Opisano metodę transferu genów do embrionów kurcz uklutych na późniejszych etapach inkubacji (starszych niż stadium Hamburgera i Hamiltona (HH) 22). Metoda ta eliminuje wady elektroporacji in ovo stosowanej u starszych embrionów kurczych i stanowi przydatną technikę badania funkcji i regulacji genów na późniejszych etapach rozwoju.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Transfer genów do starszych zarodków kur w metodzie elektroporacji ex ovo
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Zarodek kury stanowi doskonały model badawczy do studiowania funkcji i regulacji genów podczas rozwoju embrionalnego. Elektroporacja in ovo jest skuteczną metodą nadekspresji genów egzogennych lub wyciszania genów endogennych in vivo w zarodkach kur1. Poprzez elektroporację do zarodków kur można łatwo wprowadzić różne struktury, takie jak plazmidy DNA kodujące geny2-4, plazmidy z krótkimi interferującymi RNA (siRNA)5, syntetyczne krótkie oligonukleotydy RNA6 oraz antysensowne oligonukleotydy morfolinowe7. Jednak zastosowanie elektroporacji in ovo jest ograniczone do zarodków we wczesnych etapach inkubacji (młodszych niż stadium HH20 według klasyfikacji Hamburga i Hamiltona)8, a jej stosowanie w zarodkach w późniejszych etapach (starszych niż stadium HH22 – około 3,5 dnia rozwoju) wiąże się z pewnymi niedogodnościami. Na przykład w późniejszych etapach błona witelinowa jest zazwyczaj przyklejona do błony skorupki, a wycięcie okna w skorupce powoduje przerwanie naczyń, co prowadzi do śmierci zarodków; starsze zarodki są pokryte naczyniami witelinowymi i alantoicznymi, co utrudnia dostęp do nich i ich manipulację; Ponadto starsze zarodki wykazują silne ruchy, co utrudnia kontrolę ich orientacji przez stosunkowo małe okno w skorupce.
W niniejszym protokole prezentujemy metodę elektroporacji ex ovo służącą do transferu genów do zarodków kury na późnych etapach rozwoju (starszych niż stadium HH22). W przypadku elektroporacji ex ovo zarodki hodowane są w szalkach Petriego9, a naczynia witelinowe i alantois są szeroko rozpostarte. W takich warunkach starsze zarodki kury są łatwo dostępne i można nimi swobodnie manipulować. Dzięki temu metoda ta eliminuje wady elektroporacji in ovo stosowanej u starszych zarodków kury. Wykorzystując tę metodę, plazmidy mogą być łatwo transfekowane do różnych części starszych zarodków kury10-12.
Protokół
1. Hodowla Ex ovo
- Świeżo zapłodnione jaja układa się na dłuższym boku w inkubatorze z wymuszonym obiegiem powietrza (BSS160, Ehret, Niemcy) w temperaturze 37.5 °C i wilgotności 60% w celu inkubacji. Nie należy używać jaj przechowywanych w temperaturze 12 °C dłużej niż przez jeden tydzień.
- Po 2,5 dniach inkubacji (około stadium HH17) należy wyjąć jaja i oznaczyć ołówkiem ich górną część, aby wskazać kierunek rozbijania.
- Przed rozbijaniem do czystej, dużej szalki Petriego (średnica 145 mm; Greiner Bio-One GmbH, Niemcy) należy wlać około 20 ml sterylnej wody destylowanej.
- Do dużej szalki Petriego należy wstawić drugą, małą sterylną szalkę Petriego (średnica 94 mm; Greiner Bio-One GmbH).
- Jaja należy rozbić od dołu o ostrą metalową krawędź, ostrożnie otworzyć i przenieść całą zawartość każdego jaja do małej szalki Petriego.
- Dużą szalkę Petriego należy przykryć pokrywką i umieścić w innym inkubatorze (BINDER GmbH, Tuttlinge, Niemcy) w celu dalszej hodowli w temperaturze 37.5 °C i wilgotności około 60%. Po inkubacji przez odpowiednią liczbę dni embriony można wykorzystać do elektroporacji.
2. Przygotowanie do elektroporacji ex ovo
- Wytwarzaj kapilary szklane za pomocą wyciągacza mikroelektrod (PUL-100 Micropipette Puller; World Precision Instruments, Berlin, Germany), używając rurek szklanych o średnicy 1,0 mm (TW100F-4; World Precision Instruments), a następnie odłam końcówkę kapilar szklanych do uzyskania odpowiedniej średnicy.
- Ustaw odpowiednie parametry (np. różne napięcia dla konkretnych tkanek i rozmiarów embrionów) dla elektroporacji i podłącz elektrody do elektroporatora (CUY21-Edit; Nepa Gene, Chiba, Japan) zgodnie z docelowymi tkankami i rozmiarem embrionów.
- Przygotuj roztwór plazmidowy zawierający plazmidy w wektorze pCAGGS kodujące gen docelowy, np. kadherynę 7 (Cad7; pCAGGS-Cad7 w stężeniu 2,0 μg/μl) oraz gen markerowy, np. zielone białko fluorescencyjne (GFP; pCAGGS-GFP w stężeniu 0,25 μg/μl). Następnie dodaj Fast Green do stężenia końcowego 0,1% (Sigma), aby zabarwić roztwór plazmidowy na zielono.
- Napełnij kapilarę szklaną roztworem plazmidowym za pomocą pipety ustnej.
3. Transfer genów do wzgórza optycznego kurczaka poprzez elektroporację ex ovo
- Po hodowli ex ovo, np. w 6. dniu inkubacji (E6), zarodki kurcząt są wykorzystywane do elektroporacji ex ovo.
- Za pomocą precyzyjnej pęsety ostrożnie przerwij błonę żółtkową i owodniową nad wzgórzem optycznym, a następnie nanieś 3 krople sterylnego 0,9% roztworu chlorku sodu na powierzchnię wzgórza.
- Wstrzyknij roztwór plazmidu do jam wzgórza za pomocą szklanej kapilary i pipety ustnej.
- Umieść elektrody z katodą w postaci igły wolframowej i anodą w postaci prostokątnej płytki (CUY 661-3x7, Nepa Gene) obok wzgórza, a następnie natychmiast przyłóż do wzgórza impulsy elektryczne (sześć impulsów, 25 V, czas trwania impulsu 60 ms, odstępy 100 ms w każdym przypadku) generowane przez elektroporator.
- Przykryj dużą szalkę Petriego pokrywką i umieść ją z powrotem w inkubatorze. Po odpowiedniej liczbie dni inkubacji (np. 2 lub 3 dni po elektroporacji), wzgórza są pobierane i utrwalane do barwienia immunohistochemicznego (Rysunek 1) oraz analizy biologicznej.
4. Reprezentatywne wyniki
Przykład pomyślnej nadekspresji egzogennych białek Cad7 i GFP za pomocą elektroporacji ex ovo przedstawiono na Rysunku 1. Po elektroporacji plazmidu Cad7 wraz z plazmidem GFP do dachu (tectum) w E6, embriony zebrano i utrwalono dwa lub trzy dni później. W E8 białko GFP wykazuje silną ekspresję w dachu na obrazach całego preparatu (Rysunek 1A-C). Ponadto w przekrojach dachu w E9 białko GFP (kolor zielony na Rysunku 1D) oraz białko Cad7 (kolor czerwony na Rysunku 1E) są koekspresowane (kolor żółty na Rysunku 1F), co sugeruje, że elektroporacja ex ovo jest skuteczną metodą transferu genów do starszych embrionów kurczęt in vivo.
Rycina 1. Po kotransfekcji plazmidów kodujących GFP i Cad7 do wzgórza optycznego kurczaka w E6, dwa lub trzy dni po elektroporacji ex ovo, białko GFP (zielone) ulega silnej ekspresji, co pokazano na obrazach preparatów całych (A-C) w E8. W przekrojach wzgórza optycznego w E9 białko GFP (zielone w D) i białko Cad7 (czerwone w E) są koeksprymowane (żółte w F). BF, obraz w polu jasnym. Pasek skali: 200 μm w A dla A-C; 100 μm w D dla D-F.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Niniejszy protokół stanowi przewodnik po transferze genów do starszych zarodków kurzych (np. do wzgórza optycznego w E6) za pomocą elektroporacji ex ovo. Metoda ta rozszerza zastosowanie elektroporacji na starsze zarodki kurze i może być łatwo wdrożona w wielu laboratoriach w celu badania funkcji genów in vivo w późniejszych etapach. Metodą tą można z sukcesem elektroporować zarodki od E4 do co najmniej E7, a elektroporowane zarodki mogą przeżyć do E1511. Poza mózgiem, metoda ta może być równ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Niniejsza praca została sfinansowana z grantu niemieckiej Fundacji Badawczej (DFG; LU1455/1-1).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Elektroporator | Nepa Gene, Japonia | CUY21-Edit | |
| Elektrody | Nepa Gene, Japonia | CUY661-3x7 | |
| Inkubator do jaj | Ehret, Niemcy | BSS160 | |
| Inkubator do embrionów | BINDER GmbH, Niemcy | ||
| Mikroskop fluorescencyjny | Keyence, Deutschland GmbH | BZ-8000 | |
| Szalka Petriego | Greiner Bio-One GmbH, Niemcy | ||
| Wytwornica mikro–elektrod | World Precision Instruments, Niemcy | PUL-100 |
Bibliografia
- Momose, T., Tonegawa, A., Takeuchi, J., Ogawa, H., Umesono, K., Yasuda, K. Efficient targeting of gene expression in chick embryos by microelectroporation. Dev. Growth Differ. 41, 335-344 (1999).
- Luo, J., Ju, M. J., Lin, J., Yan, X., Markus, A., Mix, E., Rolfs, A., Redies, C. Cadherin-20 expression by motor neurons is regulated by Sonic hedgehog during spinal cord development. NeuroReport. 20, 365-370 (2009).
- Luo, J., Ju, M. J., Redies, C. Regionalized cadherin-7 expression by radial glia is regulated by Shh and Pax7 during chicken spinal cord development. Neuroscience. 142, 1133-1143 (2006).
- Nakamura, H., Katahira, T., Sato, T., Watanabe, Y., Funahashi, J. Gain- and loss-of-function in chick embryos by electroporation. Mech. Dev. 121, 1137-1143 (2004).
- Dai, F., Yusuf, F., Farjah, G. H., Brand-Saberi, B. RNAi-induced targeted silencing of developmental control genes during chicken embryogenesis. Dev. Biol. 258, 80-90 (2005).
- Rao, M., Baraban, J. H., Rajaii, F., Sockanathan, S. In vivo comparative study of RNAi methodologies by in ovo electroporation in the chick embryo. Dev. Dyn. 231, 592-600 (2004).
- Kos, R., Tucker, R. P., Hall, R., Duong, T. D., Erickson, C. A. Methods for introducing morpholinos into the chicken embryo. Dev. Dyn. 226, 470-477 (2003).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. J. Morphol. 88, 49-92 (1951).
- Auerbach, R., Kubai, L., Knighton, D., Folkman, J. A simple procedure for the long-term cultivation of chicken embryos. Dev. Biol. 10, 391-394 (1974).
- Luo, J., Treubert-Zimmermann, U., Redies, C. Cadherins guide migrating Purkinje cells to specific parasagittal domains during cerebellar development. Mol. Cell. Neurosci. 25, 138-152 (2004).
- Luo, J., Redies, C. Ex ovo electroporation for gene transfer into older chicken embryos. Dev. Dyn. 233, 1470-1477 (2005).
- Treubert-Zimmermann, U., Heyers, D., Redies, C. Targeting axons to specific fiber tracts in vivo by altering cadherin expression. J. Neurosci. 22, 7617-7626 (2002).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
