Opracowaliśmy system mikroskopu śledzącego w czasie rzeczywistym, który umożliwia rejestrację i kwantyfikację zachowania C. elegans z wysoką rozdzielczością i przy dużych prędkościach. Opracowaliśmy również metody obliczeniowe pozwalające na redukcję wymiarowości obrazów nicieni do podstawowego zestawu pomiarów, które w pełni opisują kształt organizmu.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Śledzenie i pomiar zachowania C. elegans
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Opracowaliśmy instrumentację, techniki przetwarzania obrazu oraz analizy danych w celu ilościowego określenia zachowań lokomotorycznych C. elegans podczas pełzania po powierzchni płytki z agarem. C. elegans jest idealnym organizmem do badania genetycznych, biochemicznych i neuronalnych podstaw zachowań, ponieważ jest podatny na manipulacje genetyczne, odpowiedni do badań mikroskopowych i wykazuje szereg złożonych zachowań, w tym taksy, uczenie się oraz interakcje społeczne1,2. Analiza behawioralna oparta na śledzeniu ruchów nicieni pełzających po płytkach z agarem okazała się szczególnie użyteczna w badaniu zachowań sensorycznych3, lokomocji4 oraz ogólnego fenotypowania mutacyjnego5. Nasz system działa poprzez przemieszczanie kamery i układu oświetlenia podczas pełzania nicieni po stacjonarnej płytce z agarem, co gwarantuje, że do organizmu nie jest przekazywany żaden bodziec mechaniczny. Nasz system śledzenia jest łatwy w obsłudze i zawiera funkcję półautomatycznej kalibracji. Wyzwaniem wszystkich systemów śledzenia wideo jest generowanie ogromnej ilości danych, które są immanentnie wielowymiarowe. Nasze programy do przetwarzania obrazu i analizy danych radzą sobie z tym problemem poprzez redukcję kształtu nicienia do zestawu niezależnych komponentów, które kompleksowo rekonstruują zachowanie nicienia jako funkcję zaledwie 3-4 wymiarów6,7. Jako przykład tego procesu wykazujemy, że nicień wchodzi w stan cofania i opuszcza go w sposób specyficzny dla danej fazy.
Protokół
1. Opis mikroskopu śledzącego
- Szalkę z agarem oświetla światłowodowe źródło światła, a obraz jest rejestrowany za pomocą kamery. System ten jest zamontowany na stole translacyjnym X,Y.
- Stół jest przesuwany przez standardowe silniki krokowe, które są podłączone do sterownika silnika krokowego.
- Sterownik i kamera są podłączone do komputera i sterowane za pomocą dedykowanych programów napisanych w LabVIEW.
- Kamera rejestruje obraz powierzchni szalki z agarem i identyfikuje ciemne obiekty na jasnym tle.
- Jakość obrazu jest dostosowana w taki sposób, aby program komputerowy mógł kwantyfikować obiekty w czasie rzeczywistym. Można regulować wzmocnienie, jasność i czas naświetlania kamery, aby uzyskać ciemny obiekt na białym tle.
- Znacznik do procesu automatycznej kalibracji wykonuje się poprzez nakłucie powierzchni agaru igłą do robaków.
- Można sprawdzić przefiltrowany obraz binarny, który jest wykorzystywany przez program śledzący.
- Oprogramowanie posiada funkcję autokalibracji, która oblicza macierz kalibracyjną poprzez przesunięcie obiektu testowego o stałą odległość.
- Odległości w pikselach są kalibrowane względem kroków silnika krokowego za pomocą macierzy kalibracyjnej.
- Po kalibracji system jest gotowy do pracy i nie wymaga ponownej kalibracji, chyba że zmieniono powiększenie lub zmieniono położenie kamery.
2. Przygotowanie płytek do śledzenia oraz C. elegans do śledzenia
- Miedziany pierścień służy do ograniczania obszaru przebywania nicieni i zapobiega ich migracji do krawędzi płytki. Miedź tworzy lokalną barierę chemiczną i nie wpływa w inny sposób na ruch nicieni w czasie trwania eksperymentu (<1 hr). Najpierw podgrzej pierścień, umieszczając go na bloku grzejnym lub urządzeniu o podobnym działaniu.
- Umieść pierścień na świeżej płytce z agarem (1,7% Bacto Agar, 0,25% Bacto-Peptone, 0,3% NaCl, 1 mM CaCl2, 1 mM MgSO4, 25 mM bufor fosforanowy potasu, 5 μg/ml cholesterolu) i lekko dociśnij, aby osadzić go w powierzchni agaru.
- Przenieś nicienie w stadium L4 lub młode osobniki dorosłe na płytkę z agarem wypełnioną buforem NGM (0,3% NaCl, 1 mM CaCl2, 1 mM MgSO4, 25 mM bufor fosforanowy potasu), aby oczyścić je z pozostałości pokarmu. Pozostaw nicienie w roztworze na kilka minut.
- Ostrożnie umieść pojedynczego nicienia na płytce do śledzenia, w pobliżu środka pierścienia. Następnie umieść płytkę w urządzeniu do śledzenia ruchu nicieni.
3. Śledzenie nicieni
- Uruchom program LabVIEW i w razie potrzeby wybierz opcje (lokalizację obrazów, typy obrazów, pomiary, ustawienia kamery).
- Za pomocą dżojstika przesuń mikroskop, aż obraz nicienia znajdzie się w polu widzenia (na ekranie komputera). Naciśnij przycisk „track”, aby uruchomić program śledzenia.
- Program komputerowy mierzy ruchy na podstawie obrazów z filtrem binarnym, zgodnie z prezentacją, i może wykonywać pomiary na tym obrazie w czasie rzeczywistym.
- Po zakończeniu śledzenia, na podstawie ruchów silników krokowych, można stworzyć rekonstrukcję trajektorii globalnej, natomiast lokalne zmiany kształtu nicienia można analizować w szczegółach.
4. Analiza danych
- Uruchom skrypt do szkieletyzacji (MATLAB), aby sparametryzować kształty nicieni. (Rycina 2)
- Oblicz mody własne ze szkieletyzowanych danych. (Rycina 3,4)
- Wyświetl Rycynę 5. Zapoznaj się z legendą rysunku lub reprezentatywnymi wynikami.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Przykład: Podczas żerowania C. elegans przechodzi z ruchu naprzód do ruchu wstecz, często wykonując reorientację (zwrot omega) przed powrotem do stanu ruchu naprzód. Ilościowe określenie tego przejścia jest istotne dla zrozumienia wzorców ruchu podczas żerowania, a także kontroli motorycznej nicienia. Możliwość ujawnienia subtelnych szczegółów zachowań lokomocyjnych można zaobserwować, korzystając z naszego urządzenia śledzącego.
Jako przykład analizujemy przejście z ruchu do przodu n...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Badanie lokomocji i naturalnych zachowań wymaga zastosowania nieinwazyjnych technik śledzenia w połączeniu z metodami redukcji danych. W niniejszej pracy zaprezentowaliśmy łatwy w użyciu system śledzenia, który rejestruje szczegółowe obrazy zachowania C. elegans podczas pełzania po powierzchni płytki z agarem. Ilość informacji zawartych w tych obrazach jest ogromna i wielowymiarowa, dlatego opracowaliśmy również metody redukcji wymiarowości danych do zaledwie czterech podstawowych mierników. Mierniki te są kompl...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Kamera CCD | Basler | A601f | |
| Obiektyw | Edmund Optics | MMS series | |
| Oświetlenie światłowodowe | Dolan Jenner | DC-950H | |
| Stół translacyjny | Deltron | LS3-4 | |
| Silnik krokowy | US digital | MS23C | |
| Sterownik silnika krokowego | Gecko | G201 | |
| Kontroler silnika krokowego | SimpleStep | SSXYZ | |
| Wszystkie kody programistyczne są dostępne. Prosimy o wysłanie wiadomości e-mail z prośbą do autora korespondencyjnego. |
Bibliografia
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-79 (1974).
- de Bono, M., Maricq, A. V. Neuronal substrates of complex behaviors in C. elegans. Annu. Rev. Neurosci. (28), 451-501 (2005).
- Pierce-Shimomura, J. T., Morse, T. M., Lockery, S. R. The fundamental role of pirouettes in Caenorhabditis elegans chemotaxis. J. Neurosci. 19 (21), 9557-9569 (1999).
- Gray, J. M., Hill, J. J., Bargmann, C. I. A circuit for navigation in Caenorhabditis elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (9), 3184-3191 (2005).
- Baek, J. H., Cosman, P., Feng, Z., Silver, J., Schafer, W. R. Using machine vision to analyze and classify Caenorhabditis elegans behavioral phenotypes quantitatively. J. Neurosci. Methods. 118 (1), 9-21 (2002).
- Stephens, G. J., Johnson-Kerner, B., Bialek, W., Ryu, W. S. Dimensionality and Dynamics in the Behavior of C. elegans. PLoS Comput. Biol. 4 (1), e1000028(2008).
- Stephens, G. J., Johnson-Kerner, B., Bialek, W., Ryu, W. S. From modes to movement in the behavior of C. elegans. PLoS One. 5 (11), e13914(2010).
- Feng, Z., Cronin, C. J., Wittig, J. H. Jr, Sternberg, P. W., Schafer, W. R. An imaging system for standardized quantitative analysis of C. elegans behavior. BMC Bioinformatics. (5), 115(2004).
- Ramot, D., Johnson, B. E., Berry, T. L. Jr, Carnell, L., Goodman, M. B. The Parallel Worm Tracker: A Platform for Measuring Average Speed and Drug-Induced Paralysis in Nematodes. PLoS One. 3 (5), e2208(2008).
- Swierczek, N. A., Giles, A. C., Rankin, C. H., Kerr, R. A. High-throughput behavioral analysis in C. elegans. Nat. Methods. 8 (7), 592-598 (2011).
- Leifer, A. M., Fang-Yen, C., Gershow, M., Alkema, M. J., Samuel, A. D. Optogenetic manipulation of neural activity in freely moving Caenorhabditis elegans. Nat. Methods. 8 (2), 147-152 (2011).
- Stirman, J. N., Crane, M. M., Husson, S. J., Wabnig, S., Schultheis, C., Gottschalk, A., Lu, H. Real-time multimodal optical control of neurons and muscles in freely behaving Caenorhabditis elegans. Nat. Methods. 8 (2), 153-158 (2011).
- Ben Arous, J., Tanizawa, Y., Rabinowitch, I., Chatenay, D., Schafer, W. R. Automated imaging of neuronal activity in freely behaving Caenorhabditis elegans. J Neurosci Methods. 187 (2), 229-234 (2010).
- Wittenburg, N., Baumeister, R. Thermal avoidance in Caenorhabditis elegans: an approach to the study of nociception. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96 (18), 10477-10482 (1999).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
