Method Article

C. elegans (C. elegans) Śledzenie i pomiar behawioralny

DOI:

10.3791/4094

⸱

November 17th, 2012

 ,  ,  , 
1Donnelly Centre, University of Toronto, 2Department of Physics and Astronomy, Vrije Universiteit, 3Okinawa Institute of Science and Technology, 4Department of Physics, University of Toronto

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opracowaliśmy system mikroskopu śledzącego szybkość wideo, który może rejestrować i określać ilościowo zachowanie C. elegans w wysokiej rozdzielczości i z dużą prędkością. Opracowaliśmy również metody obliczeniowe, aby zredukować wymiarowość obrazów robaków do podstawowego zestawu pomiarów, które w pełni opisują kształt robaka.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opracowaliśmy techniki oprzyrządowania, przetwarzania obrazów i analizy danych, aby określić ilościowo zachowanie lokomotoryczne C. elegans, gdy pełza po powierzchni płytki agarowej. Do badania genetycznych, biochemicznych i neuronalnych podstaw zachowania, C. elegans jest organizmem idealnym, ponieważ jest genetycznie podatny, podatny na mikroskopię i wykazuje szereg złożonych zachowań, w tym taksówki, uczenie się i interakcje społeczne1,2. Analiza behawioralna oparta na śledzeniu ruchów robaków pełzających po płytkach agarowych była szczególnie przydatna w badaniu zachowań sensorycznych3, lokomocji4 i ogólnego fenotypowania mutacyjnego5. Nasz system działa poprzez przesuwanie kamery i systemu oświetlenia, gdy robaki pełzają po nieruchomej płytce agarowej, co zapewnia, że żaden bodziec mechaniczny nie jest przenoszony do robaka. Nasz system śledzenia jest łatwy w użyciu i zawiera funkcję półautomatycznej kalibracji. Wyzwaniem dla wszystkich systemów śledzenia wideo jest to, że generują one ogromne ilości danych, które są z natury wielowymiarowe. Nasze programy do przetwarzania obrazów i analizy danych radzą sobie z tym wyzwaniem, redukując kształt robaka do zestawu niezależnych komponentów, które kompleksowo rekonstruują zachowanie robaków w funkcji zaledwie 3-4 wymiarów6,7. Jako przykład procesu pokazujemy, że robak wchodzi i wychodzi ze stanu odwrócenia w sposób specyficzny dla fazy.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Opis mikroskopu śledzącego

  1. Płytka agarowa jest oświetlana przez światłowodowe źródło światła i obrazowana za pomocą kamery. System ten jest montowany na stoliku translacji X,Y.
  2. Stopień poruszany jest za pomocą standardowych silników krokowych, które są połączone ze sterownikiem silnika krokowego.
  3. Kontroler i kamera są podłączone do komputera i sterowane za pomocą niestandardowych programów napisanych w LabVIEW.
  4. Kamera obrazuje powierzchnię płytki agarowej i identyfikuje ciemne obiekty na jasnym tle.
  5. Jakość obrazu jest dostosowywana tak, aby program komputerowy mógł określać ilościowo obiekty w czasie rzeczywistym. Wzmocnienie, jasność i czas otwarcia migawki aparatu można regulować, aby uzyskać ciemny obiekt na białym tle.
  6. Znak kalibracji dla procesu automatycznej kalibracji jest wykonywany poprzez szturchanie powierzchni agaru wykałaczką do robaków.
  7. Można sprawdzić przefiltrowany, binarny obraz, który jest używany przez program śledzący.
  8. Oprogramowanie posiada funkcję automatycznej kalibracji, która oblicza matrycę kalibracji, przesuwając badany obiekt o ustaloną odległość.
  9. Odległości w pikselach są kalibrowane do kroków pokonywanych przez silnik krokowy przez macierz kalibracyjną.
  10. Po kalibracji system jest gotowy do pracy i nie trzeba go ponownie kalibrować, chyba że zmieni się powiększenie lub zmieni się położenie kamery.

2. Przygotowanie płytek tropiących i C. elegans do śledzenia

  1. Miedziany pierścień służy do zagrodzenia robaków i zapobiegania ich migracji na krawędź płyty. Miedź stanowi lokalną barierę chemiczną i nie wpływa na ruch robaka w inny sposób przez cały czas trwania eksperymentu (<1 godzina). Najpierw podgrzej pierścień, umieszczając go na bloku grzewczym lub równoważnym.
  2. Umieść pierścień na świeżej płytce agarowej (1,7% agaru Bacto, 0,25% bakto-peptonu, 0,3% NaCl, 1 mM CaCl2, 1 mMMgSO4, 25 mM buforu fosforanu potasu, 5 μg/ml cholesterolu) i lekko dociśnij, aby osadzić go na powierzchni agaru.
  3. Zbierz robaki w stadium L4 lub młode dorosłe robaki na płytkę agarową wypełnioną buforem NGM (0,3% NaCl, 1 mM CaCl2, 1 mM MgSO4, 25 mM bufor fosforanu potasu), aby umyć je z resztek jedzenia. Pozwól robakom pływać przez kilka minut.
  4. Ostrożnie umieść pojedynczego robaka na płytce śledzącej w pobliżu środka pierścienia. A następnie umieść płytkę na trackerze ślimaków.

3. Śledzenie robaków

  1. Uruchom program LabVIEW i w razie potrzeby wybierz opcje (lokalizacja obrazów, typy obrazów, pomiary, ustawienia kamery).
  2. Za pomocą joysticka przesuwaj mikroskop, aż obraz robaka znajdzie się w polu view (ekran komputera). Naciśnij "śledź", aby włączyć program śledzący.
  3. Program komputerowy faktycznie mierzy ruchy binarnych przefiltrowanych obrazów, jak pokazano, i może dokonywać pomiarów na tym obrazie w czasie rzeczywistym
  4. Po śledzeniu można dokonać rekonstrukcji trajektorii globalnej na podstawie ruchów silnika krokowego, podczas gdy lokalne zmiany kształtu ślimaka można zobaczyć w szczegółach.

4. Analiza danych

  1. Uruchom skrypt szkieletowy (MATLAB), aby sparametryzować kształty robaka. (Rysunek 2)
  2. Obliczanie postaci własnych danych szkieletowych. (Rysunek 3,4)
  3. Pokaż rysunek 5. Odczytaj legendę rysunku lub reprezentatywne wyniki.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przykład: Podczas żerowania, C. elegans przechodzi z ruchu do przodu do tyłu, często wykonując reorientację (obrót omega) przed powrotem do stanu ruchu do przodu. Kwantyfikacja tego przejścia jest ważna dla zrozumienia wzorców ruchu związanych z żerowaniem, a także dla kontroli motorycznej robaka. Moc ujawniania subtelnych szczegółów zachowania lokomocji można zobaczyć za pomocą naszego urządzenia śledzącego.

Jako przykład przyglądamy się przejściu do przodu do tyłu i do tyłu, przech...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badanie lokomocji i naturalnych zachowań wymaga nieinwazyjnych technik śledzenia w połączeniu z technikami redukcji danych. Tutaj zademonstrowaliśmy łatwy w użyciu system śledzenia, który rejestruje szczegółowe obrazy zachowania C. elegans, gdy pełza po powierzchni płytki agarowej. Ilość informacji zawartych w tych obrazach jest ogromna i wielowymiarowa, dlatego opracowaliśmy również metody redukujące wymiarowość danych do zaledwie czterech podstawowych miar. Środki te są kompleksowe i łatwe do zinterpretowania ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Kamera CCDBasler A601f
ObiektywEdmund OpticsSeria
Oświetlenie światłowodoweDolan JennerDC-950H
Stopień translacyjnyDeltronLS3-4
Silnik krokowyUS cyfrowyMS23C
Napęd silnika krokowegoGeckoG201
Sterowanie silnikiem krokowymSimpleStepSSXYZ
MMS<td colspan="4">Dostępny jest cały kod programowania. Wyślij wiadomość e-mail z prośbą do autora korespondencyjnego.

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-79 (1974).
  2. de Bono, M., Maricq, A. V. Neuronal substrates of complex behaviors in C. elegans. Annu. Rev. Neurosci. (28), 451-501 (2005).
  3. Pierce-Shimomura, J. T., Morse, T. M., Lockery, S. R. The fundamental role of pirouettes in Caenorhabditis elegans chemotaxis. J. Neurosci. 19 (21), 9557-9569 (1999).
  4. Gray, J. M., Hill, J. J., Bargmann, C. I. A circuit for navigation in Caenorhabditis elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (9), 3184-3191 (2005).
  5. Baek, J. H., Cosman, P., Feng, Z., Silver, J., Schafer, W. R. Using machine vision to analyze and classify Caenorhabditis elegans behavioral phenotypes quantitatively. J. Neurosci. Methods. 118 (1), 9-21 (2002).
  6. Stephens, G. J., Johnson-Kerner, B., Bialek, W., Ryu, W. S. Dimensionality and Dynamics in the Behavior of C. elegans. PLoS Comput. Biol. 4 (1), e1000028(2008).
  7. Stephens, G. J., Johnson-Kerner, B., Bialek, W., Ryu, W. S. From modes to movement in the behavior of C. elegans. PLoS One. 5 (11), e13914(2010).
  8. Feng, Z., Cronin, C. J., Wittig, J. H. Jr, Sternberg, P. W., Schafer, W. R. An imaging system for standardized quantitative analysis of C. elegans behavior. BMC Bioinformatics. (5), 115(2004).
  9. Ramot, D., Johnson, B. E., Berry, T. L. Jr, Carnell, L., Goodman, M. B. The Parallel Worm Tracker: A Platform for Measuring Average Speed and Drug-Induced Paralysis in Nematodes. PLoS One. 3 (5), e2208(2008).
  10. Swierczek, N. A., Giles, A. C., Rankin, C. H., Kerr, R. A. High-throughput behavioral analysis in C. elegans. Nat. Methods. 8 (7), 592-598 (2011).
  11. Leifer, A. M., Fang-Yen, C., Gershow, M., Alkema, M. J., Samuel, A. D. Optogenetic manipulation of neural activity in freely moving Caenorhabditis elegans. Nat. Methods. 8 (2), 147-152 (2011).
  12. Stirman, J. N., Crane, M. M., Husson, S. J., Wabnig, S., Schultheis, C., Gottschalk, A., Lu, H. Real-time multimodal optical control of neurons and muscles in freely behaving Caenorhabditis elegans. Nat. Methods. 8 (2), 153-158 (2011).
  13. Ben Arous, J., Tanizawa, Y., Rabinowitch, I., Chatenay, D., Schafer, W. R. Automated imaging of neuronal activity in freely behaving Caenorhabditis elegans. J Neurosci Methods. 187 (2), 229-234 (2010).
  14. Wittenburg, N., Baumeister, R. Thermal avoidance in Caenorhabditis elegans: an approach to the study of nociception. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96 (18), 10477-10482 (1999).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

C elegans TrackingWorm TrackerImage ProcessingData AnalysisAgar PlateStepper MotorLabVIEW SoftwareEigen Mode AnalysisBehavioral MeasurementDimensionality Reduction

Related Articles