Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Wysokoprzepustowa mikroenkapsulacja pojedynczych komórek i wielu komórek

18K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/4096

⸱

15 czerwca 2012

 , 
1Department of Mechanical Engineering, Vanderbilt University

W tym artykule

Podsumowanie

Łącząc generowanie monodyspersyjnych kropli z inercyjnym porządkowaniem komórek i cząsteczek, opisujemy metodę enkapsulacji pożądanej liczby komórek lub cząsteczek w pojedynczej kropli z częstotliwością rzędu kHz. Wykazujemy wydajność dwukrotnie przekraczającą wydajność enkapsulacji nieuporządkowanej w przypadku kropli z jedną lub dwiema cząsteczkami.

Streszczenie

Metody enkapsulacji mikrofluidycznej były wcześniej wykorzystywane do przechwytywania komórek w wodnych, monodyspersyjnych kroplach o skali pikolitra, zapewniając izolację od środowiska cieczy objętościowej, z zastosowaniami w wysokoprzepustowym przesiewaniu, cytometrii i spektrometrii mas. Opisujemy metodę, która pozwala nie tylko na enkapsulację pojedynczych komórek, ale także na powtarzalne przechwytywanie określonej liczby komórek (w niniejszej pracy demonstrujemy enkapsulację jednej i dwóch komórek), aby badać zarówno izolację, jak i interakcje między komórkami w grupach o kontrolowanych rozmiarach. Poprzez połączenie technik generowania kropli z uporządkowaniem komórek i cząstek, demonstrujemy kontrolowaną enkapsulację cząstek o rozmiarach komórek w celu uzyskania wydajnej, ciągłej enkapsulacji. Wykorzystując wodną zawiesinę cząstek i niemieszalny olej fluorowęglowy, generujemy krople wodne w oleju za pomocą dyszy skupiającej przepływ. Natężenie przepływu fazy wodnej jest wystarczająco wysokie, aby stworzyć uporządkowanie cząstek, które docierają do dyszy z częstotliwościami będącymi wielokrotnościami całkowitymi częstotliwości generowania kropli, co pozwala na enkapsulację kontrolowanej liczby komórek w każdej kropli. W celu uzyskania reprezentatywnych wyników, jako zamienniki komórek wykorzystano cząstki polistyrenu o rozmiarze 9,9 μm. Badanie to wykazuje wydajność enkapsulacji pojedynczych cząstek Pk=1 na poziomie 83,7% oraz wydajność enkapsulacji podwójnych cząstek Pk=2 na poziomie 79,5%, w porównaniu do ich odpowiednich wydajności Poissona wynoszących odpowiednio 39,3% i 33,3%. Wykazano, że efekt stałego stężenia komórek i cząstek ma kluczowe znaczenie dla wydajnej enkapsulacji; omówiono również przejścia z trybu kroplowania do trybu strumieniowania.

Wstęp

Ciągłe zawiesiny komórek w środowisku wodnym dzielą wspólne środowisko płynne, co umożliwia równoległe oddziaływanie komórek oraz homogenizuje wpływ poszczególnych komórek na pomiary z medium. Wysokoprzepustowa enkapsulacja komórek w kroplach o skali pikolitrowej ogranicza próbki, chroniąc krople przed kontaminacją krzyżową, umożliwiając pomiar różnorodności komórkowej w obrębie próbek, zapobiegając rozcieńczaniu reagentów i ekspresjonowanych biomarkerów oraz wzmacniając sygnały z produktów bioreaktora. Krople zapewniają również możliwość ponownego łączenia kropel w większe próbki wodne lub z innymi kroplami w celu badania sygnalizacji międzykomórkowej.1,2 Zmniejszenie rozcieńczenia oznacza silniejsze sygnały detekcji dla pomiarów o wyższej dokładności, a także możliwość ograniczenia potencjalnie kosztownych objętości próbek i reagentów.3 Enkapsulację komórek w kroplach wykorzystywano w celu poprawy detekcji ekspresji białek,4 przeciwciał,5,6 enzymów,7 oraz aktywności metabolicznej8 w badaniach wysokoprzepustowych; może ona również służyć do usprawnienia wysokoprzepustowej cytometrii.9 Dodatkowe badania przedstawiają zastosowania w bio-elektrosprayingu kropel zawierających komórki dla spektrometrii mas10 oraz w ukierunkowanych powłokach komórkowych powierzchni.11 Niektóre zastosowania były jednak ograniczone przez brak możliwości kontrolowania liczby komórek enkapsulowanych w kroplach. Przedstawiamy tutaj metodę uporządkowanej enkapsulacji12, która zwiększa wykazaną wydajność enkapsulacji dla jednej i dwóch komórek i może zostać ekstrapolowana na enkapsulację większej liczby komórek.

Aby uzyskać monodyspersyjną generację kropli, mikrofluidyczne „ogniskowanie przepływu” (flow focusing) umożliwia tworzenie kropli o kontrolowanej wielkości jednego płynu (wodnej mieszaniny komórek) wewnątrz innego (ciągłej fazy olejowej) przy użyciu dyszy, w której strumienie zbiegają się.13 Dla danej geometrii dyszy częstotliwość generowania kropli f oraz ich rozmiar można zmieniać poprzez regulację przepływów fazy olejowej i wodnej Qoil oraz Qaq. Wraz ze wzrostem szybkości przepływu może nastąpić przejście z generowania kropli do niestabilnego strumieniowania cieczy wodnej z dyszy.14

Gdy roztwór wodny zawiera zawieszone cząsteczki, zostają one zamknięte w kropelkach i odizolowane od siebie na dyszy. W przypadku generowania kropelek z losowo rozłożonej wodnej zawiesiny komórek, średnia frakcja kropelek Dk zawierających k komórek jest określana przez statystykę Poissona, gdzie Dk = λk exp(-λ)/(k!) oraz λ jest średnią liczbą komórek na kropelkę. Frakcja komórek, które trafią do „poprawnie” zamkniętych kropelek, jest obliczana za pomocą wzoru Pk = (k x Dk)/Σ(k' x Dk'). Subtelna różnica między tymi dwoma miernikami polega na tym, że Dk odnosi się do wykorzystania cieczy wodnej i ilości sortowania kropelek, które musi zostać przeprowadzone po enkapsulacji, natomiast Pk odnosi się do wykorzystania próbki komórek. Przykładowo, można użyć rozcieńczonej zawiesiny komórek (niskie λ), aby tworzyć kropelki, w których większość kropelek zawierających komórki posiadałaby tylko jedną komórkę. Choć wskaźnik wydajności Pk byłby wysoki, większość kropelek byłaby pusta (niskie Dk), co wymagałoby zastosowania mechanizmu sortującego w celu usunięcia pustych kropelek, co z kolei obniżałoby przepustowość.15

Połączenie generowania kropel z uporządkowaniem bezwładnościowym umożliwia enkapsulację kropel z bardziej przewidywalną liczbą komórek na kroplę oraz wyższą przepustowością niż w przypadku enkapsulacji losowej. Fokuzowanie bezwładnościowe zostało po raz pierwszy odkryte przez Segre i Silberberga16 i odnosi się do tendencji cząstek o skończonej wielkości do migrowania do bocznych pozycji równowagi w przepływie w kanale. Uporządkowanie bezwładnościowe odnosi się do tendencji cząstek i komórek do pasywnej organizacji w równomiernie rozstawione, przesunięte, pociągi o stałej prędkości. Zarówno fokuzowanie, jak i uporządkowanie wymagają wystarczająco wysokich szybkości przepływu (wysoka liczba Reynoldsa) oraz rozmiarów cząstek (wysoka liczba Reynoldsa dla cząstek).17,18 Tutaj liczba Reynoldsa Re =uDh/ν oraz liczba Reynoldsa dla cząstek Rep =Re(a/Dh)2, gdzie u jest charakterystyczną prędkością przepływu, Dh [=2wh/(w+h)] jest średnicą hydrauliczną, ν jest lepkością kinematyczną, a to średnica cząstki, w to szerokość kanału, a h to wysokość kanału. Empirycznie długość wymagana do uzyskania w pełni uporządkowanych pociągów maleje wraz ze wzrostem Re i Rep. Należy zauważyć, że wysokie wymagania dotyczące Re i Rep (w niniejszym badaniu odpowiednio rzędu 5 i 0,5) mogą kolidować z potrzebą utrzymania niskich szybkości przepływu fazy wodnej, aby uniknąć przejścia w tryb strumieniowy przy dyszy generującej krople. Ponadto wysokie szybkości przepływu prowadzą do wyższych naprężeń ścinających działających na komórki, czego nie omówiono w niniejszym protokole. Poprzednie badanie nad uporządkowaną enkapsulacją wykazało, że ponad 90% pojedynczo enkapsulowanych komórek HL60 w warunkach przepływu podobnych do tych w niniejszym badaniu zachowało integralność błony komórkowej.12 Jednak wpływ wartości i skal czasowych naprężeń ścinających będzie musiał zostać starannie rozważony przy ekstrapolacji na inne typy komórek i parametry przepływu. Nakładanie się ograniczeń szybkości przepływu fazy wodnej dla uporządkowania komórek, generowania kropel i żywotności komórek zapewnia idealny reżim operacyjny dla kontrolowanej enkapsulacji pojedynczych i wielu komórek.

Ponieważ bardzo niewiele badań dotyczy odstępów między rzędami cząstek,19,20 określenie tych odstępów najłatwiej przeprowadzić empirycznie, a wynik będzie zależał od geometrii kanału, szybkości przepływu, wielkości cząstek i ich stężenia. Niemniej jednak równomierne odstępy boczne między rzędami oznaczają, że komórki docierają w przewidywalnych, stałych odstępach czasu. Gdy generowanie kropel odbywa się z taką samą częstotliwością, z jaką uporządkowane komórki docierają do dyszy, komórki zostają zamknięte w kropli w sposób kontrolowany. Technika ta została wykorzystana do enkapsulacji pojedynczych komórek z wydajnością rzędu 15 kHz,12 co stanowi znaczną poprawę w stosunku do wcześniejszych badań, w których zgłaszano szybkości enkapsulacji rzędu 60-160 Hz.4,15 W badaniach nad kontrolowaną enkapsulacją ponad 80% kropel zawierało dokładnie jedną komórkę, co stanowi znaczną poprawę wydajności w porównaniu ze statystyką Poissona (losową), która przewiduje średnią wydajność poniżej 40%.12

W poprzednich badaniach nad kontrolowaną enkapsulacją,12 średnia liczba cząstek na kroplę λ była dostrajana w celu zapewnienia enkapsulacji pojedynczych komórek. Hipotezyzujemy, że poprzez regulację szybkości przepływu możemy efektywnie enkapsulować dowolną liczbę komórek na kroplę, gdy λ jest równa lub bliska pożądanej liczbie komórek na kroplę. Podczas gdy enkapsulacja pojedynczych komórek jest cenna przy określaniu indywidualnych reakcji komórkowych na bodźce, enkapsulacja wielu komórek dostarcza informacji dotyczących interakcji kontrolowanej liczby i rodzajów komórek. Przedstawiamy tutaj protokół, reprezentatywne wyniki z wykorzystaniem mikrosfer polistyrenowych oraz dyskusję dotyczącą kontrolowanej enkapsulacji wielu komórek przy użyciu pasywnego kanału uporządkowania inercyjnego i dyszy do generowania kropli.

Protokół

Protokoły w tej sekcji opisują materiały i sprzęt wykorzystane konkretnie w celu uzyskania przedstawionych wyników eksperymentalnych. Należy pamiętać, że można zastosować alternatywnych dostawców odczynników i sprzętu.

1. Wytwarzanie urządzenia i miękka litografia

Do stworzenia sieci mikrokanałów z polidimetylosiloksanu (PDMS) przytwierdzonych do szklanych podłoży wykorzystano standardowe techniki miękkiej litografii,21 z których wiele zostało opisanych w poprzednich artykułach JOVE.22 Poza wykonaniem formy matrycowej za pomocą fotolitografii SU-8, procesy te można przeprowadzać poza pomieszczeniem typu clean room lub dygestorium z laminarnym przepływem powietrza; należy jednak dążyć do zminimalizowania ilości kurzu i cząsteczek, aby uzyskać powtarzalne wyniki.

  1. Zaprojektuj wzór mikrokanałów zgodnie z Rysunkiem 1 w programie AutoCAD (AutoDesk Inc.). Skorzystaj z usług zewnętrznego producenta (Fineline Imaging Inc.) w celu wydrukowania maski transparentnej o wysokiej rozdzielczości (50 000 dpi) na folii Mylar lub kwarcie, gdzie kanały są przezroczyste na ciemnym tle.
  2. Stwórz matrycę z krzemu i fotorezystu SU-8 do odlewania replikacyjnego. W skrócie: nałóż fotorezyst negatywowy SU-8 2050 (MicroChem) za pomocą wirówki, stosując prędkość obrotową zalecaną przez producenta, aby uzyskać warstwę o grubości 52 μm na czystym waflu krzemowym o średnicy 7,5 cm lub 10 cm. Po wstępnym wygrzewaniu (soft bake), usunięciu krawędziowej obręczy (edge bead removal), naświetlaniu UV przez maskę kontaktową, wygrzewaniu po naświetlaniu (post-exposure bake), wywoływaniu i naświetlaniu całości (flood exposure), zmierz rzeczywistą grubość warstwy SU-8 za pomocą profilometru Dektak (Veeco). Przyklej matrycę do dna szalki Petriego o średnicy 4" lub 5", aby przygotować ją do odlewania replikacyjnego z PDMS.
  3. Wymieszaj bazę elastomeru PDMS z utwardzaczem elastomerowym (Dow Corning) w stosunku masowym 10:1 (baza do utwardzacza). Wlej dobrze wymieszany prekursor PDMS na matrycę krzemową, aby utworzyć warstwę o końcowej grubości 2-3 mm. Mieszanina 20 g bazy elastomerowej i 2 g utwardzacza jest wystarczająca do pokrycia powierzchni o średnicy 4".
  4. Umieść matrycę i PDMS w desykatorze próżniowym (Jencons), aby odgazować nieutwardzony PDMS. Używając regulatora ciśnienia (Cole Parmer), powoli zmniejszaj ciśnienie manometryczne w komorze od 0" Hg do -27" Hg w ciągu 20 minut, aby uniknąć nadmiernego pienienia. Pozostaw urządzenie w komorze próżniowej przy ciśnieniu -27" Hg przez 30 minut lub do momentu zniknięcia pęcherzyków powietrza.
  5. Zwolnij próżnię i przenieś matrycę oraz PDMS do piekarnika o temperaturze 65 °C (Thermo Scientific) na minimum cztery godziny. Urządzenie można pozostawić w piekarniku na noc w celu poprawy procesu utwardzania.
  6. Wyjmij urządzenie z piekarnika i pozwól mu ostygnąć. Ostrożnie wytnij PDMS wokół okrągłego wafla za pomocą precyzyjnego noża i odklej PDMS. Wytnij obrys urządzenia zgodnie z Rysunkiem 1 za pomocą skalpela.
  7. Wykonej otwory portów płynowych (trzy na urządzenie) w trzech okrągłych obszarach pokazanych na Rysunku 1 za pomocą wycinaka do biopsji. Dla tego urządzenia użyj wycinaka o średnicy zewnętrznej 0,75 mm (Harris).
  8. Przyklej taśmę klejącą do wzorowanej strony PDMS i odklej ją, aby usunąć kurz. Jako tanią, lecz skuteczną alternatywę dla konwencjonalnych aparatów do plazmy tlenowej,21,22 poddaj obróbce plazmowej wzorowaną stronę PDMS oraz czyste szkiełko mikroskopowe o wymiarach 3" x 1" za pomocą przenośnego laboratoryjnego urządzenia do traktowania koronowego (Electro-Technic Products Inc.).23 Należy pamiętać, że urządzenie to powinno być używane w wyciągu lub w dobrze wentylowanym pomieszczeniu ze względu na emisję ozonu, a wszystkie zegarki i telefony komórkowe powinny znajdować się w odległości co najmniej dziesięciu stóp. Dostosuj wyładowanie koronowe, aby uzyskać stabilną koronę z minimalnym iskrzeniem. Powoli przesuwaj elektrodę około 1/4" nad każdą powierzchnią przez około 20 sekund, a następnie natychmiast zetknij potraktowane powierzchnie, aby utworzyć silne, trwałe wiązanie, zanim powierzchnie PDMS powrócą do stanu pierwotnego.
  9. Umieść urządzenie na metalowej płycie, włóż do chłodnego piekarnika, ustaw temperaturę na 120 °C i wypiecz przez noc, aby zakończyć proces wiązania i przywrócić PDMS do jego pierwotnego stanu hydrofobowego.24 Podczas tego wysokotemperaturowego wypiekania szklana powierzchnia kanału również stanie się hydrofobowa dzięki osadzeniu cienkiej warstwy hydrofobowej na szkle. Alternatywnie, powłoki hydrofobowe, takie jak Aquapel (PPG Industries), można wstrzyknąć do portów płynowych za pomocą strzykawki 1 mL i igły.12 Ostrożnie, ale stanowczo wstrzyknij Aquapel, a następnie przedmuchaj porty płynowe powietrzem, nie niszcząc wiązania PDMS ze szkłem. Intensywnie powtórz przedmuchiwanie powietrzem we wszystkich portach wlotowych i wylotowych, wycierając nadmiar Aquapelu, aby uniknąć osadów, które mogłyby zapchać kanały po wyschnięciu.

2. Przygotowanie próbek

  1. Przygotować hodowlę komórkową zgodnie z uznanymi procedurami dla wybranego typu komórek. Dla urządzenia zastosowanego w niniejszym badaniu cząstki lub komórki o rozmiarze 8-15 μm powinny być odpowiednie do uporządkowanej enkapsulacji. Mniejsze lub większe typy komórek mogą wymagać zmiany wymiarów kanału ogniskującego w celu uzyskania odpowiedniej wartości Rep. W celu zaprezentowania wyników metody opisanej w niniejszej pracy, jako zamienniki komórek wykorzystano polistyrenowe mikrosfery o średnicy 9,9 μm (G1000, Thermo Scientific).
  2. Przygotować wodną zawiesinę cząstek lub komórek poprzez delikatne mieszanie. W przypadku stosowania komórek lub cząstek polistyrenowych kluczowa jest kontrola stężenia (patrz. Rysunek 4) w celu uzyskania idealnej, uporządkowanej enkapsulacji. Kierując się wcześniejszymi danymi12, obliczyć pożądaną koncentrację komórek lub cząstek na podstawie uporządkowanego odstępu w szeregu i rozmiaru mikrokanału według wzoru: jedna komórka lub cząstka na przewidywany podłużny odstęp w szeregu pomnożone przez pole przekroju poprzecznego kanału ogniskującego. Jeśli stężenie roztworu gęstego (1% w/w) jest niewystarczające, zwiększyć stężenie (tutaj do 1,5% w/w) poprzez delikatne odwirowanie próbki, usunięcie nadsączu i ponowne zawieszenie cząstek za pomocą mieszadła Vortex lub delikatniejszego mieszania w przypadku komórek. Przygotować odpowiednią objętość, uwzględniając pożądaną objętość zbieranego materiału oraz czas trwania procesu związany z dostrajaniem przepływu.
  3. Zarówno komórki, jak i cząstki polistyrenowe mają gęstość względną większą od jeden. Chociaż nie zostało to wykazane w niniejszym protokole, w przypadku długotrwałych eksperymentów trwających od wielu minut do wielu godzin, należy dopasować wyporność roztworu poprzez dodanie substancji rozpuszczonej, takiej jak CaCl2 dla cząstek lub OptiPrep (Sigma-Aldrich) dla komórek.
  4. Przygotować 10 mL próbki ciągłej fazy olejowej fluorowęglowej poprzez zmieszanie oleju fluorowęglowego FC-40 (3M) i surfaktanta z kopolimeru blokowego PFPE-PEG25 (2,5% w/w) (RainDance Technologies) w probówce wirówkowej o pojemności 15 mL. Alternatywnie można zastosować lekki olej mineralny (PTI Process Chemicals) z surfaktantem ABIL-EM 90 (2,5% w/w) (Evonik Goldschmidt Corporation).

3. Układ eksperymentalny

  1. Włącz odwrócony mikroskop optyczny (Axio Observer, Zeiss) oraz szybką kamerę (Phantom V310, Vision Research). Skup obraz i sprawdź kanały pod kątem zapchów i zanieczyszczeń, przesuwając urządzenie ręcznie lub za pomocą zmotoryzowanego stolika mikroskopowego. Niektóre drobne zanieczyszczenia mogą zostać wypchnięte podczas przepływu cieczy. W przypadku dużych zanieczyszczeń lub wyraźnych zapchów wybierz inny kanał w urządzeniu, ponieważ zanieczyszczenia w kanale ogniskowania mogą znacznie pogorszyć jakość uporządkowania. Należy pamiętać, że zapchowania można często usunąć podczas przepływu, mocno naciskając tępą pęsetą na powierzchnię PDMS nad obszarem zapchania.
  2. Odetnij trzy odcinki rurki PVC (ID 0,01"/OD 0,03", Tygon) dla wlotu wodnego, wlotu olejowego oraz wylotu emulsji. Aby zminimalizować objętość martwą, odetnij tylko tyle rurki, by sięgała od pomp strzykawkowych do stolika mikroskopu. Końce rurek odetnij pod kątem 45°, aby ułatwić ich włożenie do portów płynowych.
  3. Za pomocą pęsety wciśnij końce rurek w porty płynowe wykonane w kroku 1, a następnie wciśnij dwie tępne igły strzykawkowe ze stali nierdzewnej o rozmiarze 30 gauge (SmallParts) w wolne końce odpowiednich rurek wlotowych wodnej i olejowej (klej nie jest wymagany). Umieść rurkę wylotową w zbiorniku na odpady. Rurka ta zostanie później przeniesiona do zbiornika do zbierania.
  4. Przenieś urządzenie wraz z podłączonymi rurkami na stolik mikroskopu, wyrównaj i ustaw ostrość na dyszy urządzenia, używając dostępnego obiektywu (w tym eksperymencie użyto 20x). Dostosuj oświetlenie Köhlera oraz inne ustawienia mikroskopu zgodnie z wymaganiami dla optymalnego nagrywania.
  5. Napełnij strzykawkę 1 mL (BD) dobrze wymieszaną fazą wodną, a strzykawkę 3 mL (BD) roztworem fazy olejowej przygotowanym w kroku 2. Należy pamiętać, że można użyć strzykawek o dowolnej objętości, które należy starannie dobrać w zależności od pożądanych czasów pracy i chęci zminimalizowania pulsacji. Przechyl jedną strzykawkę pionowo i potrząśnij nią, aby przenieść pęcherzyki powietrza do wylotu strzykawki. Powoli wciśnij tłok na tyle, aby wypchnąć powietrze do końcówki strzykawki. Trzymając strzykawkę pionowo, połącz ją z odpowiednią igłą strzykawkową już przymocowaną do urządzenia w kroku 3.3. Wciśnij tłok, aby przepchnąć powietrze przez objętość martwą igły, aż ciecz zostanie wypchnięta przez rurkę prawie do samego urządzenia. Solidnie zamocuj strzykawkę do pompy strzykawkowej (Nexus 3000, Chemyx) i zablokuj tłok. Powtórz połączenia dla drugiej strzykawki i zamocuj ją do drugiej pompy strzykawkowej.
  6. Włącz każdą pompę strzykawkową i zaprogramuj ją zgodnie z protokołami producenta pompy. Ustaw początkowe przepływy na Qoil = 50 μL/min dla fazy olejowej i Qaq = 5 μL/min dla fazy wodnej. Uruchom pompy.
  7. Odczekaj, aż każda ciecz wpłynie do urządzenia i wypełni kanały, wypychając pozostałe powietrze. Może to zająć kilka minut. Jeśli w rurkach wlotowych znajduje się duża ilość powietrza, tymczasowo zwiększ każdy przepływ, aż powietrze zostanie usunięte. Nie zwiększaj przepływów zbyt mocno, aby nie powstało w kanale wysokie ciśnienie, co mogłoby doprowadzić do przerwania wiązania PDMS ze szkłem.
  8. Przy początkowych przepływach obserwuj tworzenie się kropel na dyszy (wyniki pokazane tutaj: powiększenie 20x, częstotliwość klatek 21005 fps, czas ekspozycji 3 μs). Jeśli to możliwe, ogranicz pole widzenia kamery tylko do dyszy, aby zmaksymalizować liczbę klatek na sekundę i zmniejszyć wymagania dotyczące pamięci. Nagraj próbne filmy i potwierdź, że częstotliwość próbkowania jest wystarczająca, aby uniknąć aliasingu.
  9. Aby uniknąć tworzenia się strumienia (patrz Rycina 2), zacznij od niskich przepływów fazy wodnej. Powoli zwiększaj przepływ fazy wodnej, aby obserwować uporządkowanie cząstek w długim kanale roztworu wodnego wraz ze wzrostem przepływu.
  10. Jeśli stężenie cząstek jest zbyt niskie, aby uzyskać ciągi z relatywnie niewielką liczbą „brakujących” cząstek, a próbka nie była dopasowana pod względem wyporności, fizycznie przechyl pompę strzykawkową w stronę wylotu strzykawki, aby umożliwić stopniowe osiadanie cząstek w kierunku wylotu. Metoda ta jest zademonstrowana w protokole wideo. Okresowe obracanie strzykawki wokół jej osi może również zmniejszyć niepożądane osiadanie.
  11. Po uzyskaniu odpowiedniego uporządkowania dostosuj przepływ oleju, aby nastroić częstotliwość generowania i rozmiar kropel. Średnią objętość kropli można obliczyć, dzieląc przepływ fazy wodnej przez częstotliwość generowania kropel zmierzoną podczas nagrywania wideo. Iteracyjnie dostosuj oba przepływy, aby osiągnąć pożądane wskaźniki enkapsulacji i objętości kropel.
  12. Po potwierdzeniu stabilnej, uporządkowanej enkapsulacji przenieś rurkę wylotową ze zbiornika na odpady do zbiornika do zbierania lub wprowadź ją do innego urządzenia w celu dalszych testów.
  13. Wyznacz czas zbierania na podstawie pożądanej liczby kropli i obliczonej częstotliwości generowania.
  14. Zapisz frakcję kropel zawierających 0, 1, 2,…, N cząstek, aby określić wydajność, korzystając z wyników wideo generowania kropel lub poprzez pobranie próbki zebranej emulsji za pomocą pipety w celu inspekcji.

4. Reprezentatywne wyniki

Przedstawiono wyniki uzyskania zarówno kontrolowanej enkapsulacji pojedynczych cząstek, jak i kontrolowanej enkapsulacji podwójnych cząstek (Rysunek 3). Poprzez zmniejszenie dwukrotne szybkości przepływu oleju FC-40, enkapsulacja pojedynczych cząstek zmienia się w enkapsulację dwóch cząstek. Z drugiej strony, można było zwiększyć szybkość przepływu fazy wodnej, aby szybciej dostarczać cząstki do dyszy, jednak zwiększyłoby to ryzyko powstania strumienia wodnego w formie jetu. Histogramy na Rysunku 3 przedstawiają ułamkową liczbę cząstek na kropelkę dla obu przypadków, wraz z porównaniem do statystyki Poissona. Sporadyczne występowanie kropelek bez cząstek wynika przede wszystkim z „brakujących” cząstek w uporządkowanych ciągach, natomiast przypadki, w których enkapsulowano więcej cząstek niż zamierzono, są wynikiem lokalnych wysokich stężeń cząstek oraz cząstek, które czasami migrują w stronę jednej z dwóch pionowych pozycji ogniskowania. Należy zauważyć, że nie zastosowano dopasowania wyporności opisanego w sekcji 2. Zamiast tego, pompa strzykawkowa została fizycznie nachylona, aby umożliwić osiadanie cząstek w stronę wylotu strzykawki, co prowadziło do wysokiego stężenia cząstek podczas pomiaru.

Przebieg eksperymentu ilustrujący konieczność zastosowania odpowiednich stężeń cząstek i komórek przedstawiono na Rysunku 4. W przypadku braku pełnego uporządkowania, lokalne grupy cząstek ulegają uporządkowaniu i zostają zamknięte w kropelkach, jednak wiele kropel pozostaje bez cząstek. Histogram przedstawia obniżoną wydajność enkapsulacji w przypadku pożądanego zamknięcia dwóch cząstek.

Schemat urządzenia mikroprzepływowego z wlotami wodnymi i olejowymi, kanałem porządkującym oraz wymiarami dyszy.
Rysunek 1. Urządzenie do enkapsulacji. a) Całe urządzenie z wlotami, wylotem i długim kanałem porządkującym. Wysokość urządzenia wynosi 52 μm, a szerokość kanału porządkującego 27 μm. b) Zarówno wloty wodne, jak i olejowe posiadają duże filtry zanieczyszczeń z przerwami o wielkości zbliżonej do szerokości kanału porządkującego w powiększeniu wlotu olejowego. c) Powiększony widok dyszy pokazuje jednakową szerokość kanałów wodnych i olejowych wynoszącą 27 μm, po której następuje zwężenie dyszy do 22 μm i gwałtowny rozszerzenie do szerszego kanału o szerokości 61 μm. Należy zauważyć, że wymiary urządzenia przedstawione tutaj zostały zweryfikowane za pomocą profilometru po mikrofabrykacji i nieznacznie różnią się od wymiarów nominalnych na masce. Autentyczne zdjęcie kanału porządkującego i dyszy jest dostępne online jako Rysunek suplementarny 1. Plik maski AutoCAD został również udostępniony online jako dodatek do niniejszej pracy.

Proces tworzenia kropli mikroprzepływowych w układzie eksperymentalnym; schematy a i b pokazują zmienną dynamikę przepływu.
Rysunek 2. Histereza przejścia z trybu kapania do trybu strumieniowania przy użyciu szerszego urządzenia (80 μm szerokości x 22 μm wysokości). a) Przy stałym natężeniu przepływu FC-40 (Qoil = 45 μL/min) stabilne tworzenie kropli następuje przy częstotliwości 10 kHz dla natężenia przepływu fazy wodnej Qaq = 8 μL/min. W miarę powolnego zwiększania natężenia przepływu fazy wodnej do 10 μL/min zostaje wywołane strumieniowanie cieczy wodnej. b) Po powrocie natężenia przepływu do 8 μL/min strumieniowanie nadal trwa. Należy zauważyć, że stabilne tworzenie kropli można przywrócić poprzez krótkie zatrzymanie pompy przepływu fazy wodnej (typowa przerwa trwa 1 sekundę).

Mikroprzepływy kropelkowe: analiza rozkładu cząstek; wykresy przedstawiające wyniki rozkładu Poissona.
Rycina 3. Enkapsulacja pojedynczych i podwójnych cząstek. a) Tworzenie kropli z jedną komórką na kroplę (Qoil = 60 μL/min, Qaq = 9 μL/min) przy szybkości generowania kropli 6,1 kHz, średniej wielkości kropli 24,4 pL oraz wydajnościach przechwytywania pojedynczych komórek Dk = 79,5% i Pk = 83,7% (λ = 0,95) dla wielkości próbki nd = 517 kropli i np = 491 cząstek. b) Tworzenie kropli z dwiema komórkami na kroplę uzyskano poprzez proste zmniejszenie szybkości przepływu FC-40 Qoil do 30 μL/min. Większe (39,8 pL) krople powstają z szybkością 3,8 kHz przy wydajności przechwytywania dwóch komórek Dk = 71,5% i Pk = 79,5% (λ = 1,80) dla wielkości próbki nd = 383 kropli i np = 689 cząstek. c-d) Dwa histogramy porównują wydajności enkapsulacji cząstek w kroplach Dk dla uporządkowanej enkapsulacji pojedynczych i podwójnych cząstek ze statystyką Poissona (losowa enkapsulacja). Należy zauważyć, że w obu przypadkach odstęp między cząstkami w kierunku przepływu wynosi około 17-18 μm dla całkowicie uporządkowanych, naprzemiennych cząstek. Uzupełniające filmy pokazujące enkapsulację pojedynczych i podwójnych cząstek są dostępne online. Kliknij tutaj, aby wyświetlić dodatkowy film 3a. Kliknij tutaj, aby wyświetlić dodatkowy film 3b.

Tworzenie kropel mikrofluidycznych; schemat rozkładu uporządkowanego i Poissona; analiza liczby cząsteczek.
Rycina 4. Stężenie w dużym stopniu wpływa na wydajność enkapsulacji. a) Wraz ze spadkiem stężenia pełne uporządkowanie nie występuje, co prowadzi do powstawania „luk” w ciągach, w efekcie niektóre krople zawierają mniej cząsteczek niż przewidywano. b) Histogram przedstawia obniżoną wydajność (Dk = 55.9%, Pk = 70.9%) dla enkapsulacji dwóch cząsteczek przy niższej wartości λ = 1.57, gdzie liczba kropel z jedną cząsteczką jest niemal tak samo duża jak liczba kropel z dwiema cząsteczkami. Rycina ta powstała przy Qoil = 30 μL/min i Qaq = 9 μL/min, co odpowiada tym samym warunkom przepływu jak dla Ryciny 3b. Reprezentatywne wideo uzupełniające jest dostępne online. Kliknij tutaj, aby wyświetlić Film uzupełniający 4.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Mimo stosunkowo wysokiego stopnia uporządkowania, nie wszystkie krople będą zawierać odpowiednią liczbę cząsteczek lub komórek. Wydajność enkapsulacji można obliczyć jako liczbę komórek lub cząsteczek, które zostały zamknięte w kroplach o pożądanej liczności, podzieloną przez ich liczbę całkowitą. Te surowe dane można uzyskać za pomocą zautomatyzowanego algorytmu analizy wideo o wysokiej prędkości lub poprzez obrazowanie próbki zebranej emulsji. Można to porównać do frakcji cząsteczek Pk zamkniętych w...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

JE jest pomysłodawcą w oczekującym na rozpatrzenie patencie opartym na technologii wykorzystanej w niniejszym manuskrypcie.

Podziękowania

Dziękujemy firmie RainDance Technologies za próbkę surfaktantu PFPE-PEG wykorzystanego w niniejszym badaniu, a BioMEMS Resource Center (dyrektor Mehmet Toner) za formę z płytki krzemowej, która posłużyła do stworzenia replik kanałów z PDMS.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
AutoCADAutoDesk
Maska przezroczystościFineline Imaging Inc.
Fotorezyst SU-8MicroChem Corp.2050
Profilometr DektakVeeco Instruments, Inc.
Szalka PetriegoBD Biosciences351058
Zestaw elastomeru silikonowego PDMSDow CorningSylgard 184, numer materiału (240)4019862
Suszarka próżniowaJencons250-030
Pompa próżniowaTechnologia próżniowa Alcatel2010 C2
Regulator próżniCole-ParmerEW-00910-10
Piekarnik (suszarka)Thermo Fisher Scientific, Inc.Lindberg Blue M, OV800F
wyciśnik do biopsji, 0,75 mmHarrisUni-Core 15072
Laboratoryjne urządzenie do traktowania koronowegoElectro-Technic Products Inc.BD-20AC, SKU 12051A
Lamelki szklaneZłota Pieczęć3010
AquapelPPG IndustriesStrategia alternatywna
Mikrosfery polistyrenowe, 9,9 μmThermo Fisher Scientific, Inc.G1000
OptiPrepSigma-AldrichD1556Nie wykazano
Strzykawki Luer-LokBD Biosciences1 ml: 309628 3 ml: 309585
Olej fluorowęglowy FC-403M Inc.Sigma Aldrich, F9755
Fluorosurfaktant PFPE-PEGRainDance Technologies
Lekki olej mineralnyOdczynniki chemiczne PTI Process Chemicals08042-47-5Strategia alternatywna
Surfaktant do oleju mineralnegoEvonik Goldschmidt CorporationABIL EM 90Strategia alternatywna
Przewody PVC TygonSmall Parts, Inc.TGY-010
igła do strzykawki Luer-Lok 30 G, 1/2 cala"Small Parts, Inc.NE-301PL-C
Mikroskop odwróconyObrazowanie Carl ZeissAxio Observer.Z1
Kamera wysokich prędkościBadania nad wzrokiemPhantom V310
Pompy strzykawkowe (2)Chemyx Inc.Nexus 3000
Olej silikonowyDow Corning200 płynu, 10 cStOpcjonalne dla przechowywania emulsji

Bibliografia

  1. Zagnoni, M., Lain, G. L. e, Cooper, J. M. Electrocoalescence mechanisms of microdroplets using localized electric fields in microfluidic channels. Langmuir : the ACS journal of surfaces and colloids. 26, 14443-14449 (2010).
  2. Niu, X. Z., Gielen, F., Edel, J. B., deMello, A. J. A microdroplet dilutor for high-throughput screening. Nat. Chem. 3, 437-442 (2011).
  3. Vincent, M. E., Liu, W., Haney, E. B., Ismagilov, R. F. Microfluidic stochastic confinement enhances analysis of rare cells by isolating cells and creating high density environments for control of diffusible signals. Chemical Society reviews. 39, 974-984 (2010).
  4. Huebner, A. Quantitative detection of protein expression in single cells using droplet microfluidics. Chemical communications. , 1218-1220 (2007).
  5. Love, J. C., Ronan, J. L., Grotenbreg, G. M., van der Veen, A. G., Ploegh, H. L. A microengraving method for rapid selection of single cells producing antigen-specific antibodies. Nature biotechnology. 24, 703-707 (2006).
  6. Bradshaw, E. M. Concurrent detection of secreted products from human lymphocytes by microengraving: Cytokines and antigen-reactive antibodies. Clin. Immunol. 129, 10-18 (2008).
  7. Liu, W. S., Kim, H. J., Lucchetta, E. M., Du, W. B., Ismagilov, R. F. Isolation, incubation, and parallel functional testing and identification by FISH of rare microbial single-copy cells from multi-species mixtures using the combination of chemistrode and stochastic confinement. Lab on a chip. 9, 2153-2162 (2009).
  8. Boedicker, J. Q., Li, L., Kline, T. R., Ismagilov, R. F. Detecting bacteria and determining their susceptibility to antibiotics by stochastic confinement in nanoliter droplets using plug-based microfluidics. Lab on a chip. 8, 1265-1272 (2008).
  9. Koster, S. Drop-based microfluidic devices for encapsulation of single cells. Lab on a chip. 8, 1110-1115 (2008).
  10. Kelly, R. T., Page, J. S., Marginean, I., Tang, K., Smith, R. D. Dilution-free analysis from picoliter droplets by nano-electrospray ionization mass spectrometry. Angew Chem. Int. Ed. Engl. 48, 6832-6835 (2009).
  11. Hong, J., deMello, A. J., Jayasinghe, S. N. Bio-electrospraying and droplet-based microfluidics: control of cell numbers within living residues. Biomedical materials. 5, 21001(2010).
  12. Edd, J. F. Controlled encapsulation of single-cells into monodisperse picolitre drops. Lab on a chip. 8, 1262-1264 (2008).
  13. Anna, S. L., Bontoux, N., Stone, H. A. Formation of dispersions using "flow focusing" in microchannels. Applied Physics Letters. 82, 364(2003).
  14. Utada, A., Fernandez-Nieves, A., Stone, H., Weitz, D. Dripping to Jetting Transitions in Coflowing Liquid Streams. Physical Review Letters. 99, (2007).
  15. Chabert, M., Viovy, J. L. Microfluidic high-throughput encapsulation and hydrodynamic self-sorting of single cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 3191-3196 (2008).
  16. Segrí, G., Silberberg, A. Radial Particle Displacements in Poiseuille Flow of Suspensions. Nature. 189, 209-210 (1961).
  17. Carlo, D. D. i Inertial microfluidics. Lab on a chip. 9, 3038-3046 (2009).
  18. Carlo, D. D. i, Edd, J., Humphry, K., Stone, H., Toner, M. Particle Segregation and Dynamics in Confined Flows. Physical Review Letters. 102, (2009).
  19. Humphry, K. J., Kulkarni, P. M., Weitz, D. A., Morris, J. F., Stone, H. A. Axial and lateral particle ordering in finite Reynolds number channel flows. Physics of Fluids. 22, 081703(2010).
  20. Lee, W., Amini, H., Stone, H. A., Carlo, D. D. i Dynamic self-assembly and control of microfluidic particle crystals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 22413(2010).
  21. Duffy, D. C., McDonald, J. C., Schueller, O. J. A., Whitesides, G. M. Rapid prototyping of microfluidic systems in poly(dimethylsiloxane. Anal. Chem. 70, 4974-4984 (1998).
  22. Kotz, K., Cheng, X., Toner, M. PDMS Device Fabrication and Surface Modification. J. Vis. Exp. (8), e319(2007).
  23. Haubert, K., Drier, T., Beebe, D. PDMS bonding by means of a portable, low-cost corona system. Lab on a chip. 6, 1548-1549 (2006).
  24. Hatch, A. C. 1-Million droplet array with wide-field fluorescence imaging for digital PCR. Lab on a chip. , 3838-3845 (2011).
  25. Holtze, C. Biocompatible surfactants for water-in-fluorocarbon emulsions. Lab on a chip. 8, 1632-1639 (2008).
  26. Garstecki, P., Stone, H., Whitesides, G. Mechanism for Flow-Rate Controlled Breakup in Confined Geometries: A Route to Monodisperse Emulsions. Physical Review Letters. 94, (2005).
  27. Garstecki, P., Fuerstman, M. J., Stone, H. A., Whitesides, G. M. Formation of droplets and bubbles in a microfluidic T-junction-scaling and mechanism of break-up. Lab on a chip. 6, 437-446 (2006).
  28. Nie, Z. Emulsification in a microfluidic flow-focusing device: effect of the viscosities of the liquids. Microfluidics and Nanofluidics. , (2008).
  29. Holt, D. J., Payne, R. J., Chow, W. Y., Abell, C. Fluorosurfactants for microdroplets: interfacial tension analysis. Journal of colloid and interface science. 350, 205-211 (2010).
  30. Holt, D. J., Payne, R. J., Abell, C. Synthesis of novel fluorous surfactants for microdroplet stabilisation in fluorous oil streams. Journal of Fluorine Chemistry. 131, 398-407 (2010).
  31. Hatch, A. C., Fisher, J. S., Pentoney, S. L., Yang, D. L., Lee, A. P. Tunable 3D droplet self-assembly for ultra-high-density digital micro-reactor arrays. Lab on a chip. 11, 2509-2517 (2011).
  32. Baret, J. C. Surfactants in droplet-based microfluidics. Lab on a chip. 12, 422-433 (2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Enkapsulacja mikroprzepływowadysza skupiająca strumieńuporządkowanie inercyjneenkapsulacja pojedynczych komórekenkapsulacja podwójnych komórekzamienniki cząsteczkoweszybkość generowania kropelszybkość przepływu fazy wodnejszybkość przepływu fazy olejowejkontrolowana enkapsulacja
Wysokoprzepustowa mikroenkapsulacja pojedynczych komórek i wielu komórek
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.