Protokół identyfikacji oddziaływań białko-białko oparty na znakowaniu metabolicznym 15N, immunoprecypitacji, ilościowej spektrometrii mas i modulacji powinowactwa

Summary

Prezentujemy wariant metody QUICK (QUantitative Immunoprecipitation Combined with Knockdown), która została wprowadzona wcześniej w celu rozróżnienia prawdziwych i fałszywych interakcji białko-białko. Nasze podejście opiera się na znakowaniu ^{metabolicznym 15N}, modulacji powinowactwa interakcji białko-białko przez obecność/brak ATP, immunoprecypitacji i ilościowej spektrometrii mas.

Abstract

Interakcje białko-białko są fundamentalne dla wielu procesów biologicznych w komórce. Dlatego ich charakterystyka odgrywa ważną rolę w obecnych badaniach i dostępnych jest mnóstwo metod ich badania¹. Interakcje białko-białko są często bardzo dynamiczne i mogą zależeć od lokalizacji subkomórkowej, modyfikacji potranslacyjnych i lokalnego środowiska białkowego². W związku z tym powinny być one badane w ich naturalnym środowisku, dla którego metody z wyboru są metody koimmunoprecypitacji³. Partnerzy interakcji współstrąconych są identyfikowani albo za pomocą immunoblottingu w podejściu celowanym, albo za pomocą spektrometrii mas (LC-MS/MS) w sposób nieukierunkowany. Na tę ostatnią strategię często negatywnie wpływa duża liczba wyników fałszywie dodatnich, wynikających głównie z wysokiej czułości nowoczesnych spektrometrów masowych, które z pewnością wykrywają ślady niespecyficznie wytrącających się białek. Niedawne podejście do przezwyciężenia tego problemu opiera się na założeniu, że zmniejszone ilości określonych partnerów interakcji będą współstrącać się z danym białkiem docelowym, którego stężenie komórkowe jest zmniejszone przez RNAi, podczas gdy ilości niespecyficznie wytrącających się białek powinny pozostać nienaruszone. Podejście to, nazwane QUICK for QUantitative Immunoprecipitation Combined with Knockdown⁴, wykorzystuje znakowanie stabilnych izotopów aminokwasów w hodowli komórkowej (SILAC)⁵ i MS w celu ilościowego określenia ilości białek immunoprecypitowanych ze szczepów typu dzikiego i knock-down. Białka występujące w stosunku 1:1 można uznać za zanieczyszczenia, czyli te wzbogacone w osady z typu dzikiego jako swoi partnerzy interakcji białka docelowego. Chociaż QUICK jest innowacyjny, ma pewne ograniczenia: po pierwsze, SILAC jest kosztowny i ograniczony do organizmów, które idealnie nadają się do auksotrofii w stosunku do argininy i/lub lizyny. Co więcej, gdy podawana jest ciężka arginina, konwersja argininy do proliny powoduje dodatkowe przesunięcia masy dla każdej proliny w peptydzie i nieznacznie rozcieńcza ciężką argininę lekką, co sprawia, że kwantyfikacja jest bardziej żmudna i mniej dokładna^5,6. Po drugie, QUICK wymaga, aby przeciwciała były miareczkowane w taki sposób, aby nie nasycały się białkiem docelowym w ekstraktach z mutantów knock-down.

Tutaj wprowadzamy zmodyfikowany protokół QUICK, który pokonuje wyżej wymienione ograniczenia QUICK, zastępując SILAC do znakowania metabolicznego ¹⁵N i zastępując knock-down za pośrednictwem RNAi na modulację powinowactwa interakcji białko-białko. Wykazujemy możliwość zastosowania tego protokołu przy użyciu jednokomórkowej zielonej algi Chlamydomonas reinhardtii jako organizmu modelowego i białka opiekuńczego chloroplastu HSP70B jako białka docelowego⁷ (ryc. 1). Wiadomo, że HSP70 oddziałują z określonymi ko-opiekuńczymi i substratami tylko w stanie ADP⁸. Wykorzystujemy tę właściwość jako sposób na weryfikację specyficznej interakcji HSP70B z jego czynnikiem wymiany nukleotydów CGE1⁹.

Protocol

1. Adsorpcja przeciwciał

1. Odważyć 120 mg białka A Sepharose w 15-mililitrowej stożkowej probówce (Falcon). Ponieważ 15 mg białka A sefarozy jest potrzebne do każdej immunoprecypitacji (IP), ilość ta wystarcza na 8 IP. Dodać 5 ml 0,1 M buforu fosforanowego (pH 7,4) i pozostawić sefalozę białka A pęczniejącą przez 30 minut w temperaturze 4 °C.

(Zauważ, że wszystkie kroki od tego momentu muszą być wykonywane w rękawiczkach, aby uniknąć zanieczyszczenia keratyną, oraz na lodzie, aby uniknąć degradacji białek/dysocjacji kompleksu.)

2. Wirować przez 60 sekund przy 1 000 x g i 4 °C w celu osadzenia spęczniejącej sefalozy białka A. Ostrożnie usunąć supernatant i ponownie zawiesić kulki w 5 ml 0,1 M buforze fosforanowym (pH 7,4). Powtórz ten krok trzy razy, aby dokładnie umyć koraliki.
3. Po ostatnim etapie wirowania usunąć supernatant i pozostawić około 0,5 ml buforu fosforanowego. Dodać 0,9 ml 0,5 M buforu fosforanowego (pH 7,4), 400 μl oczyszczonych przeciwciał pierwszorzędowych o powinowactwie (50 μl na IP) przeciwko białku docelowemu (tutaj HSP70B) i 16 μl przeciwciał przeciwko białku kontrolnemu (tutaj CF1β). Napełnić ddH₂O do całkowitej objętości 5 ml.

(Zauważ, że przeciwciała oczyszczone z powinowactwa powinny być używane do redukcji zanieczyszczenia niespecyficznymi IgG, które zakłócają analizę nano-LC-MS - dla protokołu zobacz Willmund et al. (2005)¹⁰. CF1β jest wytrącany jako kontrola obciążenia i został wybrany, ponieważ występuje w dużych ilościach i po lizie komórek występuje we frakcjach rozpuszczalnych i błonowych. Alternatywnie, poziomy zanieczyszczających białek mogą być wykorzystane do normalizacji nierównomiernego obciążenia.)

4. Pozwól kulkom sefarozy białka A adsorbować IgG podczas 1-godzinnej inkubacji w temperaturze 25 °C na walce rurowej (CAT RM5W, 36 obr./min).
5. Wirować przez 60 sekund w temperaturze 1 000 x g i w temperaturze 4 °C w celu granulowania kulek sefarozy białka A. Ostrożnie usunąć supernatant i ponownie zawiesić kulki w 5 ml 0,1 M buforu boranu sodu (pH 9,0). Powtórz ten krok trzy razy, aby dokładnie usunąć aminy, które mogłyby wygasić środek sieciujący.
6. Odważyć 25,9 mg świeżego, stałego dimetylosimimidanu i ponownie zawiesić w 5 ml 0,1 M buforu boranu sodu (pH 9,0) do uzyskania końcowego stężenia 20 mM. Dodaj ten roztwór do kulek sefarozy białka A.
7. Pozostawić IgG do sieciowania z białkiem A przez 30 minut w temperaturze 25 °C na wałku rurowym.
8. Wirować przez 60 sekund przy 1 000 x g i 4 °C w celu granulowania kulek. Ostrożnie usunąć supernatant i ponownie zawiesić kulki w 5 ml 1 M Tris-HCl (pH 7,5) do wygaszenia wolnego środka sieciującego. Powtórzyć ten krok raz i inkubować przez 2 godziny w temperaturze 25 °C lub 12-24 godziny w temperaturze 4 °C na wałku rurowym.
9. Opcjonalnie: jeśli kulki sefarozy białka A sprzężone z IgG nie są bezpośrednio używane do IP, możliwe jest przechowywanie przez okres do jednego tygodnia. W tym celu należy odwirować przez 60 sekund w temperaturze 1 000 x g i w temperaturze 4 °C w celu osadzenia kulek, ostrożnie usunąć supernatant i ponownie zawiesić kulki w 5 ml 0,1 M buforu fosforanowego (pH 7,5) zawierającego 0,02% azydku sodu i przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu dalszego użycia.

2. Liza komórek, sieciowanie i przygotowanie próbek

1. Hodować dwie kultury Chlamydomonas w pożywce zawierającej 7,5 mM ¹⁴NH₄Cl lub ¹⁵NH₄Cl jako źródło azotu do gęstości ~5 x 10⁶ komórek/ml. Komórki muszą przejść przez co najmniej dziesięć pokoleń, aby uzyskać pełne znakowanie. W tym przypadku komórki hodowano fotomiksotroficznie w pożywce TAP¹¹ na wytrząsarce rotacyjnej w temperaturze 25 °C pod ciągłym naświetlaniem światłem białym (30 μE ^{m-2 s-1}).
2. Przenieść dwie podwielokrotności ^{po 14}komórek znakowanych N i ¹⁵komórek znakowanych N do czterech probówek GSA i zebrać komórki przez 4-minutowe wirowanie w temperaturze 4 000 x g i w temperaturze 4 °C (Liczba komórek zebranych dla każdej podwielokrotności zależy od stężenia komórkowego białka docelowego w komórkach i musi być wcześniej określona empirycznie, aby zapewnić wytrącenie wystarczającej ilości białka docelowego. Dobrym punktem wyjścia jest 10⁹ komórek na podwielokrotność, tj. 200 ml kultury o wymiarach 5 x 10⁶ komórek/ml).
   Tylko do sieciowania: w przypadku, gdy kompleksy białkowe zostaną usieciowane przed IP, komórki muszą zostać umyte w celu usunięcia amin obecnych w pożywce. W tym celu należy ponownie zawiesić komórki w 40 ml wstępnie schłodzonego buforu KH (20 mM HEPES-KOH (pH 7,2), 80 mM KCl) i przenieść je do 50-ml probówek Falcon. Wirować przez 60 sekund przy 1 000 x g i temperaturze 4 °C. Powtórzyć ten krok raz.
3. Zawieś komórki w 2 ml buforze do lizy (20 mM HEPES-KOH (pH 7,2), 1 mM MgCl₂, 10 mM KCl, 154 mM NaCl) wstępnie schłodzonym do 4 °C i przenieś je do 15-ml probówek Falcon. Pozostałe komórki należy zebrać w probówkach GSA z dodatkowym 1 ml buforu do lizy każda. Dodać 50 μl 25 x inhibitor proteazy i 12,5 μl 1 M MgCl₂ (do końcowego stężenia 3,5 mM) do każdej podwielokrotności.
4. Dodać 150 μl buforu do lizy, 12,5 μl 1 M ATP, 833 μl 270 mM fosforanu kreatyny i 7 μl 5 μg/μl fosfokinazy kreatynowej (końcowe stężenie to 2,5 mM ATP, 45 mM fosforanu kreatyny i 7 μg/ml fosfokinazy kreatyny) do jednej z podwielokrotności zawierających ¹⁴komórek znakowanych N i ¹⁵N (są to podwielokrotności +ATP).
5. Dodać 930 μl buforu do lizy i 70 μl 1 U/μl apirazy do pozostałych podwielokrotności zawierających ¹⁴komórek znakowanych N i ¹⁵N (są to podwielokrotności -ATP).
6. Inkubować przez 2 minuty w temperaturze 25 °C na walce rurowej w celu uzyskania stanu zubożenia ATP i napełnienia ATP. Jeśli etap sieciowania zostanie pominięty, dodaj kolejny 1 ml buforu do lizy.
   Tylko do sieciowania: w przypadku, gdy badane oddziaływania białko-białko są przejściowe, zaleca się ich wychwycenie na etapie sieciowania. W tym celu należy dodać 500 μl 20 mM ditio-bis(propionianu sukcynimidylu) (DSP) rozpuszczonego w DMSO (końcowe stężenie wynosi 2 mM) do każdej probówki bezpośrednio przed sonikacją.
7. Poddaj się sonifikacji cztery razy po 20 sekund na lodzie, aby rozbić komórki z 20-sekundowymi przerwami między nimi w celu schłodzenia. (Używamy Bandelin Sonoplus HD2070 z końcówką KE76 przy kontroli wyjściowej 75% i cyklu pracy 60%. Niezbędne ustawienia dla innych maszyn/urządzeń/końcówek muszą być określone z wyprzedzeniem, aby zapewnić całkowitą lizę komórek i uniknąć rozlania.)
   Wyłącznie do sieciowania: pozwolić na sieciowanie kompleksów białkowych poprzez inkubację przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C na wałku rurowym. Po usieciowaniu uzupełnić każdą probówkę 500 μl 1 M glicyny i inkubować na walce rurowej przez kolejne 15 minut w temperaturze 4 °C, aby ugasić środek sieciujący.
8. Przygotować cztery 6-mililitrowe poduszki z sacharozą (20 mM HEPES-KOH (pH 7,2), 0,6 M sacharozy) w cienkościennych probówkach SW41 Ti (Beckman Coulter nr art.: 344059), ostrożnie ułożyć całe ~5,5 ml lizatów komórkowych na poduszkach sacharozy (zrównoważyć z buforem do lizy) i odwirować przez 30 minut w temperaturze 200 000 x g i 4 °C w wirniku SW41 Ti.
9. Przenieść górną część gradientu zawierającego rozpuszczalne kompleksy białkowe do czterech 15-mililitrowych probówek Falcon (unikać przenoszenia części poduszki sacharozy), dodać 350 μl 10% Triton X-100 do końcowego stężenia 0,5% do każdej z nich, dokładnie wymieszać i dodać bufor do lizy do całkowitej objętości 7 ml każdy.
   (Przenieść 70 μl każdego rozpuszczalnego ekstraktu komórkowego do świeżych 1,5-ml stożkowych probówek (probówek Eppendorfa) i dodać 70 μl 2 x bufor do próbek SDS (4% SDS, 125 mM Tris-HCl (pH 6,8), 20% glicerol, 10% 2-merkaptoetanol) do każdego z nich w celu przeprowadzenia SDS-PAGE i analiz immunoblot.)
10. Wyrzucić poduszki sacharozy i ponownie zawiesić granulki membrany w 3 ml buforu do lizy każdy. Dodać do każdego 1 ml 10% Triton X-100 do końcowego stężenia 2%, sonikować na lodzie w celu rozpuszczenia granulek i dodać bufor do lizy do całkowitej objętości 5 ml każdy.
11. Przygotować kolejne cztery 6-mililitrowe poduszki sacharozy w cienkościennych probówkach SW41 Ti, ostrożnie ułożyć ~5 ml rozpuszczonych membran z kroku 2.10 na poduszkach sacharozy i wirować przez 30 minut przy 200 000 x g i 4 °C w wirniku SW41 Ti.
12. Przenieść górną część gradientu zawierającego błonowe kompleksy białkowe do czterech 15-mililitrowych probówek Falcon i dodać bufor do lizy (zawierający 2% Triton X-100) do końcowej objętości 7 ml każdy. (Przenieść 70 μl każdego rozpuszczalnego ekstraktu komórkowego do świeżych probówek Eppendorfa i dodać 70 μl 2 x SDS próbki do każdej z nich w celu przeprowadzenia SDS-PAGE i analiz immunoblotowych.)

3. Immunoprecypitacja

1. Granulki sefarozy białka A zawierające sprzężone przeciwciała (z etapów 1.8 lub 1.9) należy zagnieździć przez 60-sekundowe wirowanie w temperaturze 1 000 x g i temperaturze 4 °C, ostrożnie usunąć supernatant i ponownie zawiesić kulki w 4 ml buforu do lizy. Powtórz ten krok dwukrotnie, aby zrównoważyć kulki w buforze do lizy.
2. Napełnić do 8 ml buforem do lizy i przenieść 1 ml zawiesiny do każdej z ośmiu 15-mililitrowych probówek Falcon zawierających rozpuszczalne lub błonowe kompleksy białkowe z ¹⁴i ¹⁵komórek znakowanych izotopem N i 15 N (z etapów 2.9 i 2.12) w ilości ATP i zubożonych w ATP.
3. Inkubować przez 2 godziny w temperaturze 4 °C na walce rurowej w celu wytrącenia kompleksów białkowych.
Granulki osadzić
4. przez 60-sekundowe odwirowanie w temperaturze 1 000 x g w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatanty. Pozostaw niewielką objętość płynu na wierzchu koralików, aby ułatwić przenoszenie.
5. Przenieś kulki z każdej probówki Falcon do stożkowych probówek o pojemności 1,5 ml (probówek Eppendorfa). Aby zebrać wszystkie pozostałe kulki w probówkach Falcon, dodaj do każdej z nich kolejne 0,8 ml buforu do lizy zawierającego 0,1% Tritonu, delikatnie wiruj, wiruj przez 60 sekund przy 1 000 x g i 4 °C i przenieś bufor z resztkowymi kulkami do probówek Eppendorfa. Wymiana rurki jest konieczna, aby zapobiec zanieczyszczeniom z białek przylegających do ścianek z tworzywa sztucznego.
Granulki osadzać przez
6. 15-sekundowe odwirowywanie w temperaturze 16 100 x g w temperaturze 4 °C, ostrożnie usunąć supernatanty i ponownie zawiesić kulki w 1,3 ml buforu do lizy zawierającego 0,1% Trytonu. Powtórz ten krok dwukrotnie z buforem do lizy zawierającym Triton i dwa razy z buforem do lizy bez Trytonu, aby dokładnie umyć kulki. Pozostaw niewielką objętość płynu na wierzchu koralików, aby ułatwić przenoszenie.
7. Ponownie przenieś kulki do świeżych probówek Eppendorf o pojemności 1,5 ml, aby usunąć białka przylegające do plastikowych ścianek. Umyj stare probówki 1 ml buforu do lizy bez Tritonu i przenieś wszystkie pozostałe kulki do świeżych probówek.
8. Wirować przez 15 sekund przy 16 100 x g i temperaturze 4 °C, najpierw usunąć supernatanty za pomocą zwykłej pipety, a następnie całkowicie usunąć pozostały supernatant za pomocą strzykawki Hamiltona o pojemności 50 μl.

4. Przygotowanie próbki dla nano-LC-MS/MS

1. Dodać 100 μl świeżo przygotowanego buforu elucyjnego (8 M mocznika, 25 mM NH₄HCO₃) do każdej probówki, użyć 100 μl buforu elucyjnego do zmycia kulek przyklejonych do strzykawki Hamiltona i inkubować przez 10 minut w termomikserze przy 800 obr./min i 65 °C, a następnie przez kolejne 20 minut w temperaturze 30 °C. (Znacznie pełniejszą elucję związanych białek uzyskuje się przez elucję z 2% SDS a następnie wytrącanie 80% acetonu.)
2. Wirować przez 15 sekund przy 16 100 x g i temperaturze 25 °C. Przenieść supernatanty do świeżych probówek za pomocą strzykawki Hamiltona o pojemności 50 μl.
3. Dodać 50 μl buforu elucyjnego do kulek, użyć 50 μl buforu elucyjnego do zmycia kulek przyklejających się do strzykawki Hamiltona i powtórzyć etapy inkubacji i wirowania odpowiednio 4.1 i 4.2. Zbierz odpowiednie eluaty.
   (Przenieść 30 μl eluatów do świeżych probówek Eppendorfa, dodać 30 μl 2 x bufor do próbek SDS do każdej z nich w celu przeprowadzenia SDS-PAGE i analiz immunoblotowych.)
4. Połączyć eluowane osady z białek rozpuszczalnych i błonowych potraktowanych +/-ATP, ¹⁴N i ¹⁵N znakowanych N w następujący sposób:
   120 μl ¹⁵N/+ATP i 120 μl ¹⁴N/-ATP
   120 μl ¹⁴N/+ATP i 120 μl ¹⁵N/-ATP
   120 μl ¹⁵N/+ATP i 120 μl ¹⁴N/-ATP
   120 μl ¹⁴N/+ATP i 120 μl ¹⁵N/-ATP
5. Dodać 1,5 μl świeżo przygotowanego 1 M DTT do końcowego stężenia 6,5 mM do każdej z czterech kombinacji w celu redukcji wiązań dwusiarczkowych (w tym tych w sieci sieciującej) i inkubować przez 30 minut w temperaturze 25 °C.
6. Dodać 10,5 μl świeżo przygotowanego 0,6 M jodoacetamidu do końcowego stężenia 25 mM w celu karboksymetylowania zredukowanych tioli i inkubować przez 20 minut w temperaturze 25 °C w ciemności.
7. Dodać 256 μl 40 mM NH₄HCO₃ i 4 μl Lys-C (0,1 μg/μl), zamknąć probówki parafilmem i inkubować przez co najmniej 16 godzin przez noc na kole obrotowym w temperaturze 37 °C.
8. Dodać 470 μl 20 mM NH₄HCO₃, 10 μl 100 % acetonitrylu (do końcowego stężenia 1%) i 8 μl kulek trypsyny i inkubować na kole obrotowym przez co najmniej 16 godzin w temperaturze 37 °C.
9. Wirować przez 5 minut w temperaturze 16 100 x g i temperaturze 4 °C, a następnie przenieść supernatanty do świeżych probówek Eppendorfa o pojemności 2 ml. Umyj stare probówki 50 μl 20 mM NH₄HCO₃, 0,5% kwasem octowym i połącz je z pierwszymi supernatantami.
10. Do odsalania przygotuj domowe końcówki C_18-StageTips, wycinając dwa krążki z materiału Empore C₁₈ za pomocą igły strzykawkowej i umieszczając je w końcówce do pipety o pojemności 200 μl. W ten sposób przygotuj cztery końcówki o pojemności 200 μl. Przebij otwory w pokrywkach czterech probówek Eppendorf o pojemności 2 ml i włóż końcówki.
11. Końcówki C_18-StageTip należy przygotować do przygotowania w 50 μl roztworu B (80% acetonitrylu, 0,5% kwasu octowego). Wirować przez 3 minuty w temperaturze 800 g i temperaturze 25 °C.
12. Zrównoważyć końcówki C_18-StageTips ze 100 μl roztworu A (0,5% kwasu octowego, 2% acetonitrylu). Wirować przez 3 minuty w temperaturze 800 g i temperaturze 25 °C. Powtórzyć ten krok raz.
13. Załadować 100 μl supernatantów z mineralizacji tryptycznej (4.9) na końcówkę C_18-StageTips i wirować przez 3 minuty w temperaturze 800 g i temperaturze 25 °C. Powtarzać ten krok, aż do momentu, gdy do kolumn zostaną naniesione kompletne supernatanty.
14. Umyj końcówki C_18-StageTips 100 μl roztworu A. Wirować przez 3 minuty w temperaturze 800 g i temperaturze 25 °C. Powtórz ten krok dwukrotnie.
15. Wypłukać peptydy tryptyczne do świeżej 1,5-mililitrowej probówki Eppendorfa z 50 μl roztworu B. Wirować przez 3 minuty w temperaturze 800 g i temperaturze 25 °C. Powtórz ten krok raz. Suszenie peptydów do końca w odkurzaczu prędkościowym.
16. Opcjonalnie: zgrzej probówki Eppendorf parafilmem i przechowuj w temperaturze -80 °C do dalszego użycia.
17. Ponownie zawiesić wysuszone peptydy w 20 μl roztworu A i inkubować przez co najmniej 1 godzinę na lodzie, przerywając dwie 15-minutowe inkubacje w kąpieli sonikatora. Wirować przez 20 minut przy 16 100 x g i temperaturze 4 °C, a następnie nanieść supernatant na nano-LC-MS/MS.

5. Reprezentatywne wyniki

Jak pokazano przykładowo dla ¹⁴ekstraktów komórkowych znakowanych N na rysunku 2A, HSP70B i CGE1 są prawie wyłącznie zlokalizowane w frakcji rozpuszczalnej, niezależnie od stanu ATP. W przeciwieństwie do tego, CF1β jest zlokalizowany we frakcjach rozpuszczalnych i wzbogaconych w błonę, ponieważ sonikacja odcina jego część od CF_o umieszczonego w membranie, a zatem służy jako kontrola obciążenia dla obu frakcji. Jak pokazano na rysunku 2B, podobne ilości HSP70B wytrącono przeciwciałami anty-HSP70B z ¹⁴N- i ¹⁵rozpuszczalnych ekstraktów znakowanych N, niezależnie od stanu ATP. W przeciwieństwie do tego, tylko niewielka ilość HSP70B została wytrącona z frakcji błonowych, przy czym nieco większe ilości pochodziły z frakcji błonowych zubożonych w ATP w porównaniu z frakcjami pełnymi ATP, co potwierdza wcześniejsze wyniki⁹. Żaden CGE1 nie był współwytrącany z HSP70B we frakcjach rozpuszczalnych lub błonowych wypełnionych ATP, podczas gdy duże ilości CGE1 były współwytrącane z HSP70B z frakcji rozpuszczalnych zubożonych w ATP, a niewiele z frakcji błonowych zubożonych w ATP.

Interakcja CGE1 z HSP70B tylko w stanie ADP jest również obserwowana w analizie MS: na rysunku 3 pokazano reprezentatywne widma MS1 peptydów HSP70B i CGE1 z osadów generowanych za pomocą surowicy przeciw HSP70B z rozpuszczalnych ekstraktów komórkowych. W eksperymencie pokazanym na rysunku 3A osady pochodziły z mieszanin ¹⁴ekstraktów znakowanych azotem bez ATP i ¹⁵ekstraktów znakowanych azotem zawierających ATP. Podczas gdy ciężka i lekka znakowana forma peptydu HSP70B została wykryta z równą intensywnością, znaleziono tylko lekką znakowaną formę peptydu CGE1 (z ekstraktów -ATP). Na rysunku 3B pokazano te same peptydy z osadu anty-HSP70B pochodzącego z mieszanin wzajemnie znakowanych rozpuszczalnych ekstraktów komórkowych. W związku z tym tym tym wykryto tylko ciężką znakowaną formę peptydu CGE1 (z ekstraktów -ATP), podczas gdy tak było również w przypadku lekkich, jak i ciężkich znakowanych peptydów HSP70B.

Rysunek 1. Eksperymentalny przepływ pracy. Komórki są metabolicznie znakowane ¹⁴N i ¹⁵N przez co najmniej 10 pokoleń, zbierane i zaopatrywane w ATP lub pozbawione ATP. Po lizie komórek kompleksy białkowe mogą być opcjonalnie sieciowane (X-link) za pomocą DSP. Zlizowane komórki są następnie rozdzielane na frakcje rozpuszczalne (Sol) i wzbogacone w błonę (Pel). Białka docelowe (tutaj HSP70B) i białko kontrolne (tutaj CF1β) są immunoprecypitowane specyficznymi przeciwciałami sprzężonymi z kulkami sefarozy białka A (czarnym). Po przemyciu, wytrącone białka są eluowane i albo bezpośrednio analizowane przez immunoblotting, albo odpowiednie ¹⁴frakcji znakowanych N i ¹⁵N w stanach +ATP i -ATP są łączone, trawione i analizowane przez nano-LC-MS/MS. W pokazanym tutaj przykładzie ^{frakcja 15}znakowana N została zubożona z ATP. W związku z tym stosunek intensywności ciężkich znakowanych (ciemne kolory) do jasno znakowanych (jasne kolory) peptydów z białka kontrolnego (CF1β), białka docelowego (HSP70B) i zanieczyszczeń niespecyficznie związanych powinien wynosić około jednego, podczas gdy oczekuje się, że stosunek ten będzie bardzo wysoki dla białek specyficznie oddziałujących z białkiem docelowym (CGE1). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą postać.

Rysunek 2. A Analiza danych wejściowych do immunoprecypitacji HSP70B. Białko całkowite wyekstrahowano z frakcji rozpuszczalnych (Sol) i wzbogaconych w błonę (Pel), które zostały zubożone w ATP (-ATP) lub uzupełnione ATP i systemem regeneracji ATP (+ATP). 0,01% ekstraktów białkowych oddzielono na 10% żelu poliakrylamidowym SDS, a poziomy białka HSP70B i CGE1 w stosunku do kontroli obciążenia CF1β analizowano za pomocą immunoblottingu. B Analiza immunoprecypitatów. HSP70B poddano immunoprecypitacji z ¹⁴N- i ¹⁵N-znakowanych rozpuszczalnych i wzbogaconych błoną ekstraktów komórkowych zawierających lub niezawierających ATP. Białka odpowiadające 3,3% immunoprecypitatów oddzielono na 10% żelu poliakrylamidowym SDS, a poziomy HSP70B i CGE1 w stosunku do kontroli obciążenia CF1β analizowano za pomocą immunoblottingu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą postać.

Rysunek 3. Reprezentatywne widma masowe peptydów HSP70B i CGE1 z immunoprecypitatów anty-HSP70B wykonane na mieszanych frakcjach rozpuszczalnych (¹⁴N-ATP/¹⁵N +ATP). Pokazano pełne widma MS peptydów znakowanych ¹⁴N i ¹⁵N, odpowiadających odpowiednio stanom -ATP i +ATP z HSP70B i koimmunoprecypitowanego CGE1. Oba peptydy są naładowane potrójnie, peptyd HSP70B zawiera 22 atomy azotu, peptyd CGE1 19, co odpowiada przesunięciu masy odpowiednio 7,33 i 6,33 m/z. B Reprezentatywne widma masowe z doświadczenia odwrotności (¹⁴N +ATP/¹⁵N -ATP). Pokazano pełne widma MS tych samych peptydów znakowanych ¹⁴N i ¹⁵N, tutaj odpowiadających stanom +ATP i -ATP odpowiednio z HSP70B i koimmunoprecypitowanego CGE1. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą postać.

Discussion

Niedawno wprowadziliśmy dwa ulepszenia do podejścia QUICK: etap sieciowania do wychwytywania przejściowych interakcji białko-białko (QUICK-X) oraz kontrolne wytrącanie w celu normalizacji w celu uzyskania nierównej wydajności wytrącania⁶. Poniżej przedstawiamy protokół zawierający dwa kolejne ulepszenia QUICK: po pierwsze, zastępujemy SILAC⁵ znakowaniem metabolicznym ¹⁵N. Zaletą jest to, że znakowanie ^{metaboliczne 15}N jest znacznie tańsze niż SILAC, jeśli ¹⁵N jest dostarczane w postaci prostej soli nieorganicznej. Ponadto, dzięki znakowaniu metabolicznemu ¹⁵N, QUICK może być stosowany do organizmów prototroficznych dla wszystkich aminokwasów, takich jak większość roślin, grzybów i bakterii. I wreszcie, interkonwersja argininy do proliny nieodłącznie związana z SILAC^5,6 nie stanowi problemu dla kwantyfikacji peptydów znakowanych ¹⁵N. Przykładami odpowiednich narzędzi do ilościowej oceny danych proteomicznych ¹⁵N są MSQUANT¹² lub IOMIQS¹³.

Po drugie, wprowadzamy modulację powinowactwa jako sposób na specyficzne zmniejszenie ilości białek oddziałujących z danym białkiem docelowym w jednej próbce w porównaniu z inną. Zaletą tego podejścia jest to, że omija ono konstrukcję mutantów knockdown, które dla niektórych układów modelowych są trudne do wygenerowania lub w ogóle nie mogą być wygenerowane w przypadku niezbędnych białek docelowych. Co więcej, pozwala to uniknąć błędnych interpretacji spowodowanych zróżnicowaną ekspresją białek, która może wystąpić jako odpowiedź komórki na powalenie białka docelowego: jeśli inne białka również są regulowane w dół i reagują krzyżowo z surowicą stosowaną do immunoprecypitacji, zostaną zinterpretowane jako prawdziwi partnerzy interakcji białka docelowego. Wreszcie, modulacja powinowactwa znosi potrzebę znalezienia właściwego stosunku przeciwciał do antygenu.

Chociaż stosujemy nasz protokół do Chlamydomonas reinhardtii jako organizmu modelowego, można go łatwo przystosować do każdego innego organizmu, który może być hodowany w hodowli komórkowej i jest w stanie wykorzystywać amonowiec lub azotan jako źródło azotu. Modulacja powinowactwa kompleksów białkowych przez ATP/ADP może być bezpośrednio zastosowana do innych białek opiekuńczych, których interakcja z substratami i białkami kohortowymi zależy od stanu ATP, takich jak układy opiekuńcze GroEL/HSP60/Cpn60 lub HSP90^14,15, lub do dowolnego innego układu, w którym powinowactwo wiązania jest modulowane przez ATP. Modulacja powinowactwa powinna również działać w przypadkach, gdy powinowactwo między interakcjami białkowymi jest zmieniane przez określone leki, takie jak radicykol lub geldanamycyna w przypadku systemów HSP90¹⁵.

Wyraźnym ograniczeniem naszego protokołu jest to, że wymaga on przeciwciał oczyszczonych z powinowactwa przeciwko białku docelowemu, o którym wiadomo, że jest wrażliwe na określone leczenie/lek, które moduluje jego powinowactwo do białek partnerskich. W związku z tym nie jest to metoda o wysokiej przepustowości.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
BiałkoA Sepharose	Sigma-Aldrich	P3391
DMP (dimetylopimelimidate)	Sigma-Aldrich	D8388	Przechowywać wysuszony w temperaturze -20 ° C, rozpuścić bezpośrednio przed użyciem
Inhibitor proteazy (kompletny, wolny od EDTA)	Roche Applied Science	11873580001
ATP (adenozyno-5'-trifosforan)	Carl Roth	K054
Fosforan kreatyny	Sigma-Aldrich	27920
Fosfokinaza kreatynowa	Sigma-Aldrich	C7886
DSP Dithiobis [propionian sukcynimidylu]	Thermo Sientific	22585	Przechowywać w stanie wysuszonym w temperaturze 4 stopni; C
15NH4Cl	Cambridge isotope laboratories, Andover, MA	NLM-467
Lys-C (endoproteinaza Lys-C)	Roche Applied Science	11047825001
Koraliki trypsyny (Poroszyme Immobilized Trypsin)	Applied Biosystems	2-3127-00	Energicznie wymieszać bezpośrednio przed użyciem
Empore C18 47 mm Dysk	Varian	12145004