Artykuł metodologiczny

Tworzenie zdefiniowanych środowisk gazowych w celu zbadania wpływu hipoksji na C. elegans

DOI:

10.3791/4088

⸱

20 lipca 2012

 ,  , 
1Department of Biochemistry, University of Washington, 2Molecular and Cellular Biology Program, University of Washington

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten artykuł szczegółowo opisuje, jak używać komór hipoksyjnych o ciągłym przepływie do generowania atmosfer o określonych stężeniach O2, aby zrozumieć biologiczne reakcje na obniżone O2. System ten jest łatwy w konfiguracji i konserwacji oraz wystarczająco elastyczny, aby dopasować się do szerokiego zakresu stężeńO2 i systemów modelowych

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tlen jest niezbędny do przetrwania wszystkich metazoan, z jednym znanym wyjątkiem1. Zmniejszona dostępnośćO2 (niedotlenienie) może wystąpić podczas stanów chorobowych, normalnego rozwoju lub zmian warunków środowiskowych2-5. Zrozumienie komórkowych szlaków sygnałowych, które są zaangażowane w reakcję na niedotlenienie, może dostarczyć nowych informacji na temat strategii leczenia różnych patologii u ludzi, od udaru po raka. Cel ten został utrudniony, przynajmniej częściowo, przez trudności techniczne związane z kontrolowaną ekspozycją na niedotlenienie w genetycznie podatnych organizmach modelowych.

Nicień Caenorhabditis elegans idealnie nadaje się jako organizm modelowy do badania reakcji niedotlenienia, ponieważ jest łatwy do hodowli i genetycznego manipulowania. Co więcej, możliwe jest badanie odpowiedzi komórkowych na określone niedotlenione stężenia O2 bez efektów zakłócających, ponieważ C. elegans uzyskujeO2 (i inne gazy) przez dyfuzję, w przeciwieństwie do ułatwionego układu oddechowego6. Czynniki, o których wiadomo, że są zaangażowane w odpowiedź na niedotlenienie, są konserwatywne w C. elegans. Rzeczywista odpowiedź na niedotlenienie zależy od dostępnego specyficznego stężeniaO2. U C. elegans narażenie na umiarkowaną hipoksję wywołuje odpowiedź transkrypcyjną, w której pośredniczy głównie hif-1, wysoce konserwatywny czynnik transkrypcyjny indukowany hipoksją6-9. Zarodki C.elegans wymagają hif-1 do przeżycia w 5 000-20 000 ppm O27,10. Niedotlenienie to ogólny termin oznaczający "mniej niż normalnieO2". Normoksja (normaO2) może być również trudna do zdefiniowania. Za normoksję uważamy ogólnie powietrze w pomieszczeniu, które wynosi 210 000 ppmO2. Wykazano jednak, że C. elegans preferuje behawioralne stężenia O2 od 5 do 12% (50 000-120 000 ppm O2)11. U larw i dorosłych hif-1 zapobiega diapauzie wywołanej niedotlenieniem w 5,000 ppm O212. Jednak hif-1 nie odgrywa roli w odpowiedzi na niższe stężeniaO2 (anoksja, definicja operacyjna <10 ppm O2)13. W anoksji C. elegans wchodzi w odwracalny stan zawieszonej animacji, w którym cała mikroskopijnie obserwowalna aktywność ustaje10. Fakt, że różne reakcje fizjologiczne zachodzą w różnych warunkach, podkreśla znaczenie eksperymentalnej kontroli nad hipoksyjnym stężeniemO2.

Tutaj prezentujemy metodę budowy i realizacji komór środowiskowych, które wytwarzają niezawodne i powtarzalne warunki niedotlenienia o określonych stężeniachO2. Metoda ciągłego przepływu zapewnia szybkie wyrównanie komory i zwiększa stabilność systemu. Dodatkowo przezroczystość i dostępność komór pozwala na bezpośrednią wizualizację zwierząt narażonych na niedotlenienie. Ponadto demonstrujemy skuteczną metodę szybkiego zbierania próbek C. elegans po ekspozycji na hipoksję, która jest niezbędna do zaobserwowania wielu szybko odwróconych zmian, które zachodzą w hipoksji10,14. Metoda ta stanowi podstawową podstawę, którą można łatwo modyfikować do indywidualnych potrzeb laboratorium, w tym różnych systemów modelowych i różnych gazów.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Budowa komór środowiskowych

  1. Wybierz najmniejszą rozsądną objętość studzienki wymaganą dla zakresu Twojego projektu. Komora musi być wykonana z materiału nieprzepuszczalnego dla gazów (O2). Można stosować naczynia krystalizacyjne Pyrex, pudełka Anaeropack lub duże pudełka z odlewu akrylowego (Ellard Instrumentation). Odkryliśmy, że 9 płytek 50 mm może zmieścić się w naczyniu krystalizacyjnym Kimex o wymiarach 100 x 50. Szklane płytki mogą być używane jako pokrywki do naczyń krystalizacyjnych Pyrex.
  2. Wywierć otwór w wybranej komorze i dopasuj do plastikowej męskiej złączki Luer do węża (Cole Parmer). Złączki mogą być zabezpieczone za pomocą łącznika rurowego lub żywicy epoksydowej. Zainstaluj podobną złączkę po przeciwnej stronie zbiornika, aby umożliwić przepływ gazu do i z komory. Jeśli to możliwe, przesuń otwory, aby zwiększyć turbulentne mieszanie.
  3. Otrzymać zbiorniki sprężonego gazu o określonych stężeniachO2 (zrównoważonychN2), które są certyfikowanym wzorcem zawartościO2 lub, w warunkach beztlenowych, czystymN2 (<10 ppmO2). Używaj automatycznych regulatorów przełączających do badań długoterminowych, aby uniknąć zakłóceń poziomu tlenu w komorach.
  4. Wykazano, że reakcja organizmu na niedotlenienie jest zależna od temperatury15. Umieszczając komorę w inkubatorze, można utrzymać różne temperatury. Temperatury w inkubatorze mogą być nierówne, dlatego rozsądnie jest korzystać z rejestratora temperatury do ciągłego pomiaru temperatury wewnątrz komory.

2. Podłączenie gazu do komory środowiskowej

  1. Do wszystkich połączeń należy używać rurek o średnicy zewnętrznej jednej ósmej cala połączonych za pomocą złączy zatrzaskowych lub złączek zaciskowych. Rurki powinny być nieprzepuszczalne i niereagujące zO2, takie jak fluorowany etylen-propylen (FEP) lub nylon (Cole Parmer). Schemat zakończonej konfiguracji znajduje się na rysunku 1.
  2. Podłącz zbiorniki sprężonego gazu do urządzenia sterującego przepływem, takiego jak regulator przepływu masowego (Sierra Instruments) lub rotametr (Aalborg). Upewnij się, że ciśnienie przed zbiornikiem mieści się w zakresie urządzenia przepływowego i złączek króćca węża. Zwykle stosuje się reduktory dwustopniowe, przy czym drugi stopień jest ustawiony na żądane ciśnienie [Patrz rozdział trzeci, aby uzyskać informacje na temat wyboru odpowiedniego natężenia przepływu]
  3. Uwodnić gaz, przepuszczając go przez wodę destylowaną za pomocą butelki do płukania gazem ze spiekanym cylindrem, a następnie skierować do jednej ze złączek w komorze środowiskowej, pozostawiając drugą złączkę otwartą do odprowadzania gazu (patrz rysunek 1). W przypadku badań krótkoterminowych hydratacja gazu chroni przed wysuszeniem płytki, ale w przypadku badań długoterminowych może być konieczne monitorowanie wilgotności.
  4. Do uszczelnienia komory można użyć smaru próżniowego Dow Corning. Umieść obciążniki na pokrywie komory, aby zapewnić hermetyczne uszczelnienie. Aby potwierdzić szczelne uszczelnienie i odpowiedni przepływ, przytrzymaj małą kałużę wody w dłoni w rękawiczce do złączki zewnętrznej w komorze i sprawdź, czy nie ma pęcherzyków.

3. Wybór natężenia przepływu

  1. Zakładając idealne wymieszanie, za każdym razem, gdy wymieniana jest objętość komory, następuje 90% wymiana gazowa atmosfery gazowej (prawo Ficka). Na przykład w komorze o pojemności 100 cm3 i natężeniu przepływu 100 cm3/min, pierwotne powietrze w komorze zostanie zastąpione 90% pożądanego gazu po 1 minucie, a następnie asymptotycznie zbliży się do pełnej wymiany o 90% co minutę.
  2. Większe natężenia przepływu i mniejsze pojemniki szybciej osiągną pożądane stężenie tlenu. W przypadku pojemników Kimex 100 x 50 (400 cm3) natężenie przepływu 120 cm3/min pozwoli osiągnąć 99,9% wymiany w ciągu 10 minut (3 wymiany). To natężenie przepływu jest odpowiednie dla większości warunków tlenowych. O ile nam wiadomo, nie przeprowadzono systematycznych badań, w jaki sposób szybkość zmian stężeniaO2 wpływa na odpowiedź u C. elegans.

4. Przygotowanie próbek do badania żywotności

  1. Robaki wystawione na warunki niedotlenienia często uciekają z powierzchni płytek agarowych. Aby temu zapobiec, umieść pierścień kwasu palmitynowego (10 mg/ml w etanolu) wokół krawędzi płytek. Kwas palmitynowy wyjdzie z roztworu, gdy etanol odparuje, tworząc fizyczną barierę. Bariery kwasu palmitynowego nie wpływają na tempo składania jaj, płodność ani długość życia C. elegans16. Zakopywanie się nie występuje częściej w warunkach niedotlenienia, więc dodatkowe środki zapobiegawcze nie są na ogół wymagane.
    1. Wygeneruj zsynchronizowane populacje poprzez wybielanie grawitacyjnych dorosłych osobników w małej kropli alkalicznego roztworu wybielacza na płytkach z niewysiewanymi pożywkami wzrostowymi nicieni (NGM)17. W przeciwieństwie do standardowych protokołów wybielania podchlorynem w dużych partiach, należy pobrać od 1 do 100 zwierząt w kropli roztworu wybielacza na powierzchni płytki NGM, a następnie pozwolić, aby roztwór wybielacza wchłonął się na płytkę17. Po co najmniej 12 godzinach przenieś zsynchronizowane larwy L1 na płytki obsiane żywymi bakteriami OP50. Alternatywnie można pozwolić dorosłym osobnikom na składanie jaj na talerzu przez 2-3 godziny, aby wytworzyć grupę robaków, które będą rozwijać się synchronicznie lub wybrać larwy L4 z mieszanej populacji.
    2. Unikaj narażania wybielonych zarodków na niedotlenienie, ponieważ może to zmniejszyć żywotność13. Aby zebrać młode zarodki (2-4 komórki), dorosłe osobniki można posiekać w niewielkiej objętości wody za pomocą żyletki, a zarodki przenieść na płytki za pomocą pipety doustnej w celu późniejszego narażenia na niedotlenienie.
  3. Płyty uszczelniające w komorze środowiskowej. Zwierzęta kontrolne powinny być trzymane w normoksji (powietrze domowe) w tej samej temperaturze, co leczone robaki. Nie ma zauważalnej różnicy między próbkami pozostawionymi w powietrzu w kurniku a tymi przechowywanymi w identycznej komorze, przez którą przepływa powietrze domowe. Zainicjuj przepływ gazu i utrzymuj ekspozycję przez żądany czas. Aby zapewnić jednorodność rampy, należy wymienić wodę w butelce do mycia gazem przed ekspozycją.
  4. Aby ocenić przeżywalność zarodków, pozwól robakom rozwijać się przez 48 godzin po powrocie do powietrza w pomieszczeniu, w którym to momencie powinny to być larwy w czwartym stadium / dorosłe osobniki pierwszego dnia. Zdobywaj punkty za przetrwanie, cenzurując wszelkie robaki, których nie można rozliczyć.
  5. Aby uwidocznić zwierzęta narażone na niedotlenienie, przenieś robaki do kropli M9 na szkiełku nakrywkowym o średnicy 22 mm2 i odwróć na podkładkę z 2% agarozy w M917. W razie potrzeby jako środek znieczulający można zastosować lewamizol (25 mM) lub azydek sodu (10 mM). Azydek sodu i lewamizol mogą zmylić niektóre obserwacje ze względu na toksyczność i powinny być stosowane rozsądnie18.

5. Szybkie zbieranie robaków narażonych na niedotlenienie (przykład: przygotowanie próbek do zachodniej analizy HIF-1)

Wiele efektów wywołanych niedotlenieniem jest szybko odwracanych po powrocie do powietrza w pomieszczeniu, w tym wznowienie produkcji jaj12, fosforylacja mitotycznych epitopów w embriogenezie13 i degradacja białka HIF-19,19. Szybka izolacja zwierząt narażonych na niedotlenienie jest wymagana w celu uzyskania powtarzalnych efektów w tych warunkach. Dzięki tej konfiguracji zwierzęta można zbierać i zamrażać w ciekłym azocie w czasie krótszym niż dwie minuty. Podczas gdy komory do hipoksji w komorze rękawicowej pozwalają na manipulowanie próbkami w warunkach beztlenowych, ich koszt i praktyczność w warunkach innych niż niedotlenienie ograniczają ich użyteczność.

  1. Hoduj robaki Bristol N2 na 4 płytkach o wysokości 10 cm (HG), aż większość robaków będzie ciężarnymi dorosłymi17. Umyj robaki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml zawierającej alkaliczny roztwór wybielacza w proporcji 1:5 i inkubuj z rotacją, aż robaki zaczną się rozpuszczać, nie dłużej niż 5 minut9. Umyj robaki trzy razy za pomocą M9, obracając w dół z prędkością 1500 x g między każdym myciem bez hamowania.
  2. Utrzymuje się wybielone zarodki na 8 płytkach NGM o średnicy 150 mm i pozostawia do rozwinięcia się w larwy L4 (~48 godzin dla Bristol N2 w temperaturze 22 °C). Przenieś płytki do komór środowiskowych i wystawij na działanie warunków niedotlenienia (1 000 ppm, 5 000 ppm) i beztlenku (N2) przez 4 godziny. Czasy ekspozycji będą się różnić w zależności od projektu eksperymentalnego. Podczas gdy narażenie na niedotlenienie ma natychmiastowy wpływ na tempo składania jaj, zarodki dwukomórkowe umierają po 16-18 godzinach od ekspozycji12. Przy takiej konfiguracji komory hipoksji dolna granica ekspozycji jest ograniczona przez szybkość wymiany atmosfery niezbędną do osiągnięcia równowagi.
  3. Oznacz jedną probówkę do mikrofugi o pojemności 1,5 ml i jedną probówkę stożkową o pojemności 15 ml dla każdej próbki eksperymentalnej. Robaki narażone na niedotlenienie są bardziej narażone na przyklejanie się do boków rurki podczas zbioru. Aby temu zapobiec, umieść 100 μl 1% dodecylosiarczanu sodu (SDS) w każdej stożkowej probówce o pojemności 15 ml. Jeśli SDS hamuje dalsze aplikacje, można zastosować albuminę surowicy bydlęcej (BSA), aby zapobiec przywieraniu. Wydaje się, że rutynowe stosowanie kart charakterystyki lub BSA nie ma widocznej różnicy. Dodaj 50 μl 2x barwnika ładującego białko (4% SDS, 10% 2-merkaptoetanolu i śladowe ilości błękitu bromfenolowego w 30% glicerolu (w/v)) do probówki o pojemności 1,5 ml. Przygotuj Dewara z ciekłym azotem.
  4. Zmierz czas kroków po usunięciu robaków z niedotlenienia i zapisz. Zdejmij pokrywę do komory hipoksyjnej, weź jedną płytkę z próbką i ponownie zamknij komorę. Użyj wody destylowanej, aby umyć robaki na nylonowym filtrze, a następnie wlej do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Obracaj robaki w wirówce stołkowej o sile 1500 x g przez 15-20 sekund z hamulcem.
  5. Użyj próżni, aby usunąć większość supernatantu z probówki, pozostawiając osad robaka nietknięty.
  6. Za pomocą pipety przenieś granulkę robaka w 50 μl do probówki z mikrofugą o pojemności 1,5 ml. Uszczelnij rurkę i zanurz w ciekłym azocie.
  7. Powtarzać tę czynność, aż wszystkie próbki zostaną wyizolowane. Postępuj zgodnie z poniższymi procedurami dla próbek kontroli powietrza w domu, aby uzyskać spójność. Próbki można przechowywać w temperaturze -20 °C.

6. Reprezentatywne wyniki

Efekty biologiczne niedotlenienia można zobaczyć, badając zdolność C. elegans do dorosłości (Rysunek 2). Zarodki złożone przez mutanty delecji Bristol (N2) i hif-1 (ia04) typu dzikiego przeżywają w stężeniach O2 w powietrzu domowym (210 000 ppm O2). Robaki N2 są w stanie przystosować się i przetrwać do dorosłości w 5,000 ppm O2, podczas gdy zarodki hif-1 nie są zdolne do życia. Pokazuje to, że HIF-1 jest niezbędny do przystosowania się do zmieniających się poziomów tlenu dostępnego w środowisku10. Ani zwierzęta N2, ani hif-1 nie mogą przetrwać narażenia na 1000 ppmO2.

Wizualizacja robaka bezpośrednio w niedotlenieniu jest możliwa przy użyciu lunety preparacyjnej i przezroczystego pojemnika (Rysunek 3). Dzięki bezpośredniemu umieszczeniu komory hipoksji na lunecie sekcyjnej, nie ma potrzeby wyjmowania robaków z hipoksji w celu obserwacji reakcji organizmu. Luneta może być wyposażona w iluminację fluorescencyjną (jak na rysunku 3), co jeszcze bardziej rozszerza możliwe rodzaje obserwacji w hipoksji.

figure-protocol-1
Rysunek 1. Przykład komory do hipoksji. Kierunek przepływu gazu jest wskazywany za pomocą strzałek. Gaz jest przechowywany w zbiornikach sprężonego gazu o określonych stężeniachO2 (1) i podłączony jest dwustopniowy reduktor (2). Gaz dostaje się do dolnej części rury przepływowej (3), wychodząc z góry przy odpowiednim natężeniu przepływu. Następnie gaz przepływa do kolby bąbelkowej (4), nawadniając gaz (upewnić się, że kolba bąbelkowa jest prawidłowo podłączona, obserwując pęcherzyki). Uwodniony gaz przechodzi następnie do komory hipoksji na zaworze dopływowym (5), narażając próbki na niedotlenienie. Gaz w końcu dostaje się do pomieszczenia przez otwór wydechowy wywiercony w komorze.

figure-protocol-2
Rysunek 2. Żywotność zarodków narażonych na 1 000 ppm O2 , 5 000 ppm O2 i normoksję (~ 210 000 ppm O2). Zarodki były wystawione na działanie każdego z warunków tlenowych jako zarodki przez 24 godziny w komorach tlenowych o ciągłym przepływie. Robaki przeniesiono do warunków normoksyjnych, pozwolono im rozwinąć się do dorosłości przez 48 godzin, a następnie oceniono je pod kątem żywotności do dorosłości. n>50, N=5.

figure-protocol-3
Rysunek 3. Wizualizacja C. elegans w hipoksji za pomocą mikroskopii. Robaki są narażone na niedotlenienie przy użyciu opisanych metod. Przezroczysta komora środowiskowa (zbudowana z pyreksowego naczynia krystalizacyjnego i szklanej płytki) jest umieszczona bezpośrednio na stoliku lunety sekcyjnej. Pokazane są dwa widoki, jeden obejmujący cały układ przepływu gazu, drugi z samą komorą na stoliku mikroskopu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metoda ta przedstawia strategię konstruowania środowiska hipoksyjnego, które pozwala na utrzymanie w laboratorium środowisk o precyzyjnych stężeniach tlenu. Komory te zapewniają prostą metodę wystawiania organizmów na działanie określonych niskich stężeńO2 oraz monitorowania wyników molekularnych i fizjologicznych. Opisana komora środowiskowa jest montowana przez laboratorium, a nie kupowana komercyjnie, dzięki czemu może być modyfikowana w celu dopasowania do potrzeb eksperymentu.

...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy członkom laboratorium Millera za dyskusję i krytyczną lekturę manuskryptu. Praca ta została wsparta nową nagrodą badacza przyznaną przez Nathan Shock Center of Excellence in the Basic Biology of Aging to DLM oraz nagrodą National Institutes of Health R00 AG030550 DLM.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Rurki (FEP i PTFE)Cole Parmer TygonYO-95821-00 (1/8" FEP) 06605-27 (1/16 x 1/8" PTFE)’ R-3603
Złączki zaciskoweSeattle Fluid Systems06363-58 (M. łącznik 1/16") 06363-62 (F. łącznik 1/16") 06363-60 (M. łącznik 1/8") 06363-61 (F. łącznik 1/8")
Rura przepływowaAalborgPMR3-010073 (3 wyjścia) PMR1-013520 (1 wyjście)
Regulator przepływu masowegoSierra Instruments810S-L-DR-2-OV1-SK1-V1-S1 (Mass Trak) C100L-DD-2-OV1-SV1-PV2-V1-SO-C10 (Inteligentny Trak 2)
Zbiornik sprężonego gazuAirGasWykonane na zamówienie
Plastikowe męskie złączki Luer do wężaCole Parmer45505-41 (seria 500 1/16")
Pudełka z odlewu akrylowegoOprzyrządowanie EllardWykonane na zamówienie
Złączki rurowe (mosiądz lub stal nierdzewna)Seattle Fluid SystemsB-402-1 (Nakrętka 1/4") B-200-3 (Trójnik 1/8") B-400-set (Tulejki 1/4") B-QM2-B1-200 (QM Korpus QC) B-200-1-2 (1/8 x 1/8" męski złącze)
Dow Corning Vacuum GreaseSigma-AldrichZ273554
Pudełko AnaeroPackMisubishi Gas Chemical CompanyR684004 (0,4 litra) R685025 (2,5 litra) R685070 (7,0 litra)
Butelka do mycia gazu PyrexSigma-AldrichCLS31770500C (500 mL) CLS31770250C (250 mL) CLS31770125C (125 mL)
Kwas palmitynowySigma-AldrichP0500
Kozia anty-mysia peroksydaza IgG-chrzanowaSouthern Biotechnology Associates1032-05
SuperSignal West Pico Chemiluminsecent SubstratePierce Chemical34077
100 x 50 szklane naczynia krystalizacyjneKimax Kimble23000
szt.

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Danovaro, R. The first metazoa living in permanently anoxic conditions. BMC Biology. 8, 30(2010).
  2. Birner, P. Overexpression of Hypoxia-inducible Factor 1 alpha Is a Marker for an Unfavorable Prognosis in Early-Stage Invasive Cervical Cancer. Cancer Research. 60, 4693-4696 (2000).
  3. Harris, A. L. Hypoxia - a key regulatory factor in tumour growth. Nat. Rev. Cancer. 2, 38-47 (2002).
  4. Ramirez-Bergeron, D. L. Hypoxia affects mesoderm and enhances hemangioblast specification during early development. Development. 131, 4623-4634 (2004).
  5. Staff, F. E. Wheel-well Stowaways Risk Lethal Levels of Hypoxia and Hypothermia. Human Factors and Aviation. 44, 1-5 (1997).
  6. Shen, C., Powell-Coffman, J. A. Genetic Analysis of Hypoxia Signaling and Response in C. elegans. Annals of the New York Academy of Sciences. 995, 191-199 (2003).
  7. Shen, C., Nettleton, D., Jiang, M., Kim, S. K., Powell-Coffman, J. A. Roles of the HIF-1 Hypoxia-inducible Factor during Hypoxia Response in Caenorhabditis elegans. Journal of Biological Chemistry. 280, 20580-20588 (2005).
  8. Wang, G. L., Jiang, B. H., Rue, E. A., Semenza, G. L. Hypoxia-inducible factor 1 is a basic-helix-loop-helix-PAS heterodimer regulated by cellular O2 tension. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92, 5510-5514 (1995).
  9. Epstein, A. C. R. C. elegans EGL-9 and Mammalian Homologs Define a Family of Dioxygenases that Regulate HIF by Prolyl Hydroxylation. Cell. 107, 43-54 (2001).
  10. Nystul, T. G., Goldmark, J. P., Padilla, P. A., Roth, M. B. Suspended Animation in C. elegans Requires the Spindle Checkpoint. Science. 302, 1038-1041 (2003).
  11. Gray, J. M. Oxygen sensation and social feeding mediated by a C. elegans guanylate cyclase homologue. Nature. 430, 317-322 (2004).
  12. Miller, D. L., Roth, M. B. C. Elegans Are Protected from Lethal Hypoxia by an Embryonic Diapause. Current Biology. 19, 1233-1237 (2009).
  13. Padilla, P. A., Nystul, T. G., Zager, R. A., Johnson, A. C. M., Roth, M. B. Dephosphorylation of Cell Cycle-regulated Proteins Correlates with Anoxia-induced Suspended Animation in Caenorhabditis elegans. Molecular Biology of the Cell. 13, 1473-1483 (2002).
  14. Hu, C. -J., Wang, L. -Y., Chodosh, L. A., Keith, B., Simon, M. C. Differential Roles of Hypoxia-Inducible Factor 1{alpha} (HIF-1{alpha}) and HIF-2{alpha} in Hypoxic Gene Regulation. Molecular and Cellular Biology. 23, 9361-9374 (2003).
  15. Treinin, M. HIF-1 is required for heat acclimation in the nematode Caenorhabditis elegans. Physiological Genomics. 14, 17-24 (2003).
  16. Miller, D. L., Roth, M. B. Hydrogen sulfide increases thermotolerance and lifespan in Caenorhabditis elegans. PNAS. 104, 20618-20622 (2007).
  17. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
  18. Massie, M. R., Lapoczka, E. M., Boggs, K. D., Stine, K. E., White, G. E. Exposure to the metabolic inhibitor sodium azide induces stress protein expression and thermotolerance in the nematode Caenorhabditis elegans. Cell Stress Chaperones. 8, 1-7 (2003).
  19. Salceda, S., Caro, J. Hypoxia-inducible Factor 1α (HIF-1α) Protein Is Rapidly Degraded by the Ubiquitin-Proteasome System under Normoxic Conditions. Journal of Biological Chemistry. 272, 22642-22647 (1997).
  20. Theilacker, J. C., White, M. J. Diffusion of Gases in Air and Its Affect on Oxygen Deficiency Hazard Abatement. AIP Conference Proceedings. 823, 305-312 (2006).
  21. Chua, B., Kao, R. L., Rannels, D. E., Morgan, H. E. Inhibition of protein degradation by anoxia and ischemia in perfused rat hearts. Journal of Biological Chemistry. 254, 6617-6623 (1979).
  22. Probst, G., Riedinger, H. Jr, Martin, P., Engelcke, M., Probst, H. Fast Control of DNA Replication in Response to Hypoxia and to Inhibited Protein Synthesis in CCRF-CEM and HeLa Cells. Biological Chemistry. 380, 1371-1382 (1999).
  23. Semenza, G. L., Sen, C. K. Oxygen Sensing. 381, Academic Press. (2004).
  24. Chan, K., Roth, M. B. Anoxia-Induced Suspended Animation in Budding Yeast as an Experimental Paradigm for Studying Oxygen-Regulated Gene Expression. Eukaryotic Cell. 7, 1795-1808 (2008).
  25. Nystul, T. G., Roth, M. B. Carbon monoxide-induced suspended animation protects against hypoxic damage in Caenorhabditis elegans. PNAS. 101, 9133-9136 (2004).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Komora hipoksycznaprzep yw ci g yst enie tlenukomora rodowiskowanawil anie gazupobieranie pr bektest ywotno ciwizualizacja mikroskopowaodpowied na anoksj

Powiązane artykuły