Identyfikacja kompleksów białkowych w Escherichia coli za pomocą sekwencyjnego oczyszczania powinowactwa peptydów w połączeniu z tandemową spektrometrią mas

Summary

Oczyszczanie powinowactwa oznaczonych białek w połączeniu ze spektrometrią mas (APMS) to potężna metoda systematycznego mapowania sieci interakcji białek i badania mechanistycznych podstaw procesów biologicznych. W tym miejscu opisujemy zoptymalizowaną procedurę APMS opartą na powinowactwie do peptydów sekwencyjnych (SPA) opracowaną dla bakterii Escherichia coli, która może być stosowana do izolowania i charakteryzowania stabilnych kompleksów wielobiałkowych do niemal jednorodności, nawet zaczynając od niskiej liczby kopii na komórkę.

Abstract

Ponieważ większość procesów komórkowych jest zapośredniczona przez zespoły makromolekularne, systematyczna identyfikacja interakcji białko-białko (PPI) i identyfikacja składu podjednostek kompleksów wielobiałkowych może dostarczyć wglądu w funkcję genów i zwiększyć zrozumienie systemów biologicznych^{1, 2}. Interakcje fizyczne można mapować z dużą pewnością dzięki izolacji na dużą skalę i charakterystyce endogennych kompleksów białkowych w warunkach zbliżonych do fizjologicznych w oparciu o oczyszczanie powinowactwa białek znakowanych chromosomowo w połączeniu ze spektrometrią mas (APMS). Podejście to zostało z powodzeniem zastosowane w organizmach zróżnicowanych ewolucyjnie, w tym drożdżach, muchach, robakach, komórkach ssaków i bakteriach^1-6. W szczególności wygenerowaliśmy karboksylowo-końcowy system podwójnego znakowania sekwencyjnego powinowactwa do peptydów (SPA) do oczyszczania natywnych kompleksów białkowych z hodowanych Gram-ujemnych Escherichia coli, przy użyciu genetycznie podatnych szczepów laboratoryjnych gospodarza, które dobrze nadają się do badań całego genomu podstawowej biologii i konserwatywnych procesów prokariontów^{1, 2, 7}. Nasz system znakowania SPA jest analogiczny do tandemowej metody oczyszczania powinowactwa opracowanej pierwotnie dla drożdży^{8, 9} i składa się z peptydu wiążącego kalmodulinę (CBP), po którym następuje miejsce rozszczepienia wysoce specyficznej proteazy wirusa wytrawiania tytoniu (TEV) i trzech kopii epitopu FLAG (3X FLAG), co pozwala na dwie kolejne rundy wzbogacania powinowactwa. Po amplifikacji kasety, specyficzne dla sekwencji liniowe produkty PCR kodujące znacznik SPA i wybieralny marker są integrowane i wyrażane w ramce jako fuzje karboksylowo-końcowe na tle DY330, które jest indukowane w celu przejściowej ekspresji wysoce wydajnego heterologicznego systemu rekombinacji lambda bakteriofagów¹⁰. Późniejsze dwuetapowe oczyszczanie za pomocą kalmoduliny i kulek powinowactwa anty-FLAG umożliwia wysoce selektywne i wydajne odzyskiwanie nawet kompleksów białkowych o niskiej liczebności z kultur na dużą skalę. Tandemowa spektrometria mas jest następnie stosowana do identyfikacji stabilnie współoczyszczających się białek o wysokiej czułości (niskie granice wykrywalności nanogramów).

Tutaj opisujemy szczegółowe procedury krok po kroku, które powszechnie stosujemy do systematycznego znakowania białek, oczyszczania i analizy opartej na spektrometrii mas rozpuszczalnych kompleksów białkowych z E. coli, które mogą być skalowane i potencjalnie dostosowane do innych gatunków bakterii, w tym niektórych oportunistycznych patogenów, które są podatne na rekombinację. Wynikające z tego interakcje fizyczne mogą często ujawnić interesujące, nieoczekiwane składniki i połączenia, sugerując nowe powiązania mechanistyczne. Integracja danych PPI z alternatywnymi danymi asocjacyjnymi molekularnymi, takimi jak interakcje genetyczne (gen-gen) i przewidywania kontekstu genomowego (GC), może ułatwić wyjaśnienie globalnej organizacji molekularnej kompleksów wielobiałkowych w obrębie szlaków biologicznych. Sieci wygenerowane dla E. coli można wykorzystać do uzyskania wglądu w funkcjonalną architekturę ortologicznych produktów genowych u innych drobnoustrojów, dla których obecnie brakuje adnotacji funkcjonalnych.

Protocol

1. Budowa specyficznego dla genu znakowania SPA w szczepie E. coli DY330

1. Plazmid pJL148 obejmujący sekwencję DNA znacznika SPA i kasetę markera oporności na antybiotyki kanamycyny (Kan^R) są używane jako matryca w amplifikacji reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR)⁷. Specyficzny dla genu starter do przodu 45 nt, umieszczony bezpośrednio przed kodonem stop genu docelowego w ramce ze starterem do przodu specyficznym dla znacznika 27 bp (5'- AGCTGGAGGATGGAAAAAGAGAAG -3') i specyficznym dla genu starterem odwrotnym 45 nt, umieszczonym bezpośrednio za kodonem stop genu docelowego w ramce ze starterem odwrotnym specyficznym dla znaczn....

Results

Po oznaczeniu białek przynęty, które są wyrażane na poziomach endogennych, są oczyszczane pod względem powinowactwa z kultur fazy logarytmicznej, próbki zostały przetestowane na żelu barwiącym srebro, aby uwidocznić poszczególne składniki polipeptydowe izolowanych stabilnych kompleksów. Poddaliśmy również drugą porcję próbek białek oczyszczonych z powinowactwa bezżelowej tandemowej spektrometrii mas (LCMS) w celu zidentyfikowania odpowiednich sekwencji polipeptydowych. Skuteczność tej procedury APMS wykazano za pomocą re.......

Discussion

Kluczowym aspektem opisanego tutaj podejścia APMS opartego na SPA jest to, że znakowanie odbywa się w naturalnym kontekście chromosomalnym, zapewniając w ten sposób utrzymanie normalnej regulacji genów (tj. zachowanie natywnego promotora przynęty, a zatem poziom ekspresji nie jest zaburzony), a natywne, stabilnie związane kompleksy białkowe są odzyskiwane na poziomach bliskich endogenności. Problemów z polaryzacją operonów można również uniknąć, umieszczając promotor zorientowany na zewnątrz w wybieralnym marker.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
I. Antybiotyki
Kanamycin	Bioshop	#KAN201
2. Terrific-Broth medium
Bio-Tryptone	Bioshop	#TRP 402
Ekstrakt drożdżowy	Bioshop	#YEX 555
Glycerol	Bioshop	#GLY 002
K2HPO4	Bioshop	#PPM 302
KH2PO4	Bioshop	#PPM 303
3. Szczep bakteryjny i plazmid
DY330		Yu et al. (2000)10
pJL148		Zeghouf et al. (2004)7
4. Odczynniki do PCR i elektroforezy
Taq Polimeraza DNA	Fermentas	# EP0281
10 X bufor PCR	Fermentas	# EP0281
10 mM dNTPs	Fermentas	# EP0281
25 mM MgCl2	Fermentas	# EP0281
Agarose	Bioshop	# AGA002
Ładowanie barwnik	NEB	#B7021S
Bromek etydyny	Bioshop	# ETB444
10X Bufor TBE	Thermo Scientific	#28355
Tris Base	Bioshop	#TRS001
Kwas borowy	Bioshop	#BOR001
0,5 M EDTA (pH 8,0)	Sigma	# E6768
drabinka DNA	NEB	#N3232L
5. Zestawy do izolacji i czyszczenia plazmidu
Plasmid Midi kit	Qiagen	#12143
QIAquick PCR Purification	Qiagen	#28104
6. Sprzęt do PCR i transformacji
Thermal cycler	BioRad	iCycler
Elektroforeza w żelu agarozowym	BioRad
Electroporator	Bio-Rad	GenePulser II
0,2 cm Kuweta do elektroporacji	Bio-Rad
42 ° C Wytrząsarka do kąpieli wodnej	Innova 3100
C Shaker	New Brunswick Scientific, Stany Zjednoczone
32 ° C duży shaker	New Brunswick Scientific, USA
32 ° Inkubator płytkowy C	Fisher Scientific
7. Elektroforeza i Western blotting
akrylamidu strong>acrylamide, N,N'-metylenobis-akryloamid	Bio-Rad	#161-0125
Nadsiarczan amonu	Bioshop	# AMP001
n-butanol	Sigma	# B7906
TEMED	Bioshop	#TEM001
Bibuła filtracyjna Whatman nr 1	Fischer Scientific	#09-806A
Mini protean 3 cell	Bio-Rad#	165-3301
Urządzenie do przenoszenia żelu iBlot	Invitrogen	#IB1001
Membrany nitrocelulozowe	Bio-Rad	#162-0115
Monoklonalne przeciwciało Anti-Flag M2	Sigma	#F3165
Peroksydaza chrzanowa	Amersham	#NA931V
Wstępnie barwione wzorce masy cząsteczkowej białka	Bio-Rad	#161-0363
Odczynnik chemiluminescencyjny	PIERCE	#1856136
Film autoradiograficzny	Clonex Corp	#CLEC810
Wytrząsarka do huśtania na platformie
Sonicator	Branson Ultrasonic	#23395
NaCl	Bioshop	#SOD001
Inhibitory proteazy	Roche	#800-363-5887
0,5 mM TCEP-HCl	Thermo Scientific	#20490
9. Odczynniki i sprzęt do oczyszczania powinowactwa
0,8 x 4 cm Kolumna polipropylenowa Bio-Rad	#	732-6008
Nukleaza benzonazy	Novagen	# 70746
Koraliki agarozowe Anti-FLAG M2	Sigma	#A2220
Koraliki kalmodulinowo-sefarozowe	GE Healthcare	#17-0529-01
Proteaza TEV	Invitrogen	#12575-015
Triton X-100	Sigma	#T9284
CaCl2	Sigma	#C2661
EGTA	Sigma	#E3889
LabQuake Shaker	Thermolyne	#59558
10. Odczynniki do barwienia srebra
Metanol	Bioshop	#MET302
Kwas octowy	Bioshop	t#ACE222
Tiosiarczan sodu	Sigma	#S-7143
Azotan srebra	Fischer Scientific	#S181-100
Formaldehyd	Bioshop	#FOR201
Węglan	soduBioshop	#SOC512
11. Odczynniki i sprzęt do identyfikacji białek
Trypsin Gold, spektrometria mas klasy	Promega	# V5280
50 mM NH4HCO3	Bioshop	#AMC555
1 mM CaCl2	Bioshop	#CCL302
Acetonitryl	Sigma	#A998-4
Formic kwas	Sigma	#F0507
Woda klasy HPLC	Sigma	# 95304
Jodoacetamid	Sigma	# 16125
Milipore Zip-Tip	Millipore #	ZTC18M960
~ 10 cm 3 μ m Pompa HPLC z żywicy Luna-C18	Phenomenex
Proxeon nano Thermo	Fisher Scientific
LTQ Orbitrap Velos spektrometr		Thermo Fisher Scientific
12. Sprzęt laboratoryjny
4 litrowe kolby stożkowe	VWR	#89000-372
50 ml polipropylenowe probówki sokoła	Dowolny Sprzedawca
Mikroprobówki wirówkowe 1,5 ml	Dowolny sprzedawca
Płatki stożkowe 250 ml	VWR	#29140-045
15 ml sterylne probówki hodowlane	Thermo Scientific	#366052
Fiolki kriogeniczne	VWR	#479-3221-80
° C zamrażarka	Fisher Scientific	#13-990-14
Szybki system próżniowy	Thermo Scientific
i roztwory 1. 1 litr Terrific Bulth (TB) media 11 g Bio-Trypton 22 g Ekstrakt drożdżowy 2% Glicerol 50 ml bulionu soli potasowej rozwiązanie 2. Roztwór podstawowy soli potasowej 1.5 M K2HPO4 0.35 M KH2PO4 3. Bufor dźwiękowy 20 mM Tris-HCl (pH 7,9) 150 mM NaCl 0,2 mM EDTA 10% Glycerol Przed użyciem dodaj inhibitor proteazy (PI) i 0,1-0,5 mM TCEP 4. Bufor AFC 30 mM Tris-HCl (pH 7,9) 150 mM NaCl 0,1% detergentu Przed użyciem dodaj PI i 0,1-0,5 mM TCEP 5. Bufor rozszczepienia TEV 30 mM Tris-HCl (pH 7,9) 150 mM NaCl 0,2 mM EDTA 0,1% detergentu Przed użyciem dodaj PI i 0,1-0,5 mM TCEP 6. Bufor wiążący kalmodulinę 30 mM Tris-HCl (pH 7,9) 150 mM NaCl 2 mM CaCl2 0,1% detergentu Przed użyciem dodaj PI i 0,1-0,5 mM TCEP 7. Bufor płuczący kalmodulinę 30 mM Tris-HCl pH 7,9 150 mM NaCl 2 mM CaCl2 0,1-0,5 mM TCEP 8. Bufor elucji kalmoduliny 30 mM Tris-HCl (pH 7,9) 100 mM NaCl 10 mM EGTA 0,1-0,5 mM TCEP 9. Roztwór rozwijający (1L) 37% Formaldehyd 30 g węglanu sodu 1000 ml wody destylowanej 10. Bufor trawienny 50 mM NH4HCO3 1 mM CaCl2 11. Roztwór zwilżający i równoważący 70% acetonitrylu (ACN) w 0,1% kwasie mrówkowym 12. Roztwór myjący 100% H2O w 0,1% kwasie mrówkowym