Mapowanie funkcjonalnych sieci i szlaków bakteryjnych w Escherichia Coli przy użyciu syntetycznych macierzy genetycznych

Podsumowanie

Systematyczne, wielkoskalowe syntetyczne badania interakcji genetycznych (gen-gen lub epistaza) mogą być wykorzystywane do badania redundancji genetycznej i wzajemnych przesłuchów ścieżek. W tym miejscu opisujemy wysokoprzepustową ilościową technologię badań przesiewowych syntetycznych macierzy genetycznych, zwaną eSGA, którą opracowaliśmy w celu wyjaśnienia relacji epistatycznych i zbadania sieci interakcji genetycznych w Escherichia coli.

Streszczenie

Fenotypy są determinowane przez złożony szereg fizycznych (np. białko-białko) i funkcjonalnych (np. gen-gen lub genetyczny) interakcji (GI)¹. Chociaż interakcje fizyczne mogą wskazywać, które białka bakteryjne są powiązane jako kompleksy, niekoniecznie ujawniają one relacje funkcjonalne na poziomie szlaku1. Badania przesiewowe przewodu pokarmowego, w których mierzy się wzrost podwójnych mutantów zawierających dwa usunięte lub inaktywowane geny i porównuje je z odpowiadającymi im pojedynczymi mutacjami, mogą rzucić światło na epistatyczne zależności między loci, a tym samym zapewnić środki do badania i odkrywania nowych relacji funkcjonalnych². Mapy przewodu pokarmowego na dużą skalę zostały zgłoszone dla organizmów eukariotycznych, takich jak drożdże^3-7, ale informacje o IG pozostają rzadkie dla prokariontów⁸, co utrudnia funkcjonalną adnotację genomów bakteryjnych. W tym celu wraz z innymi opracowaliśmy wysokoprzepustowe ilościowe metody badań przesiewowych bakteryjnego przewodu pokarmowego^{9, 10}.

Tutaj prezentujemy kluczowe kroki wymagane do przeprowadzenia ilościowej procedury przesiewowej E. coli Synthetic Genetic Array (eSGA) w skali genomu⁹, wykorzystując naturalną koniugację bakteryjną i homologiczną rekombinację do systemowego generowania i mierzenia dopasowania dużej liczby podwójnych mutantów w formacie tablicy kolonii. Krótko mówiąc, robot jest używany do przenoszenia, poprzez koniugację, chloramfenikolu (Cm) - oznaczonych zmutowanymi allelami z zaprojektowanych "szczepów dawcy" Hfr (High frequency of recombination) do uporządkowanej macierzy kanamycyny (Kan) - szczepów biorcy F. Zazwyczaj używamy pojedynczych mutantów z utratą funkcji z nieistotnymi delecjami genów (np. kolekcja "Keio"¹¹) i niezbędnymi mutacjami hipomorficznymi genów (tj. allelami nadającymi zmniejszoną ekspresję białka, stabilność lub aktywność^{9, 12, 13}) w celu zbadania funkcjonalnych powiązań odpowiednio genów nieistotnych i niezbędnych. Po koniugacji i następującej po niej wymianie genetycznej, w której pośredniczy rekombinacja homologiczna, powstałe podwójne mutanty są selekcjonowane na pożywce stałej zawierającej oba antybiotyki. Po wyrośnięciu płytki są obrazowane cyfrowo, a rozmiary kolonii są ilościowo oceniane za pomocą własnego automatycznego systemu przetwarzania obrazu¹⁴. Indeksy glikemiczne ujawniają się, gdy tempo wzrostu podwójnego mutanta jest albo znacznie lepsze, albo gorsze niż oczekiwano⁹. Pogarszające (lub ujemne) GI często wynikają między mutacjami powodującymi utratę funkcji w parach genów ze szlaków kompensacyjnych, które wpływają na ten sam podstawowy proces². W tym przypadku utrata pojedynczego genu jest buforowana, tak że każdy pojedynczy mutant jest zdolny do życia. Jednak utrata obu szlaków jest szkodliwa i powoduje syntetyczną śmiertelność lub chorobę (tj. powolny wzrost). I odwrotnie, łagodzące (lub pozytywne) interakcje mogą wystąpić między genami w tym samym szlaku lub kompleksie białkowym², ponieważ sama delecja któregokolwiek genu jest często wystarczająca, aby zakłócić normalną funkcję szlaku lub kompleksu, tak że dodatkowe perturbacje nie zmniejszają aktywności, a tym samym wzrostu, dalej. Ogólnie rzecz biorąc, systematyczna identyfikacja i analiza sieci przewodu pokarmowego może dostarczyć bezstronnych, globalnych map funkcjonalnych relacji między dużą liczbą genów, z których można wywnioskować informacje na poziomie szlaku pominięte w innych podejściach9.

Protokół

1. Konstruowanie zmutowanych szczepów dawcy Hfr Cavalli poprzez rekombinację^{15, 16}

Kroki do konstruowania barwników dawcy eSGA są opisane poniżej. Krótko mówiąc, używamy ukierunkowanej rekombinacji homologicznej za pośrednictwem λ- Red¹⁶ amplifikowanych selektywnych fragmentów kasety markerów DNA generowanych przez PCR w celu stworzenia nieistotnych mutantów delecji genów (sekcja 1.1) lub niezbędnych hipomorficznych zmutowanych szczepów dawcy genów (sekcja 1.2), które są następnie używane jako "zapytania" do zdefiniowania sieci GI.

Uwaga: Podczas procesu rozwoju technologii oceniliśmy skuteczność wykorzystania transferu koniugacyjnego za pośrednictwem Hfr do łączenia mutacji przy użyciu dobrze zdefiniowanego szczepu dawcy Hfr (Hfr Cavalli, Hfr Hayes i Hfr 3000). Zbadaliśmy (i) zdolność do efektywnego wytwarzania mutantów dawcy przy użyciu metody rekombinacji zapoczątkowanej przez Yu i in. (2000)¹⁶, (ii) względną wydajność sprzęganego transferu DNA różnych markerów chromosomowych oraz (iii) wpływ pozycji genu zapytania i orientacji chromosomowej w stosunku do locus transferu Hfr, oriT. Odkryliśmy, że wydajność rekombinacji homologicznej za pośrednictwem λ-czerwieni była znacznie wyższa w Hfr Cavalli niż w Hfr Hayes lub Hfr3000. W razie potrzeby transdukcja P1 lub szczep Psuedo Hfr¹⁷ mogą być użyte do stworzenia zmutowanych dawców. Udało nam się zaadaptować wszystkie te metody do pozyskiwania i selekcji dużej liczby dawców. Ponieważ w naszych próbnych eksperymentach koniugacyjnych ogólna skuteczność transferu i liczba zaobserwowanych byłych koniugantów była znacznie wyższa w przypadku Hfr Cavalli, to konkretne tło szczepu zostało wybrane do budowy dawcy i eSGA na dużą skalę. Opisano wszystkie procedury dotyczące badań przesiewowych eSGA z wykorzystaniem dawców Hfr Cavalli.

1. Amplifikacja fragmentu DNA w celu późniejszej rekombinacji w celu usunięcia nieistotnego genu
   Zastosuj dwuetapową zagnieżdżoną amplifikację PCR (ryc. 1), aby utworzyć kasetę delecji genu do zastąpienia docelowej otwartej ramki odczytu markerem oporu Cm z plazmidu pKD3 (GI: 15554330; identyfikator białka: AAL02033.1)¹⁵. Marker jest otoczony miejscami^{FRT 11}, co pozwala na usunięcie genu oporności, jeśli to konieczne, w dalszych eksperymentach.
   Uwaga: Wykonujemy zagnieżdżony dwuetapowy PCR w celu usunięcia plazmidu ze amplifikowanego produktu, który jest następnie używany do transformacji komórek bakteryjnych. Usunięcie plazmidu (w pierwszym PCR), a następnie stworzenie kasety z nokautem genu w drugim PCR jest konieczne, ponieważ transformacja plazmidem jest znacznie bardziej wydajna niż rekombinacja, a celem jest uzyskanie - w jak największym stopniu - tylko szczepów, które z powodzeniem zastąpiły docelowe genomowe DNA markerem selektywnym. Alternatywą dla zagnieżdżonego PCR jest przeprowadzenie trawienia restrykcyjnego plazmidu poza regionem amplifikowanym w drugim etapie PCR. Następnie produkt trawienia restrykcyjnego jest oczyszczany i wykorzystywany jako matryca w zagnieżdżonym etapie PCR (1.1.2). Ta opcja jest również prosta, ale wymaga więcej czasu pracy.
   1. Użyj około 45 ng pKD3 jako matrycy w PCR ze starterami F1 do przodu i do tyłu R1, aby uzyskać produkt o stężeniu 1,070 pz. Oczyść fragment PCR za pomocą protokołu oczyszczania Qiagen PCR i rozcieńczyć produkt w sterylnej wodzie destylowanej do stężenia 5 ng/μl.
   2. Używając oczyszczonego produktu PCR jako matrycy, ustaw drugi PCR z zagnieżdżonymi starterami specyficznymi dla genu (np. nokaut), F2 i R2, które mają (i) 45 nt regionów homologii specyficznych dla genu na końcach 5', aby umożliwić rekombinację homologiczną bezpośrednio przed i za genem docelowym w celu zastąpienia go markerem oporności Cm i (ii) 20 nt na końcach 3', aby zapoczątkować syntezę markera Cm. Wielkość wydobytego fragmentu wynosi 1 123 pz. Regiony homologiczne specyficzne dla genu są zaprojektowane tak, aby usunąć docelową otwartą ramkę odczytu, pozostawiając nienaruszone wszelkie sąsiednie lub częściowo nakładające się segmenty kodujące. Po tym wzmocnieniu przejdź do kroku 1.3.
2. Amplifikacja kasety znakującej w celu stworzenia niezbędnej mutacji hipomorficznej genu
   1. Aby skonstruować hipomorficzne zmutowane szczepy dawcy, dodaj C-końcowy znacznik fuzji sekwencyjnego powinowactwa peptydowego (SPA), który często nieznacznie wpływa na podstawową funkcję białka poprzez destabilizację obfitości transkryptu (tj. liczby kopii białka) lub fałdowania/aktywności białka. W tym celu należy utworzyć wybieralną matrycę DNA ze znacznikiem SPA (SPA-CM), przekształcając marker oporności Kan w pJL148¹⁸ na Cm przy użyciu rekombinacji między identycznymi sekwencjami nukleotydowymi flankującymi marker Kan w pJL148 i marker Cm w pKD3¹⁵. Otrzymany szablon składa się z wbudowanego w ramkę znacznika SPA, po którym następuje znacznik oporu Cm, i nadaje się do amplifikacji PCR, rekombinacji, a następnie eSGA¹².
      Uwaga: Niezbędne geny są potencjalnie najbardziej interesujące dla badań nad funkcją genów. Ponieważ jednak genów tych nie można usunąć, konieczne było opracowanie innowacyjnych metod badania funkcjonalnych powiązań między niezbędnymi genami. Początkowo opracowano kilka odpowiednich, bardzo skutecznych podejść dotyczących drożdży. Na przykład Davierwala i in. (2005)¹⁹ przeprowadzili badania przesiewowe przewodu pokarmowego przy użyciu panelu 575 wrażliwych na temperaturę mutantów genów egzogennych i odkryli, że niezbędne geny wykazywały około pięciokrotnie większą liczbę IG niż geny nieistotne. Podobnie Breslow i in. (2008)²⁰ opracowali podejście "zmniejszonej obfitości przez zaburzenia mRNA" (DAmP) w celu wygenerowania biblioteki hipomorficznych alleli obejmujących ~82% niezbędnych genów drożdży w celu zbadania szlaków i kompleksów. Podejście DAmP modyfikuje koniec 3' ekspresji mRNA, zmniejszając poziom docelowego genu⁶, prawdopodobnie z powodu destabilizacji mRNA. Podobnie jak w przypadku podejścia DAmP⁶, nasza strategia polegała na wykorzystaniu subtelnych efektów zakłócania końca 3' ekspresji mRNA niezbędnych białek.
      Jak opisujemy poniżej, znacznik sam w sobie prawdopodobnie nie wpływa na fałdowanie lub funkcję białka, ale subtelne zaburzenie mRNA przez znacznik jest wystarczające, w połączeniu ze stresorami środowiskowymi lub innymi mutacjami, aby ujawnić funkcjonalnie informacyjne interakcje gen-środowisko ¹³ i gen-gen ^{9, 12}.
      Po pierwsze, do tej pory użyliśmy znaczników SPA do oczyszczenia ~ 3,000 niezbędnych i nieistotnych białek E. coli^21-23, przy czym ponad 80% z 307 niezbędnych białek E. coli jest reprezentowanych wśród naszych szczepów znakowanych SPA⁸. Ponieważ znacznik został z powodzeniem wykorzystany do wyizolowania znanych kompleksów białkowych, które zostały wzajemnie zwalidowane (tj. ten sam kompleks można było wyizolować przez znakowanie i oczyszczanie różnych białek z tego samego kompleksu); a izolowane kompleksy były biologicznie istotne, uważamy, że znaczniki zwykle nie wpływają na fałdowanie białek ani funkcję¹². Podobnie, nasze niepublikowane obserwacje ujawniły, że znacznik sam w sobie zwykle nie wpływa na wzrost szczepu. Doszliśmy jednak do wniosku, że zmiana 3'-UTR poprzez integrację znacznika i kasety markera, jak to zgłoszono w przypadku szczepów DAmP⁶, może zdestabilizować niektóre transkrypty na poziomie RNA lub, w rzadkich przypadkach, utrudnić prawidłowe fałdowanie lub funkcję białek fuzyjnych. Dlatego przewidywaliśmy, że połączenie takich zaburzonych alleli niezbędnych genów z innymi funkcjonalnie istotnymi mutacjami w innym miejscu genomu skutkowałoby informacyjnymi indeksami glikemicznymi, co rzeczywiście zaobserwowano^{9, 12}. Co więcej, znakowane SPA allele niezbędnych genów wykazywały interakcje gen-środowisko (np. nadwrażliwość na leki) zgodnie z profilowaniem fenotypowym Nichols i in. (2011)¹³, którzy poddali podzbiór niezbędnych szczepów oznaczonych SPA różnym warunkom wzrostu. To samo badanie potwierdziło, że większość (54 z 58 przetestowanych) szczepów podstawowych znakowanych SPA wykazywała upośledzoną przydatność w jednym lub więcej warunkach hodowli¹³, co potwierdza pogląd, że znacznik SPA często tworzy łagodne allele hipomorficzne w podstawowych genach, które są przydatne w zastosowaniach przesiewowych przewodu pokarmowego całego genomu, w tym eSGA.
   2. Amplifikować kasetę znakującą z matrycy SPA-Cm za pomocą specyficznych dla genu starterów S1 i S2, z których każdy zawiera (i) region specyficzny dla genu 45 nt do rekombinacji homologicznej na końcu 5', a następnie (ii) sekwencję specyficzną dla SPA-Cm 27 pz na końcu 3'.
3. Potwierdzanie i oczyszczanie produktu PCR
   1. Upewnij się, że kaseta znakująca została prawidłowo amplifikowana, poddając 2-5 μl produktu PCR elektroforezie w żelu agarozowym i oczyść pozostałe DNA zgodnie ze standardowym protokołem oczyszczania PCR producenta (Qiagen). Produkt PCR należy wypłukać w 30 μl sterylnej wody destylowanej i rozcieńczyć do stężenia ~50 ng/μl. Oczyszczony produkt może być natychmiast zużyty w procesie przemiany (krok 1.5) lub przechowywany w temperaturze -20 °C przez okres do 6 miesięcy.
4. Przygotowanie kompetentnych komórek Hfr Cavalli do budowy dawców
   1. Zaszczepić jeden ml nasyconej przez noc kultury szczepu Hfr Cavalli w 70 ml świeżej pożywki Luria-Bertani (LB) z 35 μl 50 μg/ml ampicyliny w kolbie o pojemności 250 ml. Inkubować kulturę w temperaturze 32 °C z wytrząsaniem przy 220 obr./min, aż do uzyskania gęstości optycznej (OD) 600 nm ~0,5-0,6 (~2 godz.).
   2. Przenieść kulturę do łaźni wodnej w celu indukcji ciepła_czerwonego układu rekombinacji λ¹⁶ w temperaturze 42 °C przez 15 minut z wytrząsaniem przy 160 obr./min. Zatrzymaj indukcję, przenosząc kulturę do schłodzonej łaźni wodnej z zawiesiną lodową na 10-20 minut przy 160 obr./min. Upewnij się, że komórki są zimne od tego momentu do momentu transformacji; Używaj probówek i kuwet, które zostały schłodzone na lodzie przez co najmniej 15 minut przed użyciem.
   3. Podzielić kulturę równo na 2 wstępnie schłodzone probówki polipropylenowe o pojemności 50 ml (~35 ml kultury na probówkę) i odwirować przy 4 400 x g przez 6 minut w temperaturze 4 °C.
   4. Wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy przez delikatne odwrócenie w ~ 50 ml lodowatej sterylnej wody destylowanej. Ponownie odwirować komórki przy 4 400 x g przez 6 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić każdą komórkę w 20 ml lodowatego sterylnego 10% glicerolu i ponownie odwirować, jak opisano powyżej.
   5. Zdekantować supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 500 μl lodowatego 10% glicerolu. Przygotowane kompetentne komórki w objętości 50 μl podzielić na pojedyncze, wstępnie schłodzone mikroprobówki wirówkowe o pojemności 1,5 ml w celu natychmiastowego przekształcenia. Komórki można zamrozić na suchym lodzie lub w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C przez okres do 3 miesięcy. Jednak wydajność transformacji jest najwyższa w przypadku świeżo przygotowanych, kompetentnych komórek.
5. przekształcenie
   1. Dodać 100 ng oczyszczonego produktu PCR z kroku 1.3.1 do właściwych komórek. Przesuń rurkę i pozwól zawiesinie siedzieć na lodzie przez 5 minut.
   2. Przenieś zawiesinę lodowato zimnych kompetentnych komórek i DNA do wstępnie schłodzonej kuwety do elektroporacji. Wymieszaj ogniwo elektroporacyjne z ustawieniem 2,5 kV, 25 μF, 200 omów w kuwecie o odstępie 2 mm (tj. jeśli używasz innej kuwety, zapoznaj się z instrukcjami producenta dotyczącymi ustawień elektroporacji) i natychmiast dodaj 1 ml pożywki SOC o temperaturze pokojowej. Przenieść elektroporowane komórki w pożywce SOC do probówki hodowlanej o pojemności 15 ml i inkubować w temperaturze 32 °C przez 1 godzinę z wytrząsaniem orbitalnym przy 220 obr./min.
   3. Po inkubacji odwirować komórki o sile 4 400 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Usunąć około 850 μl supernatantu i ponownie zawiesić osad komórek w pozostałej cieczy.
   4. Rozprowadzić komórki na wstępnie ogrzanych płytkach LB zawierających 17 μg/ml Cm i inkubować w temperaturze 32 °C przez noc. Wybierz dwie pojedyncze kolonie transformantów i rozłóż je na płytkach LB-Cm, aby potwierdzić mutacje. Zalecamy unikanie największych kolonii transformantów, aby zmniejszyć możliwość wyboru szczepów z rzadkimi mutacjami supresorowymi. Smugi tych samych transformantów na LB-Kan, aby potwierdzić, że szczepy nie są odporne na Kan.
      Uwaga: Ponieważ marker odporności Cm jest używany do wytwarzania szczepów dawcy, nie oczekujemy, że mutanty dawcy będą odporne na Kan. Umieszczając transformanty zarówno na płytkach LB-Kan, jak i LB-Cm, upewniamy się, że sama mutacja dawcy nie spowodowała w jakiś sposób oporności na Kan. Gdyby ten krok nie został wykonany, a docelowe mutacje wpłynęłyby na zdolność szczepu do przetrwania na Kan, podwójne mutanty nie zostałyby skutecznie wytworzone przy użyciu eSGA, ponieważ szczepy dawcy przetrwałyby wszystkie etapy selekcji. Jest to jedynie zapobiegawczy krok logiczny mający na celu wychwycenie nieoczekiwanych fenotypów lub innych problemów, które mogą przeszkadzać w ukończeniu badań przesiewowych eSGA. Jeśli ten krok zostanie pominięty, inne kontrolki nadal będą identyfikować uszkodzone ekrany. Jednak wcześniejsze wykrycie dawcy, który jest odporny na Kan, wyeliminowałoby szereg bezproduktywnych i niepotrzebnych kroków. Inne możliwe powody, dla których szczep rośnie na Kan, mogą obejmować na przykład przeterminowany antybiotyk, a także użycie niewłaściwego produktu PCR lub szczepu do transformacji. Wszystkie te problemy można zidentyfikować i rozwiązać na wczesnym etapie procedury za pomocą tej kontroli, która nie jest wymagana, ale zalecana w przypadku eSGA.
6. Potwierdzenie delecji genu innego niż istotnego (etap 1.6.1) lub mutacji hipomorficznej genu zasadniczego (sekcja 1.6.2)
   Uwaga: Podczas potwierdzania delecji genu metodą PCR, jako kontrolę należy użyć genomowego DNA ze szczepu typu dzikiego.
   1. Potwierdzanie nieistotnej delecji genu
      1. Aby potwierdzić delecję genu metodą PCR, należy wyizolować genomowe DNA z przekształconych, przypuszczalnych szczepów nokautowych wyhodowanych w płynnym podłożu LB-CM, postępując zgodnie z instrukcjami producenta (Promega).
      2. Aby potwierdzić udaną rekombinację, amplifikuj DNA z każdego transformantu za pomocą trzech różnych zestawów starterów potwierdzających nokaut. Przeprowadź reakcje z ~150 ng matrycy genomowego DNA i potwierdź prawidłowe rozmiary fragmentów, uruchamiając produkty syntetyzowane przez PCR na żelu agarozowym.
      3. Pierwszy zestaw starterów składa się z 20-nt flankującego startera, umieszczonego 200 pz przed obszarem docelowym (KOCO-F) oraz startera Cm-R, który jest komplementarny do sekwencji kasety CM. Oczekuje się, że ta amplifikacja wytworzy amplikon 445 nt w mutancie, ale nie w szczepie typu dzikiego (ryc. 1).
      4. Drugi zestaw zawiera starter do przodu (Cm-F), wyżarzanie do sekwencji kasety Cm oraz starter potwierdzający 20-nt z odwrotnym flankowaniem (KOCO-R), który jest przeznaczony do wyżarzania 200 pz za końcem 3' usuniętego genu. Oczekuje się, że ta reakcja amplifikacji wytworzy amplikon 309 nt w mutancie, ale nie w szczepie typu dzikiego (ryc. 1).
      5. Trzeci PCR zawiera startery KOCO-F i KOCO-R. Reakcja ta jest wymagana do potwierdzenia, że wybrany szczep nie jest merodiploidem, przy czym jeden locus genu został zastąpiony przez kasetę, a inna zduplikowana, ale poza tym kopia genu typu dzikiego jest nadal obecna. Oczekuje się, że ta amplifikacja z poprawnego mutanta delecji da produkt o wielkości 1,4 kb (rysunek 1).
         Uwaga: Gdy gen docelowy ma mniej więcej taką samą długość w parach zasad jak kaseta delecji genu, nie zauważy się różnicy między locus, który został zastąpiony przez kasetę, a locus, który tego nie zrobił. Aby uzyskać ostateczne potwierdzenie w takich przypadkach, zalecamy użycie dodatkowych starterów w celu specyficznej amplifikacji segmentu DNA w usuniętym genie. W takim przypadku, jeśli gen został usunięty, produkt amplifikacji będzie obserwowany tylko w dzikim szczepie kontrolnym, a nie w zmutowanym. Te startery mogą być zaprojektowane ręcznie lub obliczeniowo, aby specyficznie amplifikować segment DNA w usuniętym regionie. Zazwyczaj wzmacniamy obszary o wartości 140 punktów bazowych.
   2. Potwierdzenie niezbędnej mutacji hipomorficznej genu
      1. Aby potwierdzić mutację hipomorficzną za pomocą PCR, użyj specyficznych dla genu starterów 20-nt do przodu (KOCO-F) i wstecznych (KOCO-R) znajdujących się odpowiednio 200 pz przed i za miejscem insercji znacznika SPA (Figura 2).
         Uwaga: Ten etap amplifikacji jest używany jako kontrola, aby upewnić się, że nie ma nieoznakowanej kopii docelowego genu niezbędnego. Gdy obecna jest tylko oznaczona wersja, obserwuje się pojedyncze pasmo o 310 pz większe niż amplikon SPA-CM. Produkt o wartości 400 pz sygnalizowałby obecność nieoznakowanej wersji genu.
      2. Równolegle z potwierdzeniem PCR, należy użyć Western blot, aby zweryfikować wprowadzenie znacznika SPA w ramce przy użyciu przeciwciała anty-FLAG M2 specyficznego dla epitopów FLAG znacznika^{SPA 21}.
7. Przechowywanie potwierdzonego szczepu dawcy
   1. Przenieś nocną hodowlę potwierdzonego zmutowanego szczepu rekombinowanego dawcy do znakowanych kriowialiów, uzupełnij glicerolem do 15% końcowego stężenia i dobrze wymieszaj. W przypadku długotrwałego przechowywania kriowiale należy przechowywać w temperaturze -80 °C.

2. Szykowanie E. coli F- Mutanty biorców dla ekranów eSGA

1. Replika pojedynczej nieistotnej delecji genu E. coli Keio kolekcja mutantów wygenerowanych przez Mori i wsp. (3,968 szczepów;¹¹; F- BW25113; można uzyskać z Open Biosystems) zrobotyzownie do dwudziestu czterech 384-dołkowych mikropłytek zawierających 80 μl ciekłego podłoża LB na studzienkę, uzupełnionych 50 μg/ml Kan.
   Uwaga: W celu systematycznej oceny indeksów gimnologicznych z niezbędnymi genami, biorca kolekcji^{Keio 11} można uzupełnić o hipomorficzne zmutowane szczepy genu niezbędnego z C-końcowymi znacznikami SPA^{22, 23}.
2. Aby zrobić miejsce dla szczepu kontroli granicznej, który będzie działał jako kontrola pozytywna, należy pomóc w normalizacji płytek i pomiędzy nimi, a także w automatycznej kwantyzacji kolonii, usunąć zaszczepione pożywki z najbardziej zewnętrznych dołków każdej płytki z powyższego kroku i przenieść na nowe płytki, ponownie pozostawiając najbardziej zewnętrzne studzienki puste.
   Uwaga: Szczep kontroli granicznej JW5028 z kolekcji Keio¹¹ został usunięty dla małego pseudogenu, który nie powinien i nie ma w naszych badaniach przesiewowych całego genomu wykazywać IG u żadnych dawców. Dlatego jest to dobry szczep kontroli pozytywnej do identyfikacji rzadkich przypadków, w których koniugacja, przypinanie lub selekcje nie powiodły się, co skutkowało brakiem lub sporadycznym wzrostem szczepu granicznego. Na przykład, jeśli kolonie kontroli granicznej nie rosną po podwójnej selekcji mutantów, szczep pytający może nie być zdolny do koniugacji, próba koniugacji mogła zostać podjęta w stanie, który uniemożliwił jej przeprowadzenie (np. na płytce zawierającej antybiotyk) lub do płytki selekcyjnej mógł zostać dodany niewłaściwy antybiotyk. Podobnie, jeśli obserwuje się bardzo niewiele, sporadyczne kolonie na całej płytce, w tym na granicy, koniugacja lub przypinanie mogły się nie powieść i należy powtórzyć badanie. Jeśli ten sporadyczny wzrost graniczny jest powtarzalny, może to wskazywać na konsekwentnie słabą koniugację dawcy, a zatem przypadki, w których nie obserwuje się podwójnych mutantów, są prawdopodobnie spowodowane niepowodzeniem koniugacji, a nie prawdziwymi GI. Takie ekrany musiałyby zostać odrzucone z dalszej analizy. Ponadto, będąc obecnym na wszystkich płytkach, szczep kontroli granicznej pozwala oprogramowaniu do kwantyzacji kolonii automatycznie określać pozycje kolonii na podwójnie zmutowanych płytkach, a tym samym pozycje kolonii nie muszą być wyznaczane ręcznie. Wreszcie, szczep kontroli granicznej pomaga w normalizacji rozmiarów kolonii w obrębie (np. różne rzędy na płytce) i między (np. różne płytki biorcze przypięte tym samym dawcą w różnym czasie) płytek.
3. Podobnie, utwórz punkty kontroli ujemnej, usuwając dowolne dwa szczepy z innego miejsca na każdej płytce (nie na granicy) i przenosząc szczepy na nową płytkę. Wypełnij te puste studzienki pożywką LB zawierającą 17 μg/ml Cm. Oczekuje się, że te plamki kontroli ujemnej będą puste u biorcy, a zatem podwójnie zmutowane płytki i pomogą zapewnić, że nie wystąpiły żadne błędy przetwarzania lub obsługi płytek podczas numerowania, obrazowania lub przypinania płytek.
   Uwaga: Te puste miejsca są wymagane do kontroli ujemnej. Kontrole ujemne pomagają zidentyfikować przypadki, w których selekcja się nie powiedzie - gdy szczepy kontroli ujemnej rosną podczas selekcji. Sugerujemy, aby nie tylko wybrać unikalne punkty kontroli ujemnej dla każdej z płytek biorcy, ale także wybrać punkty kontroli ujemnej w tym samym kwadrancie płytki (np. w prawym dolnym rogu). W ten sposób wzorzec punktów kontroli ujemnej pozwoliłby zidentyfikować możliwe błędy niewłaściwego obchodzenia się z płytkami (np. błędne oznakowanie płytek lub przypięcie do góry nogami, gdzie lewa górna kolonia jest przypięta w prawej dolnej pozycji).
4. Zaszczepić szczep Keio JW5028¹¹ z delecją pseudogenu do kolby o pojemności 500 ml z 200 ml LB, zawierającej 50 μg/ml Kan. Na podstawie naszych całogenomowych badań przesiewowych eSGA, wzrost tego konkretnego mutanta jest najbardziej zbliżony do BW25113 typu dzikiego i dlatego jest on wykorzystywany do kontroli granicznej.
5. Hoduj odmiany w układzie, a także kulturę JW5028 przez noc w temperaturze 32 °C z wytrząsaniem orbitalnym 190 obr./min, wytrząsając do OD ~0,4-0,6 przy 600 nm. Po nocnym wzroście należy wypełnić studzienki graniczne około 80 μl nocnej kultury JW5028
.
6. Zmontowane płyty można wykorzystać w kroku 3.2. Alternatywnie, w przypadku długotrwałego przechowywania, należy uzupełnić każdą studzienkę w płytkach odbiorczych 15% glicerolu, wymieszać podłoże z glicerolem i utrzymywać płytki w temperaturze -80 °C.

3. Procedura krycia szczepów o wysokiej gęstości do generowania podwójnych mutantów E. coli

1. Szczep dawcy Hfr, noszący mutację zapytania, oznaczony Cm, hodować przez noc w temperaturze 32 °C w bogatym płynnym podłożu LB-Cm (17 μg/ml Cm) z wytrząsaniem przy 220 obr./min.
2. Przypnij uporządkowaną kolekcję zmutowanych biorców o gęstości 384 kolonii na stałe płytki LB uzupełnione 50 μg/ml Kan. Równolegle przypnij zmutowany szczep dawcy o gęstości 384 kolonii do tej samej liczby płytek LB, uzupełnionych 17 μg/ml Cm. Inkubuj płytki przez noc w temperaturze 32 °C.
   Uwaga: Płytki odbiorcze używane do przypinania mogą wymagać do 36 godzin na uzyskanie wystarczająco dużych kolonii do kolejnych etapów. Gdy średnia wielkość kolonii granicznej wynosi około 2 mm średnicy (lub więcej), płytki są gotowe do przypinania.
3. Aby skoniugować szczepy, przypnij dawcę z płytki dawcy na noc z 384 kolonią na solidnej płytce LB. Następnie przypnij pojedynczą płytkę biorcy z 384 kolonią do świeżo przypiętego dawcy na płytce koniugacyjnej. Kontynuuj przypinanie, aż wszystkie płytki dawcy-biorcy zostaną sprzężone poprzez przypinanie do stałych płytek koniugacyjnych LB. Inkubować przypięte płytki koniugacyjne w temperaturze 32 °C przez 16 do 24 godzin.
   Uwaga: Pojedyncze zmutowane szczepy dawców mogą wykazywać zmienność między genami w skuteczności krycia ze względu na potencjalny wpływ mutacji na koniugację, wydajność transferu DNA lub dopasowanie. Wzrost można zatrzymać w dowolnym momencie między 16 a 24 godziną, gdy uzyskano wystarczająco duże kolonie do kolejnych etapów przypinania. Koniugacje trwające od 16 do 24 godzin dają wystarczającą liczbę byłych koniugantów, aby uzyskać powtarzalne wyniki eSGA nawet dla mutantów z późno przenoszącymi się genami lub mutantów o nieco niższym przystosowaniu.
4. Przypnij każdą płytkę koniugacyjną o gęstości 384 do pojedynczej, stałej płytki LB, zawierającej Cm (17 μg/ml) i Kan (50 μg/ml), aż wszystkie płytki koniugacyjne zostaną przypięte. Inkubować świeżo przypięte płytki pierwszego selekcyjnego przez 16-36 godzin w temperaturze 32 °C.
   Uwaga: Jeśli chodzi o etapy selekcji, może być konieczne różne czasy w przypadku różnych badań przesiewowych dawców. Ponieważ wszystkie podwójne mutanty w danym ekranie mają tę samą mutację dawcy, średnio wolniej rosnący mutant dawcy powoduje powstanie wolniej rosnących podwójnych mutantów. W związku z tym, w zależności od sprawności dawcy, etapy selekcji mogą trwać od 16 do 36 godzin. Wzrost podwójnych mutantów można zatrzymać, gdy podwójne mutanty są wystarczająco duże, aby można było przejść do kolejnego etapu, albo przypinając po pierwszej selekcji, albo obrazując po drugiej. Zwykle przekłada się to na kolonie kontroli granicznej o średnicy co najmniej 2 mm.
5. Ponownie przypnij każdą pierwszą płytkę selekcyjną do drugiej, podwójnej płytki selekcyjnej (Cm i Kan) w formacie 1,536 kolonii, tak aby każda pierwsza kolonia selekcyjna była reprezentowana przez cztery kolonie na drugiej płytce selekcyjnej. Inkubować płytki przez 16-36 godzin w temperaturze 32 °C. Sfotografować końcowe płytki selekcyjne podwójnego mutanta, aby ilościowo zmierzyć sprawność wzrostu mutanta i przeanalizować interakcje między parami genów (ryc. 3).
   Uwaga: Chociaż częstość merodiploidii (częściowych duplikacji chromosomów) jest niska i wynosi około 1/1000 komórek²⁴, merodiploidia może maskować GI. W związku z tym zalecamy włączenie kontrprób biologicznych do wszystkich badań przesiewowych eSGA. Na szczęście komercyjne jednorazowe talerze i plastikowe podkładki do przypinania mogą być ponownie użyte do trzech razy, sterylizując materiały w następujący sposób: Agar z płytek jest wyrzucany, a płytki i podkładki są sterylizowane przez namoczenie ich w 10% wybielaczu przez noc, a następnie spłukanie wodą destylowaną, mycie w 70% etanolu i suszenie plastiku na powietrzu w okapie przepływowym w świetle ultrafioletowym. Sterylne podkładki i płytki są przechowywane w szczelnie zamkniętych sterylnych plastikowych torebkach do czasu użycia.

4. Przetwarzanie danych i uzyskiwanie wyników GI

1. Zmierz kolonie na każdej płytce w trybie wsadowym lub indywidualnie za pomocą specjalistycznego oprogramowania do obrazowania kolonii ^{3, 9}.
   Uwaga: Odpowiednia, oparta na Javie aplikacja do obrazowania i oceniania kolonii o wysokiej przepustowości jest teraz dostępna bezpłatnie do publicznego dostępu (http://srcollins77.users.sourceforge.net/). Oprogramowanie działa na różnych platformach (np. Mac lub PC) i może być uruchamiane jako plik wykonywalny lub z okna terminala.
2. Normalizuj surowe pomiary wielkości kolonii, korygując systematyczne odchylenia wewnątrz i między płytkami, takie jak efekty krawędzi płytki, efekty zmienności między płytkami, nierównomierne oświetlenie obrazu, artefakty wynikające z fizycznej krzywizny powierzchni agaru, efekty konkurencji dla sąsiednich kolonii i możliwe wady pinowania, a także różnice w czasie wzrostu⁹. Te systematyczne artefakty są niezależne od dopasowania podwójnie zmutowanego mutanta i powinny być korygowane, ponieważ dają podstawę do fałszywych szacunków dopasowania wzrostu.
3. Kolonie w rzędach krawędziowych i kolumnach są zwykle większe ze względu na mniejszą konkurencję o składniki odżywcze niż te, które znajdują się w środku płytki. Dlatego, aby skorygować ten efekt, przeskaluj rozmiary kolonii krawędzi tak, aby mediana wielkości w tym wierszu lub kolumnie była równa medianie wielkości kolonii w środku płytki.
4. Przeanalizuj wyniki statystycznie, aby uwzględnić odtwarzalność i standardową wariancję w stosunku do średnich rozmiarów pomiarów powtórzonych kolonii. Do oceny odtwarzalności doświadczalnej niezbędne są co najmniej trzy niezależne eksperymenty z replikami biologicznymi.
5. Na koniec użyj znormalizowanych średnich rozmiarów dopasowania wzrostu kolonii, aby wygenerować wynik GI (S) dla każdej pary genów przy użyciu następującego wzoru:

gdzie, S_var = (var_Exp x (n_Exp-1) + var_Cont x (n_Cont -1)) / (n_Exp + n_Cont -2); var_Exp = maksymalna wariancja znormalizowanych rozmiarów kolonii dla podwójnego mutanta; var_Cont = mediana wariancji znormalizowanych rozmiarów kolonii podwójnie zmutowanych ze zbioru referencyjnego; n_Exp = liczba pomiarów wielkości kolonii podwójnie zmutowanych; n_Cont = mediana liczby powtórzeń eksperymentalnych we wszystkich eksperymentach; μ_Exp = mediana znormalizowanych rozmiarów kolonii podwójnych mutantów; i μ_Cont = mediana znormalizowanych rozmiarów kolonii dla wszystkich podwójnych mutantów powstałych z pojedynczego szczepu mutanta dawcy. Wskaźnik S odzwierciedla zarówno statystyczną pewność domniemanej interakcji digenicznej, jak i biologiczną siłę oddziaływania. Silne dodatnie wyniki S wskazują na efekty łagodzące, co sugeruje, że oddziałujące geny uczestniczą w tym samym szlaku⁹, podczas gdy znaczące ujemne wyniki S odzwierciedlają chorobę syntetyczną lub śmiertelność, co często sugeruje przynależność do równoległych redundantnych szlaków⁹. W celu określenia zależności funkcjonalnych na poziomie szlaku, z końcowego zestawu danych uzyskuje się pojedynczy wynik S dla każdej pary badanych genów.
Uwaga: W naszym poprzednim badaniu⁹ stwierdziliśmy, że rekombinacja ma tendencję do rzadszego zachodzenia między genami w promieniu 30 kbp od siebie. Dlatego do dalszej analizy, po normalizacji i wygenerowaniu wyniku, usuwamy interakcje między genami w promieniu 30 kpz od siebie. Oprócz samych indeksów geograficznych można badać funkcjonalne zależności między parami genów, przyglądając się, jak podobne są profile przewodu pokarmowego tych dwóch genów. Profil przewodu pokarmowego genu to zbiór wszystkich interakcji tego genu ze wszystkimi innymi genami w genomie poza obszarem sprzężenia genu. Funkcjonalnie podobne geny mają tendencję do wyższych korelacji profili interakcji genetycznych^{12, 25}. Tak więc, obliczając współczynniki korelacji dla wszystkich genów w eksperymentalnym zbiorze danych, można wykorzystać eSGA do badania relacji funkcjonalnych nawet między genami leżącymi blisko siebie na chromosomie.

Wyniki

GI ujawniają funkcjonalne relacje między genami. Podobnie, ponieważ geny w tym samym szlaku wykazują podobne wzorce przewodu pokarmowego, a podobieństwo profilu przewodu pokarmowego reprezentuje zgodność fenotypów, możemy grupować funkcjonalnie powiązane geny w szlaki, grupując ich profile żołądkowo-jelitowe. Integracja GI i sieci korelacji GI z informacjami o interakcjach fizycznych lub innymi danymi asocjacyjnymi, takimi jak relacje kontekstu genomowego (GC), może również ujawnić organizację modułów funkcjonalnych wyżs...

Dyskusja

Przedstawiliśmy krok po kroku protokół wykorzystania zrobotyzowanych badań przesiewowych eSGA do badania funkcji genów bakteryjnych na poziomie szlaku poprzez badanie przewodu pokarmowego. Takie podejście może być wykorzystane do badania pojedynczych genów, jak również całych systemów biologicznych u E. coli. Staranne wykonanie opisanych powyżej etapów eksperymentalnych, w tym wszystkie odpowiednie kontrole, oraz rygorystyczna analiza i niezależna walidacja danych GI są kluczowymi aspektami sukcesu eSGA w doko...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
I. Antybiotyki
Chloramfenikol	Bioshop	#CLR201
Kanamycyna		#KAN201
Ampicylina		# AMP201
2. Luria-Bertani medium
LB w proszku	Bioshop	#LBL405
Agar	Bioshop	#AGR003
3. Szczepy bakteryjne i plazmidy
Hfr Cavalli szczep λ System red (JL238)	Babu et al.14.
pKD3	E. coli Genetic Stock Centre, Yale
Keio E. coli F- kolekcja biorców	National BioResource Project (NBRP) Japonii11
Hypomorficzny E. coli F- Szczepy ze znacznikiem SPA	Otwarte biosystemy; Babu et al.14
4. Startery
pKD3 odsolone stałe startery			F1: 5'-GGCTGACATGGGAATTAGC-3' R1: 5'-AGATTGCAGCATTACACGTCTT-3'
Odsolone niestandardowe podkłady			Cm-R: 5'-TTATACGCAAGGCGACAAGG-3' Cm-F: 5'- GATCTTCCGTCACAGGTAGG-3'Desolowane
niestandardowe podkłady			F2 i R2: 20 nt stałe regiony oparte na sekwencji pKD3 i 45 nt niestandardowe regiony homologii Region stały F2: 5'-CATATGAATATCCTCCTTA-3' R2 obszar stały: 5'-TGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3'S1 i S2: 27 obszarów stałych nt do przygotowania wzmocnienia kasety SPA-Cm i 45 nt niestandardowych regionów homologii Obszar stały S1: 5'AGCTGGAGGATCCATGGAAAAGAGAAG -3' Region stały S2: 5'- GGCCCCATATGAATATCCTCCTTAGTT -3' KOCO-F i KOCO-C: 20 starterów nt 200 pz od miejsca delecji genu nieistotnego lub miejsca insercji znacznika genu genu essential<
Taq DNA polimeraza Fermentas		# EP0281
10X bufor PCR	Fermentas	# EP0281
10 mM dNTPs	Fermentas	# EP0281
25 mM MgCl2	Fermentas	# EP0281
Agarose	Bioshop	# AGA002
Ładowanie barwnik	NEB	#B7021S
Bromek etydyny	Bioshop	# ETB444
10X Bufor TBE	Bioshop	# ETB444.10
Tris Base	Bioshop	# TRS001
Kwas borowy	Sigma	# T1503-1KG
0,5 M EDTA (pH 8,0)	Sigma	# B6768-500G
Drabinka DNA	NEB	#N3232L
6. Zestawy do izolacji i oczyszczania DNA
Zestaw do izolacji i oczyszczania genomowego DNA	Promega	#A1120
Zestaw Plasmid Midi	Qiagen	# 12143
Zestaw do oczyszczania QIAquick PCR	Qiagen	#28104
7. Sprzęt do PCR, Transformacji i Replikowania
Termocykler	BioRad, iCycler
Elektroforeza w żelu agarozowym	BioRad
Elektroporator	Bio-Rad GenePulser II
0,2 cm Kuweta do elektroporacji	Bio-Rad
42 ° C Wytrząsarka do kąpieli wodnej	Innova 3100
Beckman Coulter TJ-25 Wirówka	Beckman Coulter
32 ° Wytrząsarka C	New Brunswick Scientific, USA
32 ° Inkubator płytkowy C	Fisher Scientific
RoToR-HDA robot stołowy	Singer Instruments
96, 384 i 1,536 gęstości pinów Singer	Instruments
96 lub 384 długie piny	Singer Instruments
8. Sprzęt do obrazowania< / strong>
Stojak na aparat	fotograficzny Kaiser
Aparat cyfrowy, 10 megapikseli	Dowolny dostawca
Kasetony świetlne, jednostki Testrite 16 "x 24"	Testrite
9. Podkładki lub talerze Recykling
10% wybielacz	Dowolny sprzedawca
70% etanolu	Każdy sprzedawca
Sterylna woda destylowana	Dowolny sprzedawca
Okap przepływowy	Dowolny sprzedawca
Lampa ultrafioletowa	Dowolny sprzedawca
10. Sprzęt laboratoryjny
probówki polipropylenowe 50 ml	Dowolny Sprzedawca
Probówki do mikrowirówek 1,5 ml	Dowolny sprzedawca
Płatki stożkowe 250 ml	VWR	# 29140-045
15 ml sterylne probówki	hodowlane Thermo Scientific	# 366052
Fiolki kriogeniczne	VWR	# 479-3221
Płytki prostokątne	Singer Instruments
96-dołkowe i 384-dołkowe płytki mikromiareczkowe	Singer Instruments	Nunc
Wałek do uszczelniania wielodołkowych	Sigma	#R1275
	ABgene	# AB-0580
Samoprzylepne uszczelki płytkowe	Fisher Scientific	# 13-990-14-80
° C zamrażarka	Dowolny sprzedawca