Method Article

Transformacja genomowa pikoeukarionta Ostreococcus tauri

DOI:

10.3791/4074

⸱

July 13th, 2012

 ,  ,  ,  , 
1SynthSys, University of Edinburgh , 2Centre National de la Recherche Scientifique, Université Pierre et Marie Curie, Paris 06, 3UMR 7621, Laboratoire d'Océanographie Microbienne, Observatoire Océanologique, Banyuls-sur-Mer, Université Pierre et Marie Curie, Paris 06

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten artykuł opisuje genetyczną transformację jednokomórkowego algi morskiej Ostreococcus tauri za pomocą elektroporacji. Ten organizm eukariotyczny jest skuteczną platformą modelową dla roślin wyższych, posiadającą znacznie zmniejszoną złożoność genomiczną i komórkową oraz łatwo podatną zarówno na hodowlę komórkową, jak i biologię chemiczną.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Częste problemy utrudniające szybki postęp w naukach o roślinach obejmują złożoność komórek, tkanek i całego organizmu, a zwłaszcza wysoki poziom redundancji genomu wpływający na prostą genetykę u wyższych roślin. Nowy organizm modelowy Ostreococcus tauri jest najmniejszym wolno żyjącym znanym do tej pory eukariontem i posiada znacznie zmniejszony rozmiar genomu i złożoność komórkową1,2, objawiającą się obecnością tylko jednego z większości organelli (mitochondrium, chloroplast, stos Golgiego) na komórkę i genomem zawierającym tylko ~8000 genów. Co więcej, połączenie jednokomórkowej i łatwej hodowli zapewnia platformę podatną na podejścia z zakresu biologii chemicznej. Ostatnio Ostreococcus został z powodzeniem wykorzystany do badania podstawowych mechanizmów leżących u podstaw okołodobowego pomiaru czasu3-6. Wyniki badań nad tym modelowym organizmem wpłynęły nie tylko na naukę o roślinach, ale także na biologię ssaków7. Ten przykład pokazuje, jak szybkie eksperymenty na prostym eukarioncie z zielonej linii mogą przyspieszyć badania nad bardziej złożonymi organizmami poprzez generowanie testowalnych hipotez przy użyciu metod technicznie wykonalnych tylko w tym kontekście zmniejszonej złożoności. Wiedza o genomie i możliwość modyfikacji genów są niezbędnymi narzędziami w każdym modelowym gatunku. Informacje o genomie1, transkryptomii8 i proteomice9 dla tego gatunku są powszechnie dostępne, podczas gdy wcześniej opisane metody6,10 do genetycznej transformacji Ostreococcus są znane niewielu laboratoriom na całym świecie.

W tym artykule szczegółowo opisane są eksperymentalne metody genetycznego przekształcania tego nowego organizmu modelowego z konstruktem nadekspresji za pomocą elektroporacji, a także metoda włączania przekształconych komórek do niskoprocentowej agarozy, aby umożliwić selekcję przekształconych linii pochodzących z pojedynczej przekształconej komórki. Po udanym zastosowaniu Ostreococcus w badaniach okołodobowych, można spodziewać się rosnącego zainteresowania Ostreococcus ze strony różnych obszarów badawczych w ramach nauk o roślinach i poza nimi, w tym w obszarach biotechnologicznych. Naukowcy z szerokiego zakresu nauk biologicznych i medycznych, którzy pracują nad konserwatywnymi szlakami biochemicznymi, mogą rozważyć kontynuowanie badań nad Ostreococcus, wolnymi od złożoności genomowej i organizmowej większych gatunków modelowych.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie materiału z glonów

  1. Komórki Ostreococcus są hodowane w sztucznej wodzie morskiej (ASW). Sole morskie (zwykle około 40 gramów na litr) rozpuszcza się w wodzie dejonizowanej do zasolenia 30 ppt, mierzonego za pomocą miernika zasolenia. Do pożywki wzbogacającej11,12 dodaje się pierwiastki metali śladowych i witaminy, jak opisano w tabelach 1-3. Media są następnie sterylizowane przez filtr 0,22 μm.
  2. W celu utrzymania populacji, komórki Ostreococcus szczep OTTH95 są hodowane aseptycznie w rozcieńczeniu 1/100 w świeżym ASW co 7 dni i hodowane w stałym świetle w inkubatorze wzrostu roślin wyposażonym w filtr Moonlight Blue. Natężenie światła powinno być bliskie 20 μmol m-2 s-1, a temperatura jest utrzymywana na poziomie 20 °C. Komórki nie wymagają ciągłego mieszania, ale są wstrząsane raz na 2 do 3 dni, aby zapobiec agregacji.
  3. Do każdej przemiany potrzeba 50 ml komórek o gęstości komórek 20-30 x 106 ml-1, którą należy osiągnąć 5-7 dni po podhodowli. Przybliżoną gęstość komórek i osię można określić za pomocą cytometrii przepływowej lub hemocytometru przy minimalnym powiększeniu x40.

2. Elektroporacja

  1. Przygotuj DNA do transformacji. Do każdej przemiany potrzeba 5 μg czystego, zlinearyzowanego plazmidowego DNA o stężeniu 1 μg/μl w sterylnej wodzie dejonizowanej. Aby uzyskać to DNA, autorzy zalecają użycie zestawu przygotowawczego Qiagen midi, chociaż inne metody mogą działać równie dobrze. Produkt należy roztrawić za pomocą enzymu, który nacina szkielet użytego wektora, ale nie w transgenie lub genie selekcyjnym. Następnie należy oczyścić i zagęścić powstałe liniowe DNA przez wytrącanie etanolu, a następnie ponownie zawiesić produkt w odpowiedniej objętości wysokiej jakości sterylnej wody dejonizowanej.
  2. Przygotować probówki do mikrowirówek zawierające 5 μg DNA dla każdej przemiany. Kontrola bez DNA jest konieczna, aby każda linia komórkowa została przekształcona. Utrzymuj te probówki na lodzie, razem z kuwetą do elektroporacji o średnicy 2 mm dla każdej przemiany.
  3. Przygotować 2,2 ml buforu do sporządzania zawiesiny na każdą przemianę. Rozpuścić sorbitol w 1 M roztworze w ddH2O, dodać 0,1 % kwasu pluronowego F68 i przefiltrować do sterylizacji.
  4. Dodać kwas pluronowy F68 do końcowego stężenia 0,1% do komórek i granulować je przez 10 minut w temperaturze 8000 x g w temperaturze 10 °C w probówce o pojemności 50 ml ze stożkowym dnem. Natychmiast ponownie zawiesić komórki w 1 ml buforu do sporządzania zawiesiny, pipetując w górę i w dół, a następnie przenieść do probówki do mikrofuge. Wirować przez 10 minut w temperaturze 8000 x g w temperaturze 10 °C i pracując szybko, powtórzyć ten krok prania jeszcze raz.
  5. Za pomocą odciętej końcówki ponownie zawiesić każdą ostatnią granulkę w 40 μl bufora do zawieszania. Dodać 40 μl zawieszonych komórek do każdej probówki zlinearyzowanego DNA na lodzie, delikatnie wymieszać i przenieść do kuwety do elektroporacji.
  6. Umieść kuwetę w maszynie do elektroporacji. Zmień ustawienia na 6 kV cm-1, 600 Ω i 25 μF. Elektroporuj ogniwa.
  7. Inkubować komórki elektryczne w kuwetach w temperaturze pokojowej przez 10 minut i wykorzystać ten czas do przygotowania kolb do hodowli tkankowych. Oznacz je i dodaj do każdego 30 ml świeżego ASW. Wyjmij 1 ml z każdej kolby i delikatnie dodaj go do odpowiedniej kuwety. Inkubować przez 2 minuty i delikatnie usunąć ASW, teraz zawierający kuleczkę komórek, a następnie delikatnie i powoli pipetować bezpośrednio do ASW w kolbie hodowlanej.
  8. Komórki zazwyczaj pozostają w kuli. Uważaj, aby w tym momencie nie potrząsnąć ani nie naruszyć zagregowanych komórek. Pozostawić komórki do regeneracji w inkubatorze przez 1-2 godziny, a następnie ponownie zawiesić, potrząsając kolbami. W tym czasie komórki powinny się swobodnie zawiesić i nie powinny być widoczne żadne grudki. Pozostaw kultury do wyzdrowienia na noc w inkubatorze.

3. Włączenie komórek na płytkach do podłoża półstałego

  1. Następnego dnia należy przelać w autoklawie roztwór 2,1% agarozy o niskiej temperaturze topnienia w ddH2O w butelce zawierającej mieszadło. Przechowywać stopiony w temperaturze 65-90 °C w większej zlewce zawierającej wodę na podgrzewanym mieszadle magnetycznym. Do każdej przemiany należy przygotować 8 szalek Petriego (o średnicy 55 mm) i 8 probówek o pojemności 15 ml, z których każda zawiera 9 ml ASW oraz wymagany wybór. W przypadku stosowania Nourseothricin lub G418 należy użyć 2 mg/ml.
  2. Zbierz przekształcone komórki z inkubatora. Pracując w sterylnym okapie przepływowym, dodaj 1 ml wrzącej agarozy LMP do 9 ml w jednej z probówek. Zamknij tubkę i wymieszaj, odwracając ją. Następnie dodaj 0,5 ml świeżo przekształconych komórek, szybko wymieszaj i wlej do talerza. Powtórzyć ten proces z pozostałymi 7 probówkami, a następnie przejść do następnej kolby transformacyjnej.
  3. Pozostaw płytki otwarte w okapie przepływowym na godzinę, aby agaroza stężała. Następnie zamknij talerze i przenieś je na duże kwadratowe szalki Petriego, z których każda pomieści 4 talerze. Uszczelnij kwadratowe płytki parafilmem. Należy pamiętać, że płytki nie zastygną całkowicie, w wyniku czego żel jest bardzo delikatny. Należy uważać, aby nie złamać żelu podczas obchodzenia się z płytkami. Umieść wszystkie kwadratowe płytki w inkubatorze.

4. Wybór przekształconych kolonii

  1. Kolonie powinny pojawić się po 10 do 21 dniach na płytkach transformacyjnych, ale nie na pozorowanych przekształconych płytkach. Do pobierania kolonii należy użyć pipety o pojemności 200 μl z końcówkami odcinającymi. Po prostu wybierz wolne kolonie i wysysaj zieloną kolonię. Uważaj, aby nie uwzględnić żadnych komórek z sąsiednich kolonii.
  2. Przenieść komórki do 2 ml płynnego podłoża zawierającego selekcję, na płytkę z 24 dołkami. W przypadku stosowania Nourseothricin należy stosować 1,75 mg/ml. Mieszać, pipetując w górę i w dół. Wybierz 24-50 kolonii na transformację. Uszczelnij płytki parafilmem i przenieś do inkubatora.
  3. Po tygodniu przenieś 100 μl każdej studzienki do 2 ml świeżego ASW z selekcją na płytce 24-dołkowej i hoduj przez dodatkowe 7 dni. Ocalałe linie komórkowe można wykorzystać do dalszych badań. Stabilna integracja z genomem i liczba insercji powinny być analizowane za pomocą PCR i Southern Blot. Genomowe DNA można uzyskać do tych celów przy użyciu dowolnej standardowej metody ekstrakcji DNA roślinnego w zmniejszonej skali.

5. Reprezentatywne wyniki

Komórki podzielone na 1/100 osiągnęły gęstość 25 milionów komórek na mililitr po wzroście przez 7 dni. Elektroporacja ogniw przy odpowiednich ustawieniach spowodowała uzyskanie stałej czasowej między 10 a 14 milisekund. Kiedy komórki są przenoszone do pożywki w kolbach hodowlanych, powinna powstać kulka komórek. Po lekkim wstrząśnięciu po godzinie ogniwa powinny łatwo zawiesić się ponownie. Włączenie 1 ml przekształconych komórek do 0,2% agaru LMP powinno dać spójny, ale tylko półstały żel. Kolonie powinny pojawić się po 10 do 21 dniach. Podczas transformacji 5 μg zlinearyzowanego DNA przy użyciu powyższego protokołu, zwykle oczekiwano 50-100 kolonii na płytkę transformacyjną, w porównaniu z żadną na płytkach kontroli ujemnej. ~80% pobranych rodzin zostało pozytywnie wyselekcjonowanych przez oporność na antybiotyki w płynnej pożywce i zostało wykorzystanych w kolejnych badaniach.

  Końcowe stężenie Roztwór podstawowy Objętość na 1 litr NaNO3 8,83 x 10-4 mln 75 g/L dH2O 1 ml NH4Cl 3,63 x 10-5 m 2,68 g/L dH2O 1 ml β-glicerofosforan 1 x 10-5 m 2,16 g/L dH2O 1 ml H2SeO3 1 x 10-8 m 1,29 mg/L dH2O 1 ml Tris-base (pH 7,2) 1 x 10-3 m 121,1 g/l dH2O 1 ml Roztwór metali śladowych K   Tabela 2 1 ml Roztwór witamin f/2   Tabela 3 0,5 ml

Tabela 1. Składniki średnie dla wzrostu O. tauri11, 12. Uzupełnić całkowitą objętość 1 litra sztucznej wody morskiej do zasolenia 30 ppt i dodać powyższe składniki z roztworów podstawowych, jak wskazano. Przefiltruj i wysterylizuj pożywkę i zużyj w ciągu tygodnia. Zapasy wszystkich związków z wyjątkiem roztworu witaminowego można połączyć w celu dodania 6 ml tego roztworu na każdy litr pożywki.

  Końcowe stężenie Roztwór podstawowy Ilość na 1 litr Na2EDTA • 2H2O 1 x 10-4 m   41,6 gr FeCl3 • 6H2O 1 x 10-5 m   3,15 gr Na2MoO4 • 2H2O 1 x 10-8 m 6,3 g/l dH2O 1 ml ZnSO4 • 7H2O 1 x 10-9 m 22,0 g/l dH2O 1 ml CoCl2• 6H2O 1 x 10-9 m 10,0 g/L dH2O 1 ml MnCl2 • 4H2O 1 x 10-8 m 180,0 g/l dH2O 1 ml CuSO4• 5H2O 1 x 10-8 m 9,8 g/l dH2O 1 ml

Tabela 2. Roztwór metalu śladowego11,12. Uzupełnić do całkowitej objętości 1 litra w dH2O i podgrzewać do rozpuszczenia. Podzielić roztwór na porcje i zamrozić do przechowywania. Wskazane stężenia końcowe odnoszą się do pożywki końcowej, a nie do roztworu metalu śladowego.

  Końcowe stężenie Roztwór podstawowy Ilość na 1 litr Witamina B12 1 x 10-10 m 1 g/L dH2O 1 ml biotyna 1 x 10-9 m 0,1 g/L dH2O 10 ml Tiamina • HCl 1 x 10-7 m   200 mg tabletki powlekania

Tabela 3. f/2 Roztwór witaminowy11. Uzupełnić łącznie do 1 litra wdH2O, przefiltrować do sterylizacji, podwielokrotność i zamrozić. Wskazane stężenia końcowe odnoszą się do pożywki końcowej, a nie do roztworu witaminy.

figure-protocol-1
Rysunek 1. Graficzne przedstawienie procesu transformacji. Schematyczne przedstawienie procedury genetycznej transformacji Ostreococcus tauri za pomocą elektroporacji.

figure-protocol-2
Rysunek 2. Rozwój kultury. Komórki są hodowane w sposób aseptyczny w rozcieńczeniu 1/100 w świeżym ASW co 7 dni i hodowane w stałym świetle w inkubatorze wzrostu roślin wyposażonym w filtr Moonlight Blue. Natężenie światła powinno być bliskie 20 μmol m-2 s-1, a temperatura jest utrzymywana na poziomie 20 °C Ogniwa nie wymagają ciągłego mieszania, ale są wstrząsane raz na 2 do 3 dni, aby zapobiec agregacji.

figure-protocol-3
Rysunek 3. Tworzenie kolonii na 0,2% agarozie LMP. Przenieś 4 płytki na dużą kwadratową szalkę Petriego i zamknij parafilmem (u góry po lewej). Gdy kolonie się uformują, po prostu wybierz wolne (najlepiej stożkowate) kolonie (u góry po prawej) i odessaj je z płytki za pomocą pipety p200. W kontroli ujemnej (na dole po prawej) nie powinno być żadnych kolonii.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Stan komórkowy i oś hodowli ma kluczowe znaczenie dla procesu transformacji. Chociaż komórki są zwykle utrzymywane w cyklach 12 godzin światła i 12 godzin ciemności, wydajność przemian w komórkach hodowanych w tych warunkach okazała się niewystarczająca. Podczas powtarzających się etapów granulowania / ponownego zawieszania komórki powinny zawsze łatwo ulegać ponownemu zawieszeniu. Jeśli komórki agregują się lub obecna jest substancja podobna do śluzu, lepiej rozpocząć procedurę od początku. Zazwyczaj można spodziewać się ~50 kolonii na każdej płytce transformacyjnej, w porównaniu z żadną na płytce kontroli ujemnej. W przypadku niskiej wydajności transformacji warunki hodowli powinny być zróżnicowane, aby zapewnić optymalny stan komórek. Zmienne wpływające na wydajność przemiany obejmują temperaturę otoczenia w laboratorium (powinna być bliska 20 °C) i szybkość obsługi (procedura od komórek granulujących [2.3] do odzysku [2.7] powinna zająć ~1 godzinę). Ważne jest również, aby wszystkie rozwiązania były przygotowywane na świeżo przed każdą transformacją. Do włączenia do płytek kluczowe znaczenie ma stężenie agarozy LMP. Komórki Ostreococcus nie będą rosły w wysokich stężeniach agarozy i będą dyfundować w niskich stężeniach.

Wcześniej opublikowano trzy wektory transformacji dla Ostreococcus 6 i oczekuje się, że wkrótce zostaną wygenerowane i opublikowane kolejne wektory. Istniejący wektor Pot-Luc6 pozwala na użycie promotora z wyboru w połączeniu z C-końcowym znacznikiem lucyferazy świetlika, co pozwala na szybszą selekcję linii transgenicznej i łatwe do opanowania wzorce ekspresji, podczas gdy wektorPotox 6 przenosi silny indukowalny promotor13 pobrany z genu Ostreococcus High Affinity Phosphate Transporter (HAPT) dla nadekspresji genu będącego przedmiotem zainteresowania. Wektor Potox-Luc wywodzi się z Potoks, niosąc dodatkowy marker lucyferazy, który może być używany do pośredniej selekcji linii nadekspresji14. Skutecznymi markerami wyboru na tych wektorach są Nourseothricin i G148. Komórki Ostreococcus są jednak wysoce oporne na wiele antybiotyków, a stężenia związków niezbędnych do selekcji transgenicznych komórek Ostreococcus są wyższe niż w przypadku konwencjonalnych układów modelowych (2 mg/ml).

Chociaż proces ten wydaje się nieefektywny, duża liczba komórek i plazmidowego DNA potrzebnych do tej procedury nie stanowi znaczącej przeszkody. Większym ograniczeniem jest to, że każda wygenerowana linia, która jest odporna na marker wybieralny, musi być analizowana indywidualnie, aby sprawdzić, czy cały konstrukt jest zintegrowany z DNA. Zaobserwowaliśmy przykłady, w których udana ekspresja markera selekcyjnego nie odpowiadała insercji rzeczywistego genu będącego przedmiotem zainteresowania; tzn. mogą wystąpić częściowe integracje. Najwyraźniej losowa insercja do genomu oznacza również, że nie ma kontroli nad miejscem insercji przy użyciu tej metody, a metody oparte na rekombinacji homologicznej są obecnie opracowywane. Jednak opisana tutaj metoda jest, według naszej najlepszej wiedzy, obecnie jedyną scharakteryzowaną metodą generowania genetycznie zmodyfikowanych komórek Ostreococcus .

Ponieważ Ostreococcus tauri dopiero od niedawna jest używany jako eksperymentalny organizm modelowy, większość metod pracy z tymi komórkami prawdopodobnie będzie ewoluować i być udoskonalana przez rosnącą społeczność badawczą. Protokół ten ma na celu pomóc ludziom rozpocząć pracę z Ostreococcus, ale w żadnym wypadku nie twierdzi, że opisuje wszystko, co trzeba wiedzieć o transformacji genomowej tej mikroalgi. Autorzy mają nadzieję, że czytelnicy będą w stanie dostosować ten protokół do własnych potrzeb, ponieważ niewielkie różnice w inkubatorach (poziom światła lub jakość) i innych parametrach będą istniały i prawdopodobnie będą musiały zostać zoptymalizowane w każdym laboratorium z osobna, aby uzyskać zdrowe kultury potrzebne do tego protokołu. Po opanowaniu opisanych tutaj technik, wektory mogą być konstruowane w celu generowania luminescencyjnych, fluorescencyjnych lub innych oznakowanych linii fuzji pod kontrolą szeregu promotorów. Ta ekscytująca, nowatorska platforma eksperymentalna będzie przydatna do zbadania, w jaki sposób skomplikowane problemy biochemiczne są rozwiązywane u eukariontów o zmniejszonej złożoności, w których podejścia farmakologiczne są znacznie ułatwione3.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

SynthSys, Centrum Biologii Systemów Integracyjnych, finansowane przez BBSRC, a EPSRC przyznaje D019621. Dotacja przyznana przez Sieć Doskonałości UE w ramach programu "Genomika morska" dla FYB została sfinansowana w ramach rozwoju metod transformacji genetycznej.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Medium conmeanents
Instant Ocean Marine Saltfrom amazon.co.uk lub rocketaquatics.co.uk
NaNO3S5506-250GSigma
NH4ClA9434-500GSigma
Glycerol 2-fosforan soli disodowej hydratG9422-100GSigma
H2SeO384920-250GSigma
Ultra pure tris15504-020Invitrogen
Na2EDTA∙ 2H2OBPE120-500GFisher Scientific
FeCl3∙ 6H2O157740Sigma
Na2MoO4∙ 2H2O31439-100G-RSigma
ZnSO4∙ 7H2OZ0251Sigma
CoCl2∙ 6H2O31277Sigma
MnCl2∙ 4H2O203734-5GSigma
CuSO4∙ 5H2OC8027Sigma
Witamina B12 (cyjanokobalamina)V2876Sigma
Biotyna 47868Sigma
Tiamina ∙ HCl T4625Sigma
AmpicillinA9518-25GSigma
NeomycynaN6386Sigma
KanamycynaK4000Sigma
Materiały eksploatacyjne do hodowli
Tissue Culture T25 Kultury zawiesinowe wentylowane kanałem nalewniczym83.1810.502Starstedt
Tissue Culture Flask T75 Kultury zawiesinowe wentylowane z kanałem nalewniczym83.1813.502Starstedt
Kolba do kultur tkankowych T175 Kultury zawiesinowe wentylowane z kanałem nalewowym83.1812.502Starstedt
TPP Filtry butelkowe, 1L, kompletne99950THelena Bioscience
TPP Filtry butelkowe, 500ml,99500THelena Bioscience
TPP Filtry butelkowe, 250ml,99250THelena Bioscience
TPP Filtry butelkowe, 150ml,99150THelena Bioscience
do akwarium morskiegoDSG-10Daeyoon
Chemikalia do transformacji
D-SorbitolS6021-1KGSigma
Pluronic F-68 roztwórP5556-100MLSigma
ClonNat51000Werner
Agaroza o niskiej temperaturze topnienia16520-050Invitrogen
Materiały eksploatacyjne do transformacji
Tissue Culture Flask T25 Zawiesiny Kultury Wentylowane z kanałem nalewowym83.1810.502Kolba
T75 Kultury zawiesinowe wentylowane z kanałem nalewniczym83.1813.502Kolba
T175 Kultury zawiesinowe wentylowane z kanałem nalewowym83.1812.502Probówki wirówkowe Starstedt
Greiner 50ml227261GBO
Gene Pulser/MicroPulser, szczelina 0,2 cm, 50165-2086Bio-Rad
szalka Petriego okrągła PS 3 VENTS H14.2 Φ 55 391-0895VWR International
szalka Petriego kwadratowa z czterema otworami wentylacyjnymi polistyren sterylny przez napromieniowanie przezroczysty 120 mmFB51788Fisher Scientific
Moonlight Filtr światła niebieskiego183Lee Lighting
Miernik zasolenia do kultur tkankowych Starstedt do kultur tkankowych Starstedt Kuwety

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Genome analysis of the smallest free-living eukaryote Ostreococcus tauri unveils many unique features. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 11647-11652 (2006).">Derelle, E. Genome analysis of the smallest free-living eukaryote Ostreococcus tauri unveils many unique features. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 11647-11652 (2006).
  2. 3-D ultrastructure of O. tauri: electron cryotomography of an entire eukaryotic cell. PLoS One. 2, e749(2007).">Henderson, G. P., Gan, L., Jensen, G. J. 3-D ultrastructure of O. tauri: electron cryotomography of an entire eukaryotic cell. PLoS One. 2, e749(2007).
  3. Circadian rhythms persist without transcription in a eukaryote. Nature. 469, 554-558 (2011).">O'Neill, J. S. Circadian rhythms persist without transcription in a eukaryote. Nature. 469, 554-558 (2011).
  4. Proteasome function is required for biological timing throughout the twenty-four hour cycle. Curr. Biol. 21, 869-875 (2011).">van Ooijen, G., Dixon, L. E., Troein, C., Millar, A. J. Proteasome function is required for biological timing throughout the twenty-four hour cycle. Curr. Biol. 21, 869-875 (2011).
  5. Multiple light inputs to a simple clock circuit allow complex biological rhythms. Plant. J. 66, 375-385 (2011).">Troein, C. Multiple light inputs to a simple clock circuit allow complex biological rhythms. Plant. J. 66, 375-385 (2011).
  6. Clocks in the green lineage: comparative functional analysis of the circadian architecture of the picoeukaryote ostreococcus. Plant Cell. 21, 3436-3449 (2009).">Corellou, F. Clocks in the green lineage: comparative functional analysis of the circadian architecture of the picoeukaryote ostreococcus. Plant Cell. 21, 3436-3449 (2009).
  7. Circadian clocks in human red blood cells. Nature. 469, 498-503 (2011).">O'Neill, J. S., Reddy, A. B. Circadian clocks in human red blood cells. Nature. 469, 498-503 (2011).
  8. Orchestrated transcription of biological processes in the marine picoeukaryote Ostreococcus exposed to light/dark cycles. B.M.C. Genomics. 11, 192(2010).">Monnier, A. Orchestrated transcription of biological processes in the marine picoeukaryote Ostreococcus exposed to light/dark cycles. B.M.C. Genomics. 11, 192(2010).
  9. Shotgun proteomic analysis of the unicellular alga Ostreococcus tauri. J. Proteomics. 74, 2060-2070 (2011).">Le Bihan, T. Shotgun proteomic analysis of the unicellular alga Ostreococcus tauri. J. Proteomics. 74, 2060-2070 (2011).
  10. Expression of polypeptides from the nuclear genome of Ostreococcus sp. US application patent. , 201001174050 (2010).
  11. Studies of marine planktonic diatoms. I. Cyclotella nana Hustedt, and Detonula confervacea (cleve) Gran. Can. J. Microbiol. 8, 229-239 (1962).">Guillard, R. R. L., Ryther, J. H. Studies of marine planktonic diatoms. I. Cyclotella nana Hustedt, and Detonula confervacea (cleve) Gran. Can. J. Microbiol. 8, 229-239 (1962).
  12. Media for the culture of oceanic ultraphytoplankton. J. Phycol. 23, 633-638 (1987).">Keller, M. D., Selvin, R. C., Claus, W., Guillard, R. R. L. Media for the culture of oceanic ultraphytoplankton. J. Phycol. 23, 633-638 (1987).
  13. A phosphate-regulated promoter for fine-tuned and reversible overexpression in Ostreococcus: Application to circadian clock functional analysis. PLoS One. 6, e28471(2011).">Djouani-Tari, elB. A phosphate-regulated promoter for fine-tuned and reversible overexpression in Ostreococcus: Application to circadian clock functional analysis. PLoS One. 6, e28471(2011).
  14. Integration of light signals by the retinoblastoma pathway in the control of S phase entry in the picophytoplanktonic cell Ostreococcus. PLoS. Genet. 6, e1000957(2010).">Moulager, M. Integration of light signals by the retinoblastoma pathway in the control of S phase entry in the picophytoplanktonic cell Ostreococcus. PLoS. Genet. 6, e1000957(2010).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Ostreococcus tauriGenetic TransformationElectroporation MethodLow Percentage AgaroseColony SelectionFlow CytometryPCR AnalysisSouthern BlotBlue Light IncubationAntibiotic Resistance

Related Articles