Modelowanie raka związanego z zapaleniem jelita grubego z wykorzystaniem azoksymetanu (AOM) i dekstranu siarczanowego sodu (DSS)

Podsumowanie

Przedstawiamy protokół, w którym podanie genotoksycznego czynnika azoksymetanu (AOM), a następnie trzy cykle podania prozapalnego dekstranu siarczanu sodu (DSS), pozwala na szybkie i powtarzalne wywołanie guzów okrężnicy u myszy, wykazujących podobieństwa morfologiczne i molekularne do nowotworów związanych z zapaleniem jelita grubego u ludzi.

Streszczenie

Osoby z nieswoistymi zapaleniami jelit (IBD), takimi jak choroba Leśniowskiego-Crohna (CD) lub wrzodziejące zapalenie jelita grubego (UC), są bardziej narażone na rozwój raka jelita grubego (CRC) niż osoby zdrowe. Ryzyko to jest proporcjonalne do czasu trwania i zasięgu choroby, a skumulowana zapadalność może sięgać 30% u osób z wieloletnim UC z rozległym zajęciem okrężnicy.¹ Przyjmuje się, że dysplazja okrężnicy w IBD oraz rak związany z zapaleniem jelita grubego (CAC) rozwijają się w wyniku powtarzających się cykli uszkadzania i naprawy komórek nabłonkowych, podczas gdy komórki te są wystawione na działanie przewlekłego środowiska cytokin zapalnych.² Choć nowotwory spontaniczne i związane z zapaleniem jelita grubego mają wspólną cechę w postaci bycia gruczolakorakami, uważa się, że sekwencja leżących u ich podstaw zdarzeń molekularnych jest inna.³ Ta różnica uzasadnia potrzebę stosowania specyficznych modeli zwierzęcych CAC.

Obecnie istnieje kilka modeli mysich do badania CAC. Dekstran siarczan sodu (DSS), związek o bezpośrednim działaniu toksycznym na nabłonek okrężnicy, może być podawany myszom w wodzie pitnej w wielu cyklach w celu wywołania stanu przewlekłego zapalenia. Przy odpowiednio długim czasie trwania u niektórych z tych myszy rozwijają się guzy.⁴ Rozwój guzów w tym modelu jest przyspieszony, jeśli substancja jest podawana w warunkach prokarcynogennych. Obejmują one myszy z mutacjami genetycznymi w szlakach tumorigenzy (APC, p53, Msh2), a także myszy poddane wcześniejszemu leczeniu czynnikami genotoksycznymi (azoksymetan [AOM], 1,2-dimetylohydrazyna [DMH]).⁵

Połączenie DSS z AOM jako model raka jelita grubego związanego z zapaleniem jelit zyskało popularność ze względu na swoją powtarzalność, skuteczność, niską cenę i łatwość zastosowania. Chociaż oba związki mają wspólny mechanizm działania, stwierdzono, że AOM jest bardziej aktywny i stabilny w roztworze niż DMH. Podczas gdy rozwój guzów w innych modelach zazwyczaj wymaga kilku miesięcy, u myszy poddanych iniekcji AOM, a następnie traktowanych DSS, odpowiednie guzy rozwijają się już w ciągu 7–10 tygodni.^{6, 7} Ponadto AOM i DSS można podawać myszom o dowolnym podłożu genetycznym (knock out, transgeniczne itp.) bez konieczności krzyżowania ze specyficzną linią nowotworową. W niniejszej pracy prezentujemy protokół indukowania nowotworzenia w okrężnicy wywołanego zapaleniem u myszy, wykorzystujący pojedynczą iniekcję AOM, po której następują trzy siedmiodniowe cykle podawania DSS w okresie 10 tygodni. Model ten indukuje guzy z zmianami histologicznymi i molekularnymi ściśle przypominającymi te występujące w ludzkim CAC, stanowiąc tym samym niezwykle wartościowy model do badania onkogenezy i chemoprewencji w tej chorobie.⁸

Protokół

1. Indukcja raka związanego z zapaleniem jelita grubego

1. Przygotuj klatki z myszami w wieku 6–8 tygodni, dopasowanymi pod względem płci i wieku, do wykorzystania w grupach eksperymentalnej i kontrolnej. Myszy można oznaczyć indywidualnie za pomocą markerów na ogonach lub nacięć usznych.
2. W dniu 0 zarejestruj masę ciała wyjściową i wstrzyknij każdej myszy do jam brzusznych (IP) 10 mg/kg roztworu roboczego AOM (1 mg/ml w soli izotonicznej, rozcieńczonego z roztworu stokowego 10 mg/ml w dH2O przechowywanego w -20 °C). W zależności od doświadczenia dawkę tę można dostosować w zakresie 7–14 mg/kg i/lub powtórzyć na wczesnym etapie eksperymentu.

Uwaga: AOM jest lotną substancją genotoksyczną i należy z nią obchodzić się ostrożnie, zgodnie z załączoną kartą charakterystyki (MSDS). Roztwory należy przygotowywać w dygestorium, przechowywać w lodzie i utylizować zgodnie z protokołami obowiązującymi w danej instytucji.

3. Przygotować 2,5% (2,5 g/100 ml) roztwór DSS w wodzie destylowanej i przefiltrować go za pomocą filtra z octanu celulozy o rozmiarze porów 0,22 μm pod próżnią. Dawkę tę można dostosować w zakresie 1-3,5% w zależności od szczepu myszy i warunków środowiskowych. Po przygotowaniu roztwór DSS można przechowywać w lodówce do 1 tygodnia.
4. W 7. dniu podać myszom roztwór DSS jako wodę pitną. Przy maksymalnie 5 myszach w klatce, przy każdej wymianie roztworu DSS potrzeba będzie około 250 ml/klatkę; są to jednak jedynie wartości szacunkowe, które mogą się różnić w zależności od rodzaju butelek na wodę używanych w danym animalarium.
5. Aby zapewnić ciągłe dostarczanie DSS przez siedem dni, roztwór DSS należy wymienić w czystych butelkach trzykrotnie (co 2-3 dni) w tym okresie. Niektórzy badacze przed wymianą na nowy roztwór mierzą ilość spożytego DSS w celu określenia poziomu ekspozycji.
6. W 14. dniu przywrócić w klatkach standardową wodę pitną na dwa tygodnie.
7. Powtórzyć kroki (1.4) – (1.6) w 28. i 49. dniu, aby przeprowadzić drugi i trzeci cykl podawania DSS. „Cykl” DSS składa się z jednego tygodnia podawania DSS w wodzie pitnej, po którym następują 2 tygodnie podawania zwykłej (autoklawowanej) wody.

2. Ocena kliniczna zapalenia jelita grubego i progresji guza

1. Myszy należy ważyć i obserwować 2-3 razy w tygodniu. Procentowa utrata masy ciała w stosunku do wartości wyjściowej służy jako miara zastępcza ciężkości zapalenia jelita grubego. W zależności od celów eksperymentalnych można przeprowadzać regularne oceny krwawienia z odbytu, biegunki lub wypadania odbytu i raportować je zgodnie z różnymi systemami punktacji.^{9, 10}
2. W tygodniu następującym po pełnym cyklu podawania DSS można spodziewać się utraty masy ciała do 10% wraz z 2-3 dniami biegunki i krwawienia z odbytu (podczas tego bezpośredniego okresu po podaniu DSS przydatna może być codzienna obserwacja).

Możliwe jest, że niektóre myszy nie wyzdrowieją; myszy, które utratą więcej niż 20% masy ciała, mają mniejsze szanse na przeżycie i mogą wymagać przedwczesnej eutanazji. Pojedynczy zastrzyk doszpikowy (IP) 0,5 - 1,0 ml soli fizjologicznej u takich myszy może być przydatnym środkiem wspomagającym w celu wyrównania objętości płynów utraconych w wyniku biegunki.

3. Endoskopia myszy (opcjonalnie)

1. Endoskopię po drugim lub trzecim cyklu DSS można przeprowadzić w celu potwierdzenia wzrostu guza in vivo przed uśmierceniem zwierząt. Ponieważ model AOM/DSS jest dość niezawodny w indukowaniu guzów, krok ten zazwyczaj nie jest konieczny. Metodą tą należy ocenić tylko nieliczne myszy, ponieważ może ona doprowadzić do uszkodzenia guzów.¹¹
2. Zapewnij znieczulenie myszy za pomocą sedacji wziewnej lub wstrzykiwanej.
3. Po znieczuleniu myszy przymocuj ją taśmą za ogon i klatkę piersiową do płaskiej deski.
4. Ostrożnie wprowadź endoskop mysi do odbytnicy myszy, używając soli fizjologicznej do nadmuchiwania i przemywania, aby poprawić widoczność wewnątrz światła jelita i usunąć treść kałową. (Należy zaznaczyć, że endoskopię można również przeprowadzić przy użyciu insuflacji powietrzem jako alternatywy dla soli fizjologicznej, co może zapewnić lepszą wizualizację guza.¹²)

4. Uśmiercenie myszy i pobranie jelita grubego

1. W 70. dniu każda mysz traktowana AOM/DSS powinna posiadać wiele guzów jelita grubego i być gotowa do oceny. Termin ten może zostać przesunięty o tygodnie lub miesiące, jeśli pożądane są większe guzy. (Należy zauważyć, że myszy z ciężkim wypadnięciem odbytnicy mogą wymagać wcześniejszej eutanazji w celu uniknięcia nadmiernego dyskomfortu zwierząt, zgodnie z wytycznymi instytucjonalnych komisji ds. opieki nad zwierzętami).
2. Przed sekcją uśmierć poszczególne myszy przy użyciu izofluranu i zwichnięcia stawów szyjnych (lub innej zatwierdzonej przez instytucję metody). W tym czasie można dokonać pomiaru masy końcowej oraz innych parametrów.
3. Połóż mysz stroną brzuszną do góry na desce do cięcia. Pokryj brzuch 70% etanolem, aby zapobiec zanieczyszczeniu zawartości jamy brzusznej włosami podczas wycinania jelita grubego.
4. Używając pęsety, chwyć linię środkową brzucha i wykonaj niewielkie nacięcie, aby odsłonić otrzewną.
5. Przedłuż to nacięcie po każdej stronie brzucha wzdłuż łuku żebrowego.
6. Użyj nożyczek, aby przeciąć miednicę w taki sposób, aby można było pobrać jelito grube aż do połączenia odbytniczo-odbytowego. Jest to istotne, ponieważ uszkodzenia w przebiegu zapalenia jelit indukowanego DSS są największe w dystalnej części odbytnicy i odpowiednio w tym regionie rozwija się najwięcej guzów.
7. W tym czasie można pobrać również dodatkowe tkanki, takie jak węzły chłonne krezkowe.

5. Przygotowanie jelita grubego do analizy makroskopowej

1. Używając igły do zgłębnika 18G przymocowanej do strzykawki 5 ml, przepłucz jelito grube lodowatym solą fizjologiczną buforowaną fosforanowo (PBS) w taki sposób, aby płyn wypływał w kierunku fizjologicznym. Jeśli tkanka jelita grubego ma zostać wykorzystana do analizy RNA lub białek, można utrzymać ją w niskiej temperaturze, stosując schłodzone wcześniej tacki robocze.
2. Rozпоryj wypłukane jelito grube wzdłuż jego krezki i rozłóż je na chłodnej tacce. Guzy są łatwiejsze do zwizualizowania, gdy jelito grube zostanie umieszczone na ciemnym podłożu. Alternatywnie można zastosować 1% barwnik błękit Alcianu, aby uwydatnić guzy. Ocen liczbę i wielkość guzów za pomocą linijki lub suwmiarki cyfrowej.
3. Na tym etapie można wyciąć niewielkie fragmenty guza oraz przyległej prawidłowej tkanki do późniejszej analizy metodami RNA, białkowymi lub immunohistochemicznymi (IHC), pozostawiając część pozostałego jelita grubego do oceny histologicznej.

Cyfrowa fotografia makroskopowa preparatów okrężnicy bezpośrednio po kroku 5.2 może być pomocna w precyzyjnej analizie obciążenia nowotworowego, zwłaszcza jeśli znaczne fragmenty okrężnic zostaną wycięte do innych rodzajów analiz, jak opisano powyżej. Obciążenie nowotworowe (%) można obliczyć jako stosunek powierzchni guza do całkowitej powierzchni okrężnicy, korzystając z bezpłatnego oprogramowania, takiego jak ImageJ.

6. Przygotowanie jelita grubego do oceny histologicznej

1. Nanieś 10% formalinę na pozostałą część jelita grubego na zimnej tacy za pomocą strzykawki lub palca. Pozostawienie tkanki do utrwalenia przez co najmniej 30 sec w ten sposób ułatwia przeniesienie do naczynia z utrwalaczem. Przed nałożeniem nowej, otwartej części jelita grubego na tę samą tacę upewnij się, że resztki formaliny zostały starte.
2. Przenieś jelita grube do naczynia wypełnionego 10% formaliną i przymocuj ich brzegi szpilkami.
3. Po 3 hr utrwalania przenieś jelita grube do 70% etanolu. Jelita grube mogą być przechowywane w 70% etanolu bezterminowo.
4. Trzy przekroje podłużne jelita grubego (proksymalny, środkowy, dystalny/odbytnica) można ustabilizować w 2% agarze i przekazać do zatopienia w parafinie. Upewnij się, że proksymalna i dystalna część jelita grubego/odbytnica są zorientowane w jednolity sposób dla każdej myszy.
5. Dysplazję, uszkodzenia krypt i stan zapalny może opisać i ocenić doświadczony specjalista zgodnie z wcześniej opublikowanymi protokołami.^{10, 13-15} Myszy mogą zostać uśpione przed 70 dniem, jeśli badacz jest zainteresowany wykryciem wczesnych zmian dysplastycznych.

7. Reprezentatywne wyniki

Opisany tutaj model AOM/DSS pozwala badaczowi na niezawodne indukowanie guzów okrężnicy u myszy. Wzrost guza w tym modelu jest bezpośrednio uwarunkowany towarzyszącym procesem zapalnym. Należy monitorować klinicznie nasilenie zapalenia jelit, śledząc utratę masy ciała oraz występowanie biegunki/hematochezji (Rycina 2). Objawy aktywności choroby mają tendencję do pojawiania się do 5. dnia cyklu DSS i utrzymywania się przez cztery lub więcej dni po odstawieniu DSS. W rzadkich przypadkach u myszy z dużym obciążeniem guzami odbytnicy może dojść do wypadania odbytnicy. Po drugim lub trzecim cyklu DSS biegunka może stać się uporczywa. Zazwyczaj guzy są obecne i możliwe do zidentyfikowania podczas kolonoskopii myszy przed trzecim cyklem DSS (Rycina 3). Dodatkowy czas i trzecia seria DSS prowadzą do powstania większych guzów w momencie pobrania materiału (Rycina 4). Do uwydatnienia guzów można zastosować miejscowo barwienie błękitem Alcianem (Rycina 5). Fotografie guzów okrężnicy pomogą w wykonaniu pomiarów, które mogą zostać wykorzystane do ilościowego porównania liczby i wielkości guzów pomiędzy grupami doświadczalnymi (Rycina 6). Utrwalone i zatopione w parafinie preparaty okrężnicy mogą następnie zostać poddane ocenie histologicznej lub barwieniu immunohistochemicznemu (Rycina 7 i 8).

Rysunek 1. Schemat podawania AOM i DSS. AOM (10 mg/kg) jest wstrzykiwany w dniu 0. Na początku drugiego tygodnia (dzień 7) myszy otrzymują 2,5% roztwór DSS w wodzie pitnej. Po siedmiu dniach podawania DSS następuje dwa tygodnie podawania wody autoklawowanej. Przed ubojem wykonuje się dodatkowe dwa cykle podawania DSS.

Rycina 2. Masa ciała myszy w stosunku do wartości wyjściowej podczas podawania AOM i DSS. Należy zauważyć, że w tygodniu następującym po każdym cyklu DSS myszy tracą 5-10% masy ciała. Utrata masy ciała w tym eksperymencie jest markerem zastępczym dla stopnia nasilenia zapalenia jelit.

Rysunek 3. Widok guzów w dystalnej części okrężnicy podczas endoskopii mysiej w 50. dniu leczenia AOM/DSS. Zwróć uwagę na liczne masy polipowate blokujące światło dystalnej części okrężnicy (b, c) w porównaniu do prawidłowej okrężnicy (a).

Rycina 4. Wzdłużnie rozcięty jelito grubego myszy obrazujący wygląd makroskopowy guzów. Zwróć uwagę na większą liczbę guzów w dystalnej części jelita grubego/odbytnicy (górny obraz po lewej) oraz charakterystyczną pofałdowaną strukturę proksymalnej części jelita grubego (górny obraz po prawej) z niewielkim wzrostem guzów. Powiększony widok dystalnej części jelita grubego pokazuje liczne guzy o różnych rozmiarach (poniżej).

Rycina 5. Guzy uwidocznione za pomocą barwienia błękitem Alcianem. Zwróć uwagę, jak barwnik podkreśla naturalną strukturę okrężnicy, a także granice każdego pojedynczego guza. Takie barwienie może być pomocne przy precyzyjnym pomiarze obszarów guzów za pomocą linijki lub pomiaru cyfrowego.

Rysunek 6. Reprezentatywny rozkład średniej liczby guzów na mysz leczoną AOM/DSS. Należy zwrócić uwagę, że większość guzów znajduje się w dystalnej części jelita grubego i ma wielkość <2 mm.

Rysunek 7. Podłużne przekroje jelita grubego zatopione w parafinie w kasecie (powyżej) oraz na szkiełku po barwieniu H&E (poniżej). Należy zauważyć, że pozostałości barwienia błękitem Alciana nie zakłócają barwienia H&E. Na obrazie szkiełka zaznaczono okręgiem duży guz (okrąg). Oznaczenia „dystalny”, „środkowy” i „proksymalny” wynikają z podziału całego jelita grubego na trzy równe części między kątnicą a odbytem.

Rysunek 8. Reprezentatywna histologia guza powstałego w wyniku podania AOM/DSS w dystalnej części okrężnicy. Preparaty barwione H&E, BrdU oraz na β-kateninę przy powiększeniu 50X (panel górny) i 400X (panel dolny) odpowiednio wykazują zmiany dysplastyczne podobne do ludzkich gruczolakowców okrężnicy.

Dyskusja

Leczenie myszy AOM i DSS szybko i skutecznie modeluje ludzkiego raka związanego z zapaleniem jelita grubego. Hipotezy dotyczące dziedzicznych czynników przyczyniających się do nowotworów związanych z zapaleniem jelita grubego można łatwo badać z wykorzystaniem myszy modyfikowanych genetycznie.^{13, 16} Alternatywnie, wpływ celów farmakologicznych w raku związanym z zapaleniem jelita grubego można badać, stosując myszy typu dzikiego.

Mimo że model ten jest wysoko ceniony przez badaczy z...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Myszy C57BL/6J	Jackson Laboratory	000664
Azoksymetana (AOM)	Sigma Aldrich	A5486-100MG	Roztwór zapasowy: rozcieńczyć do 10 mg/ml w wodzie destylowanej, przechowywać w temperaturze -20 °C w aliquotach 0,5 – 1 ml. Roztwór roboczy: rozcieńczyć roztwór zapasowy do stężenia 1 mg/ml w izotonicznym (0,9%) roztworze soli fizjologicznej
Deksyran siarczan sodu (DSS)	TdB Consultancy	DB001	MW 40 kDa (akceptowalne są preparaty 36-50 kDa z innych źródeł; do jednego eksperymentu należy użyć tej samej partii)6
System miniendoskopowy Coloview	Karl Storz	Wiele	Szczegółny opis sprzętu i konfiguracji znajduje się u Beckera et al..11
Butelka-filtr TPP Rapid FILTERMAX 500 ml, 0,22 μm PES	Midwest Scientific	TP99500	Akceptowalny jest każdy standardowy filtr do hodowli tkankowych
Alkohol etylowy 200 Proof ASC/USP	Pharmaco-AAPER (lub inny)	11ACS200	Rozcieńczyć do 70% w wodzie destylowanej
Izofluran, USP	Butler Animal Health Supply	4029405	Umieścić mysz w szklanym słoiku z gazą lub małą szmatką nasączoną środkiem anestetycznym
Prosta igła do zgłębnikowania 18G	Braintree Scientific	N-008
Bufor fosforanowy (PBS)	Sigma Aldrich	P5493	Rozcieńczyć do 1X (0,01 M) w wodzie destylowanej
Taca chłodząca (Tissue Tek II Cold Plate)	Fisher Scientific	NC9491941	Przechowywać w temperaturze -20 °C
Oprogramowanie ImageJ	NIH (bezpłatne pobieranie)		http://rsbweb.nih.gov/ij/
Formaldehyd (37%)	Fisher Scientific	F79-500	Rozcieńczyć do 10% w PBS
Agar BD Bacto	Fisher Scientific	DF0140-01-0	Użyć płyty grzejnej do przygotowania 2% roztworu w wodzie destylowanej
Pinceta okulistyczna Miltex Eye Dressing	MedPlus Inc.	18-780
Nożyczki okulistyczne Miltex	MedPlus Inc.	18-1430	Zakrzywione końce zapobiegają uszkodzeniu jelita grubego podczas otwierania.
Alcian Blue 8GX (proszek)	Sigma Aldrich	A5268	Dodać 1 g proszku do 100 ml 3% kwasu octowego (3 ml octanu lodowatego + 97 ml wody destylowanej)
Strzykawka tuberkulinowa 1 mL z dołączoną igłą śródskórną 26 G x 3/8 cala	BD	305946	Do wstrzykiwania AOM