$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Metody enkapsulacji mikroprzepływowej były wcześniej wykorzystywane do przechwytywania komórek w wodnych, monodyspersyjnych kroplach w skali pikolitrów, zapewniając ograniczenie od środowiska płynów masowych z zastosowaniami w wysokoprzepustowych badaniach przesiewowych, cytometrii i spektrometrii mas. Opisujemy metodę nie tylko hermetyzacji pojedynczych komórek, ale także wielokrotnego przechwytywania określonej liczby komórek (tutaj demonstrujemy enkapsulację jedno- i dwukomórkową) w celu zbadania zarówno izolacji, jak i interakcji między komórkami w grupach o kontrolowanych rozmiarach. Łącząc techniki generowania kropel z porządkowaniem komórek i cząstek, demonstrujemy kontrolowaną enkapsulację cząstek wielkości komórki w celu wydajnej, ciągłej enkapsulacji. Używając wodnej zawiesiny cząstek i niemieszającego się oleju fluorowęglowego, generujemy wodne krople w oleju za pomocą dyszy skupiającej przepływ. Natężenie przepływu wody jest wystarczająco wysokie, aby stworzyć uporządkowanie cząstek, które docierają do dyszy z całkowitą wielokrotnością częstotliwości generowania kropli, zamykając kontrolowaną liczbę komórek w każdej kropli. Aby uzyskać reprezentatywne wyniki, jako substytuty komórek stosuje się cząstki polistyrenu o wielkości 9,9 μm. Badanie to wykazało skuteczność enkapsulacji pojedynczych cząstek Pk = 1 wynoszącą 83,7% i skuteczność enkapsulacji podwójnej cząstek Pk = 2 wynoszącą 79,5% w porównaniu z ich odpowiednimi wydajnościami Poissona wynoszącymi odpowiednio 39,3% i 33,3%. Wykazano, że wpływ stałego stężenia komórek i cząstek ma ogromne znaczenie dla wydajnej enkapsulacji, a także zajęto się kwestią przejść od kapania do strumieniowania.
Wprowadzenie
Zawiesiny komórek w roztworach ciągłych mają wspólne środowisko płynu, które pozwala komórkom na równoległe interakcje, a także homogenizuje efekty określonych komórek w pomiarach z pożywki. Wysokoprzepustowa enkapsulacja komórek w kroplach w skali pikolitrów ogranicza próbki w celu ochrony kropli przed zanieczyszczeniem krzyżowym, umożliwia pomiar różnorodności komórkowej w próbkach, zapobiega rozcieńczaniu odczynników i ekspresji biomarkerów oraz wzmacnia sygnały z produktów bioreaktora. Krople zapewniają również możliwość ponownego łączenia kropli z większymi próbkami wodnymi lub z innymi kroplami w celu badań sygnalizacji międzykomórkowej. 1,2 Zmniejszenie rozcieńczenia oznacza silniejsze sygnały detekcji dla większej dokładności pomiarów, a także możliwość zmniejszenia potencjalnie kosztownych objętości próbek i odczynników. 3 Enkapsulacja komórek w kroplach została wykorzystana do poprawy wykrywania ekspresji białek,4 przeciwciał,5,6 enzymów,7 i aktywności metabolicznej8 do wysokoprzepustowych badań przesiewowych i może być wykorzystana do poprawy cytometrii wysokoprzepustowej. 9 Dodatkowe badania przedstawiają zastosowania w bioelektronatryskiwaniu kropli zawierających ogniwa do spektrometrii mas10 i celowanych powierzchniowych powłok komórkowych. 11 Niektóre zastosowania były jednak ograniczone ze względu na brak możliwości kontrolowania liczby komórek zamkniętych w kroplach. W niniejszym artykule przedstawiono metodę uporządkowanej enkapsulacji12, która zwiększa wykazaną skuteczność enkapsulacji dla jednej i dwóch komórek i może być ekstrapolowana do enkapsulacji większej liczby komórek.
Aby osiągnąć monodyspersyjne wytwarzanie kropli, mikroprzepływowe "skupianie przepływu" umożliwia tworzenie kontrolowanych kropel jednego płynu (wodnego mieszaniny komórek) w innym (ciągła faza olejowa) za pomocą dyszy, przy której zbiegają się strumienie. 13 Dla danej geometrii dyszy częstotliwość generowania kropli f i wielkość kropli można zmienić, dostosowując natężenie przepływu oleju i wody Qoleju i Qaq. Wraz ze wzrostem natężeń przepływu przepływy mogą przechodzić od generowania kropli do niestabilnego strumieniowania cieczy wodnej z dyszy. 14
Gdy roztwór wodny zawiera zawieszone cząstki, cząsteczki zostają zamknięte i odizolowane od siebie przy dyszy. W przypadku wytwarzania kropli przy użyciu losowo rozmieszczonej wodnej zawiesiny komórek, średnia frakcja kropli Dk zawierających k komórek jest podyktowana statystyką Poissona, gdzie Dk = λk exp(-λ)/(k!) i λ to średnia liczba komórek na kroplę. Frakcja komórek, które trafiają do "prawidłowo" zamkniętych kropli, oblicza się za pomocą Pk = (k x Dk)/Σ(k' x Dk'). Subtelna różnica między tymi dwoma wskaźnikami polega na tym, że Dk odnosi się do wykorzystania cieczy wodnej i ilości sortowania kropli, które należy zakończyć po enkapsulacji, a Pk odnosi się do wykorzystania próbki komórki. Na przykład można użyć zawiesiny rozcieńczonych komórek (niskie λ) do kapsułkowania kropli, podczas gdy większość kropli zawierających komórki zawierałaby tylko jedną komórkę. Podczas gdy wskaźnik wydajności Pk byłby wysoki, większość kropli byłaby pusta (niskie Dk), co wymagałoby mechanizmu sortowania w celu usunięcia pustych kropli, a także zmniejszenia przepustowości. 15
Połączenie generowania kropli z porządkowaniem inercyjnym daje możliwość hermetyzacji kropli z bardziej przewidywalną liczbą komórek na kroplę i wyższą przepustowością niż losowa enkapsulacja. Ogniskowanie inercyjne zostało po raz pierwszy odkryte przez Segre'a i Silberberga16 i odnosi się do tendencji cząstek o skończonych rozmiarach do migracji do pozycji równowagi bocznej w przepływie kanałowym. Uporządkowanie inercyjne odnosi się do tendencji cząstek i komórek do pasywnego organizowania się w równomiernie rozmieszczone, rozłożone w czasie ciągi o stałej prędkości. Zarówno ogniskowanie, jak i porządkowanie wymagają odpowiednio wysokich prędkości przepływu (wysoka liczba Reynoldsa) i wielkości cząstek (wysoka liczba Reynoldsa). 17,18 Tutaj liczba Reynoldsa Re = uDh/ν i cząstka liczba Reynoldsa Rep = Re(a/Dh)2, gdzie u jest charakterystyczną prędkością przepływu, Dh [=2wh/(w+h)] jest średnicą hydrauliczną, ν jest lepkością kinematyczną, a jest średnicą cząstek, w jest szerokością kanału, a h jest wysokością kanału. Empirycznie rzecz biorąc, długość wymagana do osiągnięcia w pełni uporządkowanych pociągów zmniejsza się wraz ze wzrostem Re i Rep. Należy pamiętać, że wysokie wymagania dotyczące Re i Rep (dla tego badania odpowiednio rzędu 5 i 0,5) mogą kolidować z potrzebą utrzymywania niskich natężeń przepływu wody, aby uniknąć natryskiwania na dyszę wytwarzającą krople. Ponadto wysokie natężenia przepływu prowadzą do większych naprężeń ścinających na ogniwach, które nie zostały uwzględnione w tym protokole. Poprzednie badanie z uporządkowaną enkapsulacją wykazało, że ponad 90% pojedynczo kapsułkowanych komórek HL60 w podobnych warunkach przepływu jak te w tym badaniu zachowało integralność błony komórkowej. 12 Jednak wpływ skal wielkości i czasu naprężeń ścinających będzie musiał być dokładnie rozważony podczas ekstrapolacji na różne typy ogniw i parametry przepływu. Nakładanie się na siebie ograniczeń wodnego natężenia przepływu komórek, generowania kropli i żywotności komórek zapewnia idealny reżim operacyjny dla kontrolowanej enkapsulacji pojedynczych i wielu komórek.
Ponieważ bardzo niewiele badań dotyczy odstępów między częściami,19,20 najłatwiej jest określić odstępy empirycznie i będzie to zależało od geometrii kanału, natężenia przepływu, wielkości cząstek i stężenia cząstek. Niemniej jednak równe odstępy boczne między pociągami oznaczają, że komórki docierają w przewidywalnych, stałych odstępach czasu. Gdy wytwarzanie kropli następuje z tą samą szybkością, z jaką uporządkowane komórki docierają do dyszy, komórki zostają zamknięte w kropli w kontrolowany sposób. Technika ta została wykorzystana do hermetyzacji pojedynczych komórek o przepustowości rzędu 15 kHz,12 co stanowi znaczną poprawę w porównaniu z poprzednimi badaniami wykazującymi wskaźniki enkapsulacji rzędu 60-160 Hz.4,15 W kontrolowanej pracy enkapsulacji ponad 80% kropli zawierało jedną i tylko jedną komórkę, co stanowi znaczną poprawę wydajności w porównaniu ze statystykami Poissona (losowymi), co przewiduje średnio mniej niż 40% wydajności. 12
W poprzednich kontrolowanych pracach nad enkapsulacją,12 średnia liczba cząstek na kroplę λ została dostrojona tak, aby zapewnić enkapsulację pojedynczej komórki. Stawiamy hipotezę, że poprzez dostrojenie natężeń przepływu możemy skutecznie otoczyć dowolną liczbę komórek na kroplę, gdy λ jest równe lub bliskie liczbie pożądanych komórek na kroplę. Podczas gdy enkapsulacja jednokomórkowa jest cenna w określaniu indywidualnych odpowiedzi komórek na bodźce, enkapsulacja wielokomórkowa dostarcza informacji dotyczących interakcji kontrolowanej liczby i typów komórek. W tym miejscu przedstawiamy protokół, reprezentatywne wyniki z wykorzystaniem mikrosfer polistyrenowych oraz dyskusję na temat kontrolowanej enkapsulacji wielu komórek za pomocą pasywnego inercyjnego kanału porządkującego i dyszy do generowania kropli.