Mapowanie funkcjonalnych sieci i szlaków bakteryjnych w Escherichia Coli przy użyciu syntetycznych macierzy genetycznych

Summary

Systematyczne, wielkoskalowe syntetyczne badania interakcji genetycznych (gen-gen lub epistaza) mogą być wykorzystywane do badania redundancji genetycznej i wzajemnych przesłuchów ścieżek. W tym miejscu opisujemy wysokoprzepustową ilościową technologię badań przesiewowych syntetycznych macierzy genetycznych, zwaną eSGA, którą opracowaliśmy w celu wyjaśnienia relacji epistatycznych i zbadania sieci interakcji genetycznych w Escherichia coli.

Abstract

Fenotypy są determinowane przez złożony szereg fizycznych (np. białko-białko) i funkcjonalnych (np. gen-gen lub genetyczny) interakcji (GI)¹. Chociaż interakcje fizyczne mogą wskazywać, które białka bakteryjne są powiązane jako kompleksy, niekoniecznie ujawniają one relacje funkcjonalne na poziomie szlaku1. Badania przesiewowe przewodu pokarmowego, w których mierzy się wzrost podwójnych mutantów zawierających dwa usunięte lub inaktywowane geny i porównuje je z odpowiadającymi im pojedynczymi mutacjami, mogą rzucić światło na epistatyczne zależności między loci, a tym samym zapewnić środki do badania i odkrywania nowych relacji funkcjonalnych². Mapy przewodu pokarmowego na dużą skalę zostały zgłoszone dla organizmów eukariotycznych, takich jak drożdże^3-7, ale informacje o IG pozostają rzadkie dla prokariontów⁸, co utrudnia funkcjonalną adnotację genomów bakteryjnych. W tym celu wraz z innymi opracowaliśmy wysokoprzepustowe ilościowe metody badań przesiewowych bakteryjnego przewodu pokarmowego^{9, 10}.

Tutaj prezentujemy kluczowe kroki wymagane do przeprowadzenia ilościowej procedury przesiewowej E. coli Synthetic Genetic Array (eSGA) w skali genomu⁹, wykorzystując naturalną koniugację bakteryjną i homologiczną rekombinację do systemowego generowania i mierzenia dopasowania dużej liczby podwójnych mutantów w formacie tablicy kolonii. Krótko mówiąc, robot jest używany do przenoszenia, poprzez koniugację, chloramfenikolu (Cm) - oznaczonych zmutowanymi allelami z zaprojektowanych "szczepów dawcy" Hfr (High frequency of recombination) do uporządkowanej macierzy kanamycyny (Kan) - szczepów biorcy F. Zazwyczaj używamy pojedynczych mutantów z utratą funkcji z nieistotnymi delecjami genów (np. kolekcja "Keio"¹¹) i niezbędnymi mutacjami hipomorficznymi genów (tj. allelami nadającymi zmniejszoną ekspresję białka, stabilność lub aktywność^{9, 12, 13}) w celu zbadania funkcjonalnych powiązań odpowiednio genów nieistotnych i niezbędnych. Po koniugacji i następującej po niej wymianie genetycznej, w której pośredniczy rekombinacja homologiczna, powstałe podwójne mutanty są selekcjonowane na pożywce stałej zawierającej oba antybiotyki. Po wyrośnięciu płytki są obrazowane cyfrowo, a rozmiary kolonii są ilościowo oceniane za pomocą własnego automatycznego systemu przetwarzania obrazu¹⁴. Indeksy glikemiczne ujawniają się, gdy tempo wzrostu podwójnego mutanta jest albo znacznie lepsze, albo gorsze niż oczekiwano⁹. Pogarszające (lub ujemne) GI często wynikają między mutacjami powodującymi utratę funkcji w parach genów ze szlaków kompensacyjnych, które wpływają na ten sam podstawowy proces². W tym przypadku utrata pojedynczego genu jest buforowana, tak że każdy pojedynczy mutant jest zdolny do życia. Jednak utrata obu szlaków jest szkodliwa i powoduje syntetyczną śmiertelność lub chorobę (tj. powolny wzrost). I odwrotnie, łagodzące (lub pozytywne) interakcje mogą wystąpić między genami w tym samym szlaku lub kompleksie białkowym², ponieważ sama delecja któregokolwiek genu jest często wystarczająca, aby zakłócić normalną funkcję szlaku lub kompleksu, tak że dodatkowe perturbacje nie zmniejszają aktywności, a tym samym wzrostu, dalej. Ogólnie rzecz biorąc, systematyczna identyfikacja i analiza sieci przewodu pokarmowego może dostarczyć bezstronnych, globalnych map funkcjonalnych relacji między dużą liczbą genów, z których można wywnioskować informacje na poziomie szlaku pominięte w innych podejściach9.

Protocol

1. Konstruowanie zmutowanych szczepów dawcy Hfr Cavalli poprzez rekombinację^{15, 16}

Kroki do konstruowania barwników dawcy eSGA są opisane poniżej. Krótko mówiąc, używamy ukierunkowanej rekombinacji homologicznej za pośrednictwem λ- Red¹⁶ amplifikowanych selektywnych fragmentów kasety markerów DNA generowanych przez PCR w celu stworzenia nieistotnych mutantów delecji genów (sekcja 1.1) lub niezbędnych hipomorficznych zmutowanych szczepów dawcy genów (sekcja 1.2), które są następnie używane jako "zapytania" do zdefiniowania sieci GI.

Uwaga: Podczas procesu r....

Results

GI ujawniają funkcjonalne relacje między genami. Podobnie, ponieważ geny w tym samym szlaku wykazują podobne wzorce przewodu pokarmowego, a podobieństwo profilu przewodu pokarmowego reprezentuje zgodność fenotypów, możemy grupować funkcjonalnie powiązane geny w szlaki, grupując ich profile żołądkowo-jelitowe. Integracja GI i sieci korelacji GI z informacjami o interakcjach fizycznych lub innymi danymi asocjacyjnymi, takimi jak relacje kontekstu genomowego (GC), może również ujawnić organizację modułów funkcjonalnych wyżs.......

Discussion

Przedstawiliśmy krok po kroku protokół wykorzystania zrobotyzowanych badań przesiewowych eSGA do badania funkcji genów bakteryjnych na poziomie szlaku poprzez badanie przewodu pokarmowego. Takie podejście może być wykorzystane do badania pojedynczych genów, jak również całych systemów biologicznych u E. coli. Staranne wykonanie opisanych powyżej etapów eksperymentalnych, w tym wszystkie odpowiednie kontrole, oraz rygorystyczna analiza i niezależna walidacja danych GI są kluczowymi aspektami sukcesu eSGA w doko.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
I. Antybiotyki
Chloramfenikol	Bioshop	#CLR201
Kanamycyna		#KAN201
Ampicylina		# AMP201
2. Luria-Bertani medium
LB w proszku	Bioshop	#LBL405
Agar	Bioshop	#AGR003
3. Szczepy bakteryjne i plazmidy
Hfr Cavalli szczep λ System red (JL238)	Babu et al.14.
pKD3	E. coli Genetic Stock Centre, Yale
Keio E. coli F- kolekcja biorców	National BioResource Project (NBRP) Japonii11
Hypomorficzny E. coli F- Szczepy ze znacznikiem SPA	Otwarte biosystemy; Babu et al.14
4. Startery
pKD3 odsolone stałe startery			F1: 5'-GGCTGACATGGGAATTAGC-3' R1: 5'-AGATTGCAGCATTACACGTCTT-3'
Odsolone niestandardowe podkłady			Cm-R: 5'-TTATACGCAAGGCGACAAGG-3' Cm-F: 5'- GATCTTCCGTCACAGGTAGG-3'Desolowane
niestandardowe podkłady			F2 i R2: 20 nt stałe regiony oparte na sekwencji pKD3 i 45 nt niestandardowe regiony homologii Region stały F2: 5'-CATATGAATATCCTCCTTA-3' R2 obszar stały: 5'-TGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3'S1 i S2: 27 obszarów stałych nt do przygotowania wzmocnienia kasety SPA-Cm i 45 nt niestandardowych regionów homologii Obszar stały S1: 5'AGCTGGAGGATCCATGGAAAAGAGAAG -3' Region stały S2: 5'- GGCCCCATATGAATATCCTCCTTAGTT -3' KOCO-F i KOCO-C: 20 starterów nt 200 pz od miejsca delecji genu nieistotnego lub miejsca insercji znacznika genu genu essential<
Taq DNA polimeraza Fermentas		# EP0281
10X bufor PCR	Fermentas	# EP0281
10 mM dNTPs	Fermentas	# EP0281
25 mM MgCl2	Fermentas	# EP0281
Agarose	Bioshop	# AGA002
Ładowanie barwnik	NEB	#B7021S
Bromek etydyny	Bioshop	# ETB444
10X Bufor TBE	Bioshop	# ETB444.10
Tris Base	Bioshop	# TRS001
Kwas borowy	Sigma	# T1503-1KG
0,5 M EDTA (pH 8,0)	Sigma	# B6768-500G
Drabinka DNA	NEB	#N3232L
6. Zestawy do izolacji i oczyszczania DNA
Zestaw do izolacji i oczyszczania genomowego DNA	Promega	#A1120
Zestaw Plasmid Midi	Qiagen	# 12143
Zestaw do oczyszczania QIAquick PCR	Qiagen	#28104
7. Sprzęt do PCR, Transformacji i Replikowania
Termocykler	BioRad, iCycler
Elektroforeza w żelu agarozowym	BioRad
Elektroporator	Bio-Rad GenePulser II
0,2 cm Kuweta do elektroporacji	Bio-Rad
42 ° C Wytrząsarka do kąpieli wodnej	Innova 3100
Beckman Coulter TJ-25 Wirówka	Beckman Coulter
32 ° Wytrząsarka C	New Brunswick Scientific, USA
32 ° Inkubator płytkowy C	Fisher Scientific
RoToR-HDA robot stołowy	Singer Instruments
96, 384 i 1,536 gęstości pinów Singer	Instruments
96 lub 384 długie piny	Singer Instruments
8. Sprzęt do obrazowania< / strong>
Stojak na aparat	fotograficzny Kaiser
Aparat cyfrowy, 10 megapikseli	Dowolny dostawca
Kasetony świetlne, jednostki Testrite 16 "x 24"	Testrite
9. Podkładki lub talerze Recykling
10% wybielacz	Dowolny sprzedawca
70% etanolu	Każdy sprzedawca
Sterylna woda destylowana	Dowolny sprzedawca
Okap przepływowy	Dowolny sprzedawca
Lampa ultrafioletowa	Dowolny sprzedawca
10. Sprzęt laboratoryjny
probówki polipropylenowe 50 ml	Dowolny Sprzedawca
Probówki do mikrowirówek 1,5 ml	Dowolny sprzedawca
Płatki stożkowe 250 ml	VWR	# 29140-045
15 ml sterylne probówki	hodowlane Thermo Scientific	# 366052
Fiolki kriogeniczne	VWR	# 479-3221
Płytki prostokątne	Singer Instruments
96-dołkowe i 384-dołkowe płytki mikromiareczkowe	Singer Instruments	Nunc
Wałek do uszczelniania wielodołkowych	Sigma	#R1275
	ABgene	# AB-0580
Samoprzylepne uszczelki płytkowe	Fisher Scientific	# 13-990-14-80
° C zamrażarka	Dowolny sprzedawca