Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Mapowanie bakteryjnych sieci funkcjonalnych i szlaków w Escherichia Coli z wykorzystaniem syntetycznych macierzy genetycznych

46.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/4056

⸱

12 listopada 2012

 ,  ,  , 
1Department of Molecular Genetics, University of Toronto, 2Banting and Best Department of Medical Research, Donnelly Centre, University of Toronto, 3Department of Biochemistry, Research and Innovation Centre, University of Regina

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Systematyczne, wielkoskalowe przesiewy syntetycznych interakcji genetycznych (gen-gen lub epistaza) mogą być wykorzystywane do badania redundancji genetycznej i wzajemnych powiązań między szlakami sygnałowymi. W niniejszej pracy opisujemy opracowaną przez nas technologię wysokoprzepustowych ilościowych przesiewów macierzy syntetycznych interakcji genetycznych, nazwaną eSGA, służącą do wyjaśniania relacji epistatycznych i badania sieci interakcji genetycznych w Escherichia coli.

Streszczenie

Fenotypy są determinowane przez złożony szereg oddziaływań fizycznych (np. białko-białko) i funkcjonalnych (np. gen-gen lub genetycznych) (GI)1. O ile oddziaływania fizyczne mogą wskazywać, które białka bakteryjne są powiązane w kompleksy, o tyle niekoniecznie ujawniają one zależności funkcjonalne na poziomie szlaków metabolicznych1. Przesiewy GI, w których mierzy się wzrost podwójnych mutantów posiadających dwa usunięte lub nieaktywne geny i porównuje go z odpowiednimi pojedynczymi mutantami, mogą naświetlić zależności epistatyczne między loci, a tym samym stanowić sposób badania i odkrywania nowych zależności funkcjonalnych2. Opisano wielkoskalowe mapy GI dla organizmów eukariotycznych, takich jak drożdże3-7, jednak informacje o GI dla prokariontów pozostają nieliczne8, co utrudnia adnotację funkcjonalną genomów bakteryjnych. W związku z tym my i inni opracowaliśmy wysokoprzepustowe ilościowe metody przesiewania oddziaływań genetycznych (GI) u bakterii9, 10.

W niniejszej pracy przedstawiamy kluczowe etapy wymagane do przeprowadzenia ilościowej procedury screeningu syntetycznych macierzy genetycznych (eSGA) dla E. coli w skali genomu9, wykorzystując naturalną koniugację bakteryjną oraz rekombinację homologiczną do systematycznego generowania i pomiaru dostosowania (fitness) licznych mutantów podwójnych w formacie macierzy kolonii. W skrócie, robot jest wykorzystywany do przenoszenia drogą koniugacji alleli mutantów znakowanych chloramfenikolem (Cm) z engineered szczepów „donora” Hfr (High frequency of recombination) do uporządkowanej macierzy szczepów biorców F- znakowanych kanamycyną (Kan). Typowo stosujemy pojedyncze mutanty z utratą funkcji, posiadające delecje genów nieessentialnych (np. kolekcja „Keio”11) oraz mutacje hypomorficzne genów essentialnych (tzn. allele powodujące obniżoną ekspresję, stabilność lub aktywność białka9, 12, 13), aby badać powiązania funkcjonalne odpowiednio genów nieessentialnych i essentialnych. Po koniugacji i następującej po niej wymianie genetycznej zapośredniczonej przez rekombinację homologiczną, powstałe mutanty podwójne są selekcjonowane na podłożu stałym zawierającym oba antybiotyki. Po wyroście płytek wykonuje się ich obrazowanie cyfrowe, a rozmiary kolonii są ilościowo oceniane przy użyciu wewnętrznego zautomatyzowanego systemu przetwarzania obrazu14. Interakcje genetyczne (GI) ujawniają się, gdy tempo wzrostu mutanta podwójnego jest znacząco lepsze lub gorsze niż oczekiwano9. Pogarszające (lub negatywne) GI często występują pomiędzy mutacjami z utratą funkcji w parach genów z szlaków kompensacyjnych, które wpływają na ten sam proces essentialny2. W takim przypadku utrata pojedynczego genu jest buforowana, tak że każdy z mutantów pojedynczych jest żywotny. Jednak utrata obu szlaków jest szkodliwa i prowadzi do letalności syntetycznej lub osłabienia organizmu (tzn. spowolnionego wzrostu). I odwrotnie, łagodzące (lub pozytywne) interakcje mogą występować między genami w tym samym szlaku lub kompleksie białkowym2, ponieważ delecja każdego z genów osobno jest często wystarczająca, aby zaburzyć normalną funkcję szlaku lub kompleksu w taki sposób, że dodatkowe zaburzenia nie redukują już aktywności, a tym samym wzrostu, w dalszym stopniu. Ogólnie rzecz biorąc, systematyczna identyfikacja i analiza sieci GI może dostarczyć nieobiektywnych, globalnych map relacji funkcjonalnych między dużymi liczbami genów, z których można wywnioskować informacje na poziomie szlaków, pomijane przez inne podejścia9.

Protokół

1. Konstrukcja mutantów szczepów dawców Hfr Cavalli metodą recombineeringu15, 16

Poniżej opisano kroki służące do konstruowania szczepów donacyjnych eSGA. W skrócie: wykorzystujemy ukierunkowaną rekombinację homologiczną opartą na systemie λ- Red16 fragmentów kaset z selekcyjnymi markerami DNA powielonymi metodą PCR, aby stworzyć mutanty z delecją genów nieistotnych (sekcja 1.1) lub hypomorficzne mutanty donorowe genów istotnych (sekcja 1.2), które następnie służą jako „zapytania” do definiowania sieci GI.

Uwaga: W procesie opracowywania technologii oceniliśmy skuteczność wykorzystania koniugacyjnego transferu pośredniczonego przez Hfr do łączenia mutacji z zastosowaniem dobrze zdefiniowanych szczepów donorowych Hfr (Hfr Cavalli, Hfr Hayes i Hfr 3000). Zbadaliśmy (i) zdolność do efektywnego tworzenia mutantów donorowych przy użyciu metody recombineeringu opracowanej przez Yu i wsp. (2000)16, (ii) względną wydajność koniugacyjnego transferu DNA dla różnych markerów chromosomalnych oraz (iii) wpływ pozycji genu badanego i orientacji chromosomalnej względem locus transferu Hfr, oriT. Stwierdziliśmy, że wydajność homologicznej rekombinacji pośredniczonej przez λ-Red była znacznie wyższa w szczepie Hfr Cavalli niż w Hfr Hayes lub Hfr3000. W razie potrzeby do tworzenia mutantów donorowych można zastosować transdukcję P1 lub szczep pseudo-Hfr17. Z sukcesem zaadaptowaliśmy wszystkie te metody do tworzenia i przesiewania dużej liczby donorów. Ponieważ w naszych próbnych eksperymentach koniugacyjnych ogólna wydajność transferu oraz liczba zaobserwowanych eks-koniugantów były znacznie większe w przypadku Hfr Cavalli, ten konkretny szczep wybrano jako tło do konstrukcji donorów i wielkoskalowego eSGA. Opisano wszystkie procedury dla przesiewów eSGA z wykorzystaniem donorów Hfr Cavalli.

  1. Amplifikacja fragmentu DNA do późniejszego recombineeringu w celu usunięcia genu nieessentialnego
    Zastosuj dwuetapową amplifikację metodą nested PCR (Rycina 1) w celu stworzenia kasety do delecji genu służącej do zastąpienia docelowej ramki odczytu markerem oporności na chloramphenikol (Cm) z plazmidu pKD3 (GI: 15554330; protein id: AAL02033.1)15Marker jest flankowany przez miejsca FRT.11 co umożliwia usunięcie genu oporności, jeśli jest to konieczne, w kolejnych eksperymentach.
    Uwaga: Przeprowadzamy zagnieżdżoną PCR dwuetapową w celu usunięcia plazmidu z produktu amplifikacji, który jest następnie wykorzystywany do transformacji komórek bakteryjnych. Usunięcie plazmidu (w pierwszej reakcji PCR), a następnie utworzenie kasety knockout genu w drugiej reakcji PCR jest konieczne, ponieważ transformacja plazmidem jest znacznie bardziej efektywna niż recombineering, a celem jest uzyskanie – w możliwie największym stopniu – wyłącznie szczepów, w których docinkowy fragment DNA genomowego został pomyślnie zastąpiony markerem selekcyjnym. Alternatywą dla zagnieżdżonej PCR jest przeprowadzenie trawienia restrykcyjnego plazmidu poza regionem amplifikowanym w drugim etapie PCR. Następnie produkt trawienia restrykcyjnego jest oczyszczany i wykorzystywany jako matryca w etapie zagnieżdżonej PCR (1.1.2). Ta opcja jest również prosta, lecz wymaga więcej czasu na przygotowanie próbki.
    1. Użyj około 45 ng pKD3 jako matrycy w reakcji PCR z zastosowaniem starterów forward F1 i reverse R1 w celu otrzymania produktu o długości 1 070 bp. Oczyść fragment PCR zgodnie z protokołem oczyszczania PCR firmy Qiagen, a następnie rozcieńcz produkt w sterylnej wodzie destylowanej do stężenia 5 ng/μl.
    2. Wykorzystując oczyszczony produkt PCR jako matrycę, przeprowadź drugą reakcję PCR z zastosowaniem specyficznych dla genu (np. zagnieżdżone primery (knockout) F2 i R2, które posiadają (i) 45 nt regionów homologii specyficznych dla genu na końcach 5', aby umożliwić rekombinację homologiczną bezpośrednio powyżej i poniżej genu docelowego w celu zastąpienia go markerem oporności na Cm oraz (ii) 20 nt na końcach 3', aby zainicjować syntezę markera Cm. Rozmiar otrzymanego fragmentu wynosi 1 123 bp. Regiony homologii specyficzne dla genu zostały zaprojektowane tak, aby usunąć docelową ramkę odczytu, pozostawiając nienaruszone wszystkie sąsiednie lub częściowo nakładające się segmenty kodujące. Po tej amplifikacji należy przejść do kroku 1.3.
  2. Amplifikacja kasety tagującej w celu stworzenia mutacji hypomorficznej genu niezbędnego
    1. W celu otrzymania hipomorficznych szczepów mutacyjnych dawcy, należy dodać tag fuzyjny SPA (sequential peptide affinity) na końcu C, co często nieznacznie wpływa na funkcję białek niezbędnych poprzez destabilizację poziomu transkrypcyjnego (t.j. liczbę kopii białka) lub fałdowanie/aktywność białka. W tym celu należy stworzyć selekcjonowalny szablon DNA z tagiem SPA (SPA-Cm), poprzez konwersję markera oporności na kanamycynę w pJL14818 do Cm poprzez recombineering pomiędzy identycznymi sekwencjami nukleotydowymi flankującymi marker Kan w pJL148 i marker Cm w pKD315Otrzymana matryca składa się z tagu SPA w ramce odczytu, po którym następuje marker oporności na chloramfenikol (Cm), i nadaje się do amplifikacji PCR, recombineeringu oraz następującej po nim eSGA.12.
      Uwaga: Geny niezbędne są potencjalnie najciekawszymi obiektami w badaniach nad funkcją genów. Jednak ze względu na to, że geny te nie mogą zostać usunięte, konieczne było opracowanie innowacyjnych metod badania zależności funkcjonalnych genów niezbędnych. Początkowo w drożdżach opracowano kilka odpowiednich, wysoce skutecznych podejść. Na przykład Davierwala i wsp. (2005)19 przeprowadzono badania przesiewowe w kierunku interakcji genetycznych (GI), wykorzystując panel 575 mutantów genów niezbędnych, wrażliwych na temperaturę; stwierdzono, że geny niezbędne wykazywały około pięciokrotnie większą liczbę GI niż geny nieodzowne. Podobnie Breslow i wsp. (2008)20 opracowano metodę „zmniejszenia obfitości poprzez perturbację mRNA” (DAmP), aby stworzyć bibliotekę alleli hypomorficznych obejmującą około 82% niezbędnych genów drożdży w celu badania szlaków i kompleksów. Metoda DAmP modyfikuje koniec 3' ekspresyjnego mRNA, co prowadzi do obniżenia poziomu genu docelowego6, prawdopodobnie w wyniku destabilizacji mRNA. Podobnie jak w podejściu DAmP6nasza strategia polegała na wykorzystaniu subtelnych efektów zaburzenia końca 3' mRNA ekspresyjnago białek niezbędnych do życia.
      Jak opisano poniżej, sama znacznik prawdopodobnie nie wpływa na fałdowanie ani funkcję białka, jednak subtelne zaburzenie mRNA wywołane przez znacznik jest wystarczające – w połączeniu ze stresorami środowiskowymi lub innymi mutacjami – aby ujawnić funkcjonalnie istotne interakcje gen-środowisko 13 i gen-gen 9, 12 oddziaływania
      Po pierwsze, do chwili obecnej wykorzystaliśmy znaczniki SPA do oczyszczenia około 3000 białek E. coli, zarówno niezbędnych, jak i nieodpowiednich.21-23, przy czym ponad 80% z 307 niezbędnych białek E. coli zostało reprezentowanych wśród naszych szczepów z tagiem SPA8Ponieważ znacznik został z powodzeniem wykorzystany do izolacji znanych kompleksów białkowych, które poddano walidacji wzajemnej (t. j. ten sam kompleks mógł zostać wyizolowany poprzez znakowanie i oczyszczanie różnych białek wchodzących w jego skład); oraz że wyizolowane kompleksy były biologicznie istotne, wnioskujemy, że znaczniki zazwyczaj nie wpływają na fałdowanie ani funkcję białek12Podobnie nasze niepublikowane obserwacje wykazały, że sama znacznik nie wpływa zazwyczaj na wzrost szczepu. Uznaliśmy jednak, że zmiana 3'-UTR poprzez integrację znacznika i kasety markerowej, jak zgłaszano w przypadku szczepów DAmP6może destabilizować niektóre transkrypty na poziomie RNA lub, w rzadkich przypadkach, utrudniać prawidłowe fałdowanie lub funkcjonowanie białek fuzyjnych. Przewidywaliśmy zatem, że połączenie takich zaburzonych alleli genów niezbędnych z innymi funkcjonalnie istotnymi mutacjami w innych częściach genomu doprowadzi do powstania informatywnych interakcji genetycznych (GI), co rzeczywiście zaobserwowano9, 12Ponadto allele genów niezbędnych z etykietą SPA wykazywały interakcje gen-środowisko (np. nadwrażliwość na leki) zgodnie z pracą nad profilowaniem fenotypowym autorstwa Nicholsa i współpracowników (2011)13, którzy poddali podzbiór szczepów niezbędnych z etykietą SPA różnym warunkom wzrostu. To samo badanie potwierdziło, że większość (54 z 58 badanych) szczepów niezbędnych z etykietą SPA wykazywała upośledzoną żywotność w jednej lub więcej warunkach hodowli13co wspiera tezę, że znacznik SPA często prowadzi do powstania łagodnych alleli hypomorficznych w genach niezbędnych, co jest użyteczne w zastosowaniach związanych z przesiewami GI w skali całego genomu, w tym w eSGA.
    2. Należy przeprowadzić amplifikację kasety znakującej z matrycy SPA-Cm przy użyciu specyficznych dla genu starterów S1 i S2, z których każdy zawiera (i) 45 nt region specyficzny dla genu na końcu 5', służący do rekombinacji homologicznej, a następnie (ii) 27 bp sekwencję specyficzną dla SPA-Cm na końcu 3'.
  3. Potwierdzenie i oczyszczanie produktu PCR
    1. Potwierdź poprawność amplifikacji kasety tagującej, poddając 2-5 μl produktu PCR elektroforezie w żelu agarozowym, a pozostałą część DNA oczyść zgodnie ze standardowym protokołem oczyszczania produktów PCR producenta (Qiagen). Produkt PCR elue w 30 μl sterylnej wody destylowanej i rozcieńcz do stężenia ok. 50 ng/μl. Oczyszczony produkt można wykorzystać niezwłocznie do transformacji (krok 1.5) lub przechowywać w temperaturze -20 °C do 6 miesięcy do czasu użycia.
  4. Przygotowanie kompetentnych komórek Hfr Cavalli do konstrukcji donora
    1. Przenieś 1 ml nasyconej nocnej kultury szczepu Hfr Cavalli do 70 ml świeżej pożywki Luria-Bertani (LB) z dodatkiem 35 μl ampicyliny o stężeniu 50 μg/ml do kolby o pojemności 250 ml. Inkubuj kulturę w temperaturze 32 °C przy wstrząsaniu z prędkością 220 obr./min aż do uzyskania gęstości optycznej (OD) przy 600 nm na poziomie ~0,5-0,6 (~2 h).
    2. Przenieś hodowlę do łaźni wodnej w celu indukcji termicznej λczerwony system rekombinacji16 w temperaturze 42 °C przez 15 min przy wytrząsaniu z prędkością 160 obr./min. Indukcję przerwać poprzez przeniesienie hodowli do schłodzonej łaźni wodnej z lodem na 10–20 min przy 160 obr./min. Należy dopilnować, aby komórki pozostawały schłodzone od tego momentu aż do zakończenia transformacji; należy używać probówek i kuwet, które były chłodzone w lodzie przez co najmniej 15 min przed użyciem.
    3. Podziel kulturę po równo do 2 schłodzonych wcześniej probówek polipropylenowych o pojemności 50 ml (~35 ml kultury na probówkę) i wirowuj przy 4 400 x g przez 6 min w temperaturze 4 °C.
    4. Odlej nadosad, a osad komórkowy resuspenduj poprzez delikatne odwracanie probówki w ~50 ml lodowatej, sterylnej wody destylowanej. Ponownie odwiruj komórki z prędkością 4 400 x g przez 6 min w temperaturze 4 °C. Odlej nadosad, a każdy osad komórkowy resuspenduj w 20 ml lodowatego, sterylnego 10% glicerolu i ponownie odwiruj zgodnie z powyższym opisem.
    5. Odlać supernatant i resuspender osad komórkowy w 500 μl lodowatego 10% glicerolu. Alikwotować przygotowane kompetentne komórki w objętościach 50 μl do oddzielnych, schłodzonych wcześniej probówek do mikrocentryfugowania o pojemności 1,5 ml w celu natychmiastowej transformacji. Komórki można zamrozić na suchym lodzie lub w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C przez maksymalnie 3 miesiące. Należy jednak pamiętać, że najwyższą wydajność transformacji uzyskuje się przy użyciu świeżo przygotowanych kompetentnych komórek.
  5. Transformacja
    1. Do kompetentnych komórek dodać 100 ng oczyszczonego produktu PCR z kroku 1.3.1. Delikatnie potrząsnąć probówką i pozostawić zawiesinę na lodzie przez 5 min.
    2. Przenieść zawiesinę lodowatych komórek kompetentnych i DNA do uprzednio schłodzonej kuwety do elektroporacji. Przeprowadzić elektroporację mieszaniny komórkowej przy ustawieniach 2,5 kV, 25 μF i 200 omów w kuwecie z przerwą 2 mm (t.j. (w przypadku użycia innej kuwety należy zapoznać się z instrukcjami producenta dotyczącymi parametrów elektroporacji) i niezwłocznie dodać 1 ml pożywki SOC o temperaturze pokojowej. Przenieść elektroporowane komórki w pożywce SOC do probówki hodowlanej o pojemności 15 ml i inkubować w temperaturze 32 °C przez 1 h przy wytrząsaniu orbitalnym z prędkością 220 rpm.
    3. Po inkubacji odwiruj komórki z prędkością 4 400 x g przez 5 min w temperaturze pokojowej. Usuń około 850 μl supernatantu, a następnie resuspenderuj osad komórkowy w pozostałej cieczy.
    4. Wysiać komórki na uprzednio ogrzane płytki LB zawierające 17 μg/ml Cm i inkubować przez noc w temperaturze 32 °C. Wybrać dwie pojedyncze kolonie transformantów i wysiać je kreskowaniem na płytki LB-Cm w celu potwierdzenia mutacji. Zaleca się unikanie największych kolonii transformantów, aby zmniejszyć prawdopodobieństwo wyboru szczepów z rzadkimi mutacjami supresorowymi. Te same transformanty należy również wysiać na LB-Kan, aby potwierdzić, że szczepy nie są oporne na kanamycynę.
      Uwaga: Ponieważ marker oporności Cm jest wykorzystywany do tworzenia szczepów donora, nie oczekuje się, aby mutanty donora były oporne na Kan. Poprzez wysianie transformantów na płytki LB-Kan oraz LB-Cm upewniamy się, że sama mutacja donora nie spowodowała przypadkowo oporności na Kan. Gdyby ten krok został pominięty, a mutacje docelowe wpływałyby na zdolność szczepu do przeżycia na Kan, podwójne mutanty nie zostałyby efektywnie stworzone przy użyciu eSGA, ponieważ szczepy donora przeżyłyby wszystkie etapy selekcji. Jest to jedynie zapobiegawczy krok logiczny, mający na celu wykrycie nieoczekiwanych fenotypów lub wszelkich innych problemów, które mogłyby zakłócić ukończenie przesiewów eSGA. Nawet w przypadku pominięcia tego etapu, inne kontrole pozwoliłyby zidentyfikować nieudane przesiewy. Jednak wcześniejsze wykrycie donora opornego na Kan wyeliminowałoby szereg nieproduktywnych i niepotrzebnych czynności. Innymi możliwymi przyczynami wzrostu szczepu na Kan mogłyby być na przykład przeterminowany antybiotyk, a także użycie niewłaściwego produktu PCR lub szczepu do transformacji. Wszystkie te problemy można zidentyfikować i rozwiązać na wczesnym etapie procedury dzięki tej kontroli, która nie jest wymagana, ale zalecana dla eSGA.
  6. Potwierdzenie delecji genu nieessentialnego (krok 1.6.1) lub mutacji hypomorficznej genu essentialnego (rozdział 1.6.2)
    Uwaga: Podczas potwierdzania delecji genu metodą PCR w charakterze kontroli należy wykorzystać DNA genomiczne szczepu typu dzikiego.
    1. Potwierdzenie delecji genu nieessentialnego
      1. Aby potwierdzić delecję genu metodą PCR, należy wyizolować genomowe DNA z przekształconych, domniemanych szczepów z nokautem, hodowanych w płynnym medium LB-Cm, zgodnie z instrukcjami producenta (Promega).
      2. Aby potwierdzić pomyślny przebieg rekombineeringu, należy przeprowadzić amplifikację DNA z każdego transformanta z użyciem trzech różnych zestawów starterów do potwierdzenia nokautu. Reakcje należy przeprowadzić z wykorzystaniem ok. 150 ng matrycy DNA genomowego, a poprawność wielkości fragmentów potwierdzić poprzez elektroforezę produktów PCR na żelu agarozowym.
      3. Pierwszy zestaw starterów składa się z 20-nt startera flankującego, zlokalizowanego 200 bp powyżej docelowego regionu (KOCO-F), oraz startera Cm-R, który jest komplementarny do sekwencji kasety Cm. Oczekuje się, że ta amplifikacja spowoduje powstanie amplikonu o długości 445 nt u mutanta, ale nie w szczepie dzikim (Rysunek 1).
      4. Drugi zestaw zawiera starter forward (Cm-F), przyłączający się do sekwencji kasety Cm, oraz 20-nt flankujący starter reverse do potwierdzenia (KOCO-R), zaprojektowany tak, aby przyłączać się 200 bp w kierunku 3' od końca usuniętego genu. Oczekuje się, że ta reakcja amplifikacji wyprodukuje amplikon o długości 309 nt u mutanta, ale nie w szczepie typu dzikiego (Rysunek 1).
      5. Trzecia reakcja PCR obejmuje primery KOCO-F i KOCO-R. Reakcja ta jest niezbędna do potwierdzenia, że wybrany szczep nie jest merodiploidą, w której jedno locus genowe zostało zastąpione kasetą, a druga kopia genu została zduplikowana i zachowała charakter typu dzikiego. Oczekuje się, że amplifikacja z prawidłowego mutanta z delecją przyniesie produkt o wielkości 1,4 kb (Rycina 1).
        Uwaga: W przypadku gdy gen docelowy ma zbliżoną do kasety delecyjnej długość w parach zasad, nie będzie można zauważyć różnicy między locus zastąpionym kasetą a locus niezmienionym. W takich sytuacjach, w celu uzyskania jednoznacznego potwierdzenia, zaleca się zastosowanie dodatkowych starterów do specyficznej amplifikacji fragmentu DNA w obrębie usuniętego genu. W takim przypadku, jeśli gen został usunięty, produkt amplifikacji pojawi się wyłącznie w szczepie kontrolnym typu dzikiego, a nie w mutancie. Startery te można zaprojektować ręcznie lub komputerowo tak, aby specyficznie amplifikowały fragment DNA w obrębie regionu delecji. Zazwyczaj amplifikujemy regiony o długości 140 bp.
    2. Potwierdzenie mutacji hipomorficznej w genie niezbędnym do życia
      1. Aby potwierdzić mutację hypomorficzną za pomocą PCR, należy zastosować swoiste dla genu 20-nt primery forward (KOCO-F) i reverse (KOCO-R), znajdujące się odpowiednio 200 bp powyżej i poniżej miejsca insercji znacznika SPA (Rycina 2).
        Uwaga: Ten etap amplifikacji służy jako kontrola w celu potwierdzenia braku nieoznaczonej kopii docelowego genu niezbędnego. Gdy obecna jest tylko wersja oznakowana, obserwuje się pojedynczy prążek o wielkości o 310 bp większej niż amplikon SPA-Cm. Produkt o wielkości 400 bp sygnalizowałby obecność nieoznaczonej wersji genu.
      2. Równolegle z potwierdzeniem za pomocą PCR, należy przeprowadzić analizę Western blotting w celu weryfikacji insercji w ramce odczytu znacznika SPA, wykorzystując przeciwciało anty-FLAG M2 specyficzne dla epitopów FLAG znacznika SPA.21.
  7. Przechowywanie potwierdzonego szczepu donora
    1. Przenieś nocną hodowlę potwierdzonego rekombinowanego szczepu mutanta donora do oznakowanych krio-probówek, uzupełnij glicerolem do stężenia końcowego 15% i dokładnie wymieszaj. Do długotrwałego przechowywania krio-probówki należy trzymać w temperaturze -80 °C.

2. Rozmieszczanie mutantów biorców E. coli F- w macierzach do przesiewania metodą eSGA

  1. Za pomocą robota przenieś kolekcję pojedynczych mutantów z delecją nieessentialnych genów E. coli Keio wygenerowaną przez Mori et al. (3 968 szczepów11; F- BW25113; dostępna z Open Biosystems) na dwudziest cztery mikropłytki 384-dołkowe zawierające 80 μl płynnej pożywki LB na dołek, uzupełnionej o 50 μg/ml Kan.
    Uwaga: W celu systematycznej oceny GIs z genami essentialnymi, kolekcję biorczą Keio11 można uzupełnić o hipomorficzne szczepy mutantów z delecją genów essentialnych znakowanych Kan z tagami SPA na C-końcu22, 23.
  2. Aby zrobić miejsce dla szczepu kontrolnego obwodowego, który będzie służył jako kontrola pozytywna, pomagać w normalizacji wewnątrz i między płytkami, a także w automatycznej kwantyfikacji kolonii, usuń zaszczepioną pożywkę z zewnętrznych dołków każdej płytki z poprzedniego kroku i przenieś ją na nowe płytki, ponownie pozostawiając zewnętrzne dołki puste.
    Uwaga: Szczep kontrolny obwodowy JW5028 z kolekcji Keio11 posiada delecję niewielkiego pseudogenu, który nie powinien i nie wykazywał w naszych badaniach całego genomu GIs z żadnymi donatorami. Dlatego jest to dobry szczep kontrolny pozytywny do identyfikacji rzadkich przypadków, gdy konjugacja, przenoszenie lub selekcje zawiodły, co skutkuje brakiem lub sporadycznym wzrostem szczepu obwodowego. Na przykład, jeśli kolonie kontrolne obwodowe nie rosną po selekcji mutantów podwójnych, szczep badany może nie być zdolny do konjugacji, konjugacja mogła być próbą przeprowadzona w warunkach uniemożliwiających jej zajście (np. na płytce zawierającej antybiotyk) lub do płytki selekcyjnej dodano niewłaściwy antybiotyk. Podobnie, jeśli na całej płytce, w tym na obwodzie, obserwuje się bardzo mało, sporadycznych kolonii, konjugacja lub przenoszenie mogły zawieść i badanie musi zostać powtórzone. Jeśli taki sporadyczny wzrost obwodowy jest powtarzalny, może to wskazywać na konsekwentnie słabą konjugację donatora, a zatem przypadki, w których nie obserwuje się mutantów podwójnych, mogą wynikać z niepowodzenia konjugacji, a nie z prawdziwych GIs. Takie badania powinny zostać odrzucone z dalszej analizy. Ponadto, obecność szczepu kontrolnego obwodowego na wszystkich płytkach pozwala oprogramowaniu do kwantyfikacji kolonii automatycznie określać pozycje kolonii na płytkach z mutantami podwójnymi, dzięki czemu pozycje kolonii nie muszą być wyznaczane ręcznie. Wreszcie, szczep kontrolny obwodowy pomaga w normalizacji wielkości kolonii wewnątrz ( np. różne rzędy w obrębie jednej płytki) i między płytkami ( np. różne płytki biorcze zaszczepione tym samym donatorem w różnym czasie).
  3. W podobny sposób stwórz punkty kontroli negatywnej poprzez usunięcie dowolnych dwóch szczepów z różnych lokalizacji w obrębie każdej płytki (nie z obwodu) i przeniesienie szczepów na nową płytkę. Wypełnij te puste dołki pożywką LB zawierającą 17 μg/ml Cm. Oczekuje się, że punkty kontroli negatywnej będą puste w płytkach biorczych i tym samym w płytkach z mutantami podwójnymi, co pomaga upewnić się, że nie wystąpiły błędy przetwarzania lub obsługi płytek podczas numerowania, obrazowania lub przenoszenia szczepów.
    Uwaga: Te puste punkty są wymaganymi kontrolami negatywnymi. Kontrole negatywne pomagają zidentyfikować przypadki, gdy selekcja zawodzi – gdy szczepy kontroli negatywnej rosną podczas selekcji. Sugerujemy nie tylko wybór unikalnych punktów kontroli negatywnej dla każdej z płytek biorczych, ale także wybór punktów kontroli negatywnej w obrębie tego samego kwadrantu płytki (np. prawy dolny). W ten sposób wzór punktów kontroli negatywnej pozwoli zidentyfikować możliwe błędy w obsłudze płytek (np. błędne oznakowanie płytek lub przeniesienie ich „do góry nogami”, gdzie kolonia z lewego górnego rogu zostaje przeniesiona na pozycję prawego dolnego rogu).
  4. Zaszczep szczep Keio JW502811 z delecją pseudogenu do kolby 500 ml z 200 ml LB zawierającej 50 μg/ml Kan. Na podstawie naszych badań eSGA całego genomu, wzrost tego konkretnego mutanta jest najbliższy typu dzikiego BW25113 i dlatego jest on stosowany jako kontrola obwodowa.
  5. Hoduj ułożone szczepy, jak i kulturę JW5028 przez noc w temperaturze 32 °C przy wstrząsaniu orbitalnym 190 rpm do OD ~0,4-0,6 przy 600 nm. Po nocnej hodowli wypełnij dołki obwodowe około 80 μl nocnej kultury JW5028.
  6. Przygotowane płytki można wykorzystać w kroku 3.2. Alternatywnie, do długoterminowego przechowywania, uzupełnij każdy dołek w płytkach biorczych 15% glicerolem, wymieszaj pożywkę z glicerolem i przechowuj płytki w temperaturze -80 °C.

3. Procedura wysokozagęszczonego krzyżowania szczepów w celu wytworzenia podwójnych mutantów E. coli

  1. Hodować szczep donora Hfr, posiadający badaną mutację i znakowany Cm, przez noc w temperaturze 32 °C w bogatym płynnym medium LB-Cm (17 μg/ml Cm) przy wytrząsaniu z prędkością 220 rpm.
  2. Przenieść za pomocą pinu uporządkowaną kolekcję mutantów biorców w gęstości 384 kolonii na stałe płytki LB uzupełnione o 50 μg/ml Kan. Równolegle przenieść szczep badanego mutanta donora w gęstości 384 kolonii na taką samą liczbę płytek LB uzupełnionych o 17 μg/ml Cm. Inkubować płytki przez noc w temperaturze 32 °C.
    Uwaga: Płytki z biorcami używane do przenoszenia mogą wymagać do 36 hr, aby uzyskać kolonie wystarczająco duże do kolejnych etapów. Płytki są gotowe do przenoszenia, gdy średnica przeciętnej kolonii brzeżnej wynosi około 2 mm (lub więcej).
  3. Aby przeprowadzić koniugację szczepów, przenieść donora z nocnej płytki donora o gęstości 384 kolonii na stałą płytkę LB. Następnie przenieść pojedynczą płytkę biorcy o gęstości 384 kolonii bezpośrednio na świeżo przeniesionego donora na płytce do koniugacji. Kontynuować przenoszenie, aż wszystkie pary donor-biorca zostaną poddane koniugacji na stałych płytkach LB. Inkubować przygotowane płytki do koniugacji w temperaturze 32 °C przez 16 do 24 hr.
    Uwaga: Poszczególne szczepy donora z pojedynczą mutacją mogą wykazywać zmienność wydajności kojenia w zależności od genu z powodu potencjalnego wpływu mutacji na koniugację, wydajność transferu DNA lub kondycję organizmu. Wzrost można zatrzymać w dowolnym momencie między 16 a 24 hr, gdy uzyskano kolonie wystarczająco duże do kolejnych etapów przenoszenia. Koniugacje trwające od 16 do 24 hr dają wystarczającą liczbę eks-koniugantów dla powtarzalnych wyników eSGA, nawet w przypadku mutantów genów transferowanych późno lub mutantów o nieco niższej kondycji.
  4. Przenieść każdą płytkę do koniugacji o gęstości 384 kolonii na pojedynczą stałą płytkę LB zawierającą Cm (17 μg/ml) i Kan (50 μg/ml), aż wszystkie płytki do koniugacji zostaną przeniesione. Inkubować świeżo przygotowane płytki pierwszej selekcji przez 16-36 hr w temperaturze 32 °C.
    Uwaga: W odniesieniu do etapów selekcji, różne ekrany donorowe mogą wymagać różnego amount czasu. Ponieważ wszystkie podwójne mutanty w danym ekranie mają tę samą mutację donora, średnio wolniej rosnący mutant donora daje początek wolniej rosnącym podwójnym mutantom. Zatem, w zależności od kondycji donora, etapy selekcji mogą wymagać od 16 do 36 hr. Wzrost podwójnych mutantów można zatrzymać, gdy są one wystarczająco duże do kolejnego etapu – przeniesienia po pierwszej selekcji lub obrazowania po drugiej. Zwykle przekłada się to na średnicę kolonii kontrolnych na brzegu wynoszącą co najmniej 2 mm.
  5. Ponownie przenieść każdą płytkę pierwszej selekcji na drugą płytkę selekcyjną z podwójnym antybiotykiem (Cm i Kan) w formacie 1 536 kolonii, tak aby każda kolonia z pierwszej selekcji była reprezentowana przez cztery kolonie na drugiej płytce selekcyjnej. Inkubować płytki przez 16-36 hr w temperaturze 32 °C. Wykonać zdjęcia końcowych płytek selekcji podwójnych mutantów, aby ilościowo zmierzyć kondycję wzrostu mutanta i przeanalizować interakcje między parami genów (Rycina 3).
    Uwaga: Chociaż częstotliwość merodiploidii (częściowych duplikacji chromosomowych) jest niska i wynosi około 1/1 000 komórek24, merodiploidia może maskować GI. Dlatego zalecamy uwzględnienie replik biologicznych we wszystkich ekranach eSGA. Na szczęście komercyjne płytki jednorazowe i plastikowe pady do pinowania mogą być ponownie wykorzystane do trzech razy poprzez sterylizację materiałów w następujący sposób: agar z płytek jest usuwany, a płytki oraz pady są sterylizowane poprzez moczenie w 10% wybielaczu przez noc, a następnie płukanie wodą destylowaną, mycie w 70% etanolu i suszenie plastikowych elementów na powietrzu w komorze z laminarnym przepływem powietrza pod światłem ultrafioletowym. Sterylne pady i płytki przechowuje się w szczelnych sterylnych workach plastikowych do momentu użycia.

4. Przetwarzanie danych i wyznaczanie wyników GI

  1. Zmierzyć kolonie na każdej płytce w trybie seryjnym lub indywidualnie, korzystając ze specjalistycznego oprogramowania do obrazowania kolonii 3, 9.
    Uwaga: Odpowiednia aplikacja do wysokoprzepustowego obrazowania i oceny kolonii oparta na języku Java jest obecnie dostępna bezpłatnie dla użytkowników (http://srcollins77.users.sourceforge.net/). Oprogramowanie działa na różnych platformach (np. Mac lub PC) i może być uruchamiane jako plik wykonywalny lub z okna terminala).
  2. Znormalizować surowe pomiary wielkości kolonii, korygując błędy systematyczne w obrębie i pomiędzy płytkami, takie jak efekty brzegowe płytek, efekty zmienności między płytkami, nierównomierne oświetlenie obrazu, artefakty wynikające z fizycznej krzywizny powierzchni agaru, efekty konkurencji sąsiednich kolonii i ewentualne defekty nakłuwania, a także różnice w czasie wzrostu9. Te systematyczne artefakty są niezależne od kondycji podwójnego mutanta i powinny zostać skorygowane, ponieważ prowadzą do błędnych szacunków kondycji wzrostu.
  3. Kolonie w rzędach i kolumnach brzegowych mają tendencję do bycia większymi ze względu na mniejszą konkurencję o składniki odżywcze niż w centrum płytki. Aby zatem skorygować ten efekt, należy przeskalować wielkości kolonii brzegowych tak, aby mediana wielkości w danym rzędzie lub kolumnie była równa medianie wielkości kolonii w centrum płytki.
  4. Przeanalizować wyniki statystycznie, aby uwzględnić powtarzalność oraz odchylenie standardowe od median wielkości w powtórnych pomiarach kolonii. W celu oceny powtarzalności eksperymentalnej niezbędne są co najmniej trzy niezależne powtórzenia biologiczne.
  5. Na koniec, wykorzystać znormalizowane mediany wielkości kondycji wzrostu kolonii do wygenerowania wyniku GI (S) dla każdej pary genów, stosując następujący wzór:

Wzór na wynik S dla analizy statystycznej, równanie z komponentami średniej i wariancji w kontekście badawczym.
Gdzie Svar = (varExp x (nExp-1) + varCont x (nCont -1)) / (nExp + nCont -2); varExp = maksymalna wariancja znormalizowanych rozmiarów kolonii dla podwójnego mutanta; varCont = mediana wariancji znormalizowanych rozmiarów kolonii podwójnego mutanta ze zbioru referencyjnego; nExp = liczba pomiarów rozmiarów kolonii podwójnego mutanta; nCont = mediana liczby powtórzeń eksperymentalnych we wszystkich eksperymentach; μExp = mediana znormalizowanych rozmiarów kolonii podwójnych mutantów; oraz μCont = mediana znormalizowanych rozmiarów kolonii dla wszystkich podwójnych mutantów pochodzących z pojedynczego szczepu mutanta donora. Wynik S odzwierciedla zarówno pewność statystyczną domniemanej interakcji digenicznej, jak i biologiczną siłę tej interakcji. Silne dodatnie wyniki S wskazują na efekty łagodzące, co sugeruje, że oddziałujące geny uczestniczą w tej samej ścieżce9, podczas gdy istotne ujemne wyniki S odzwierciedlają syntetyczną chorobowość lub letalność, co często sugeruje przynależność do równoległych ścieżek redundantnych9. W celu określenia funkcjonalnych zależności na poziomie ścieżki, z końcowego zbioru danych generowany jest pojedynczy wynik S dla każdej pary badanych genów.
Uwaga: W naszym poprzednim badaniu9 stwierdziliśmy, że rekombinacja ma tendencję do występować rzadziej między genami oddalonymi od siebie o mniej niż 30 kbp. Dlatego w analizach dalszych, po normalizacji i wygenerowaniu wyników, usuwamy interakcje między genami znajdującymi się w odległości do 30 kbp od siebie. Oprócz samych GI, zależności funkcjonalne między parami genów można badać, analizując podobieństwo profili GI obu genów. Profil GI genu to zbiór wszystkich interakcji tego genu ze wszystkimi innymi genami w genomie poza obszarem sprzężenia danego genu. Geny podobne funkcjonalnie wykazują tendencję do wyższych korelacji profili interakcji genetycznych12, 25. Zatem poprzez obliczenie współczynników korelacji dla wszystkich genów w eksperymentalnym zbiorze danych można wykorzystać eSGA do badania zależności funkcjonalnych nawet pomiędzy genami leżącymi blisko siebie na chromosomie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Interakcje genetyczne (GI) ujawniają funkcjonalne zależności między genami. Podobnie, ponieważ geny w tej samej ścieżce wykazują podobne wzorce GI, a podobieństwo profili GI reprezentuje zgodność fenotypów, możemy grupować funkcjonalnie powiązane geny w ścieżki poprzez klasteryzację ich profili GI. Integracja sieci GI i korelacji GI z informacjami o oddziaływaniach fizycznych lub innymi danymi o powiązaniach, takimi jak relacje kontekstu genomicznego (GC), może również ujawnić organizację funkcjonalnych modułów wyższego ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Przedstawiliśmy krok po kroku protokół wykorzystania robotycznego przesiewania metodą eSGA do badania funkcji genów bakteryjnych na poziomie szlaków poprzez analizę GI. Podejście to można stosować do badania pojedynczych genów, jak i całych systemów biologicznych w E. coli. Staranne wykonanie opisanych powyżej kroków eksperymentalnych, z uwzględnieniem wszystkich odpowiednich kontroli, a także rygorystyczna analiza i niezależna walidacja danych GI są kluczowymi aspektami sukcesu metody eSGA w odkrywaniu nowych f...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Niniejsza praca została sfinansowana ze środków Genome Canada, Ontario Genomics Institute oraz grantów Canadian Institutes of Health Research przyznanych J.G. i A.E. AG jest laureatem stypendium Vanier Canada Graduate Scholarship.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
I. Antybiotyki
ChloramfenikolSklep z odczynnikami i sprzętem laboratoryjnym#CLR201
Kanamycyna#KAN201
Ampicylina# AMP201
2. Pożywka Luria-Bertani
Sproszkowana pożywka LBSklep biotechnologiczny#LBL405
AgarSklep biologiczny#AGR003
3. Szczepy bakteryjne i plazmidy
Szczep Hfr Cavalli λczerwony system (JL238)Babu i wsp.14.
pKD3E. coli Genetic Stock Centre, Yale
Keio E. coli Kolekcja szczepów biorców F-Krajowy Projekt Biozasobów (NBRP) w Japonii11
Hypomorficzny E. coli szczepy F- z tagiem SPAOtwarte biosystemy; Babu i wsp.14
4. Startery
odsolone startery stałe oparte na wektorze pKD3F1: 5'-GGCTGACATGGGAATTAGC-3''
R1: 5'-AGATTGCAGCATTACACGTCTT-3'
Odsolone primery niestandardoweCm-R: 5'-TTATACGCAAGGCGACAAGG-3''
Cm-F: 5'- GATCTTCCGTCACAGGTAGG-3'
Odsolone startery niestandardoweF2 i R2: 20 nt stałych regionów opartych na sekwencji pKD3 oraz 45 nt niestandardowych regionów homologii
Region stały F2:
5'-CATATGAATATCCTCCTTA-3''
Region stały R2:
5'-TGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3' S1 i S2: 27 nt stałych regionów do inicjacji amplifikacji kasety SPA-Cm oraz 45 nt niestandardowych regionów homologii
Region stały S1:
5'AGCTGGAGGATCCATGGAAAAGAGAAG -3'
region stały S2:
5'- GGCCCCATATGAATATCCTCCTTAGTT -3''

KOCO-F i KOCO-C: primery o długości 20 nt, zlokalizowane 200 bp od miejsca delecji genu nieessentialnego lub genu essentialnego
miejsce insercji znacznika SPA w genie
5. Odczynniki do PCR i elektroforezy
polimeraza DNA TaqFermentas# EP0281
bufor do PCR 10XFermentas# EP0281
10 mM dNTPFermentas# EP0281
25 mM MgCl22Fermentas# EP0281
AgarozaSklep z odczynnikami i sprzętem laboratoryjnym# AGA002
Barwnik do ładowaniaNEB#B7021S
Bromek etydynySklep z odczynnikami i sprzętem laboratoryjnym# ETB444
bufor TBE 10XSklep z odczynnikami i sprzętem laboratoryjnym# ETB444.10
Tris (zasada)Sklep biotechnologiczny# TRS001
Kwas borowySigma# T1503-1KG
0,5 M EDTA (pH 8,0)Sigma# B6768-500G
Marker wielkości DNANEB#N3232L
6. Zestawy do izolacji i oczyszczania DNA
Zestaw do izolacji i oczyszczania DNA genomowegoPromega#A1120
Zestaw do midi-preparatyki plazmidówQiagen# 12143
zestaw do oczyszczania produktów PCR QIAquickQiagen#28104
7. Wyposażenie do PCR, transformacji i przenoszenia kolonii metodą replica-pinningu
TermocyklerBioRad, iCycler
Elektroforeza w żelu agarozowymBioRad
ElektroporatorBio-Rad GenePulser II
kuweta do elektroporacji 0,2 cmBio-Rad
42 °łaźnia wodna z wytrząsaniemInnova 3100
wirówka Beckman Coulter TJ-25Beckman Coulter
32 °inkubator z wytrząsaniemNew Brunswick Scientific, USA
32 °inkubator do płytek CFisher Scientific
robot laboratoryjny RoToR-HDASinger Instruments
podkładki o gęstości 96, 384 i 1536 pinówSinger Instruments
96 lub 384 długie pinySinger Instruments
8. Sprzęt obrazujący
Statyw do aparatuKaiser
Aparat cyfrowy, 10 megapikseliDowolny dostawca
Stoły świetlne, Testrite 16" x 24" jednostkiTestrite
9. Recykling podkładek lub płytek
10% roztwór wybielaczaDowolny dostawca
70% etanolDowolny dostawca
Sterylna woda destylowanaDowolny dostawca
Dygestorium z laminarnym przepływem powietrzaDowolny dostawca
Lampa ultrafioletowaDowolny dostawca
10. Sprzęt laboratoryjny
probówki polipropylenowe 50 mlDowolny dostawca
probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mlDowolny dostawca
kolby stożkowe 250 mlVWR# 29140-045
sterylne probówki do hodowli o pojemności 15 mlThermo Scientific# 366052
Probówki kriogeniczneVWR# 479-3221
Płytki prostokątneSinger Instruments
płytki mikrotitracyjne 96- i 384-dołkoweSinger InstrumentsNunc
Rolka do uszczelniania płytek wielodołkowychSigma#R1275
płytkiABgene# AB-0580
Samoprzylepne uszczelki do płytekFisher Scientific# 13-990-14
-80 °Zamrażarka CDowolny dostawca

Bibliografia

  1. Bandyopadhyay, S., Kelley, R., Krogan, N. J., Ideker, T. Functional maps of protein complexes from quantitative genetic interaction data. PLoS Comput. Biol. 4, e1000065(2008).
  2. Costanzo, M., Baryshnikova, A., Myers, C. L., Andrews, B., Boone, C. Charting the genetic interaction map of a cell. Curr. Opin. Biotechnol. 22, 66-74 (2011).
  3. Costanzo, M., et al. The genetic landscape of a cell. Science. 327, 425-4231 (2010).
  4. Fiedler, D., et al. Functional organization of the S. cerevisiae phosphorylation network. Cell. 136, 952-963 (2009).
  5. Roguev, A., et al. Conservation and rewiring of functional modules revealed by an epistasis map in fission yeast. Science. 322, 405-4010 (2008).
  6. Schuldiner, M., et al. Exploration of the function and organization of the yeast early secretory pathway through an epistatic miniarray profile. Cell. 123, 507-519 (2005).
  7. Wilmes, G. M., et al. A genetic interaction map of RNA-processing factors reveals links between Sem1/Dss1-containing complexes and mRNA export and splicing. Mol. Cell. 32, 735-746 (2008).
  8. Babu, M., et al. Systems-level approaches for identifying and analyzing genetic interaction networks in Escherichia coli and extensions to other prokaryotes. Mol. Biosyst. 12, 1439-1455 (2009).
  9. Butland, G., et al. coli synthetic genetic array analysis. Nat. Methods. 5, 789-7895 (2008).
  10. Typas, A., et al. Regulation of peptidoglycan synthesis by outer-membrane proteins. Cell. 143, 1097-10109 (2010).
  11. Baba, T., et al. Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection. Mol. Syst. Biol. 2, 2006-200008 (2006).
  12. Babu, M., et al. Genetic interaction maps in Escherichia coli reveal functional crosstalk among cell envelope biogenesis pathways. PLoS Genet. 7, e1002377(2011).
  13. Nichols, R. J., et al. Phenotypic landscape of a bacterial cell. Cell. 144, 143-156 (2011).
  14. Babu, M., Gagarinova, A., Greenblatt, J., Emili, A. Array-based synthetic genetic screens to map bacterial pathways and functional networks in Escherichia coli. Methods Mol Biol. 765, 125-153 (2011).
  15. Datsenko, K. A., Wanner, B. L. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 6640-665 (2000).
  16. Yu, D., et al. An efficient recombination system for chromosome engineering in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 5978-5983 (2000).
  17. Typas, A., et al. quantitative analyses of genetic interactions in. E. coli. Nat. Methods. 5, 781-787 (2008).
  18. Zeghouf, M., et al. Sequential Peptide Affinity (SPA) system for the identification of mammalian and bacterial protein complexes. J. Proteome Res. 3, 463-468 (2004).
  19. Davierwala, A. P., et al. , 1147-1152 (2005).
  20. Breslow, D. K., et al. A comprehensive strategy enabling high-resolution functional analysis of the yeast genome. Nat. Methods. 5, 711-718 (2008).
  21. Babu, M., et al. Sequential peptide affinity purification system for the systematic isolation and identification of protein complexes from Escherichia coli. Methods Mol. Biol. 564, 373-400 (2009).
  22. Butland, G., et al. Interaction network containing conserved and essential protein complexes in Escherichia coli. Nature. 433, 531-537 (2005).
  23. Hu, P., Janga, S. C., Babu, M., Diaz-Mejia, J. J., Butland, G., et al. Global functional atlas of Escherichia coli encompassing previously uncharacterized proteins. PLoS Biol. 7, (2009).
  24. Anderson, R. P., Roth, J. R. Tandem genetic duplications in phage and bacteria. Annu. Rev. Microbiol. 31, 473-505 (1977).
  25. Boone, C., Bussey, H., Andrews, B. J. Exploring genetic interactions and networks with yeast. Nat. Rev. Genet. 8, 437-449 (2007).
  26. Collins, S. R., et al. Functional dissection of protein complexes involved in yeast chromosome biology using a genetic interaction map. Nature. 446, 806-8010 (2007).
  27. Le Meur, N., Gentleman, R. Modeling synthetic lethality. Genome Biol. 9, R135(2008).
  28. Tong, A. H., et al. Systematic genetic analysis with ordered arrays of yeast deletion mutants. Science. 294, 2364-2368 (2001).
  29. Tong, A. H., et al. Global mapping of the yeast genetic interaction network. Science. 303, 808-813 (2004).
  30. Wong, S. L., et al. Combining biological networks to predict genetic interactions. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 15682-15687 (2004).
  31. van Opijnen, T., Bodi, K. L., Camilli, A. Tn-seq: high-throughput parallel sequencing for fitness and genetic interaction studies in microorganisms. Nat. Methods. 6, 767-772 (2009).
  32. Gagarinova, A., Emili, A. Genome-scale genetic manipulation methods for exploring bacterial molecular biology. Mol. Biosyst. 8, 1626-1638 (2012).
  33. Dewey, C. N., et al. Positional orthology: putting genomic evolutionary relationships into context. Brief Bioinform. 12, 401-412 (2011).
  34. St Onge, R. P., et al. Systematic pathway analysis using high-resolution fitness profiling of combinatorial gene deletions. Nat. Genet. 39, 199-206 (2007).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Syntetyczna macierz genetycznaprzesiewanie interakcji genetycznychformat macierzy koloniianaliza podwójnych mutantówzautomatyzowane przetwarzanie obrazuselekcja chloramfenikolemselekcja kanamycynąrekombinacja homologicznakwantyfikacja kondycji
Mapowanie bakteryjnych sieci funkcjonalnych i szlaków w Escherichia Coli z wykorzystaniem syntetycznych macierzy genetycznych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.