Niniejszy artykuł opisuje transformację genetyczną jednokomórkowej morskiej algi Ostreococcus tauri za pomocą elektroporacji. Ten organizm eukariotyczny stanowi efektywną platformę modelową dla roślin wyższych, posiadając znacznie zredukowaną złożoność genomową i komórkową oraz będąc łatwo podatnym na hodowlę komórkową i biologię chemiczną.
Artykuł metodologiczny
Transformacja genomiczna piko-eukarionta Ostreococcus tauri
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Typowe problemy utrudniające szybki postęp w naukach o roślinach obejmują złożoność komórkową, tkankową i całego organizmu, a w szczególności wysoki poziom redundancji genomicznej wpływający na prostą genetykę roślin wyższych. Nowy organizm modelowy Ostreococcus tauri jest najmniejszym znanym do dziś wolnożyjącym eukariotą i charakteryzuje się znacznie zredukowaną wielkością genomu oraz złożonością komórkową1,2, co przejawia się obecnością tylko jednego egzemplarza większości organelli (mitochondrium, chloroplastu, stosu aparatu Golgiego) na komórkę oraz genomem zawierającym jedynie ok. 8000 genów. Ponadto połączenie jednokomórkowości i łatwości hodowli zapewnia platformę podatną na podejścia biologii chemicznej. Ostatnio Ostreococcus został z sukcesem wykorzystany do badania podstawowych mechanizmów leżących u podstaw regulacji rytmów okołodobowych3-6. Wyniki uzyskane z tego organizmu modelowego wpłynęły nie tylko na naukę o roślinach, ale także na biologię ssaków7. Przykład ten pokazuje, w jaki sposób szybkie eksperymentowanie na prostym eukariocie z linii zielonej może przyspieszyć badania nad bardziej złożonymi organizmami poprzez generowanie testowalnych hipotez z wykorzystaniem metod technicznie możliwych do zrealizowania jedynie w tym środowisku o zredukowanej złożoności. Znajomość genomu i możliwość modyfikacji genów są niezbędnymi narzędziami w przypadku każdego gatunku modelowego. Informacje genomiczne1, transkryptomiczne8 i proteomiczne9 dla tego gatunku są ogólnodostępne, podczas gdy wcześniej opisane metody6,10 transformacji genetycznej Ostreococcus są znane tylko nielicznym laboratoriom na całym świecie.
W niniejszym artykule szczegółowo opisano metody eksperymentalne służące do genetycznej transformacji tego nowego organizmu modelowego konstruktem nadekspresyjnym za pomocą elektroporacji, a także metodę zawieszania przekształconych komórek w niskoprocentowej agarozie w celu umożliwienia selekcji linii transformowanych wywodzących się z pojedynczej przekształconej komórki. W związku z sukcesami zastosowania Ostreococcus w badaniach nad rytmami okołodobowymi, można spodziewać się rosnącego zainteresowania Ostreococcus w różnych obszarach badawczych w obrębie i poza naukami o roślinach, w tym w dziedzinach biotechnologicznych. Badacze z szerokiego zakresu nauk biologicznych i medycznych, pracujący nad konserwowanymi szlakami biochemicznymi, mogą rozważyć prowadzenie badań na Ostreococcus, który jest wolny od złożoności genomowej i organizmalnej większych gatunków modelowych.
Protokół
1. Przygotowanie materiału glonowego
- Komórki Ostreococcus hoduje się w sztucznej wodzie morskiej (ASW). Sole morskie (zazwyczaj około 40 g/L) rozpuszcza się w wodzie dejonizowanej do zasolenia 30 ppt, mierzonego za pomocą salinometru. Pożywkę wzbogacającą11,12, pierwiastki śladowe i witaminy dodaje się zgodnie z opisem w tabelach 1-3. Następnie pożywkę sterylizuje się przez filtr o rozmiarze porów 0,22 μm.
- W celu utrzymania kultury, komórki szczepu Ostreococcus OTTH95 przesiewa się aseptycznie w rozcieńczeniu 1/100 w świeżej ASW co 7 dni i hoduje pod stałym oświetleniem w inkubatorze do roślin wyposażonym w filtr Moonlight Blue. Natężenie światła powinno wynosić około 20 μmol m-2 s-1, a temperaturę utrzymuje się na poziomie 20 °C. Komórki nie wymagają ciągłego mieszania, ale należy je wstrząsać raz na 2 do 3 dni, aby zapobiec agregacji.
- Do każdej transformacji wymagane jest 50 ml komórek o gęstości 20-30 x 106 ml-1, którą należy osiągnąć w ciągu 5-7 dni po przesiewaniu. Przybliżoną gęstość komórek oraz aksenicznosć można określić za pomocą cytometrii przepływowej lub komory countingowej (hemocytometru) przy minimalnym powiększeniu x40.
2. Elektroporacja
- Przygotuj DNA do transformacji. Do każdej transformacji wymagane jest 5 μg czystego, zlinearyzowanego plazmidowego DNA o stężeniu 1 μg/μl w sterylnej wodzie dejonizowanej. W celu uzyskania takiego DNA autorzy zalecają użycie zestawu Qiagen midi prep, choć inne metody mogą być równie skuteczne. Przetraw produkt enzymem, który przecina szkielet użytego wektora, ale nie przecina transgenu ani genu selekcyjnego. Następnie oczyść i zagęść otrzymane linearne DNA poprzez precypitację etanolem i zawieś produkt w odpowiedniej objętości wysokiej jakości sterylnej wody dejonizowanej.
- Przygotuj probówki do mikrocentryfugi zawierające 5 μg DNA dla każdej transformacji. Dla każdej transformowanej linii komórkowej niezbędna jest kontrola bez DNA. Przechowuj te probówki w lodzie, wraz z kuwetą do elektroporacji 2 mm dla każdej transformacji.
- Przygotuj 2,2 ml buforu do resuspensji na jedną transformację. Rozpuść sorbitol do uzyskania roztworu 1 M w ddH2O, dodaj 0,1% kwasu pluronic F68 i wysterylizuj przez filtr.
- Dodaj kwas pluronic F68 do komórek do stężenia końcowego 0,1% i odwirowuj je przez 10 minut przy 8000x g w temperaturze 10 °C w probówce 50 ml z dnem stożkowym. Natychmiast resuspenduj komórki w 1 ml buforu do resuspensji poprzez pipetowanie w górę i w dół, a następnie przenieś do probówki do mikrocentryfugi. Wirowuj przez 10 minut przy 8000 x g w temperaturze 10 °C i, pracując szybko, powtórz ten etap płukania jeszcze raz.
- Za pomocą odciętej końcówki pipety resuspenduj każdy końcowy osad w 40 μl buforu do resuspensji. Dodaj 40 μl resuspendowanych komórek do każdej probówki z zlinearyzowanym DNA znajdującej się w lodzie, wymieszaj delikatnie i przenieś do kuwety do elektroporacji.
- Włóż kuwetę do urządzenia do elektroporacji. Zmień ustawienia na 6 kV cm-1, 600 Ω i 25 μF. Przeprowadź elektroporację komórek.
- Inkubuj elektroporowane komórki w kuwetach w temperaturze pokojowej przez 10 minut; wykorzystaj ten czas na przygotowanie kolb do hodowli tkankowych. Opisz je i dodaj do każdej 30 ml świeżej ASW. Odlej 1 ml z każdej kolby i delikatnie dodaj do odpowiadającej jej kuwety. Inkubuj przez 2 minuty, a następnie delikatnie usuń ASW zawierającą grudkę komórek i powoli, ostrożnie pipetuj ją bezpośrednio do ASW w kolbie hodowlanej.
- Komórki zazwyczaj pozostają w formie grudki. Należy zadbać o to, aby w tym momencie nie wstrząsać i nie zakłócać agregatów komórkowych. Pozostaw komórki do regeneracji w inkubatorze na 1-2 godziny, a następnie resuspenduj poprzez potrząsanie kolbami. W tym czasie komórki powinny swobodnie się resuspendować i nie powinny być widoczne żadne grudki. Pozostaw kultury do regeneracji w inkubatorze przez noc.
3. Osadzanie komórek na płytkach w medium półstałym
- Następnego dnia wysterylizuj w autoklawie roztwór 2,1% nisko topnej agarozy w ddH2O w butelce z prętem do mieszania. Utrzymuj w stanie stopionym w temperaturze 65-90 °C w większym zlewce z wodą na magnetycznej mieszadle grzejnej. Dla każdej transformacji przygotuj 8 szalek Petriego (średnica 55 mm) oraz 8 probówek o pojemności 15 ml, z których każda zawiera 9 ml ASW z wymaganym selekcjonerem. W przypadku użycia Nourseothricyny lub G418 zastosuj stężenie 2 mg/ml.
- Wyjmij przetransformowane komórki z inkubatora. Pracując w sterylnej komorze z laminarnym przepływem powietrza, dodaj 1 ml wrzącej agarozy LMP do 9 ml cieczy w jednej z probówek. Zamknij probówkę i wymieszaj poprzez odwracanie. Następnie dodaj 0,5 ml świeżo przetransformowanych komórek, szybko wymieszaj i wlej na szalkę. Powtórz ten proces z pozostałymi 7 probówkami, a następnie przejdź do kolejnej kolby z transformacją.
- Pozostaw otwarte szalki w komorze z laminarnym przepływem powietrza na godzinę, aby agaroza stężała. Następnie zamknij szalki i przenieś je do dużych kwadratowych szalek Petriego, z których każda pomieści 4 mniejsze szalki. Uszczelnij kwadratowe szalki parafilmem. Należy pamiętać, że szalki nie stężeją całkowicie, w wyniku czego żel jest bardzo kruchy. Podczas przenoszenia szalek należy zachować ostrożność, aby nie uszkodzić żelu. Umieść wszystkie kwadratowe szalki w inkubatorze.
4. Selekcja transformowanych kolonii
- Kolonie powinny pojawić się po 10 do 21 dniach na płytkach po transformacji, natomiast nie powinny wystąpić na płytkach kontrolnych (mock). Do wyboru kolonii należy użyć pipety 200 μl z odciętymi końcówkami. Należy po prostu wybrać izolowane kolonie i zassać zieloną kolonię. Należy zadbać o to, aby nie pobrać komórek z sąsiednich kolonii.
- Przenieść komórki do 2 ml medium płynnego z selekcją, w płytce 24-dołkowej. W przypadku stosowania Nourseothricin, należy użyć stężenia 1,75 mg/ml. Wymieszać poprzez pipetowanie w górę i w dół. Wybrać od 24 do 50 kolonii z jednej transformacji. Uszczelnić płytki parafilmem i przenieść do inkubatora.
- Po tygodniu przenieść 100 μl z każdego dołka do 2 ml świeżego ASW z selekcją w nowej płytce 24-dołkowej i hodować przez kolejne 7 dni. Przeżyłe linie komórkowe można wykorzystać w dalszych badaniach. Stabilną integrację z genomem oraz liczbę insercji należy przeanalizować za pomocą PCR i Southern Blot. DNA genomowe na potrzeby tych analiz można uzyskać, stosując dowolną zredukowaną standardową metodę ekstrakcji DNA z roślin.
5. Reprezentatywne wyniki
Komórki rozdzielone w stosunku 1 / 100 osiągnęły gęstość 25 milionów komórek na mililitr po 7 dniach hodowli. Elektroporacja komórek z zastosowaniem odpowiednich ustawień pozwoliła uzyskać stałą czasową między 10 a 14 milisekund. Po przeniesieniu komórek do pożywki w kolbach hodowlanych powinien utworzyć się agregat komórek. Po lekkim wstrząśnięciu po godzinie komórki powinny łatwo ulec resuspensji. Wprowadzenie 1 ml transformowanych komórek do 0,2% agaru LMP powinno skutkować uzyskaniem spójnego, lecz jedynie półstałego żelu. Kolonie powinny pojawić się po 10 do 21 dniach. Przy transformacji 5 μg linearyzowanego DNA zgodnie z powyższym protokołem, zazwyczaj oczekiwano od 50 do 100 kolonii na płytkę transformacyjną, w przeciwieństwie do braku kolonii na płytkach kontrolnych ujemnych. Około 80% wybranych kolonii zostało pozytywnie wyselekcjonowanych pod kątem oporności na antybiotyk w pożywce płynnej i wykorzystanych w kolejnych badaniach.
| Stężenie końcowe | Roztwór stokowy | Objętość na 1 litr | |
| NaNO3 | 8.83 x 10-4 M | 75 g/L dH2O | 1 mL |
| NH4Cl | 3.63 x 10-5 M | 2.68 g/L dH2O | 1 mL |
| β-glycerophosphate | 1 x 10-5 M | 2.16 g/L dH2O | 1 mL |
| H2SeO3 | 1 x 10-8 M | 1.29 mg/L dH2O | 1 mL |
| Tris-base(pH 7.2) | 1 x 10-3 M | 121.1 g/L dH2O | 1 mL |
| Roztwór śladowych metali K | Tabela 2 | 1 mL | |
| Roztwór witamin f/2 | Tabela 3 | 0.5 mL |
Tabela 1. Skład pożywki do hodowli O. tauri11, 12. Przygotować całkowitą objętość 1 litra sztucznej wody morskiej o zasoleniu 30 ppt, a następnie dodać powyższe składniki z roztworów zapasowych zgodnie z instrukcją. Pożywkę wysterylizować poprzez filtrację i zużyć w ciągu tygodnia. Roztwory zapasowe wszystkich związków, z wyjątkiem roztworu witamin, można połączyć w taki sposób, aby dodawać 6 ml tego roztworu na każdy litr pożywki.
| Stężenie końcowe | Roztwór stokowy | Ilość na 1 litr | |
| Na2EDTA • 2H2O | 1 x 10-4 M | 41.6 g | |
| FeCl3 • 6H2O | 1 x 10-5 M | 3.15 g | |
| Na2MoO4 • 2H2O | 1 x 10-8 M | 6.3 g/L dH2O | 1 mL |
| ZnSO4 • 7H2O | 1 x 10-9 M | 22.0 g/L dH2O | 1 mL |
| CoCl2• 6H2O | 1 x 10-9 M | 10.0 g/L dH2O | 1 mL |
| MnCl2 • 4H2O | 1 x 10-8 M | 180.0 g/L dH2O | 1 mL |
| CuSO4• 5H2O | 1 x 10-8 M | 9.8 g/L dH2O | 1 mL |
Tabela 2. Roztwór pierwiastków śladowych11,12. Dopełnić do objętości 1 litra w dH2O i podgrzać do rozpuszczenia. Roztwór podzielić na alykwoaty i zamrozić do przechowywania. Podane stężenia końcowe odnoszą się do końcowego medium, a nie do roztworu pierwiastków śladowych.
| Stężenie końcowe | Roztwór stokowy | Ilość na 1 litr | |
| Witamina B12 | 1 x 10-10 M | 1 g/L dH2O | 1 mL |
| Biotyna | 1 x 10-9 M | 0.1 g/L dH2O | 10 mL |
| Tiamina • HCl | 1 x 10-7 M | 200 mg |
Tabela 3. Roztwór witamin f/211. Dopełnić do objętości 1 litra w dH2O, wysterylizować przez filtrację, podzielić na alikwoty i zamrozić. Podane stężenia końcowe odnoszą się do gotowego medium, a nie do roztworu witamin.
Rysunek 1. Graficzny przegląd procedury transformacji. Schematyczny opis procedury genetycznej transformacji Ostreococcus tauri metodą elektroporacji.
Rysunek 2. Wzrost kultury. Komórki są podkultur现实owane aseptycznie w rozcieńczeniu 1 /100 w świeżym ASW co 7 dni i hodowane przy stałym oświetleniu w inkubatorze do roślin wyposażonym w filtr Moonlight Blue. Natężenie światła powinno wynosić około 20 μmol m-2s-1, a temperatura jest utrzymywana na poziomie 20 °C. Komórki nie wymagają ciągłego mieszania, lecz są wstrząsane raz na 2 do 3 dni w celu zapobiegania agregacji.
Rysunek 3. Tworzenie kolonii na 0,2% agarozie LMP. Przenieś 4 płytki do dużej kwadratowej szalki Petri i uszczelnij parafilmem (lewy górny róg). Po uformowaniu się kolonii należy wybrać wolne kolonie (idealnie o kształcie stożkowym) (prawy górny róg) i odessać je z płytki za pomocą pipety p200. Na kontroli negatywnej nie powinny pojawić się żadne kolonie (prawy dolny róg).
Dyskusja
Stan komórek oraz akseniczność hodowli mają kluczowe znaczenie dla procedury transformacji. Chociaż komórki są zazwyczaj utrzymywane w cyklach 12 godzin światła i 12 godzin ciemności, stwierdzono, że wydajność transformacji w komórkach hodowanych w tych warunkach jest niewystarczająca. Podczas powtarzanych etapów wirowania i resuspensji komórki powinny zawsze łatwo ulegać resuspensji. Jeśli komórki agregują lub obecna jest substancja przypominająca śluz, lepiej rozpocząć procedurę od początku. Zazwyczaj na każdej płytce transformacyjnej można spodziewać się ~50 kolonii, w przeciwieństwie do braku kolonii na płytce kontrolnej negatywnej. W przypadku niskiej wydajności transformacji należy zmienić warunki hodowli, aby upewnić się, że komórki znajdują się w optymalnym stanie. Zmienne wpływające na wydajność transformacji obejmują temperaturę otoczenia w laboratorium (powinna wynosić blisko 20 °C) oraz szybkość postępowania (procedura od wirowania komórek [2.3] do regeneracji [2.7] powinna trwać ~1 godzinę). Ważne jest również, aby wszystkie roztwory były przygotowywane na świeżo przed każdą transformacją. W przypadku wlewania na płytki kluczowe jest stężenie agarozy LMP. Komórki Ostreococcus nie będą rosnąć przy wysokich stężeniach agarozy i będą dyfundować przy niskich stężeniach.
Wcześniej opublikowano trzy wektory transformacyjne dla Ostreococcus6, a w najbliższym czasie spodziewane jest opracowanie i publikacja kolejnych. Istniejący wektor Pot-Luc6 umożliwia zastosowanie wybranego promotora w połączeniu z C-końcowym znacznikiem lucyferazy świetlika, co pozwala na szybszą selekcję linii transgenicznych oraz uzyskanie przejrzystych wzorców ekspresji, podczas gdy wektor Potox6 niesie silny promotor indukowalny13 pochodzący z genu transportera fosforanów o wysokim powinowactwie (HAPT) Ostreococcus, służący do nadekspresji genu zainteresowania. Wektor Potox-Luc pochodzi od Potox i zawiera dodatkowy marker lucyferazy, który może być wykorzystany do pośredniej selekcji linii z nadekspresją14. Skutecznymi markerami selekcyjnymi w tych wektorach są nourseotrycina i G148. Jednakże komórki Ostreococcus wykazują wysoką odporność na wiele antybiotyków, a stężenia związków niezbędne do selekcji transgenicznych komórek Ostreococcus są wyższe niż w przypadku konwencjonalnych systemów modelowych (2 mg/ml).
Mimo że proces ten wydaje się mało wydajny, duża liczba komórek i plazmidowego DNA wymagana do tej procedury nie stanowi znaczącej przeszkody. Większym ograniczeniem jest fakt, że każda wygenerowana linia oporna na marker selekcyjny musi zostać przeanalizowana indywidualnie w celu sprawdzenia, czy cały konstrukt został zintegrowany z DNA. Zaobserwowaliśmy przypadki, w których pomyślna ekspresja markera selekcyjnego nie odpowiadała insercji właściwego genu zainteresowania; innymi słowy, mogą wystąpić integracje częściowe. Ewidentnie, losowa insercja do genomu oznacza również brak kontroli nad miejscem insercji przy użyciu tej metody, a obecnie opracowywane są metody oparte na rekombinacji homologicznej. Niemniej jednak, opisana tutaj metoda jest, według naszej najlepszej wiedzy, obecnie jedyną scharakteryzowaną metodą generowania genetycznie zmodyfikowanych komórek Ostreococcus.
Ponieważ Ostreococcus tauri stał się organizmem modelowym w badaniach eksperymentalnych stosunkowo niedawno, większość metod pracy z tymi komórkami prawdopodobnie będzie ewoluować i być udoskonalana przez rozrastającą się społeczność badawczą. Niniejszy protokół ma na celu pomóc w rozpoczęciu pracy z Ostreococcus, jednak w żadnym stopniu nie pretenduje do opisania całej wiedzy na temat transformacji genomicznej tej mikroalgi. Autorzy wierzą, że czytelnicy będą w stanie dostosować ten protokół do własnych potrzeb, ponieważ wystąpią niewielkie różnice w inkubatorach (poziom lub jakość światła) oraz innych parametrach, które prawdopodobnie będą wymagały optymalizacji w każdym konkretnym laboratorium, aby uzyskać zdrowe kultury niezbędne do realizacji tego protokołu. Po opanowaniu opisanych tutaj technik można konstruować wektory w celu generowania linii fuzyjnych luminescencyjnych, fluorescencyjnych lub z innymi znacznikami, pod kontrolą różnych promotorów. Ta ekscytująca, nowa platforma eksperymentalna będzie przydatna do badania sposobu rozwiązywania złożonych problemów biochemicznych w eukarioncie o zredukowanej złożoności, w którym podejścia farmakologiczne są znacznie ułatwione3.
Oświadczenia
Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
SynthSys, Centrum Zintegrowanej Biologii Systemów, finansowane z grantu BBSRC i EPSRC D019621. Rozwój metod transformacji genetycznej został sfinansowany z grantu dla FYB w ramach sieci doskonałości EU FP6 „Marine Genomics”.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Składniki pożywki | |||
| Sól morska Instant Ocean Marine Salt | z amazon.co.uk lub rocketaquatics.co.uk | ||
| NaNO3 | S5506-250G | Sigma | |
| NH4Cl | A9434-500G | Sigma | |
| Hydrat soli disodowej 2-fosforanu glicerolu | G9422-100G | Sigma | |
| H2SeO3 | 84920-250G | Sigma | |
| Ultra czysty tris | 15504-020 | Invitrogen | |
| Na2EDTA∙2H2O | BPE120-500G | Fisher Scientific | |
| FeCl3∙6H2O | 157740 | Sigma | |
| Na2MoO4∙2H2O | 31439-100G-R | Sigma | |
| ZnSO4∙7H2O | Z0251 | Sigma | |
| CoCl2∙6H2O | 31277 | Sigma | |
| MnCl2∙4H2O | 203734-5G | Sigma | |
| CuSO4∙5H2O | C8027 | Sigma | |
| Witamina B12 (cyjanokobalamina) | V2876 | Sigma | |
| Biotyna | 47868 | Sigma | |
| Tiamina ∙ HCl | T4625 | Sigma | |
| Ampicylina | A9518-25G | Sigma | |
| Neomycyna | N6386 | Sigma | |
| Kanamycyna | K4000 | Sigma | |
| Materiały eksploatacyjne do hodowli | |||
| Kolba do hodowli tkankowych T25 do hodowli w zawiesinie, wentylowana z kanałem wylewowym | 83.1810.502 | Starstedt | |
| Kolba do hodowli tkankowych T75 do hodowli w zawiesinie, wentylowana z kanałem wylewowym | 83.1813.502 | Starstedt | |
| Kolba do hodowli tkankowych T175 do hodowli w zawiesinie, wentylowana z kanałem wylewowym | 83.1812.502 | Starstedt | |
| Filtry nakręcane na butelkę TPP, 1L, kompletne | 99950T | Helena Bioscience | |
| Filtry nakręcane na butelkę TPP, 500ml, | 99500T | Helena Bioscience | |
| Filtry nakręcane na butelkę TPP, 250ml, | 99250T | Helena Bioscience | |
| Filtry nakręcane na butelkę TPP, 150ml, | 99150T | Helena Bioscience | |
| Salinometr do akwariów morskich | DSG-10 | Daeyoon | |
| Odczynniki do transformacji | |||
| D-Sorbitol | S6021-1KG | Sigma | |
| Roztwór Pluronic F-68 | P5556-100ML | Sigma | |
| ClonNat | 51000 | Werner | |
| Agaroza o niskiej temperaturze topnienia | 16520-050 | Invitrogen | |
| Materiały eksploatacyjne do transformacji | |||
| Kolba do hodowli tkankowych T25 do hodowli w zawiesinie, wentylowana z kanałem wylewowym | 83.1810.502 | Starstedt | |
| Kolba do hodowli tkankowych T75 do hodowli w zawiesinie, wentylowana z kanałem wylewowym | 83.1813.502 | Starstedt | |
| Kolba do hodowli tkankowych T175 do hodowli w zawiesinie, wentylowana z kanałem wylewowym | 83.1812.502 | Starstedt | |
| Probówki wirówkowe Greiner 50ml | 227261 | GBO | |
| Kuwety Gene Pulser/MicroPulser, przerwa 0.2 cm, 50 szt. | 165-2086 | Bio-Rad | |
| Szalka Petri okrągła PS 3 otwory wentylacyjne H14.2 Φ55 | 391-0895 | VWR International | |
| Szalka Petri kwadratowa z czterema otworami wentylacyjnymi, polistyrenowa, sterylna przez naświetlanie, przezroczysta, 120mm | FB51788 | Fisher Scientific | |
| Filtr światła niebieskiego Moonlight Blue light filter | 183 | Lee Lighting |
Bibliografia
- Derelle, E. Genome analysis of the smallest free-living eukaryote Ostreococcus tauri unveils many unique features. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 11647-11652 (2006).
- Henderson, G. P., Gan, L., Jensen, G. J. 3-D ultrastructure of O. tauri: electron cryotomography of an entire eukaryotic cell. PLoS One. 2, e749(2007).
- O'Neill, J. S. Circadian rhythms persist without transcription in a eukaryote. Nature. 469, 554-558 (2011).
- van Ooijen, G., Dixon, L. E., Troein, C., Millar, A. J. Proteasome function is required for biological timing throughout the twenty-four hour cycle. Curr. Biol. 21, 869-875 (2011).
- Troein, C. Multiple light inputs to a simple clock circuit allow complex biological rhythms. Plant. J. 66, 375-385 (2011).
- Corellou, F. Clocks in the green lineage: comparative functional analysis of the circadian architecture of the picoeukaryote ostreococcus. Plant Cell. 21, 3436-3449 (2009).
- O'Neill, J. S., Reddy, A. B. Circadian clocks in human red blood cells. Nature. 469, 498-503 (2011).
- Monnier, A. Orchestrated transcription of biological processes in the marine picoeukaryote Ostreococcus exposed to light/dark cycles. B.M.C. Genomics. 11, 192(2010).
- Le Bihan, T. Shotgun proteomic analysis of the unicellular alga Ostreococcus tauri. J. Proteomics. 74, 2060-2070 (2011).
- Expression of polypeptides from the nuclear genome of Ostreococcus sp. US application patent. , 201001174050 (2010).
- Guillard, R. R. L., Ryther, J. H. Studies of marine planktonic diatoms. I. Cyclotella nana Hustedt, and Detonula confervacea (cleve) Gran. Can. J. Microbiol. 8, 229-239 (1962).
- Keller, M. D., Selvin, R. C., Claus, W., Guillard, R. R. L. Media for the culture of oceanic ultraphytoplankton. J. Phycol. 23, 633-638 (1987).
- Djouani-Tari, elB. A phosphate-regulated promoter for fine-tuned and reversible overexpression in Ostreococcus: Application to circadian clock functional analysis. PLoS One. 6, e28471(2011).
- Moulager, M. Integration of light signals by the retinoblastoma pathway in the control of S phase entry in the picophytoplanktonic cell Ostreococcus. PLoS. Genet. 6, e1000957(2010).
Przedruki i uprawnienia
