Artykuł metodologiczny

Protokół identyfikacji oddziaływań białko-białko w oparciu o znakowanie metaboliczne 15N, immunoprecypitację, ilościową spektrometrię mas oraz modulację powinowactwa

22.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/4083

⸱

24 września 2012

 ,  ,  ,  ,  , 
1Max Planck Institute of Molecular Plant Physiology, 2University of Kaiserslautern

W tym artykule

Podsumowanie

Przedstawiamy wariant metody QUICK (QUantitative Immunoprecipitation Combined with Knockdown), wprowadzonej wcześniej w celu odróżnienia rzeczywistych od fałszywych oddziaływań białko-białko. Nasze podejście opiera się na znakowaniu metabolicznym 15N , modulowaniu powinowactwa oddziaływań białko-białko poprzez obecność lub brak ATP, immunoprecypitacji oraz ilościowej spektrometrii mas.

Streszczenie

Oddziaływania białko-białko są fundamentalne dla wielu procesów biologicznych w komórce. Dlatego ich charakterystyka odgrywa istotną rolę w obecnych badaniach, a dostępny jest szereg metod służących do ich analizy1. Oddziaływania białko-białko są często wysoce dynamiczne i mogą zależeć od lokalizacji subkomórkowej, modyfikacji potranslacyjnych oraz lokalnego środowiska białkowego2. W związku z tym powinny być one badane w ich naturalnym środowisku, do czego metodą z wyboru są podejścia oparte na koimmunoprecypitacji3. Współwytrącone partnerzy interakcji są identyfikowani albo za pomocą immunoblottingu w podejściu celowanym, albo za pomocą spektrometrii mas (LC-MS/MS) w sposób niecelowany. Ta druga strategia jest często negatywnie wpływana przez dużą liczbę wyników fałszywie dodatnich, wynikających głównie z wysokiej czułości nowoczesnych spektrometrów mas, które z pewnością wykrywają śladowe ilości niespecyficznie wytrąconych białek. Niedawne podejście mające na celu rozwiązanie tego problemu opiera się na idei, że zmniejszone ilości specyficznych partnerów interakcji będą współwytrącać się z danym białkiem docelowym, którego stężenie komórkowe zostało zredukowane przez RNAi, podczas gdy ilości niespecyficznie wytrąconych białek powinny pozostać niezmienione. Metoda ta, nazwana QUICK od QUantitative Immunoprecipitation Combined with Knockdown4, wykorzystuje znakowanie stabilnymi izotopami aminokwasów w hodowlach komórkowych (SILAC)5 oraz MS do ilościowego określenia zawartości białek immunoprecypitowanych z szczepów typu dzikiego oraz szczepów z knockdownem. Białka występujące w stosunku 1:1 mogą być uznane za zanieczyszczenia, natomiast białka wzbogacone w osadach z typu dzikiego za specyficznych partnerów interakcji białka docelowego. Mimo innowacyjności, QUICK posiada pewne ograniczenia: po pierwsze, SILAC jest kosztowny i ograniczony do organizmów, które idealnie są auksotroficzne w stosunku do argininy i/lub lizyny. Ponadto, podczas podawania ciężkiej argininy, interkonwersja argininy do proliny skutkuje dodatkowymi przesunięciami masy dla każdej proliny w peptydzie i nieznacznie rozcieńcza ciężką argininę lekką, co sprawia, że kwantyfikacja jest bardziej żmudna i mniej dokładna5,6. Po drugie, QUICK wymaga miareczkowania przeciwciał w taki sposób, aby nie uległy one nasyceniu białkiem docelowym w ekstraktach z mutantów z knockdownem.

W niniejszej pracy przedstawiamy zmodyfikowany protokół QUICK, który eliminuje wspomniane ograniczenia metody QUICK poprzez zastąpienie SILAC metabolicznym znakowaniem 15N oraz zastąpienie wyciszania genu za pomocą RNAi modulacją powinowactwa oddziaływań białko-białko. Wykazujemy przydatność tego protokołu, wykorzystując jednokomórkową zieloną algę Chlamydomonas reinhardtii jako organizm modelowy oraz chaperon HSP70B z chloroplastów jako białko docelowe7 (Rysunek 1). Znane jest, że białka HSP70 oddziałują ze swoimi specyficznymi k chaperone'ami i substratami wyłącznie w stanie ADP8. Wykorzystujemy tę właściwość w celu weryfikacji specyficznego oddziaływania HSP70B z jego czynnikiem wymiany nukleotydów CGE19.

Protokół

1. Adsorpcja przeciwciał

  1. Odważyć 120 mg Protein A Sepharose do 15-ml probówki stożkowej (Falcon). Ponieważ do każdej immunoprecypitacji (IP) wymagane jest 15 mg Protein A sepharose, ilość ta jest wystarczająca na 8 IP. Dodać 5 ml 0.1 M buforu fosforanowego (pH 7.4) i pozostawić Protein A Sepharose do napęcznienia na 30 min w temperaturze 4 °C.

(Należy pamiętać, że wszystkie kolejne kroki muszą być wykonywane w rękawiczkach, aby uniknąć kontaminacji keratyną, oraz na lodzie, aby zapobiec degradacji białek lub dysocjacji kompleksów.)

  1. Wirować przez 60 s przy 1,000 x g i 4 °C, aby osadzić napęczniałą Protein A Sepharose. Ostrożnie usunąć nadsącz i resuspendować kulki w 5 ml 0,1 M buforu fosforanowego (pH 7,4). Powtórzyć ten krok trzy razy, aby dokładnie wypłukać kulki.
  2. Po ostatnim etapie wirowania usunąć nadsącz, pozostawiając około 0,5 ml buforu fosforanowego. Dodać 0,9 ml 0,5 M buforu fosforanowego (pH 7,4), 400 μl oczyszczonych powinowactwem przeciwciał pierwszorzędowych (50 μl na jedno IP) przeciwko białku docelowemu (w tym przypadku HSP70B) oraz 16 μl przeciwciał przeciwko białku kontrolnemu (w tym przypadku CF1β). Uzupełnić ddH2O do całkowitej objętości 5 ml.

(Należy pamiętać, że w celu ograniczenia zanieczyszczeń niespecyficznymi IgG, które zakłócają analizę nano-LC-MS, należy stosować przeciwciała oczyszczone powinowactwem – protokół opisano w pracy Willmund et al. (2005)10. CF1β jest wytrącane jako kontrola ładunku i został wybrany ze względu na wysoką zawartość oraz obecność w frakcjach rozpuszczalnych i błonowych po lizie komórek. Alternatywnie, do normalizacji nierównego ładunku można wykorzystać poziomy białek zanieczyszczających.)

  1. Pozostaw kulki Protein A Sepharose do adsorpcji IgGs podczas 1-godzinnej inkubacji w 25 °C na rotatorze do probówek (CAT RM5W, 36 rpm).
  2. Wiruj przez 60 s przy 1,000 x g i 4 °C, abyt osadzić kulki Protein A Sepharose. Ostrożnie usuń supernatant i resuspenduj kulki w 5 ml 0,1 M buforu boranu sodu (pH 9,0). Powtórz ten krok trzy razy, aby dokładnie usunąć aminy, które mogłyby znosić działanie czynnika sieciującego.
  3. Odważ 25,9 mg świeżego, stałego dimetylopimelimidatu i resuspenduj go w 5 ml 0,1 M buforu boranu sodu (pH 9,0), aby uzyskać końcowe stężenie 20 mM. Dodaj ten roztwór do kulek Protein A Sepharose.
  4. Pozostaw IgGs do sieciowania z Protein A przez 30 min w 25 °C na rotatorze do probówek.
  5. Wiruj przez 60 s przy 1,000 x g i 4 °C, aby osadzić kulki. Ostrożnie usuń supernatant i resuspenduj kulki w 5 ml 1 M Tris-HCl (pH 7,5), aby zneutralizować wolny czynnik sieciujący. Powtórz ten krok raz i inkubuj przez 2 h w 25 °C lub 12-24 h w 4 °C na rotatorze do probówek.
  6. Opcjonalnie: jeśli kulki Protein A Sepharose sprzężone z IgGs nie są wykorzystywane bezpośrednio do IP, możliwe jest ich przechowywanie do jednego tygodnia. W tym celu wiruj przez 60 s przy 1,000 x g i 4 °C, aby osadzić kulki, ostrożnie usuń supernatant i resuspenduj kulki w 5 ml 0,1 M buforu fosforanowego (pH 7,5) zawierającego 0,02% azotku sodu i przechowuj w 4 °C do dalszego użycia.

2. Lizaza komórek, sieciowanie i przygotowanie próbek

  1. Wyhodować dwie kultury Chlamydomonas w medium zawierającym 7,5 mM 14NH4Cl lub 15NH4Cl jako źródło azotu do gęstości ~5 x 106 komórek/ml. Komórki muszą przejść przez co najmniej dziesięć generacji dla pełnego znakowania. W tym przypadku komórki hodowano fotomiksotroficznie w medium TAP11 na wytrząsarce rotacyjnej w temperaturze 25 °C przy ciągłym naświetlaniu światłem białym (30 μE m-2 s-1).
  2. Przenieść po dwie alikwoty komórek znakowanych 14N i 15N do czterech probówek GSA i zebrać komórki poprzez 4-minutowe wirowanie przy 4 000 x g i 4 °C (Liczba komórek zebranych dla każdej alikwoty zależy od stężenia komórkowego białka docelowego i musi zostać wyznaczona empirycznie z wyprzedzeniem, aby zapewnić wytrącenie odpowiedniej ilości białka docelowego. Dobrym punktem wyjścia jest 109 komórek na alikwotę, t.j. 200 ml kultury o gęstości 5 x 106 komórek/ml.)
    Tylko dla sieciowania: w przypadku, gdy kompleksy białkowe będą sieciowane przed IP, komórki należy przemyć, aby usunąć aminy obecne w medium. W tym celu zawiesić komórki w 40 ml schłodzonego buforu KH (20 mM HEPES-KOH (pH 7,2), 80 mM KCl) i przenieść je do probówek Falcon 50 ml. Wirować przez 60 s przy 1 000 x g i 4 °C. Powtórzyć ten krok raz.
  3. Zawiesić komórki w 2 ml buforu lizującego (20 mM HEPES-KOH (pH 7,2), 1 mM MgCl2, 10 mM KCl, 154 mM NaCl) schłodzonego do 4 °C i przenieść je do probótek Falcon 15 ml. Zebrać pozostałe komórki z probótek GSA, dodając do każdej dodatkowy 1 ml buforu lizującego. Do każdej alikwoty dodać 50 μl 25 x inhibitora proteaz oraz 12,5 μl 1 M MgCl2 (do stężenia końcowego 3,5 mM).
  4. Do jednej z alikwot zawierających komórki znakowane 14N i 15N dodać 150 μl buforu lizującego, 12,5 μl 1 M ATP, 833 μl 270 mM fosforanu kreatyny oraz 7 μl 5 μg/μl fosfokinazy kreatynowej (stężenie końcowe to 2,5 mM ATP, 45 mM fosforanu kreatyny i 7 μg/ml fosfokinazy kreatynowej) (są to alikwoty +ATP).
  5. Do pozostałych alikwot zawierających komórki znakowane 14N i 15N dodać 930 μl buforu lizującego i 70 μl 1 U/μl apirazy (są to alikwoty -ATP).
  6. Inkubować przez 2 min w 25 °C na rotatorze do probówek, aby ustanowić stany wyczerpania ATP i nasycenia ATP. Jeśli krok sieciowania jest pominięty, dodać kolejny 1 ml buforu lizującego.
    Tylko dla sieciowania: w przypadku, gdy badane oddziaływania białko-białko są przejściowe, zaleca się ich uchwycenie poprzez krok sieciowania. W tym celu dodać 500 μl 20 mM dition-bis(succinimidyl propionate) (DSP) rozpuszczonego w DMSO (stężenie końcowe to 2 mM) do każdej probówki bezpośrednio przed sonikacją.
  7. Sonikować cztery razy po 20 s na lodzie w celu rozbicia komórek, z 20-sekundowymi przerwami pomiędzy cyklami dla schłodzenia. (Używamy urządzenia Bandelin Sonoplus HD2070 z końcówką KE76 przy kontroli wyjścia 75% i cyklu pracy 60%. Niezbędne ustawienia dla innych maszyn/urządzeń/końcówek muszą zostać określone z wyprzedzeniem, aby zapewnić całkowitą lizę komórek i uniknąć rozlania zawartości.)
    Tylko dla sieciowania: pozwolić kompleksom białkowym się zsieciować poprzez inkubację przez 1 h w 4 °C na rotatorze do probówek. Po sieciowaniu uzupełnić każdą probówkę o 500 μl 1 M glicyny i inkubować na rotatorze przez kolejne 15 min w 4 °C w celu zneutralizowania wolnego czynnika sieciującego.
  8. Przygotować cztery 6-ml poduszki sacharozowe (20 mM HEPES-KOH (pH 7,2), 0,6 M sacharozy) w cienkościennych probówkach SW41 Ti (Beckman Coulter nr kat: 344059), ostrożnie nanieść całe ~5,5 ml lizatów komórkowych na poduszki sacharozowe (uzupełnić objętość buforem lizującym) i wirować przez 30 min przy 200 000 x g i 4 °C w rotorze SW41 Ti.
  9. Przenieść górną część gradientu zawierającą rozpuszczalne kompleksy białkowe do czterech probótek Falcon 15 ml (unikając przeniesienia części poduszki sacharozowej), dodać do każdej z nich 350 μl 10% Triton X-100 do stężenia końcowego 0,5%, wymieszać ostrożnie i dodać bufor lizujący do całkowitej objętości 7 ml każda.
    (Przenieść 70 μl każdego rozpuszczalnego ekstraktu komórkowego do świeżych stożkowych probótek 1,5 ml (probótek Eppendorf) i dodać do każdej 70 μl 2 x buforu do próbek SDS (4% SDS, 125 mM Tris-HCl (pH 6,8), 20% glicerolu, 10% 2-merkaptoetanolu) do analiz SDS-PAGE i immunoblottingu.)
  10. Usunąć poduszki sacharozowe i zawiesić osady membranowe w 3 ml buforu lizującego każda. Do każdej dodać 1 ml 10% Triton X-100 do stężenia końcowego 2%, sonikować na lodzie do rozpuszczenia osadów i dodać bufor lizujący do całkowitej objętości 5 ml każda.
  11. Przygotować kolejne cztery 6-ml poduszki sacharozowe w cienkościennych probówkach SW41 Ti, ostrożnie nanieść ~5 ml zsolubilizowanych membran z kroku 2.10 na poduszki sacharozowe i wirować przez 30 min przy 200 000 x g i 4 °C w rotorze SW41 Ti.
  12. Przenieść górną część gradientu zawierającą kompleksy białek błonowych do czterech probótek Falcon 15 ml i dodać bufor lizujący (zawierający 2% Triton X-100) do objętości końcowej 7 ml każda. (Przenieść 70 μl każdego rozpuszczalnego ekstraktu komórkowego do świeżych probótek Eppendorf i dodać do każdej 70 μl 2 x buforu do próbek SDS do analiz SDS-PAGE i immunoblottingu.)

3. Immunoprecypitacja

  1. Odwiruj kulki Protein A Sepharose z unieruchomionymi przeciwciałami (z kroków 1.8 lub 1.9) przez 60 s przy 1,000 x g i 4 °C, ostrożnie usuń nadnadkład i resuspenduj kulki w 4 ml buforu do lizy (Lysis buffer). Powtórz ten krok dwukrotnie, aby zrównoważyć kulki w buforze do lizy.
  2. Uzupełnij objętość do 8 ml buforem do lizy i przenieś 1 ml zawiesiny do każdej z ośmiu probówek Falcon o pojemności 15 ml zawierających rozpuszczalne lub błonowe kompleksy białkowe z komórek z odpowiednią i ograniczoną zawartością ATP, znakowanych 14N i 15N (z kroków 2.9 i 2.12).
  3. Inkubuj przez 2 h przy 4 °C na rotatorze do probówek w celu wytrącenia kompleksów białkowych.
  4. Odwiruj kulki przez 60 s przy 1,000 x g i 4 °C i odlej nadnadkłady. Pozostaw niewielką objętość cieczy nad kulkami, aby ułatwić ich przenoszenie.
  5. Przenieś kulki z każdej probówki Falcon do stożkowych probówek o pojemności 1,5 ml (probówek Eppendorf). Aby zebrać wszystkie pozostałe kulki z probówek Falcon, dodaj do każdej kolejne 0,8 ml buforu do lizy zawierającego 0,1% Triton, delikatnie wymieszaj w wortexie, wiruj przez 60 s przy 1,000 x g i 4 °C, a następnie przenieś bufor z pozostałymi kulkami do probówek Eppendorf. Wymiana probówek jest konieczna, aby zapobiec zanieczyszczeniom białkami przylegającymi do plastikowych ścianek.
  6. Odwiruj kulki przez 15 s przy 16,100 x g i 4 °C, ostrożnie usuń nadnadkłady i resuspenduj kulki w 1,3 ml buforu do lizy zawierającego 0,1% Triton. Powtórz ten krok dwukrotnie z użyciem buforu do lizy z Tritonem oraz dwukrotnie z użyciem buforu do lizy bez Tritonu, aby dokładnie wypłukać kulki. Pozostaw niewielką objętość cieczy nad kulkami, aby ułatwić ich przenoszenie.
  7. Ponownie przenieś kulki do świeżych probówek Eppendorf o pojemności 1,5 ml, aby usunąć białka przylegające do plastikowych ścianek. Przepłucz stare probówki 1 ml buforu do lizy bez Tritonu i przenieś wszystkie pozostałe kulki do świeżych probówek.
  8. Wiruj przez 15 s przy 16,100 x g i 4 °C, usuń nadnadkłady najpierw zwykłą pipetą, a następnie całkowicie usuń pozostały nadnadkład za pomocą strzykawki Hamiltona o pojemności 50-μl.

4. Przygotowanie próbek do nano-LC-MS/MS

  1. Do każdej probówki dodać 100 μl świeżo przygotowanego buforu do elucji (8 M urea, 25 mM NH4HCO3), wykorzystując 100 μl buforu do elucji do wypłukania kulek przywierających do strzykawki Hamiltona, a następnie inkubować przez 10 min w termomikserze przy 800 rpm i 65 °C oraz przez kolejne 20 min w temperaturze 30 °C. (Znacznie bardziej kompletną elucję związanych białek uzyskuje się poprzez elucję 2% SDS i następne wytrącanie 80% acetonem.)
  2. Wirować przez 15 sek przy 16,100 x g i 25 °C. Przenieść nadsączniki do nowych probówek za pomocą strzykawki Hamiltona o pojemności 50 μl.
  3. Do kulek dodać 50 μl buforu do elucji, wykorzystując 50 μl buforu do elucji do wypłukania kulek przywierających do strzykawki Hamiltona, a następnie powtórzyć etapy inkubacji i wirowania opisane odpowiednio w punktach 4.1 i 4.2. Połączyć odpowiednie eluaty.
    (Przenieść 30 μl eluatów do nowych probówek Eppendorf, dodać do każdej 30 μl 2 x buforu do próbek SDS w celu przeprowadzenia analiz SDS-PAGE i immunoblottingu.)
  4. Połączyć wytrącone eluaty z białek rozpuszczalnych i błonowych, traktowanych +/- ATP oraz znakowanych 14N i 15N w następujący sposób:
    120 μl 15N/+ATP i 120 μl 14N/-ATP
    120 μl 14N/+ATP i 120 μl 15N/-ATP
    120 μl 15N/+ATP i 120 μl 14N/-ATP
    120 μl 14N/+ATP i 120 μl 15N/-ATP
  5. Do każdej z czterech kombinacji dodać 1,5 μl świeżo przygotowanego 1 M DTT do stężenia końcowego 6,5 mM w celu redukcji mostków dwusiarczkowych (w tym tych w łączniku sieciującym) i inkubować przez 30 min w 25 °C.
  6. Dodać 10,5 μl świeżo przygotowanego 0,6 M jodacetamidu do stężenia końcowego 25 mM w celu karboksymetylacji zredukowanych grup tiolowych i inkubować przez 20 min w 25 °C w ciemności.
  7. Dodać 256 μl 40 mM NH4HCO3 i 4 μl Lys-C (0,1 μg/μl), uszczelnić probówki parafilmem i inkubować przez co najmniej 16 h (przez noc) na rotatorze w 37 °C.
  8. Dodać 470 μl 20 mM NH4HCO3, 10 μl 100% acetonitrylu (do stężenia końcowego 1%) oraz 8 μl kulek z trypsyną i inkubować na rotatorze przez co najmniej 16 h w 37 °C.
  9. Wirować przez 5 min przy 16,100 x g i 4 °C, a następnie przenieść nadsączniki do nowych probówek Eppendorf o pojemności 2 ml. Wypłukać stare probówki 50 μl 20 mM NH4HCO3 i 0,5% kwasem octowym, a następnie połączyć z pierwszymi nadsącznikami.
  10. W celu odsolenia przygotować własne StageTipy C18, wycinając igłą strzykawki dwa dyski z materiału Empore C18 i umieszczając je w końcówce do pipety o pojemności 200 μl. W ten sposób przygotować cztery końcówki 200 μl. Wybić otwory w nakrętkach czterech probówek Eppendorf 2 ml i wstawić w nie końcówki.
  11. Przygotować StageTipy C18 za pomocą 50 μl Roztworu B (80% acetonitryl, 0,5% kwas octowy). Wirować przez 3 min przy 800 g i 25 °C.
  12. Urównoważyć StageTipy C18 za pomocą 100 μl Roztworu A (0,5% kwas octowy, 2% acetonitryl). Wirować przez 3 min przy 800 g i 25 °C. Powtórzyć ten krok raz.
  13. Nanieść 100 μl nadsączników z trawienia trypsyną (4.9) na StageTipy C18 i wirować przez 3 min przy 800 g i 25 °C. Powtarzać ten krok, aż wszystkie nadsączniki zostaną naniesione na kolumny.
  14. Wypłukać StageTipy C18 za pomocą 100 μl Roztworu A. Wirować przez 3 min przy 800 g i 25 °C. Powtórzyć ten krok dwukrotnie.
  15. Eluować peptydy trypsynowe do nowej probówki Eppendorf 1,5 ml za pomocą 50 μl Roztworu B. Wirować przez 3 min przy 800 g i 25 °C. Powtórzyć ten krok raz. Peptydy całkowicie osuszyć w wirówce próżniowej (speed vac).
  16. Opcjonalnie: uszczelnić probówki Eppendorf parafilmem i przechowywać w -80 °C do czasu dalszego użycia.
  17. Resuspendować osuszone peptydy w 20 μl Roztworu A i inkubować przez co najmniej 1 h na lodzie, przerywając proces dwoma 15-minutowymi inkubacjami w kąpieli sonikacyjnej. Wirować przez 20 min przy 16,100 x g i 4 °C, a następnie nanieść nadsącznik do analizy nano-LC-MS/MS.

5. Reprezentatywne wyniki

Jak pokazano na przykładzie ekstraktów komórkowych znakowanych 14N na Rysunku 2A, HSP70B i CGE1 lokalizują się niemal wyłącznie w frakcji rozpuszczalnej, niezależnie od stanu ATP. W przeciwieństwie do nich, CF1β lokalizuje się w frakcjach rozpuszczalnych i wzbogaconych w błony, ponieważ sonikacja odrywa część tego białka od zlokalizowanego w błonie CFo, w związku z czym służy ono jako kontrola załadunku dla obu frakcji. Jak pokazano na Rysunku 2B, podobne ilości HSP70B zostały wytrącone przeciwciałami anty-HSP70B z ekstraktów rozpuszczalnych znakowanych 14N i 15N, niezależnie od stanu ATP. Z kolei z frakcji błonowych wytrącono niewielką ilość HSP70B, przy czym nieco większe ilości pochodziły z frakcji błonowych pozbawionych ATP w porównaniu do frakcji nasyconych ATP, co potwierdza wcześniejsze wyniki9. CGE1 nie uległo współwytrąceniu z HSP70B w nasyconych ATP frakcjach rozpuszczalnych ani błonowych, podczas gdy znaczne ilości CGE1 zostały współwytrącone z HSP70B z pozbawionych ATP frakcji rozpuszczalnych, a niewielkie z pozbawionych ATP frakcji błonowych.

Oddziaływanie CGE1 z HSP70B wyłącznie w stanie ADP jest również widoczne w analizie MS: na Rysunku 3 przedstawiono reprezentatywne widma MS1 peptydów HSP70B i CGE1 z osadów uzyskanych przy użyciu antyserum przeciwko HSP70B z rozpuszczalnych ekstraktów komórkowych. W doświadczeniu przedstawionym na Rysunku 3A osady pochodziły z mieszanin ekstraktów znakowanych 14N pozbawionych ATP oraz ekstraktów znakowanych 15N zawierających ATP. Podczas gdy ciężka i lekka forma peptydów HSP70B zostały wykryte z równym natężeniem, stwierdzono obecność jedynie lekkiej formy peptydu CGE1 (z ekstraktów -ATP). Na Rysunku 3B przedstawiono te same peptydy z osadu anty-HSP70B pochodzącego z mieszanin wzajemnie znakowanych rozpuszczalnych ekstraktów komórkowych. Odpowiednio, tym razem wykryto jedynie ciężką formę peptydu CGE1 (z ekstraktów -ATP), podczas gdy w przypadku peptydów HSP70B ponownie stwierdzono obecność obu form, lekkiej i ciężkiej.

Schemat oczyszczania białek z etykietowaniem ATP, ADP, CoIP i procesem identyfikacji LC-MS/MS.
Rysunek 1. Schemat eksperymentalny. Komórki są znakowane metabolicznie 14N i 15N przez co najmniej 10 generacji, zbierane, a następnie dostarczane z ATP lub pozbawione ATP. Po lizie komórek kompleksy białkowe mogą być opcjonalnie sieciowane (X-link) za pomocą DSP. Zlizowane komórki są następnie rozdzielane na frakcję rozpuszczalną (Sol) i frakcję wzbogaconą w błony (Pel). Białka docelowe (tutaj HSP70B) oraz białko kontrolne (tutaj CF1β) są immunoprecypitowane za pomocą specyficznych przeciwciał sprzężonych z ziarnami sepharose z białkiem A (kolor czarny). Po przemyciu precipitates białek są eluowane i analizowane bezpośrednio metodą immunoblottingu lub odpowiednie frakcje znakowane 14N i 15N w stanach +ATP i -ATP są łączone, trawione i analizowane metodą nano-LC-MS/MS. W przedstawionym przykładzie frakcja znakowana 15N została pozbawiona ATP. W związku z tym stosunek intensywności peptydów znakowanych ciężko (ciemne kolory) do peptydów znakowanych lekko (jasne kolory) z białka kontrolnego (CF1β), białka docelowego (HSP70B) oraz niespecyficznie związanych zanieczyszczeń powinien wynosić około jeden, podczas gdy stosunek ten powinien być bardzo wysoki dla białek specyficznie oddziałujących z białkiem docelowym (CGE1). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy rysunek.

Analiza ekspresji białek, wyniki western blot, wpływ ATP na αHSP70B, αCGE1, αCF1β w próbkach.
Rysunek 2. A Analiza materiału wejściowego do immunoprecypitacji HSP70B. Całkowite białko wyekstrahowano z frakcji rozpuszczalnej (Sol) i wzbogaconej w membrany (Pel), które były albo pozbawione ATP (-ATP), albo suplementowane ATP i systemem regenerującym ATP (+ATP). 0,01% ekstraktów białkowych rozdzielono na 10% żelu SDS-poliakrylamidowym, a poziomy białek HSP70B i CGE1 w stosunku do kontroli ładowania CF1β przeanalizowano za pomocą immunoblottingu. B Analiza immunoprecypitatów. HSP70B poddano immunoprecypitacji z ekstraktów komórkowych rozpuszczalnych i wzbogaconych w membrany, znakowanych 14N i 15N, zawierających lub nie zawierających ATP. Białka odpowiadające 3,3% immunoprecypitatów rozdzielono na 10% żelu SDS-poliakrylamidowym, a poziomy HSP70B i CGE1 w stosunku do kontroli ładowania CF1β przeanalizowano za pomocą immunoblottingu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony rysunek.

Wykresy spektrometrii masowej oddziaływań białko-ligand, HSP70B i CGE1 z oznakowaniem izotopowym ATP.
Rycina 3. A Reprezentatywne widma masowe peptydów HSP70B i CGE1 z immunoprecypitatów anty-HSP70B przeprowadzonych na zmieszanych frakcjach rozpuszczalnych (14N -ATP/15N +ATP). Przedstawiono pełne widma MS peptydów oznakowanych 14N i 15N, odpowiadające odpowiednio stanom -ATP i +ATP, dla HSP70B oraz współimmunoprecypitowanego CGE1. Oba peptydy są trzykrotnie naładowane; peptyd HSP70B zawiera 22 atomy azotu, a peptyd CGE1 19, co odpowiada przesunięciu masy odpowiednio o 7,33 i 6,33 m/z. B Reprezentatywne widma masowe z eksperymentu odwrotnego (14N +ATP/15N -ATP). Przedstawiono pełne widma MS tych samych peptydów oznakowanych 14N i 15N, które w tym przypadku odpowiadają odpowiednio stanom +ATP i -ATP dla HSP70B oraz współimmunoprecypitowanego CGE1. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną rycinę.

Dyskusja

Niedawno wprowadziliśmy dwa ulepszenia metody QUICK: etap sieciowania w celu wychwytywania przejściowych oddziaływań białko-białko (QUICK-X) oraz wytrącanie kontrolne w celu normalizacji nierównych wydajności wytrącania6. Przedstawiamy tutaj protokół zawierający dwa kolejne ulepszenia QUICK: po pierwsze, zastępujemy metodę SILAC5 metabolicznym znakowaniem 15N. Zalety tego rozwiązania polegają na tym, że znakowanie metaboliczne 15N jest znacznie tańsze niż SILAC, jeśli 15N jest dostarczane w postaci prostej soli nieorganicznej. Co więcej, dzięki metabolicznemu znakowaniu 15N metodę QUICK można zastosować do organizmów prototroficznych w odniesieniu do wszystkich aminokwasów, takich jak większość roślin, grzybów i bakterii. Wreszcie, konwersja argininy do proliny, charakterystyczna dla SILAC5,6, nie stanowi problemu przy ilościowym oznaczaniu peptydów znakowanych 15N. Przykładami odpowiednich narzędzi do ilościowej oceny danych proteomicznych 15N są MSQUANT12 lub IOMIQS13.

Po drugie, wprowadzamy modulację powinowactwa jako sposób na specyficzne zmniejszenie ilości białek oddziałujących z danym białkiem docelowym w jednej próbce w porównaniu z inną. Zaletą tego podejścia jest to, że pozwala ono uniknąć tworzenia mutantów z wyciszeniem genu (knockdown), które w niektórych systemach modelowych są trudne do wygenerowania lub nie mogą być w ogóle stworzone w przypadku niezbędnych białek docelowych. Co więcej, zapobiega to błędnej interpretacji wynikającej z różnic w ekspresji białek, które mogą wystąpić jako odpowiedź komórki na wyciszenie białka docelowego: jeśli inne białka również zostaną wyciszone i będą wykazywać reakcję krzyżową z surowicą używaną do immunoprecypitacji, zostaną one zinterpretowane jako rzeczywiste partnerzy interakcji białka docelowego. Wreszcie, modulacja powinowactwa eliminuje konieczność ustalania odpowiedniego stosunku przeciwciała do antygenu.

Choć nasz protokół zastosowaliśmy w odniesieniu do Chlamydomonas reinhardtii jako organizmu modelowego, można go łatwo zaadaptować do każdego innego organizmu, który może być hodowany w kulturze komórkowej i jest zdolny do wykorzystania amonu lub azotanu jako źródła azotu. Modulacja powinowactwa kompleksów białkowych przez ATP/ADP może zostać bezpośrednio zastosowana do innych chaperonów, których oddziaływanie z substratami i białkami towarzyszącymi zależy od stanu ATP, takich jak systemy chaperonowe GroEL/HSP60/Cpn60 lub HSP9014,15, lub do każdego innego systemu, w którym powinowactwa wiązania są modulowane przez ATP. Modulacja powinowactwa powinna również działać w przypadkach, gdy powinowactwa w oddziaływaniach białkowych są zmieniane przez specyficzne leki, takie jak radicicol lub geldanamycyna w przypadku systemów HSP9015.

Wyraźnym ograniczeniem naszego protokołu jest fakt, że wymaga on przeciwciał oczyszczonych metodą powinowactwa przeciwko białku docelowemu, o którym wiadomo, że jest wrażliwe na konkretną terapię lub lek modulujący jego powinowactwo do białek partnerskich. W związku z tym nie jest to metoda wysokoprzepustowa.

Oświadczenia

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Dziękujemy Olivierowi Vallonowi za antiserum przeciwko CF1β. Praca ta była wspierana przez Max Planck Society oraz granty z Deutsche Forschungsgemeinschaft (Schr 617/5-1) i Bundesministerium für Bildung und Forschung (Systems Biology Initiative FORSYS, projekt GoFORSYS).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
ProteinA SepharoseSigma-AldrichP3391
DMP (dimetylopimelimidyd) Sigma-AldrichD8388Przechowywać w warunkach bezwodnych w temp. -20 °C, rozpuścić bezpośrednio przed użyciem
Inhibitor proteaz (kompletny, bez EDTA)Roche Applied Science11873580001
ATP (adenozyno-5'-trifosforan)Carl RothK054
Fosforan kreatynySigma-Aldrich27920
Kinaza kreatynowaSigma-AldrichC7886
DSP ditiobis[propionian succinimidylo]Thermo Sientific22585Przechowywać w warunkach bezwodnych w temp. 4 °C
15NH4ClCambridge isotope laboratories, Andover, MANLM-467
Lys-C (endoproteinaza
Lys-C) 		Roche Applied Science11047825001
Kuleczki z trypsyną (immobilizowana trypsyna Poroszyme)Applied Biosystems2-3127-00Wymieszać energicznie bezpośrednio przed użyciem
Dysk Empore C18 47 mmVarian12145004

Bibliografia

  1. Perrakis, A., Musacchio, A., Cusack, S., Petosa, C. Investigating a macromolecular complex: the toolkit of methods. J. Struct. Biol. 175, 106-112 (2011).
  2. Gavin, A. C., Maeda, K., Kuhner, S. Recent advances in charting protein-protein interaction: mass spectrometry-based approaches. Curr. Opin. Biotechnol. 22, 42-49 (2011).
  3. Markham, K., Bai, Y., Schmitt-Ulms, G. Co-immunoprecipitations revisited: an update on experimental concepts and their implementation for sensitive interactome investigations of endogenous proteins. Anal. Bioanal. Chem. 389, 461-473 (2007).
  4. Selbach, M., Mann, M. Protein interaction screening by quantitative immunoprecipitation combined with knockdown (QUICK. Nat Methods. 3, 981-983 (2006).
  5. Ong, S. E., Mann, M. A practical recipe for stable isotope labeling by amino acids in cell culture (SILAC). Nat Protoc. 1, 2650-2660 (2006).
  6. Heide, H. Application of quantitative immunoprecipitation combined with knockdown and cross-linking to Chlamydomonas reveals the presence of vesicle-inducing protein in plastids 1 in a common complex with chloroplast HSP90C. Proteomics. 9, 3079-3089 (2009).
  7. Nordhues, A., Miller, S. M., Muhlhaus, T., Schroda, M. New insights into the roles of molecular chaperones in Chlamydomonas and Volvox. International review of cell and molecular biology. 285, 75-113 (2010).
  8. Mayer, M. P., Bukau, B. Hsp70 chaperones: cellular functions and molecular mechanism. Cell Mol. Life Sci. 62, 670-684 (2005).
  9. Schroda, M., Vallon, O., Whitelegge, J. P., Beck, C. F., Wollman, F. A. The chloroplastic GrpE homolog of Chlamydomonas: two isoforms generated by differential splicing. The Plant Cell. 13, 2823-2839 (2001).
  10. Willmund, F., Schroda, M. HEAT SHOCK PROTEIN 90C is a bona fide Hsp90 that interacts with plastidic HSP70B in Chlamydomonas reinhardtii. Plant Physiol. 138, 2310-2322 (2005).
  11. Harris, E. H. The Chlamydomonas Sourcebook: Introduction to Chlamydomonas and Its Laboratory Use. , Elsevier, Academic Press. San Diego, CA. (2008).
  12. Mortensen, P. MSQuant, an open source platform for mass spectrometry-based quantitative proteomics. J. Proteome Res. 9, 393-403 (2010).
  13. M?hlhaus, T., Weiss, J., Hemme, D., Sommer, F., Schroda, M. Quantitative Shotgun Proteomics Using a Uniform 15N-Labeled Standard to Monitor Proteome Dynamics in Time Course Experiments Reveals New Insights into the Heat Stress Response of Chlamydomonas reinhardtii. Mol. Cell Proteomics. 10, (2011).
  14. Bukau, B., Horwich, A. L. The Hsp70 and Hsp60 chaperone machines. Cell. 92, 351-366 (1998).
  15. Wandinger, S. K., Richter, K., Buchner, J. The Hsp90 chaperone machinery. J. Biol. Chem. 283, 18473-18477 (2008).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Metaboliczne znakowanie azotemChlamydomonas reinhardtiichaperon HSP70Bczynnik wymiany nukleotyd w CGE1trawienie trypsynko c wki StageTips C18
Protokół identyfikacji oddziaływań białko-białko w oparciu o znakowanie metaboliczne 15N, immunoprecypitację, ilościową spektrometrię mas oraz modulację powinowactwa
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.