Opracowaliśmy system mikroskopu śledzącego w czasie rzeczywistym, który umożliwia rejestrację i kwantyfikację zachowania C. elegans z wysoką rozdzielczością i przy dużych prędkościach. Opracowaliśmy również metody obliczeniowe pozwalające na redukcję wymiarowości obrazów nicieni do podstawowego zestawu pomiarów, które w pełni opisują kształt organizmu.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Śledzenie i pomiar zachowania C. elegans
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Opracowaliśmy instrumentację, techniki przetwarzania obrazu oraz analizy danych w celu ilościowego określenia zachowań lokomotorycznych C. elegans podczas pełzania po powierzchni płytki z agarem. C. elegans jest idealnym organizmem do badania genetycznych, biochemicznych i neuronalnych podstaw zachowań, ponieważ jest podatny na manipulacje genetyczne, odpowiedni do badań mikroskopowych i wykazuje szereg złożonych zachowań, w tym taksy, uczenie się oraz interakcje społeczne1,2. Analiza behawioralna oparta na śledzeniu ruchów nicieni pełzających po płytkach z agarem okazała się szczególnie użyteczna w badaniu zachowań sensorycznych3, lokomocji4 oraz ogólnego fenotypowania mutacyjnego5. Nasz system działa poprzez przemieszczanie kamery i układu oświetlenia podczas pełzania nicieni po stacjonarnej płytce z agarem, co gwarantuje, że do organizmu nie jest przekazywany żaden bodziec mechaniczny. Nasz system śledzenia jest łatwy w obsłudze i zawiera funkcję półautomatycznej kalibracji. Wyzwaniem wszystkich systemów śledzenia wideo jest generowanie ogromnej ilości danych, które są immanentnie wielowymiarowe. Nasze programy do przetwarzania obrazu i analizy danych radzą sobie z tym problemem poprzez redukcję kształtu nicienia do zestawu niezależnych komponentów, które kompleksowo rekonstruują zachowanie nicienia jako funkcję zaledwie 3-4 wymiarów6,7. Jako przykład tego procesu wykazujemy, że nicień wchodzi w stan cofania i opuszcza go w sposób specyficzny dla danej fazy.
Protokół
1. Opis mikroskopu śledzącego
- Szalkę z agarem oświetla światłowodowe źródło światła, a obraz jest rejestrowany za pomocą kamery. System ten jest zamontowany na stole translacyjnym X,Y.
- Stół jest przesuwany przez standardowe silniki krokowe, które są podłączone do sterownika silnika krokowego.
- Sterownik i kamera są podłączone do komputera i sterowane za pomocą dedykowanych programów napisanych w LabVIEW.
- Kamera rejestruje obraz powierzchni szalki z agarem i identyfikuje ciemne obiekty na jasnym tle.
- Jakość obrazu jest dostosowana w taki sposób, aby program komputerowy mógł kwantyfikować obiekty w czasie rzeczywis....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Przykład: Podczas żerowania C. elegans przechodzi z ruchu naprzód do ruchu wstecz, często wykonując reorientację (zwrot omega) przed powrotem do stanu ruchu naprzód. Ilościowe określenie tego przejścia jest istotne dla zrozumienia wzorców ruchu podczas żerowania, a także kontroli motorycznej nicienia. Możliwość ujawnienia subtelnych szczegółów zachowań lokomocyjnych można zaobserwować, korzystając z naszego urządzenia śledzącego.
Jako przykład analizujemy przejście z ruchu do przodu n.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Badanie lokomocji i naturalnych zachowań wymaga zastosowania nieinwazyjnych technik śledzenia w połączeniu z metodami redukcji danych. W niniejszej pracy zaprezentowaliśmy łatwy w użyciu system śledzenia, który rejestruje szczegółowe obrazy zachowania C. elegans podczas pełzania po powierzchni płytki z agarem. Ilość informacji zawartych w tych obrazach jest ogromna i wielowymiarowa, dlatego opracowaliśmy również metody redukcji wymiarowości danych do zaledwie czterech podstawowych mierników. Mierniki te są kompl.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Kamera CCD | Basler | A601f | |
| Obiektyw | Edmund Optics | MMS series | |
| Oświetlenie światłowodowe | Dolan Jenner | DC-950H | |
| Stół translacyjny | Deltron | LS3-4 | |
| Silnik krokowy | US digital | MS23C | |
| Sterownik silnika krokowego | Gecko | G201 | |
| Kontroler silnika krokowego | SimpleStep | SSXYZ | |
| Wszystkie kody programistyczne są dostępne. Prosimy o wysłanie wiadomości e-mail z prośbą do autora korespondencyjnego. |
Bibliografia
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-79 (1974).
- de Bono, M., Maricq, A. V. Neuronal substrates of complex behaviors in C. elegans. Annu. Rev. Neurosci. (28), 451-501 (2005).
- Pierce-Shimomura, J. T., Morse, T. M., Lockery, S. R.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
