Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Cykliczna amplifikacja błędnego fałdowania białek prionów

19K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/4075

⸱

7 listopada 2012

 ,  , 
1Department of Civil Engineering, University of Nebraska at Lincoln, 2Department of Medical Microbiology and Immunology, Creighton University

W tym artykule

Podsumowanie

Cykliczna amplifikacja błędnego fałdowania białek (PMCA) jest testem in vitro służącym do badania konwersji prionów oraz barier szczepowych i gatunkowych. Może być również wykorzystywana jako test detekcji prionów.

Streszczenie

Priony są czynnikami zakaźnymi, które wywołują nieuchronnie śmiertelne zaraźliwe encefalopatie gąbczaste (TSE) u zwierząt i ludzi9,18. Białko prionowe występuje w dwóch odrębnych izoformach: niezakaźnym białku kodowanym przez organizm gospodarza (PrPC) oraz białku zakaźnemu (PrPSc), które jest nieprawidłowo sfałdowaną izoformą PrPC 8.

Jednym z wyzwań związanych z pracą z agentami prionowymi jest długi okres inkubacji przed wystąpieniem objawów klinicznych po inokulacji gospodarza13. Tradycyjnie wymuszało to przeprowadzanie długotrwałych i kosztownych badań bioanalitycznych na zwierzętach. Ponadto właściwości biochemiczne i biofizyczne PrPSc są słabo scharakteryzowane ze względu na ich nietypową konformację i stany agregacji.

PrPSc może inicjować konwersję PrPC do PrPSc in vitro14. PMCA jest techniką in vitro, która wykorzystuje tę zdolność, stosując cykle sonikacji i inkubacji w celu produkcji dużych ilości PrPSc w przyspieszonym tempie, z układu zawierającego nadmiar PrPC i śladowe ilości zarodnika PrPSc19. Technika ta okazała się skuteczna w odtwarzaniu swoistości gatunkowej i szczepowej konwersji PrPC do PrPSc, emulowaniu interferencji szczepów prionów oraz amplifikacji bardzo niskich poziomów PrPSc z zakażonych tkanek, płynów i próbek środowiskowych6,7,16,23.

Niniejsza praca szczegółowo opisuje protokół PMCA, w tym zalecenia dotyczące minimalizacji kontaminacji, generowania spójnych wyników oraz ich kwantyfikacji. Omówiono również kilka zastosowań PMCA, w tym generowanie i charakterystykę zakaźnych szczepów prionów, interferencję szczepów prionów oraz detekcję prionów w środowisku.

Protokół

1. Przygotowanie sprzętu

  1. Użyj sonikatora Misonix 3000 lub Misonix 4000 (Farmingdale, NY) podłączonego do łaźni wodnej Thermo Electron Neslab EX-7 (Newington, NH) w celu utrzymania stałej temperatury 37 °C. Sonicuj próbki w cienkościennych paskach probówek PCR o pojemności 200 μl z wypukłymi zakrętkami marki Thermo Scientific (Waltham, MA).
  2. Nowy sonikator wymaga okresu "docierania" podczas ciągłej pracy9. Dwumiesięczny okres docierania składa się z cykli obejmujących 40-sekundowy impuls sonikacji i 10-minutową inkubację, przy poziomie amplitudy ustawionym na 10. Należy zaobserwować erozję na całej powierzchni tytanowego emitera do mikropłytek (Rysunek 1, panel B). Krążąca woda stanie się biała i mętna z powodu erozji tytanowego emitera do mikropłytek. Wymieniaj tę wodę codziennie.
  3. Amplifikacja PrPSc będzie różnić się w obrębie emitera do mikropłytek. Najlepszą wydajność amplifikacji PrPSc można uzyskać w promieniu 5 cm od centrum emitera do mikropłytek (patrz Rysunek 1, panel C).
  4. Jedna runda PMCA składa się ze 144 cykli. Każdy cykl obejmuje 5 s sonikacji i 10 min inkubacji. Przełoży się to w przybliżeniu na 24 h na jedną rundę PMCA.
  5. Moc sonikacji wyświetlana na panelu sterowania sonikatora zmienia się w zależności od liczby probówek PCR znajdujących się w statywie sonikatora oraz temperatury wody krążącej z łaźni wodnej. Upewnij się, że woda ma temperaturę 37 °C i nie wypełniaj więcej niż 30% statywu na probówki sonikatora (Rysunek 1, panel C). Rozmieść probówki PCR w obrębie emitera do mikropłytek. Pozostaw przynajmniej jeden pusty rząd między paskami probówek PCR i nie łącz więcej niż czterech probówek w jednym pasku (Rysunek 1, panel C).
  6. Intensywność sonikacji jest krytyczna dla udanej amplifikacji szczepu prionów. Podczas sonikacji dostosuj amplitudę tak, aby moc wyjściowa mieściła się w zakresie 155 ~ 170 watów. W naszym laboratorium poziom mocy jest ustawiony odpowiednio na sześć dla Misonix 3000 i siedem dla Misonix 4000.
  7. W łaźni wodnej stosuj wodę destylowaną, aby zapobiec osadzaniu się kamienia. Wymieniaj tę wodę co tydzień. Podczas cykli inkubacji i sonikacji wewnątrz pokrywy emitera do mikropłytek pojawi się kondensacja wody. Aby uniknąć kondensacji, przymocuj małą akwariową matę grzejną do górnej części obudowy sonikatora, jak pokazano na Rysunku 1, panel A.

2. Przygotowanie próbek

  1. Wszystkie procedury z udziałem zwierząt zostały zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Use Committee Uniwersytetu Creighton i są zgodne z Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Przed pobraniem tkanek zwierzę musi zostać poddane znieczuleniu i perfuzji transkardialnej za pomocą lodowatego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanem z dodatkiem 5 mM EDTA o pH 7,4, aby usunąć krew z mózgu i uniknąć hamowania reakcji PMCA przez krew7. Tkanki zwierzęce należy pobierać szybko, stosując technikę aseptyczną, używając osobnych narzędzi do sekcji dla każdego szczepu prionów. Po sekcji tkankę umieszcza się w probówce do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml, zamraża gwałtownie na suchem lodzie i przechowuje w temperaturze -80 °C do momentu homogenizacji.
  2. Aby przygotować roztwór podłoża PMCA (PrPC), należy zhomogenizować niezakażony mózg chomika (UN BH) do uzyskania 10% roztworu masy/objętości (w/v) w lodowatym buforze konwersyjnym (patrz część 3), używając homogenizatora tkanek Tenbroeck. Podczas homogenizacji należy uważać, aby do homogenizatora nie dostało się powietrze, co zapobiegnie nadmiernemu pienieniu się roztworu. Roztwór należy oczyścić poprzez wirowanie przy 500 x g przez 30 s, a następnie podzielić supernatant na alykwoy w probówkach do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml. Przechowywać w temperaturze -80 °C do dalszego użycia.
  3. Aby przygotować roztwór nasion PMCA (PrPSc), należy zhomogenizować materiał zakaźny (mózg, śledzionę, węzły chłonne, inne tkanki lub zanieczyszczoną glebę) do uzyskania 10% roztworu w/v w lodowatej wodzie, a następnie podzielić roztwór na alykwoy w probówkach do mikrocentryfugi o pojemności 0,6 ml. Przechowywać w temperaturze -80 °C do dalszego użycia.

3. Przygotowanie buforu konwersyjnego

  1. Odważyć 0,5093 g Triton X-100 do kolby miarowej o pojemności 50 ml (wynikiem jest końcowe stężenie 1% Triton X-100) (Sigma-Aldrich GmbH; Steinheim, Niemcy).
  2. Dodać jedną tabletkę inhibitora proteaz Complete Protease Inhibitor Tablet (Roche Diagnostics GmbH; Mannheim, Niemcy).
  3. Dodać 0,0931 g EDTA (zaowocuje to końcowym stężeniem 5 mM EDTA) (Mallinckrodt Baker Inc.; Phillipsburg, NJ).
  4. Dostosować pH do 7,4 za pomocą 1N NaOH.
  5. Dopełnić objętość do 50 ml za pomocą soli fizjologicznej z buforem fosforanowym Dulbecco (DPBS) (Mediatech Inc.; Manassas, VA).
  6. Przefiltrować roztwór przez membranę nitrocelulozową o porach 0,45 μm za pomocą aparatu do filtracji próżniowej. Bufor konwersyjny można przechowywać w temperaturze 4 °C nie dłużej niż przez miesiąc.

4. Amplifikacja szczepów prionów z wykorzystaniem PMCA

  1. Rozcieńczyć zarodniki PMCA w podłożu PMCA w stosunku 1:20 (tj. zmieszać 5 μl zarodników PMCA i 95 μl podłoża PMCA) w probówce PCR. Pobrać i przechowywać alikwot 15 μl w temperaturze -80 °C jako kontrolę niepoddaną sonikacji; kontrola ta zostanie wykorzystana do ilościowego określenia amplifikacji PrPSc poprzez trawienie proteinazą K (PK), a następnie analizę Western blot (WB). Dodatkową kontrolę niepoddaną sonikacji można uzyskać, umieszczając drugi alikwot 15 μl w temperaturze 37 °C przez cały czas trwania reakcji PMCA. W celach statystycznych wymagane jest minimum trzech powtórzeń.
  2. Pozostałą część próbki (70 μl) poddać jednej rundzie PMCA, zgodnie z Rysunkiem 1, Panel A. Wstrząsać probówki co 5 h, aby uniknąć kondensacji wody na wypukłej zakrętce probówki PCR.
  3. Probówki z próbkami należy odwirować i delikatnie wymieszać w wibratorze (vortex), dbając o to, aby roztwór nie dostał się do wypukłej zakrętki, przed otwarciem po każdej procedurze, aby zapewnić homogeniczność i uniknąć potencjalnej kontaminacji.
  4. W przypadku seryjnego PMCA (sPMCA) dla szczepów o krótkim okresie inkubacji (tj. HY TME, HaCWD lub 263K), rozcieńczyć materiał poddany sonikacji w stosunku 1:20, przenosząc 5 μl zsonikowanej próbki z pierwszej rundy do 95 μl świeżego, niezarażonego homogenatu mózgowego (Rysunek 2, Panel B).
  5. W przypadku sPMCA dla szczepów o długim okresie inkubacji (tj. DY TME, 139H, 22CH, 22AH lub ME7H), rozcieńczyć materiał poddany sonikacji w stosunku 1:1, przenosząc 50 μl zsonikowanej próbki z pierwszej rundy do 50 μl świeżego, niezarażonego homogenatu mózgowego (Rysunek 2, Panel B).
  6. Pobrać dwa alikwoty po 15 μl z wcześniej rozcieńczonej zsonikowanej mieszaniny (z kroków 4.4 lub 4.5) i przechowywać jeden z nich w temperaturze -80 °C, a drugi w 37 °C (roztwory kontrolne niepoddane sonikacji dla drugiej rundy PMCA). Pozostałą część poddać drugiej rundzie PMCA.
  7. Procedurę tę można powtarzać w nieskończoność. W naszym laboratorium przeprowadziliśmy do piętnastu rund PMCA, przy czym właściwości szczepu pozostały niezmienione.
  8. Próbki poddać trawieniu PK. Dla typowego WB zmieszać 5 μl PK w stężeniu 80 μg/ml z 5 μl próbki (roztwór ten będzie miał końcowe stężenie PK 40 μg/ml) i inkubować w 37 °C przez jedną godzinę. Dodać 10 μl buforu do ładowania żelu. Gotować ten roztwór przez 10 min. Pozostawić roztwór do ostygnięcia i nałożyć 10 μl na żel.
  9. Aby obliczyć skuteczność amplifikacji, przeprowadzić analizę WB próbek poddanych trawieniu PK w celu oszacowania ilości amplifikowanego PrPSc, porównując je albo z kontrolami niepoddanymi sonikacji20,21 (Rysunek 2, Panel C), albo ze znanymi ilościami rekombinowanego PrP niepoddanego trawieniu PK.

5. Unikanie kontaminacji krzyżowej

Należy podjąć krytyczne środki w celu zminimalizowania kontaminacji krzyżowej oraz występowania wyników fałszywie dodatnich wynikających z tworzenia się produktów odpornych na proteazy de novo.

  1. Do pobierania próbek dla każdego szczepu prionów należy używać oddzielnego zestawu narzędzi do sekcji (np. pęset, szczypiec, nożyczek).
  2. Przed homogenizacją niezinfekowanych mózgów, które będą służyć jako podłoże PMCA, należy przetrzeć pipety 1% roztworem wybielacza. Statyw do probówek PCR sonikatora, homogenizatory tkanek oraz statywy do przechowywania probówek PCR należy moczyć w 1% roztworze wybielacza przez 10 min, a następnie dokładnie wypłukać wodą destylowaną.
  3. Obszar roboczy należy wyłożyć nową matą chłonną Versi-Dry Lab Soaker za każdym razem, gdy homogenizowana jest nowa próbka, przygotowywany jest nowy eksperyment PMCA lub podczas rozdzielania alikwotów pomiędzy rundami sPMCA.
  4. Należy zmieniać rękawiczki na nowe przy każdym kontakcie z nowymi próbkami (zwłaszcza podczas przenoszenia alikwotów pomiędzy rundami sPMCA).
  5. W każdym cyklu PMCA należy stosować krótkie serie sonikacji. Cykle składające się z 5 s sonikacji połączonej z 10 min inkubacji są wystarczające do amplifikacji prionów bez generowania PrPSc de novo 1,20,21,23,24. Jak wykazano w innych laboratoriach, wydłużenie czasu sonikacji, zwiększenie amplitudy sonikacji oraz zwiększenie liczby cykli PMCA zwiększa prawdopodobieństwo powstania PrPSc de novo2.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Cykliczna amplifikacja błędnie sfałdowanych białek (PMCA) jest stosowana do amplifikacji PrPSc in vitro7, 12, 14, 19, 24. Pomyślną amplifikację PrPSc wykazuje wzrost intensywności prążka na analizach Western blot dla białka prionowego odpornego na PK (migrującego w zakresie od 19 do 30 kDa dla szczepów prionowych pochodzących od chomika), co przedstawiono na Rysunku 3. Wzrost intensywności tego prążka po PMCA wskazuje na amplifikację materiału PrPSc od...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Wyzwania związane z amplifikacją zakaźnych białek prionowych to długie okresy inkubacji oraz koszty eksperymentów in vivo. Technika PMCA jest kosztowo efektywnym sposobem amplifikacji zakaźnych prionu. Kilka laboratoriów potwierdziło zdolność PMCA do dokładnej amplifikacji szczepów prionów in vitro 7, 9, 12, 14, 19,24.

Choroby prionowe mogą być przenoszone między gatunkami. Bessen i Marsh skutecznie zaszczepili chomiki zapaleniem mózgu norków, co doprowadziło do po...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie zgłoszono konfliktów interesów.

Podziękowania

Pragniemy podziękować dr Vesper Fe Marie Ramos za krytyczną lekturę rękopisu. Praca ta była wspierana przez National Center for Research Resources (P20 RR0115635-6, C06 RR17417-01 oraz G20RR024001) oraz National Institute for Neurological Disorders and Stroke (2R01 NS052609).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Misonix 3000MisonixS-3000
Misonix 4000MisonixS-4000
Rozdrabniacz tkanek Tenbr–ckKontes885000-0007
Kąpiel wodna Neslab EX-7Thermo ElectronNeslab EX-7
Strefy probówek PCR 0,2 mlThermo ScientificAB-0451
Triton X-100Sigma AldrichT9284-100ML
Kompletny inhibitor proteazRoche11 697 498 001
EDTAJ.T. Baker4040-00
DPBSMallinckrodt Baker Mediatech21-031-CV
Ręczniki laboratoryjne Versi-DryFisher Scientific14 206 28
Grzałka Repti ThermZoo Med Laboratories, Inc.RH-4

Bibliografia

  1. Ayers, J. I., Schutt, C. R., Shikiya, R. A., Aguzzi, A., Kincaid, A. E., Bartz, J. C. The strain-encoded relationship between PrP replication, stability and processing in neurons is predictive of the incubation period of disease. PLoS pathogens. 7, e1001317(2011).
  2. Barria, M. A., Mukherjee, A., Gonzalez-Romero, D., Morales, R., Soto, C. De novo generation of infectious prions in vitro produces a new disease phenotype. PLoS Pathog. 5, e1000421(2009).
  3. Bessen, R. A., Marsh, R. F. Biochemical and physical properties of the prion protein from two strains of the transmissible mink encephalopathy agent. J. Virol. 66, 2096-2101 (1992).
  4. Bessen, R. A., Marsh, R. F. Distinct PrP properties suggest the molecular basis of strain variation in transmissible mink encephalopathy. J. Virol. 68, 7859-7868 (1994).
  5. Bessen, R. A., Marsh, R. F. Identification of two biologically distinct strains of transmissible mink encephalopathy in hamsters. J. Gen. Virol. 73, 329-334 (1992).
  6. Castilla, J., Gonzalez-Romero, D., Saa, P., Morales, R., De Castro, J., Soto, C. Crossing the species barrier by PrP(Sc) replication in vitro generates unique infectious prions. Cell. 134, 757-768 (2008).
  7. Castilla, J., Morales, R., Saa, P., Barria, M., Gambetti, P., Soto, C. Cell-free propagation of prion strains. EMBO J. 27, 2557-2566 (2008).
  8. Caughey, B., Raymond, G. J. The scrapie-associated form of PrP is made from a cell surface precursor that is both protease- and phospholipase-sensitive. J. Biol. Chem. 266, 18217-18223 (1991).
  9. Deleault, N. R., Harris, B. T., Rees, J. R., Supattapone, S. Formation of native prions from minimal components in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 9741-9746 (2007).
  10. Dickinson, A. G., Fraser, H., Meikle, V. M., Outram, G. W. Competition between different scrapie agents in mice. Nat. New Biol. 237, 244-245 (1972).
  11. Gonzalez-Romero, D., Barria, M. A., Leon, P., Morales, R., Soto, C. Detection of infectious prions in urine. FEBS Lett. 582, 3161-3166 (2008).
  12. Green, K. M., Castilla, J., Seward, T. S., Napier, D. L., Jewell, J. E., Soto, C., Telling, G. C. Accelerated high fidelity prion amplification within and across prion species barriers. PLoS Pathog. 4, e1000139(2008).
  13. Hadlow, W. J., Race, R. E., Kennedy, R. C. Temporal distribution of transmissible mink encephalopathy virus in mink inoculated subcutaneously. J. Virol. 61, 3235-3240 (1987).
  14. Kocisko, D. A., Come, J. H., Priola, S. A., Chesebro, B., Raymond, G. J., Lansbury, P. T., Caughey, B. Cell-free formation of protease-resistant prion protein. Nature. 370, 471-474 (1994).
  15. Kurt, T. D., Telling, G. C., Zabel, M. D., Hoover, E. A. Trans-species amplification of PrP(CWD) and correlation with rigid loop 170N. Virology. 387, 3235-3240 (2009).
  16. Maddison, B. C., Baker, C. A., Terry, L. A., Bellworthy, S. J., Thorne, L., Rees, H. C., Gough, K. C. Environmental sources of scrapie prions. J. Virol. 84, 11560-11562 (2010).
  17. Nichols, T. A., Pulford, B., Wyckoff, A. C., Meyerett, C., Michel, B., Gertig, K., Hoover, E. A., Jewell, J. E., Telling, G. C., Zabel, M. D. Detection of protease-resistant cervid prion protein in water from a CWD-endemic area. Prion. 3, 171-183 (2009).
  18. Prusiner, S. B. Novel proteinaceous infectious particles cause scrapie. Science. 216, 136-144 (1982).
  19. Saborio, G. P., Permanne, B., Soto, C. Sensitive detection of pathological prion protein by cyclic amplification of protein misfolding. Nature. 411, 810-813 (2001).
  20. Saunders, S. E., Bartz, J. C., Vercauteren, K. C., Bartelt-Hunt, S. L. An enzymatic treatment of soil-bound prions effectively inhibits replication. Appl. Environ. Microbiol. 77, 4313-4317 (2011).
  21. Saunders, S. E., Shikiya, R. A., Langenfeld, K., Bartelt-Hunt, S. L., Bartz, J. C. Replication efficiency of soil-bound prions varies with soil type. Journal of virology. , (2011).
  22. Schutt, C. R., Bartz, J. C. Prion interference with multiple prion isolates. Prion. 2, 61-63 (2008).
  23. Shikiya, R. A., Ayers, J. I., Schutt, C. R., Kincaid, A. E., Bartz, J. C. Co-infecting prion strains compete for a limiting cellular resource. Journal of. 84, 5706-5714 (2010).
  24. Shikiya, R. A., Bartz, J. C. In vitro generation of high titer prions. Journal of virology. , (2011).
  25. Weber, P., Giese, A., Piening, N., Mitteregger, G., Thomzig, A., Beekes, M., Kretzschmar, H. A. Generation of genuine prion infectivity by serial PMCA. Veterinary microbiology. 123, 346-357 (2007).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Konwersja białka prionowegoamplifikacja szczepu prionowegoprotokół PMCAcykle inkubacji i sonikacjitrawienie proteinazą Kanaliza Western blotrozcieńczanie zarodników prionowychprzygotowanie substratuzapobieganie kontaminacji
Cykliczna amplifikacja błędnego fałdowania białek prionów
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.