóry głowy myszy za pomocą trymera elektrycznego.
3. Wprowadź cewnik do żyły ogonowej oraz cewnik doprzewnowy (IP). W przypadku badań z przeżyciem należy zastosować odpowiednią technikę sterylną; umieszczenie cewnika IP zaprezentowane w filmie do niniejszego artykułu jest odpowiednie wyłącznie dla eksperymentów bez przeżycia.
4. Wykonaj wszelkie dodatkowe przygotowania wymagane do eksperymentu stymulacji neuronowej. W przypadku mapowania stymulacji wibrissae w korze pola beczułkowego, użyj mikroskopu stereoskopowego i nożyczek mikrochirurgicznych, aby odciąć wibrissae jak najbliżej powierzchni skóry, nie drażniąc mieszka włosowego ani otaczającej skóry.
5. Nałóż żel ultradźwiękowy na skórę głowy, a następnie opuść na głowę kolumnę wody ograniczoną cienką plastikową folią (np. worek na śmieci o grubości 7,6 μm). Przez kolumnę wody wprowadź patyczek z watą, aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza uwięzione w żelu ultradźwiękowym. Ustaw przetwornik ultradźwiękowy w jego naturalnej odległości ogniskowej (58 mm) bezpośrednio nad mózgiem myszy w kolumnie wody i przetrzyj przetwornik opuszką palca, aby usunąć wszelkie uwięzione pęcherzyki powietrza.

4. Otwieranie bariery krew-mózg za pomocą mikropęcherzyków i ultradźwięków (BOMUS)

1. Wykonaj zastrzyk domięśniowy roztworu manganu w dawce 0,5 mmol/kg IP. Zaślep cewnik dosytnieniowy, aby mangan nie wyciekł, i odczekaj 10 minut w celu umożliwienia jego dystrybucji (Rysunek 1).
2. Aby otworzyć barierę krew-mózg (BBB), podaj 30 μL lipidowych mikrosfer perflutrenu (aktywowane DEFINITY) przez cewnik w żyle ogonowej, jednocześnie uruchamiając sekwencję impulsów ultradźwiękowych. Kontynuuj sonikację przez 3 minuty.

5. Stymulacja neuronów

1. Przed rozpoczęciem stymulacji neuronalnej należy odczekać około 40 minut, aż poziomy Mn²⁺ w mózgu się ustabilizują. W ten sposób można odróżnić gwałtowny wzrost wzmocnienia bazowego wynikający z dyfuzji Mn²⁺ przez barierę krew-mózg od subtelnego różnicowego wzmocnienia spowodowanego stymulacją. Następnie należy rozpocząć stymulację zgodnie z wybranym paradygmatem (Rycina 1).
2. W przypadku stymulacji wibrys należy wyłączyć izofluran i zdjąć stożek nosowy. Miękkim pędzlem artystycznym należy wykonywać ręcznie koliste ruchy (1-5 Hz) przez układ wibrys w odległości około 2-5 mm od skóry. Stymulację należy kontynuować przez 90 min. Mangan wykazuje działanie sedatywne, co umożliwia nieskrępowaną stymulację zwierzęcia. Jeśli zwierzę stanie się niespokojne, należy podać 5% izofluranu za pomocą stożka nosowego przez około 15 sekund.

6. Obrazowanie metodą rezonansu magnetycznego

1. Po stymulacji wznowić znieczulenie za pomocą maski nosowej. Należy kontynuować utrzymywanie temperatury ciała oraz miareczkować poziom izofluranu, aby utrzymać częstotliwość oddychania w zakresie od 85 do 125 oddechów na minutę.
2. Umieścić mysz w cewce do obrazowania MR i przenieść do systemu MRI. Wykonać wysokorozdzielcze trójwymiarowe obrazy MR ważone T₁. Przykładowo, należy zastosować sekwencję 3D spoiled gradient recalled echo (SPGR) z następującymi parametrami: czas repetycji 25 ms; czas echa 2 ms; kąt odchylenia 30 stopni; szerokość pasma 15,63 kHz; pole widzenia 20 × 20 × 12 mm; macierz 128 × 128 × 60.

7. Analiza obrazu

1. Analiza obrazu jest specyficzna dla zastosowanego paradygmatu stymulacji. W przypadku eksperymentu ze stymulacją wibrys (Rysunek 2), zaimportuj obrazy z kilku zwierząt do odpowiedniego środowiska analitycznego. Jeśli niektóre zwierzęta były stymulowane po stronie prawej, a inne po lewej, odzwierciedl niektóre z nich, aby wszystkie obrazy były efektywnie „stymulowane po lewej stronie”. Następnie, aby porównać stymulowaną stronę każdego mózgu z jego przeciwległą stroną niestymulowaną, utwórz zduplikowany i lustrzany zestaw obrazów lewej strony niestymulowanej. Zarejestruj wszystkie obrazy w wspólnej przestrzeni, a następnie wygładź je za pomocą gaussowskiego jądra o rozmiarze 3 × 3 × 3 piksele.
2. Eksportuj dane do środowiska analizy matematycznej, takiego jak MATLAB. Opcjonalnie zamaskuj nieistotne elementy anatomiczne w zbiorach danych. Znormalizuj intensywność obrazów metodą iteracyjną Venot et al. ^17,18.
3. Użyj parowego jednostronnego testu t, aby porównać każdy woxel stymulowanych stron każdego mózgu z odpowiadającym mu przeciwległym voxelem na stronach niestymulowanych każdego mózgu.
4. Wyświetl wynikową mapę wartości p, aby zidentyfikować obszary różnicowej aktywności (Rysunek 3).

8. Reprezentatywne wyniki

Przedstawiona tutaj metoda składa się z dwóch podstawowych etapów: (1) otwierania BBB za pomocą mikropęcherzyków i ultradźwięków (BOMUS) oraz (2) rezonansu magnetycznego z wzmocnieniem manganem indukowanym aktywacją (AIM MRI). Ponieważ drugi etap zależy od pierwszego, istotne jest zweryfikowanie prawidłowej implementacji BOMUS.

Przerwanie bariery krew-mózg po podaniu kontrastu skracającego czas T₁ (takiego jak mangan lub środek oparty na gadolinie) skutkuje wzrostem sygnału w miąższu mózgu w obrazowaniu T₁-zależnym w porównaniu do mózgów, w których nie przeprowadzono procedury BOMUS (Rycina 4). Rozkład tego wzmocnienia manganowego nie jest całkowicie jednorodny, choć jest dość spójny pomiędzy zwierzętami. Rozkład ten odzwierciedla nie tylko niejednorodność otwarcia BBB, ale wynika również z naturalnego, nierównomiernego rozkładu Mn w obrębie mózgu ¹⁹. Dynamika przestrzenna i czasowa otwarcia BBB została opisana szczegółowo w poprzednich publikacjach ¹².

Po pomyślnym przeprowadzeniu procedury BOMUS następnym krokiem jest wykonanie obrazowania AIM MRI. Możliwe jest zastosowanie wielu paradygmatów eksperymentalnych; jednak ze względu na liczne potencjalne czynniki zakłócające, grupy kontrolne i analiza muszą zostać starannie zaprojektowane. Efekty zakłócające obejmują niejednorodne otwieranie BBB, niejednorodne gromadzenie się Mn w mózgu, dynamikę czasową dyfuzji Mn oraz nieswoistą aktywność neuronalną. W niniejszej demonstracji zmapowano odpowiedź neuronalną na jednostronną stymulację wibrysów. Aby uwzględnić niejednorodności i przepływ Mn, niestymulowana strona każdego mózgu została wykorzystana jako kontrola wewnętrzna. W celu uwzględnienia nieswoistej aktywności neuronalnej, która może się różnić między zwierzętami, w analizie zastosowano testy statystyczne, aby zidentyfikować obszary, które były spójnie odmienne u badanych zwierząt (Rysunek 2). Wynikiem była trójwymiarowa mapa różnic oraz trójwymiarowa mapa wartości p (Rysunek 3), z której prawa strona wskazywała obszary o wyższym sygnale po stronie przeciwległej do stymulowanych wibrysów. Lewa strona mapy wskazywała obszary, w których sygnał był znacząco wyższy po stronie tej samej co stymulowane wibrysy. Mapa wartości p zidentyfikowała szeroki obszar podwyższonego sygnału po stronie przeciwległej do stymulowanych wibrysów, który odpowiadał polu beczkowemu pierwotnej kory czuciowej, którego odpowiedź na stymulację wibrysów została szeroko udokumentowana za pomocą elektrofizjologii ^20,21 oraz badań z użyciem 2-deoksyglukozy. Bardziej szczegółowa dyskusja tych wyników została opublikowana wcześniej ¹³.

Rysunek 1. Harmonogram protokołu funkcjonalnego obrazowania neurologicznego z wykorzystaniem BOMUS i AIM MRI (Zaadaptowano z Howles et al. ¹³).

Rycina 2. Schemat analizy służący do identyfikacji obszarów o różnej intensywności pomiędzy stroną stymulowaną a niestymulowaną każdego mózgu. Aby porównać stymulowaną stronę każdego mózgu z przeciwległą stroną niestymulowaną, tworzony jest zduplikowany i lustrzany zestaw obrazów lewej strony niestymulowanej. Obrazy te są rejestrowane, filtrowane i normalizowane. Na koniec test t pozwala porównać obrazy lewej strony stymulowanej i lewej strony niestymulowanej. Test t jest „parzysty”, tak aby stymulowana strona każdego mózgu była porównywana wyłącznie ze stroną niestymulowaną tego samego mózgu. Test t jest „jednostronny”, dzięki czemu jedna strona mapy wartości p wskazuje na istotnie wyższy sygnał po stymulowanej stronie mózgu, podczas gdy druga strona mapy wartości p wskazuje na istotnie wyższy sygnał po stronie niestymulowanej (Adaptowano z Howles et al. ¹³).

Rycina 3. Wyniki połączonej analizy 7 zwierząt w dwóch różnych pozycjach osiowych. Pierwsza kolumna przedstawia średnią ze wszystkich wyrównanych obrazów zarejestrowanych w taki sposób, aby efektywnie u wszystkich myszy stymulowane były lewe wibrysy. Obrazy te są nałożone na mapę kolorów wskazującą średni procentowy wzrost sygnału w każdym wokselu względem przeciwległej półkuli, zgodnie z paskiem kolorów. Kolorowe obszary po prawej stronie obrazu pokazują miejsca, w których półkula przeciwległa do stymulacji wykazywała wyższy sygnał. Kolorowe obszary po lewej stronie obrazu pokazują miejsca, w których półkula ipsilateralna do stymulacji wykazywała wyższy sygnał. Druga kolumna przedstawia te same obrazy z nałożoną mapą wartości p wskazującą istotność statystyczną wzrostu sygnału. Trzecia kolumna przedstawia tę samą mapę wartości p nałożoną na odpowiadające jej ryciny z atlasu stereotaksycznego Paxinosa¹⁶ z zaznaczonymi polami beczkowymi kory sensorycznej (Adaptowano z Howles et al. ¹³).

Rycina 4. Przestrzenny rozkład Mn²⁺ w mózgu. Obrazy wykonano 170 min po podaniu 0,5 mmol/kg IP MnCl₂ u myszy traktowanych BOMUS (n=5) oraz w grupie kontrolnej (n=4). Po normalizacji obliczono mapy średniej wartości i odchylenia standardowego (lewy panel). Wzmocnienie było większe u myszy traktowanych BOMUS. Choć wzmocnienie to nie było jednolite w całym mózgu, było ono dość spójne, z wyjątkiem obszarów w pobliżu krawędzi mózgu i komór. Wykorzystując obszary zainteresowania (ROI) wyznaczone wokół różnych struktur, obliczono średni SNR (+ 1 SD) dla każdej grupy (prawy panel). Zwierzęta traktowane BOMUS wykazały wyższy SNR, ale także większą wariancję między strukturami i między osobnikami (Adaptacja z Howles et al. ¹³).

Rycina 5. Aby zbadać wpływ BOMUS na tkankę, mózgi myszy poddanych działaniu BOMUS utrwalono, pocięto w odstępach 500- μm i zabarwiono hematoksyliną oraz eozyną. Przedstawiono średnią liczbę wycieków erytrocytów widocznych w każdym przekroju mózgu dla ciśnień akustycznych 0,36 MPa (n = 3), 0,52 MPa (n = 4) i 5,0 MPa (n = 1). Słupki błędów wskazują błąd standardowy. Drugi panel przedstawia przykład rozległego wycieku erytrocytów z mózgu poddanego działaniu ciśnienia 5,0 MPa (Adaptacja z Howles et al. ¹²).

Rysunek 6. Do oceny aktywności, pobudzenia i reaktywności przed znieczuleniem oraz 3 i 24 godziny po wybudzeniu z narkozy zastosowano ilościowe testy behawioralne. System punktacji, opisany wcześniej ¹², oparto na uznanej ilościowej ocenie behawioralnej myszy opracowanej przez Irwina w 1968 roku²². Przedstawiono średnią punktację behawioralną (± SEM) dla zwierząt z grupy kontrolnej (n = 3) oraz traktowanych BOMUS (0,36 MPa) (n = 8). W stosunku do poziomu bazowego sprzed znieczulenia u wszystkich zwierząt zaobserwowano spadek punktacji behawioralnej 3 godziny po znieczuleniu, jednak w dużej mierze powróciła ona do normy następnego dnia. W każdym punkcie czasowym nie stwierdzono różnic między obiema grupami, co wskazuje, że BOMUS nie wpłynął w sposób mierzalny na zachowanie zwierząt (Adaptacja z Howles et al. ¹²).

Dyskusja

W niniejszej pracy przedstawiono metodę nieinwazyjnego otwierania BPP w całym mózgu myszy za pomocą ultradźwięków i mikropęcherzyków (BOMUS). Po otwarciu BPP podano Mn²⁺, a następnie wykorzystano obrazowanie rezonansem magnetycznym z wzmocnieniem manganem indukowanym aktywacją (AIM MRI) do obrazowania odpowiedzi neuronalnej na krótkotrwałą stymulację u myszy w lekkiej sedacji.

Odpowiednie otwarcie bariery krew-mózg (BBB) osiągnięto przy szczytowym ujemnym ciśnieniu akustycznym wynos...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Hydrofon	Sonora Medical Systems, Longmont, CA	SN S4-251
Stół translacyjny	Newport Corporation, Irvine, CA
Przetwornik ultradźwiękowy	Olympus NDT, Inc., Waltham MA	A306S-SU	Należy sprawdzić arkusz testowy producenta dołączony do przetwornika, aby ustalić dokładną częstotliwość środkową konkretnego przetwornika, która może różnić się od częstotliwości nominalnej podanej w katalogu. (np. częstotliwość nominalna naszego przetwornika wynosiła 2.25 MHz, ale rzeczywista częstotliwość środkowa wynosiła 2.15 MHz.)
Stacja obrazowania Vevo	VisualSonics, Inc. Toronto, Canada
Wzmacniacz mocy 50 dB	E&I, Rochester, NY	model 240L
Generator sygnałowy	Agilent Technologies, Santa Clara, CA	model 33220A
MnCl2-(H2O)4	Sigma		Masa cząsteczkowa różni się w zależności od partii, należy skontaktować się z producentem w celu uzyskania dokładnego pomiaru
Lipidowe mikrosfery perflutrenowe	Lantheus Medical Imaging, N. Billerica, MA	DEFINITY
Mieszadło do mikrosfer	Lantheus Medical Imaging, N. Billerica, MA	VIALMIX
Cewka obrazowania MR	m2m Imaging Corp., Hillcrest, OH		Kwadraturowa cewka wolumetryczna nadawczo-odbiorcza o średnicy 35 mm
System MRI	GE Healthcare, Milwaukee, WI		Konsola GE EXCITE obsługująca magnes z poziomym otworem 7-T
Środowisko analizy obrazu	Visage Imaging, San Diego, CA, MathWorks, Natick MA	Amira MATLAB